專利名稱：基于量子點熒光原位雜交的海綿細(xì)胞內(nèi)共生細(xì)菌的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種細(xì)菌檢測技術(shù)領(lǐng)域的方法，具體是一種基于量子點熒光原位 雜交的海綿細(xì)胞內(nèi)共生細(xì)菌的檢測方法。
背景技術(shù)：
作為最古老的后生動物，海綿具有獨特的腔狀結(jié)構(gòu)，以濾食海水中的微生物為生， 體內(nèi)聚集了大量的共生微生物，一般可以達(dá)到海綿體積40%以上。許多證據(jù)表明，海綿來源 的藥用天然產(chǎn)物可能是其共生微生物產(chǎn)生的，海綿共生微生物也因此成為了海洋藥物研發(fā) 的重點之一。對這些微生物的多樣性進(jìn)行分析，鑒定出具有宿主特異性的微生物是開發(fā)利 用海綿共附生微生物資源的前提。熒光原位雜交技術(shù)是一種不依賴于培養(yǎng)和DNA提取的方 法在一定條件下，使熒光染料標(biāo)記的寡核苷酸探針與靶標(biāo)DNA的結(jié)合，通過熒光顯微鏡觀 察拍照，其結(jié)果可以直接展示微生物在原位條件下的分布、種類和相對豐度。熒光原位雜交 技術(shù)在海綿共生微生物的研究當(dāng)中有成功應(yīng)用的案例，但很多時候，海綿強(qiáng)烈、廣譜的自發(fā) 熒光會干擾、甚至掩蓋探針的信號，使檢測失敗。因此，迫切需要開發(fā)一種新的方法可以繞 過海綿自發(fā)熒光的障礙，使得熒光原位雜交技術(shù)能夠應(yīng)用廣泛應(yīng)用于海綿共生微生物的研 允。量子點技術(shù)是近幾年來新興的熒光標(biāo)記技術(shù)。其本身是一種納米級的半導(dǎo)體 顆粒，可被激發(fā)出穩(wěn)定、強(qiáng)烈的熒光。且熒光的顏色隨著其自身半徑的不同也不同，在 腫瘤檢測等方面已經(jīng)有了成功的應(yīng)用。經(jīng)過對現(xiàn)有技術(shù)的檢索發(fā)現(xiàn)，中國專利申請?zhí)?200510020089. 9，記載了一種“穩(wěn)定標(biāo)記肝癌細(xì)胞的方法”，該技術(shù)與傳統(tǒng)的熒光染料相比， 量子點的熒光譜更加豐富，不易粹滅。但是該現(xiàn)有技術(shù)的檢測往往依賴抗原抗體反應(yīng)，對于 成分復(fù)雜、抗原性低、檢測對象含量低的環(huán)境樣品(海洋生物、地質(zhì)樣品)來說，抗原抗體 反應(yīng)難以達(dá)到要求。因此，需要選擇新的檢測方法。目前應(yīng)用較多的DNA分子雜交技術(shù)是 較為理想的標(biāo)記環(huán)境樣品的方法，用熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針在一定條件下與目標(biāo)DNA結(jié) 合，實現(xiàn)復(fù)雜環(huán)境樣品中微量DNA的檢測。因此，如果能用量子點標(biāo)記寡核苷酸探針進(jìn)行檢 測，則可以利用其豐富的激發(fā)光譜和極高的靈敏度實現(xiàn)海綿細(xì)胞內(nèi)共生細(xì)菌的檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提供一種基于量子點熒光原位雜交的海綿 細(xì)胞內(nèi)共生細(xì)菌的檢測方法，將機(jī)械法與化學(xué)法相結(jié)合，可以快速獲取海綿細(xì)胞，量子點發(fā) 光技術(shù)可以避免海綿細(xì)胞自發(fā)熒光的干擾，成功探測到海綿細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的，獲取海綿單細(xì)胞，按照經(jīng)典的熒光原位雜交 方法，采用生物素標(biāo)記的寡核苷酸探針與海綿單細(xì)胞內(nèi)的微生物基因組DNA進(jìn)行雜交，最 后采用鏈親和素標(biāo)記的量子點進(jìn)行孵育處理，得到在激發(fā)光為紫外區(qū)的熒光顯微鏡下呈現(xiàn) 藍(lán)色的海綿細(xì)胞以及呈現(xiàn)紅色的細(xì)菌。
所述的獲取海綿單細(xì)胞是指1)將海綿組織解離于無鈣鎂人工海水中得到海綿細(xì)胞粗懸液；2)收集海綿細(xì)胞粗懸液中的沉淀經(jīng)離心處理后得到海綿細(xì)胞，經(jīng)固定脫水處理得 到海綿單細(xì)胞。所述的海綿組織是指體積不超過0. 5cm3的海綿組織；所述的無鈣鎂人工海水與海綿組織的體積比為1 15-20，IlOrpm ；所述的無鈣鎂人工海水的組分及含量為31. 6g/L NaCl、0. 75g/L KClU.0g/L Na2SO4,2. 4g/LTris/HCl、0. 02g/L NaHCO3,7. 2g/L EDTA，余量為去離子水，該無鈣鎂人工海 水的PH為7.6 ；所述的解離是指將海綿組織在20°C以下環(huán)境振蕩、洗滌40min-60min后于200 目的不銹鋼細(xì)胞篩網(wǎng)上摩擦進(jìn)行機(jī)械解離，同時用20-25倍于海綿體積的無鈣鎂人工海水 沖洗，沖洗液轉(zhuǎn)入錐形瓶中IlOrpm ；所述的離心處理是指對海綿細(xì)胞粗懸液中的沉淀采用300g離心處理5min后用 無鈣鎂人工海水洗滌三次，再次以300g離心處理5min獲得包含海綿細(xì)胞內(nèi)內(nèi)共生微生物 的海綿細(xì)胞；所述的固定脫水處理是指對海綿細(xì)胞采用20倍體積，4%濃度的多聚甲醛溶液 進(jìn)行固定，然后制備細(xì)胞涂片并分別置于75%、85%、100%的乙醇中脫水風(fēng)干。所述的生物素標(biāo)記的寡核苷酸探針是指細(xì)菌通用寡核苷酸探針 EUB338-5' GCTGCCTCCCGTAGGAGT 3' -Biotin 儲液所述的雜交是指采用生物素標(biāo)記的寡核苷酸探針與雜交緩沖液混合后滴加于固 定脫水處理后的海綿單細(xì)胞上，在43°C環(huán)境下雜交4-5h，經(jīng)洗滌預(yù)熱后在48°C環(huán)境下進(jìn)行 第一次孵育20min，再經(jīng)二次預(yù)熱后滴加量子點雜交緩沖液，并在37°C環(huán)境下進(jìn)行第二次 孵育20min。所述的寡核苷酸探針與雜交緩沖液的用量比例為體積比1 20;所述的雜交緩沖液的組分及含量為NaCl 900mM、Tris/HCl 20mM、SDS 0. 01% wt, 甲酰胺31 % wt，該雜交緩沖液的pH為7. 4。所述的洗滌是指雜交完成后，傾去殘留的探針雜交液，滴加預(yù)熱至48°C的雜交 后洗液；所述的雜交后洗液的組分及含量為NaCl IlOmM, Tris/HCl 20mM、EDTA 5mM、 0.01% WtSDS，該雜交后洗液的PH為7. 4。所述的二次預(yù)熱是指用37°C的TBS緩沖液洗滌兩次，每次5min ；所述的TBS緩沖液的組分及含量為NaCl 0.8%,KCl 0. 02%,Tris/HCl 0.3%，該 TBS緩沖液的pH為7.4。所述的孵育處理是指在37°C以下孵育30min，孵育完畢后用TBS溶液洗滌四次；所述的用TBS溶液洗滌四次是指用含有0. 05%吐溫-20的TBS溶液在37°C環(huán)境 下洗滌四次，每次5min。按照本發(fā)明方法可以快速獲取海綿細(xì)胞，避免海綿細(xì)胞自發(fā)熒光的干擾，成功探 測到海綿細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌，為海綿共生微生物多樣性與功能的研究提供了新的視角。


圖1為實施例中Holoxea sp.海綿細(xì)胞內(nèi)共生細(xì)菌的檢測結(jié)果。
具體實施例方式下面對本發(fā)明的實施例作詳細(xì)說明，本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行 實施，給出了詳細(xì)的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實施 例。實施例1本實施例具體實施步驟如下1、海綿細(xì)胞分離(1)以下操作都在無菌條件下進(jìn)行。海綿組織(l_2g)于4°C解凍后切成不大于 0.5cm3 的小塊。加入盛有 15-20 倍體積人工海水(1. Ig CaCl2,10. 2g MgCl2 · 6H20，31. 6g NaCl，0. 75gKCl，1. Og Na2SO4, 2. 4g Tris/HCl，0. 02g NaHCO3, IL 去離子水，pH 7.6)的錐形 瓶中，110rpm，20°C溫和振蕩 40min_60min。(2)將上一步中洗滌后的海綿小塊于200目的不銹鋼細(xì)胞篩網(wǎng)上輕輕摩擦進(jìn)行機(jī) 械解離，讓海綿小塊變成蓉狀，同時用20-25倍體積無鈣鎂人工海水(31. 6g NaCl,0. 75g KCl, 1. OgNa2SO4, 2. 4g Tris/HCl, 0. 02g NaHCO3, 7. 2g EDTA，IL 去離子水，pH 7.6)沖洗，轉(zhuǎn) 入錐形瓶中110rpm，20°C振蕩、解離40min-60min，得到海綿細(xì)胞的粗懸液。粗懸液經(jīng)300g， 5min離心后分別收集沉淀和上清，并用無鈣鎂人工海水洗滌沉淀(重懸一300g, 5min —收 集沉淀和上清)三次。操作時注意輕緩，避免對海綿細(xì)胞產(chǎn)生損傷。300g離心獲得的沉淀 為海綿細(xì)胞，其中包含海綿細(xì)胞內(nèi)內(nèi)共生微生物。2、海綿細(xì)胞固定、脫水對獲得的海綿細(xì)胞取10-20 μ L涂片，風(fēng)干后采用卡諾氏 固定液(60%乙醇、30%氯仿、10%冰醋酸混合而成)進(jìn)行室溫固定30分鐘。風(fēng)干后分別在 75%、85%、100%的乙醇中各浸泡3分鐘，風(fēng)干。待雜交用。3、寡核苷酸探針雜交將生物素標(biāo)記的細(xì)菌通用寡核苷酸探針 EUB338 (5 ‘ GCTGCCTCCCGTAGGAGT 3 ‘ -Biotin)用雙蒸水配成 50ng/ μ L 的儲液，取 5 μ L 與 100 μ L 雜交緩沖液(NaCl 900mM, Tris/HCl 20mM, SDS 0. 01 %，甲酰胺 31 %，pH 7. 4)混合， 滴加于涂片區(qū)域。置于濕盒中，將雜交爐溫度設(shè)為43°C，雜交4-5h。雜交完成后，傾去殘留 的探針雜交液，滴加100 μ L預(yù)熱至48°C的雜交后洗液(NaCl IlOmM, Tris/HCl 20mM, EDTA 5mM,0.01% SDS, pH 7. 4)，48°C孵育20min。洗滌完畢后傾去雜交后洗液。用預(yù)熱至37°C 的 TBS 緩沖液(NaCl 0. 8%, KCl 0. 02%, Tris/HCl 0. 3%, pH 7. 4)洗滌 5min，重復(fù)一次。 滴加量子點雜交緩沖液100 μ L，37°C孵育20min。4、量子點標(biāo)記用量子點雜交緩沖液將量子點-鏈親和素復(fù)合物稀釋100倍，取 ^^口！^商加于雜交區(qū)域力了！孵育〗。!^!!。孵育完畢，傾去殘留的量子點雜交液，用含有 0. 05%吐溫-20的TBS溶液37°C洗滌5min，重復(fù)一次。再用預(yù)熱至37°C的TBS溶液洗滌 5min，重復(fù)一次。風(fēng)干后加蓋蓋玻片。所述的量子點雜交緩沖液由武漢珈源量子點技術(shù)開發(fā)有限公司的量子點熒光原 位雜交試劑盒提供(產(chǎn)品號Κ-5002-1)。所述的鏈親和素標(biāo)記的量子點是指量子點雜交緩沖液將量子點_鏈親和素復(fù)合
5物稀釋100倍，其中量子點-鏈親和素復(fù)合物由武漢珈源量子點技術(shù)開發(fā)有限公司的量子 點熒光原位雜交試劑盒提供(產(chǎn)品號Κ-5002-1)。5、熒光顯微鏡觀察結(jié)果如圖1所示，激發(fā)光波長選擇紫外區(qū)，海綿細(xì)胞顯示藍(lán) 色，量子點雜交信號(紅色)顯示細(xì)菌雜交信號的存在。細(xì)菌含量較高時紅色熒光會覆蓋 海綿細(xì)胞的藍(lán)色熒光。實施例2本實施例具體實施步驟如下1、海綿細(xì)胞分離(1)以下操作都在無菌條件下進(jìn)行。海綿組織(l_2g)于4°C解凍后切成不大于 0.5cm3 的小塊。加入盛有 15-20 倍體積人工海水(1. Ig CaCl2,10. 2g MgCl2 · 6H20，31. 6g NaCl，0. 75gKCl，1. Og Na2SO4, 2. 4g Tris/HCl，0. 02g NaHCO3, IL 去離子水，pH 7.6)的錐形 瓶中，110rpm，20°C溫和振蕩 40min_60min。(2)將上一步中洗滌后的海綿小塊于200目的不銹鋼細(xì)胞篩網(wǎng)上輕輕摩擦進(jìn)行機(jī) 械解離，讓海綿小塊變成蓉狀，同時用20-25倍體積無鈣鎂人工海水(31. 6g NaCl,0. 75g KCl, 1. OgNa2SO4, 2. 4g Tris/HCl, 0. 02g NaHCO3, 7. 2g EDTA，IL 去離子水，pH 7.6)沖洗，轉(zhuǎn) 入錐形瓶中110rpm，20°C振蕩、解離40min-60min，得到海綿細(xì)胞的粗懸液。粗懸液經(jīng)300g， 5min離心后分別收集沉淀和上清，并用無鈣鎂人工海水洗滌沉淀(重懸一300g, 5min —收 集沉淀和上清)三次。操作時注意輕緩，避免對海綿細(xì)胞產(chǎn)生損傷。300g離心獲得的沉淀 為海綿細(xì)胞，其中包含海綿細(xì)胞內(nèi)內(nèi)共生微生物。2、海綿細(xì)胞固定、脫水對獲得的海綿細(xì)胞采用20倍體積，4%的多聚甲醛溶液懸 浮，4°C浸泡過夜。固定完成的細(xì)胞取10-20 μ L涂片，風(fēng)干后分別在75%、85%、100%的乙 醇中各浸泡3分鐘，風(fēng)干。待雜交用。3、寡核苷酸探針雜交將生物素標(biāo)記的細(xì)菌通用寡核苷酸探針 EUB338 (5 ‘ GCTGCCTCCCGTAGGAGT 3 ‘ -Biotin)用雙蒸水配成 50ng/ μ L 的儲液，取 5 μ L 與 100 μ L 雜交緩沖液(NaCl 900mM, Tris/HCl 20mM, SDS 0. 01 %，甲酰胺 31 %，pH 7. 4)混合， 滴加于涂片區(qū)域。置于濕盒中，將雜交爐溫度設(shè)為43°C，雜交4-5h。雜交完成后，傾去殘留 的探針雜交液，滴加100 μ L預(yù)熱至48°C的雜交后洗液(NaCl IlOmM, Tris/HCl 20mM, EDTA 5mM,0.01% SDS, pH 7. 4)，48°C孵育20min。洗滌完畢后傾去雜交后洗液。用預(yù)熱至37°C 的 TBS 緩沖液(NaCl 0. 8%, KCl 0. 02%, Tris/HCl 0. 3%, pH 7. 4)洗滌 5min，重復(fù)一次。 滴加量子點雜交緩沖液100 μ L，37°C孵育20min。4、量子點標(biāo)記用量子點雜交緩沖液將量子點-鏈親和素復(fù)合物稀釋100倍，取 ^^口！^商加于雜交區(qū)域力了！孵育〗。!^!!。孵育完畢，傾去殘留的量子點雜交液，用含有 0. 05%吐溫-20的TBS溶液37°C洗滌5min，重復(fù)一次。再用預(yù)熱至37°C的TBS溶液洗滌 5min，重復(fù)一次。風(fēng)干后加蓋蓋玻片。所述的量子點雜交緩沖液由武漢珈源量子點技術(shù)開發(fā)有限公司的量子點熒光原 位雜交試劑盒提供(產(chǎn)品號Κ-5002-1)。所述的鏈親和素標(biāo)記的量子點是指量子點雜交緩沖液將量子點_鏈親和素復(fù)合 物稀釋100倍，其中量子點-鏈親和素復(fù)合物由武漢珈源量子點技術(shù)開發(fā)有限公司的量子 點熒光原位雜交試劑盒提供(產(chǎn)品號Κ-5002-1)。
5、熒光顯微鏡觀察結(jié)果檢測結(jié)果為陰性?？赡艿脑蚴嵌嗑奂兹┳鳛榻宦?lián)型的 固定劑使得微生物細(xì)胞壁變得更加緊實，無法讓探針透過。與成功的實施例1相比，卡諾氏 固定液更適合于以微生物檢測為目的細(xì)胞固定。在接下來的實施例3中，將討論雜交溫度 對量子點熒光原位雜交實驗的影響。實施例3本實施例具體實施步驟如下1、海綿細(xì)胞分離(1)以下操作都在無菌條件下進(jìn)行。海綿組織(l_2g)于4°C解凍后切成不大于 0.5cm3 的小塊。加入盛有 15-20 倍體積人工海水(1. Ig CaCl2,10. 2g MgCl2 · 6H20，31. 6g NaCl，0. 75gKCl，1. Og Na2SO4, 2. 4g Tris/HCl，0. 02g NaHCO3, IL 去離子水，pH 7.6)的錐形 瓶中，110rpm，20°C溫和振蕩 40min_60min。(2)將上一步中洗滌后的海綿小塊于200目的不銹鋼細(xì)胞篩網(wǎng)上輕輕摩擦進(jìn)行機(jī) 械解離，讓海綿小塊變成蓉狀，同時用20-25倍體積無鈣鎂人工海水(31. 6g NaCl,0. 75g KCl, 1. OgNa2SO4, 2. 4g Tris/HCl, 0. 02g NaHCO3, 7. 2g EDTA，IL 去離子水，pH 7.6)沖洗，轉(zhuǎn) 入錐形瓶中110rpm，20°C振蕩、解離40min-60min，得到海綿細(xì)胞的粗懸液。粗懸液經(jīng)300g， 5min離心后分別收集沉淀和上清，并用無鈣鎂人工海水洗滌沉淀(重懸一300g, 5min —收 集沉淀和上清)三次。操作時注意輕緩，避免對海綿細(xì)胞產(chǎn)生損傷。300g離心獲得的沉淀 為海綿細(xì)胞，其中包含海綿細(xì)胞內(nèi)內(nèi)共生微生物。2、海綿細(xì)胞固定、脫水對獲得的海綿細(xì)胞取10-20 μ L涂片，風(fēng)干后采用卡諾氏 固定液(60%乙醇、30%氯仿、10%冰醋酸混合而成)進(jìn)行室溫固定30分鐘。風(fēng)干后分別在 75%、85%、100%的乙醇中各浸泡3分鐘，風(fēng)干。待雜交用。3、寡核苷酸探針雜交將生物素標(biāo)記的細(xì)菌通用寡核苷酸探針 EUB338 (5 ‘ GCTGCCTCCCGTAGGAGT 3 ‘ -Biotin)用雙蒸水配成 50ng/ μ L 的儲液，取 5 μ L 與 100 μ L 雜交緩沖液(NaCl 900mM, Tris/HCl 20mM, SDS 0. 01 %，甲酰胺 31 %，pH 7. 4)混合， 滴加于涂片區(qū)域。置于濕盒中，將雜交爐溫度設(shè)為46°C，雜交4-5h。雜交完成后，傾去殘留 的探針雜交液，滴加100 μ L預(yù)熱至48°C的雜交后洗液(NaCl IlOmM, Tris/HCl 20mM, EDTA 5mM,0.01% SDS, pH 7. 4)，48°C孵育20min。洗滌完畢后傾去雜交后洗液。用預(yù)熱至37°C 的 TBS 緩沖液(NaCl 0. 8%, KCl 0. 02%, Tris/HCl 0. 3%, pH 7. 4)洗滌 5min，重復(fù)一次。 滴加量子點雜交緩沖液100 μ L，37°C孵育20min。4、量子點標(biāo)記用量子點雜交緩沖液將量子點-鏈親和素復(fù)合物稀釋100倍，取 ^^口！^商加于雜交區(qū)域力了！孵育〗。!^!!。孵育完畢，傾去殘留的量子點雜交液，用含有 0. 05%吐溫-20的TBS溶液37°C洗滌5min，重復(fù)一次。再用預(yù)熱至37°C的TBS溶液洗滌 5min，重復(fù)一次。風(fēng)干后加蓋蓋玻片。所述的量子點雜交緩沖液由武漢珈源量子點技術(shù)開發(fā)有限公司的量子點熒光原 位雜交試劑盒提供(產(chǎn)品號Κ-5002-1)。所述的鏈親和素標(biāo)記的量子點是指量子點雜交緩沖液將量子點_鏈親和素復(fù)合 物稀釋100倍，其中量子點-鏈親和素復(fù)合物由武漢珈源量子點技術(shù)開發(fā)有限公司的量子 點熒光原位雜交試劑盒提供(產(chǎn)品號Κ-5002-1)。5、熒光顯微鏡觀察結(jié)果檢測結(jié)果為陰性。為了提高探針檢測的特異性，在本實施例中，雜交溫度提高到46°C，但并未得到陽性結(jié)果。分析原因，可能是之前文獻(xiàn)報道的46°C 這一高特異性溫度只適合純培養(yǎng)微生物檢測，對于環(huán)境樣品并不適合，畢竟，較高的雜交溫 度是以犧牲靈敏度為代價來提高特異性的。 綜合三個實施例，更加確定了海綿細(xì)胞的固定劑是卡諾氏固定液，雜交溫度應(yīng)控 制在43 0C ο
權(quán)利要求
一種基于量子點熒光原位雜交的海綿細(xì)胞內(nèi)共生細(xì)菌的檢測方法，其特征在于，通過獲取海綿單細(xì)胞，按照經(jīng)典的熒光原位雜交方法，采用生物素標(biāo)記的寡核苷酸探針對海綿單細(xì)胞內(nèi)的微生物基因組DNA進(jìn)行雜交，最后采用鏈親和素標(biāo)記的量子點進(jìn)行孵育處理，得到在激發(fā)光為紫外區(qū)的熒光顯微鏡下呈現(xiàn)藍(lán)色的海綿細(xì)胞以及呈現(xiàn)紅色的細(xì)菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于量子點熒光原位雜交的海綿細(xì)胞內(nèi)共生細(xì)菌的檢測方 法，其特征是，所述的獲取海綿單細(xì)胞是指1)將海綿組織解離于無鈣鎂人工海水中得到海綿細(xì)胞粗懸液；2)收集海綿細(xì)胞粗懸液中的沉淀經(jīng)離心處理后得到海綿細(xì)胞，經(jīng)固定脫水處理得到海 綿單細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于量子點熒光原位雜交的海綿細(xì)胞內(nèi)共生細(xì)菌的檢測方 法，其特征是，所述的無鈣鎂人工海水的組分及含量為31. 6g/L NaCl,0. 75g/L KClU.0g/L Na2SO4,2. 4g/L Tris/HCl、0. 02g/L NaHCO3,7. 2g/L EDTA，余量為去離子水，該無鈣鎂人工海 水的PH為7. 6。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于量子點熒光原位雜交的海綿細(xì)胞內(nèi)共生細(xì)菌的檢測方 法，其特征是，所述的解離是指將海綿組織在20°C以下環(huán)境振蕩、洗滌40min-60min后于 200目的不銹鋼細(xì)胞篩網(wǎng)上摩擦進(jìn)行機(jī)械解離，同時用20-25倍于海綿體積的無鈣鎂人工 海水沖洗，沖洗液轉(zhuǎn)入錐形瓶中l(wèi)lOrpm。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于量子點熒光原位雜交的海綿細(xì)胞內(nèi)共生細(xì)菌的檢測方 法，其特征是，所述的離心處理是指對海綿細(xì)胞粗懸液中的沉淀采用300g離心處理5min 后用無鈣鎂人工海水洗滌三次，再次以300g離心處理5min獲得包含海綿細(xì)胞內(nèi)內(nèi)共生微 生物的海綿細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于量子點熒光原位雜交的海綿細(xì)胞內(nèi)共生細(xì)菌的檢測方 法，其特征是，所述的固定脫水處理是指對海綿細(xì)胞采用20倍體積，4%濃度的多聚甲醛 溶液進(jìn)行固定，然后制備細(xì)胞涂片并分別置于75%、85%、100%的乙醇中脫水風(fēng)干。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于量子點熒光原位雜交的海綿細(xì)胞內(nèi)共生細(xì)菌的檢測方 法，其特征是，所述的雜交是指采用生物素標(biāo)記的寡核苷酸探針與雜交緩沖液混合后滴加 于固定脫水處理后的海綿單細(xì)胞上，在43°C環(huán)境下雜交4-5h，經(jīng)洗滌預(yù)熱后在48°C環(huán)境下 進(jìn)行第一次孵育20min，再經(jīng)二次預(yù)熱后滴加量子點雜交緩沖液，并在37°C環(huán)境下進(jìn)行第 二次孵育20min。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于量子點熒光原位雜交的海綿細(xì)胞內(nèi)共生細(xì)菌的檢測方 法，其特征是，所述的孵育處理是指在37°C以下孵育30min，孵育完畢后用TBS溶液洗滌四 次。
全文摘要
一種細(xì)菌檢測技術(shù)領(lǐng)域的基于量子點熒光原位雜交的海綿細(xì)胞內(nèi)共生細(xì)菌的檢測方法，通過獲取海綿單細(xì)胞，按照經(jīng)典的熒光原位雜交方法，采用生物素標(biāo)記的寡核苷酸探針對海綿單細(xì)胞內(nèi)的微生物基因組DNA進(jìn)行雜交，最后采用鏈親和素標(biāo)記的量子點進(jìn)行孵育處理，得到在激發(fā)光為紫外區(qū)的熒光顯微鏡下呈現(xiàn)藍(lán)色的海綿細(xì)胞以及呈現(xiàn)紅色的細(xì)菌。本發(fā)明將機(jī)械法與化學(xué)法相結(jié)合，可以快速獲取海綿細(xì)胞，避免海綿細(xì)胞自發(fā)熒光的干擾，成功探測到海綿細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌。
文檔編號C12Q1/04GK101974626SQ20101050305
公開日2011年2月16日 申請日期2010年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月12日
發(fā)明者劉放, 張風(fēng)麗, 李志勇, 楊振亞, 韓敏奇 申請人:上海交通大學(xué)