專利名稱：一種春蘭梅瓣品種的分子特異標記及其獲得方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種春蘭梅瓣品種的分子特異標記及其獲得方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng) 域。
背景技術(shù)：
二千三百年前就有越王勾踐種蘭渚山可謂全國最早，三百多年來共選育出春蘭品 種400多個可謂全國最多，百余年來譽滿神州的春蘭“四大天王”-宋梅、集圓、龍字、萬字 均出自浙江。浙江自1645年以來，共選育出春蘭品種600多個，僅紹興地區(qū)選育和栽培的 春蘭品種就有430多個；品種之多為全國之最。改革開放后，蘭花在紹興市，特別在紹興縣 成了農(nóng)民發(fā)家致富的一條捷徑，蘭花產(chǎn)業(yè)不斷發(fā)展壯大。目前，僅紹興縣蘭花產(chǎn)業(yè)從業(yè)者達 2500多人，蘭花種植面積2000多畝，蘭花產(chǎn)業(yè)年產(chǎn)值達1億元以上。文人雅士玩賞的小小 蘭花，如今在浙江紹興縣卻成了百萬乃至千萬富翁的“生產(chǎn)線”。在這個縣有1500多農(nóng)戶長 年從事蘭花的收集、馴化和培育。目前，至少有20多戶農(nóng)民因種植蘭花而資產(chǎn)逾千萬元。近幾年來，隨著我省經(jīng)濟的長足發(fā)展，人民生活水平的不斷提高，蘭花交流營運也 得到不斷升溫。如紹興地區(qū)養(yǎng)蘭戶每年以15%以上的速度遞增。目前我省已基本形成一個 普遍養(yǎng)蘭的氛圍。從2000年至2006年我省蘭花交易形勢上看，蘭花產(chǎn)業(yè)正成為我省人民 致富的一條捷徑，正成為我省可持續(xù)發(fā)展的特色優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)。同時我省蘭花產(chǎn)業(yè)也面臨著諸 多被動因素，嚴重影響著該產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。蘭花是大自然賦予我們的寶貴自然資源，也是我省寶貴的自然資源和經(jīng)濟資源， 近年來，由于蘭花價格的持續(xù)上升，一些地區(qū)對野生蘭花的采挖比較混亂。目前江浙兩省每 年的下山蘭草很少，野生蘭花資源已遭很大程度的破壞，許多山區(qū)已經(jīng)到了亂挖、濫采的地 步，目前已無下山草可挖，所以蘭展上已很難找到一些帶有香味的浙江下山春蘭。我國為避 免此類現(xiàn)象的發(fā)生，除利用法律、法規(guī)措施禁止人為破壞和掠奪蘭花野生資源，更重要的是 利用現(xiàn)有的蘭花資源，加強新品種的培育和栽培管理技術(shù)的研究，利用現(xiàn)有的種質(zhì)資源以 蘭養(yǎng)蘭、以蘭擴蘭，既有效地保護蘭花自然資源，又滿足養(yǎng)蘭愛好者的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了能對春蘭梅瓣品種進行簡便、快速、準確的鑒定和檢測，提供 了一種春蘭梅瓣品種的分子特異標記及其獲得方法。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為一種春蘭梅瓣品種的分子特異標記，采用特異性ISSR-PCR擴增引物對春蘭普通 品種與梅瓣基因進行擴增，得到大小為550bp的DNA片段即為所述的分子特異標記。一種春蘭梅瓣品種的分子特異標記的獲得方法，包括如下步驟(1)春蘭梅瓣品種的資源收集和基因組DNA的提?。?2)春蘭梅瓣品種的特異PCR擴增引物的獲得，采用ISSR-PCR技術(shù)，經(jīng)過大量的篩 選試驗，獲得特異PCR擴增引物為ACACACACACACACACCTT ；
(3) ISSR分子標記的PCR擴增產(chǎn)物的獲得擴增總體積為20uL，10 XPCR buffer (含 mg2+) 2. OuL, 10mmol/L dNTP (三磷酸脫氧核糖核苷)0. 4uL, 2. 5U/uL TaqDNA 聚 合酶 0. 3uL, IOu mol/L 特異 PCR 擴增引物 ACACACACACACACACCTT 2uL,基因組 DNA IuL, ddH20(重蒸水)14. 3uL ；PCR 反應條件94°C 3min ；94°C 45sec，51°C 45sec，72°C 90sec，38 個循環(huán)；72 °C 7min ；(4)電泳檢測取上述PCR擴增產(chǎn)物2uL，與IuL上樣緩沖液(6 X loading buffer) 混勻，點樣于的瓊脂糖凝膠上，于IXTBE緩沖液中，8V/cm電壓下電泳，電泳結(jié)束后，用 EB (溴化乙錠)染色，然后在凝膠成像儀上照相，此時可見550bp大小的特異片段，而其他普 通春蘭均未見特異性片段。所述步驟(1)中，用改良的CTAB法提取基因組DNA，DNA稀釋至20ng/uL，_20°C冰 箱貯藏備用。根據(jù)采用這一個特殊引物進行PCR擴增，以能否產(chǎn)生550bpDNA片段作為對梅瓣春 蘭進行鑒定和檢測的依據(jù)。該檢測方法與傳統(tǒng)的辨別梅瓣春蘭的方法相比，具有更強的操作性，傳統(tǒng)的方法 須等開花之后通過花瓣的花型特征來判定，而該檢測方法在春蘭幼苗時通過嫩葉即可進行 檢測，檢測時間短，準確性高。以下結(jié)合附圖和具體實施方式
對本發(fā)明作進一步說明。


圖1為梅瓣春蘭專用檢測引物對春蘭進行ISSR-PCR擴增結(jié)果。圖中梅瓣春蘭(天 興，萬字，瑞梅，宋梅，冠姚和賀梅)均能擴增出分子量約為550bp的特殊DNA條帶，而普通 春蘭(普1，普2和普3)則沒有。
具體實施例方式下面通過具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明并不受以下實施例所限定。實施例1(1)春蘭梅瓣品種的資源收集和基因組DNA的提?。黄渲?，基因組DNA的提取具體 為用改良的CTAB法提取基因組DNA，DNA稀釋至20ng/uL，_20°C冰箱貯藏備用。(2)春蘭梅瓣品種的特異PCR擴增引物的獲得，采用ISSR-PCR技術(shù)，經(jīng)過大量的篩 選試驗，獲得特異PCR擴增引物為ACACACACACACACACCTT。(3) ISSR分子標記的PCR擴增產(chǎn)物的獲得擴增總體積為20uL，10 XPCR buffer (含 mg2+)2. OuL，10mmol/L dNTP 0. 4uL，2. 5U/uLTaqDNA 聚合酶 0. 3uL，IOu mol/L 特 異 PCR擴增引物 ACACACACACACACACCTT 2uL，基因組 DNA IuL, ddH20 14. 3uL ;PCR 反應條件 94°C 3min ；94°C 45sec，51°C 45sec，72°C 90sec，38 個循環(huán) 72°C 7min。(4)電泳檢測取上述PCR擴增產(chǎn)物2uL，與IuL上樣緩沖液混勻，點樣于1 %的瓊 脂糖凝膠上，于1 X TBE緩沖液中，8V/cm電壓下電泳，電泳結(jié)束后，用EB染色，然后在凝膠成 像儀上照相，此時可見550bp大小的特異片段，而其他普通春蘭均未見特異性片段。(5)對9個春蘭品種進行ISSR擴增，其中3個普通品種，6個梅瓣品種。6個梅瓣品種均能擴增出專一的ISSR標記。 上述實施例僅用于解釋說明本發(fā)明的發(fā)明構(gòu)思，而非對本發(fā)明權(quán)利保護的限定， 凡利用此構(gòu)思對本發(fā)明進行非實質(zhì)性的改動，均應落入本發(fā)明的保護范圍。
權(quán)利要求
一種春蘭梅瓣品種的分子特異標記，其特征在于采用特異性ISSR PCR擴增引物對春蘭普通品種與梅瓣基因進行擴增，得到大小為550bp的DNA片段即為所述的分子特異標記。
2.如權(quán)利要求1所述的一種春蘭梅瓣品種的分子特異標記的獲得方法，其特征在于包 括如下步驟(1)春蘭梅瓣品種的資源收集和基因組DNA的提??；(2)春蘭梅瓣品種的特異PCR擴增引物的獲得，采用ISSR-PCR技術(shù)，經(jīng)過大量的篩選試 驗，獲得特異PCR擴增引物為ACACACACACACACACCTT ；(3)ISSR分子標記的PCR擴增產(chǎn)物的獲得擴增總體積為20uL，IOXPCR buffer (含 mg2+) 2. OuL, 10mmol/L dNTP 0. 4uL, 2. 5U/uLTaqDNA 聚合酶 0. 3uL, IOu mol/L 特異 PCR 擴增 引物 ACACACACACACACACCTT 2uL，基因組DNA luL，ddH20 14. 3uL ;PCR 反應條件94°C 3min ; 94°C 45sec，51°C 45sec，72°C 90sec,38 個循環(huán)；72°C 7min ；(4)電泳檢測取上述PCR擴增產(chǎn)物2uL，與IuL上樣緩沖液混勻，點樣于1%的瓊脂糖 凝膠上，于1 X TBE緩沖液中，8V/cm電壓下電泳，電泳結(jié)束后，用EB染色，然后在凝膠成像儀 上照相，此時可見550bp大小的特異片段，而其他普通春蘭均未見特異性片段。
3.如權(quán)利要求2所述的一種春蘭梅瓣品種的分子特異標記的獲得方法，其特征在于 所述步驟(1)中，用改良的CTAB法提取基因組DNA，DNA稀釋至20ng/uL，_20°C冰箱貯藏備 用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種春蘭梅瓣品種的分子特異標記及其獲得方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。春蘭梅瓣的分子標記DNA片段大小為550kp，特異性PCR擴增引物序列為ACACACACACACACACCTT。方法包括步驟梅瓣春蘭資源的收集，基因組DNA的提取；特異PCR擴增引物的獲得；ISSR-PCR擴增產(chǎn)物的獲得；電泳檢測。本發(fā)明的分子特異標記可應用于梅瓣春蘭的快速鑒定。
文檔編號C12Q1/68GK101955933SQ201010502030
公開日2011年1月26日 申請日期2010年10月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月1日
發(fā)明者孫葉芳, 林國梅, 趙虎, 邢海, 鄭琪, 黃岳夫 申請人:鄭琪;孫葉芳;趙虎;黃岳夫;林國梅;邢海