專利名稱：雞低氧適應(yīng)性分子遺傳標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于雞遺傳(分子)標(biāo)記輔助選擇技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種雞低氧適應(yīng)的 遺傳標(biāo)記及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
藏雞是我國(guó)青藏高原特有的原始小型地方雞種，是世界上適應(yīng)高原時(shí)間最長(zhǎng)、適 應(yīng)能力最強(qiáng)的家雞品種，已首批列入我國(guó)受保護(hù)的畜禽品種資源名錄。與低地雞種相比，藏 雞的遺傳基礎(chǔ)頗具特色，即使將其引進(jìn)到低海拔地區(qū)飼養(yǎng)和繁殖數(shù)代后，種蛋在高海拔孵 化性能仍遠(yuǎn)高于低地雞(張浩，吳常信，強(qiáng)巴央宗，馬雪英，唐曉惠，普布.高海拔孵化雞胚 死亡曲線分析.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，10 (4) 109-114)。低地雞在模擬4000m以上高海 拔條件下孵化時(shí)，孵化率接近零(Visschedijk A H J. Effects of barometric pressure and abnormal gasmixtures on gaseous exchange by the avian embryo. Am. Zool,1980, 20 =469-476)。13. 0%氧濃度模擬孵化結(jié)果顯示，藏雞孵化率能達(dá)到35. 0%，而低地雞品種 (壽光雞，隱性白羽肉雞)只有3.0% (張浩等.小型蛋雞及其雜交種蛋高海拔孵化性能研 究.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006,39:1507-1510)。這說明藏雞在長(zhǎng)期適應(yīng)高海拔低氧環(huán)境的過程 中，機(jī)體從遺傳基礎(chǔ)上啟動(dòng)或加速了許多基因的活動(dòng)，調(diào)整了氧氣運(yùn)輸功能和能量代謝，在 體內(nèi)合成并貯存了一系列抵抗低氧的活性物質(zhì)，是研究低氧分子機(jī)制的絕好模型。很久以來低氧適應(yīng)一直是國(guó)內(nèi)外生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的重要熱點(diǎn)之一，但至今人 們對(duì)高原動(dòng)物(包括人)的低氧適應(yīng)分子遺傳機(jī)理還很不清楚。研究者曾關(guān)注血紅蛋白 Ιδ ^^Φ WiSjSti^'b (Monge, C and Leon-Velarde F. Physiological adaptation to highaltitude :oxygen transport in mammals and birds.Physiol Rev,1991, 71 (4) :1135-1172)，發(fā)現(xiàn)了一些高山動(dòng)物的特異突變(Lutfullah G, Ali SA, and Abbasi AA. Molecular mechanism of high altitude respiration :primary structure of a minor hemoglobin component from Tufted duck(Aythya fuligula, Anseriformes). Biochem Bioph Res Co, 2005,326 (1) 123-130. Gou X, Li N, Lian L, Yan D, Zhang H, Wei Z, and Wu C. Hypoxic adaptation of hemoglobin in Tibetan chick embryo Highoxygen-affinity mutation and selective expression. Comp BiochemPhysiol, B, 2007，147 (2) :147-155)，但近年來的研究表明低氧適應(yīng)最重要的生理機(jī)制是血管因子調(diào)節(jié) 的血液流動(dòng)(Erzurum SCiFhosh S，Janocha AJjXu W, Bauer S，Bryan NS, Tejero J，Hemann CiHille R，Strehr DJiFeelisch M，and Beall CM. Higher blood flow and circulatingNO products offset high-altitude hypoxia among Tibetans.PNAS,2007，104 (45) 17593-17598)。NO是重要的血管因子，具有調(diào)節(jié)血流和血管阻力的作用(Williams幾， Cartland D， Hussain A， Egginton S.Adifferential role for nitric oxide in two forms of physiologicalangiogenesis in mouse. J Physiol，2006，570 (3) :445_454)。在 低氧的誘導(dǎo)下，動(dòng)物產(chǎn)生NO增加，活化含血紅素的鳥苷酸環(huán)化酶，使血管平滑肌和血小板 中的cGMP水平增加，促進(jìn)血管平滑肌松弛(Garthwaite J, Charles Si, Chess-Williams2/6頁(yè)
R.Endothelium-derivedrelaxing factor release on activation of NMDA receptors suggests as intercellar message in brain. Natrue, 1988,336 :385),維持組織毛細(xì)血管 持久性擴(kuò)張，減小外周阻力，加速血液循環(huán)，改善組織獲氧能力。高原藏族人(Erzurum SC, Fhosh S，Janocha AJ,Xu W,Bauer S，Bryan NS，Tejero J，Hemann C，Hille R，Strehr DJ, Feelisch M，and Beall CM. Higher blood flow and circulating NO products offset high-altitudehypoxia among Tibetans. PNAS，2007，104 (45) :17593_17598)、高原印地安 A (Beall CM. Tibetan and Andean patterns of adaptation tohigh-altitude hypoxia. Hum Biol，2000，72(l) :201_28)、高原鼠兔(吳天一.我國(guó)高原醫(yī)學(xué)研究進(jìn)展，高原醫(yī)學(xué)雜 志，2005，15(1) :1_8)、藏綿羊(Koizumi T，Ruan Z，Sakai A，Ishizaki T，Matsumoto T， Saitou M，Matauzaki T，Kubo K，Wang Z，Chen Q，Wang X. Contribution of nitricoxide to adaptation of Tibetan sheep to high altitude. Respir PhysiolNeurobiol, 2004, 140(2) 189-196)等高山本土動(dòng)物的體內(nèi)有較高的NO產(chǎn)生量，有利于動(dòng)物對(duì)高原低氧環(huán)境 的適應(yīng)。NO在體內(nèi)由一氧化氮合酶(NOS)催化產(chǎn)生，NOS有3種同功酶，其中誘導(dǎo) 型NOS(iNOS)受低氧誘導(dǎo)因子I(HIF-I)誘導(dǎo)表達(dá)，發(fā)揮擴(kuò)張血管的作用(Smenza GL. Surviving ischemia adaptiveresponses mediated by hypoxia-inducible factor. J Clin Invest, 2000,106(7) :809_812)。Lin 等克隆 了雞巨噬細(xì)胞 iNOS 基因的 cDNA， 長(zhǎng)約 4. 5kb，編碼 1136 個(gè) AA(Lin AW, Chang CC, McCormick CC. Molecularcloning and expression of an avian macrophage nitric-oxide synthasecDNA and the analysis of the genomic 5' -flanking region. J Biol Chem，1996，271 (20) :11911_11919)。本發(fā)明 提供了藏雞iNOS基因SNP分子遺傳標(biāo)記與其高原低氧適應(yīng)的關(guān)系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一個(gè)雞低氧適應(yīng)性相關(guān)聯(lián)的分子遺傳標(biāo)記，通過該遺傳標(biāo) 記可以預(yù)測(cè)雞的低氧適應(yīng)性，從而用于雞的輔助育種。本發(fā)明是通過下列技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)雞低氧適應(yīng)性分子遺傳標(biāo)記，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNo. 1所示，該序列位 于雞iNOS基因的5，側(cè)翼序列，第70bp處有1個(gè)A70-C70的堿基突變，記為A70C，導(dǎo)致Bsm I-RFLP多態(tài)性。研究表明，A70C突變與低氧適應(yīng)性相關(guān)聯(lián)，CC型突變表現(xiàn)出更高的低氧適 應(yīng)性。應(yīng)理解，任何包含SEQ ID No. 1序列中A70C位點(diǎn)的特異性序列，都可以用于檢測(cè)低 氧適應(yīng)性，從而本發(fā)明分子遺傳標(biāo)記還包括SEQ ID No. 1中至少包含第70位堿基的特異性 片段。本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易根據(jù)本發(fā)明的分子遺傳標(biāo)記設(shè)計(jì)出用于擴(kuò)增該分子標(biāo)記 的引物或鑒定所述分子標(biāo)記的探針，從而用于該遺傳標(biāo)記的檢測(cè)，例如通過PCR擴(kuò)增得到 所述遺傳標(biāo)記，再通過克隆測(cè)序得到相應(yīng)的序列，或者通過Bsm I-RFLP多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)。因 而，本發(fā)明還包括用于擴(kuò)增所述分子遺傳標(biāo)記的引物或鑒定所述分子遺傳標(biāo)記的探針，以 及含有所述引物或探針的試劑盒。本發(fā)明還提供一種雞低氧適應(yīng)性分子遺傳標(biāo)記方法(PCR-RFLP標(biāo)記)，其用SEQ ID No.2和3所示的引物以樣品雞基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用Bsm I酶切PCR產(chǎn)物，并進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，當(dāng)70bp處的堿基都為A時(shí)，Bsm I識(shí)別該位點(diǎn)，記為AA型 (84bp+68bp，平原型)；當(dāng)70bp處的堿基突變?yōu)镃時(shí)，Bsm I識(shí)別該位點(diǎn)消失，記為CC型 (152bp)；雜合型記為 AC 型(152bp+84bp+68bp)。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種耐低氧雞的選育方法，其通過檢測(cè)樣品雞基因組DNA中的 SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的第70位堿基，篩選出該堿基為C的雞。具體地可以用SEQ ID No. 2和3所示的引物以樣品雞基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化克隆測(cè) 序，來鑒定SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的第70位堿基，或者用Bsm I酶切PCR產(chǎn)物，并進(jìn) 行凝膠電泳檢測(cè)，當(dāng)70bp處的堿基都為A時(shí)，Bsm I識(shí)別該位點(diǎn)，記為AA型(84bp+68bp，平 原型)；當(dāng)70bp處的堿基突變?yōu)镃時(shí)，Bsm I識(shí)別該位點(diǎn)消失，記為CC型(152bp)；雜合型 記為 AC 型(152bp+84bp+68bp)。本發(fā)明分子遺傳標(biāo)記與雞低氧適應(yīng)性相關(guān)聯(lián)，通過該遺傳標(biāo)記可以篩選低氧適應(yīng) 性較強(qiáng)的雞種，從而用于雞的輔助育種。


圖1 雞iNOS基因5，側(cè)翼區(qū)擴(kuò)增結(jié)果；瓊脂糖膠濃度為2%;圖中泳道M為DL2000 Marker ；泳道1_10為低地雞中的擴(kuò)增片段，泳道11_20為藏雞中的擴(kuò)增片段；片段大小均 為 152bp。圖2:雞iNOS基因Bsm I-RFLP檢測(cè)結(jié)果；瓊脂糖膠濃度為4 % ；圖中泳道M為 DL2000 Marker ；泳道1-9為低地雞Bsm I-RFLP電泳結(jié)果，泳道10-18為藏雞Bsm I-RFLP 電泳結(jié)果。AA基因型，84bp和68bp ；AC基因型，152bp、84bp和68bp ；CC基因型，152bp。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離 本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明 的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實(shí)施例1雞iNOS基因片段的獲得及SNP位點(diǎn)篩選選擇高原地方雞品種“藏雞”和低地雞“隱性白羽肉雞”、“壽光雞”、“北京油雞”和 “絲羽烏骨雞”等為試驗(yàn)材料(均購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)種雞場(chǎng))，根據(jù)雞iNOS基因的5’側(cè) 翼序列(GeneBank登錄號(hào):U46503. 1)設(shè)計(jì)以下引物正向引物F 5, ACAACTTTTTAGATGTTTTCAA 3 ‘反向引物R 5 ‘ CTATGTTAAGATTCTCTATGCT 3 ‘用上述引物在藏雞、隱性白肉雞、壽光雞、北京油雞和絲羽烏骨雞基因組DNA進(jìn) 行 PCR 擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)體系為 50 μ L，其中 IOXPCRBuffer 5 μ L, 10mml/L dNTP mix 4μ L, 5pmol/ μ L 的引物各 2 μ L，TaqDNA 聚合酶(5U/ μ L) 1 μ L，DNA 模板 2 μ L (DNA 約 IOOng)，加 dd H2O至50 μ L。PCR反應(yīng)條件為第1步95°C變性5min ；第2步95°C變性30s ；第3步50°C 復(fù)性30s ；第4步72°C延伸Imin ；重復(fù)第2至第4步36個(gè)循環(huán)，之后再72°C延伸7min，最 后降溫至4°C保持。對(duì)上述4個(gè)雞種的PCR產(chǎn)物經(jīng)Gel Extraction Kit試劑盒(購(gòu)自上海生物工程技術(shù)有限公司，按照試劑盒說明書操作)純化、測(cè)序。上述擴(kuò)增片段603bp(SEQ ID No. 6)，序 列經(jīng)DNAMAN軟件進(jìn)行序列比對(duì)，其中位于該片段383處(位于5’側(cè)翼-1422bp處)有A/ C堿基突變(“藏雞”為C，其它雞種為A)，該突變引起B(yǎng)sm I酶切位點(diǎn)(GAATGCN)多態(tài)性。實(shí)施例2雞iNOS基因5，側(cè)翼區(qū)多態(tài)性PCR-RFLP檢測(cè)方法的建立為了快速方便的檢測(cè)雞iNOS基因5’側(cè)翼區(qū)多態(tài)性，針對(duì)實(shí)施例1中發(fā)現(xiàn)的SNP 位點(diǎn)設(shè)計(jì)新的擴(kuò)增引物，引物序列為正向引物F 5 ‘ AACAGAGACCTGAGTTTTCTATA 3 ‘，反向引物R 5, TTCTTACATTTAGGACACTTTCA 3 ‘。用該引物對(duì)藏雞和隱性白羽肉雞、壽光雞、北京油雞、絲羽烏骨雞等基因組DNA進(jìn) 行 PCR 擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)體系為 50 μ L，其中 10XPCR Buffer 5 μ L, 10mml/L dNTP mix 4μ L, 5pmol/ μ L 的引物各 2 μ L，Taq DNA 聚合酶(5U/ μ L) 1 μ L, DNA 模板 2 μ L (DNA 約 IOOng)， 加dd H2O至50 μ L。PCR反應(yīng)條件為第1步95°C變性5min ；第2步95°C變性30s ；第3步 50°C復(fù)性30s ；第4步72°C延伸30s ；重復(fù)第2至第4步36個(gè)循環(huán)，之后再72°C延伸7min， 最后降溫至4°C保持。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用濃度為2%的瓊脂糖膠電泳，溴化乙錠染色，凝膠成像系統(tǒng)中觀 察，可見到片段大小為152bp的清晰條帶(見圖2)。該P(yáng)CR產(chǎn)物用Bsm I內(nèi)切酶酶切，反應(yīng) 體系為10 X Buffer 1. 5 μ L，Bsm I 酶 0. 5 μ L (10U/μ L)，PCR 產(chǎn)物 7 μ L，力口 ddH20 至 15μ L。 37°C反應(yīng)4-6h。然后，酶切產(chǎn)物在4%瓊脂糖凝膠中電泳，溴化乙錠染色，凝膠成像系統(tǒng)中 觀察(見圖3)。當(dāng)70bp處的堿基都為A時(shí)，Bsm I識(shí)別該位點(diǎn)，記為AA型(84bp+68bp，平 原型)；當(dāng)70bp處的堿基突變?yōu)镃時(shí)，Bsm I識(shí)別該位點(diǎn)消失，記為CC型(152bp，高原型)； 雜合型記為AC型(152bp+84bp+68bp)。建立了該SNP位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)的PCR-RFLP技術(shù)。實(shí)施例3本發(fā)明篩選的遺傳標(biāo)記在不同雞群體中的多態(tài)性檢測(cè)采用實(shí)施例2中建立的PCR-RFLP技術(shù)，對(duì)林芝藏雞(采自平均海拔2900m的林芝 地區(qū))、拉薩藏雞(采自平均海拔3650m的拉薩市)、山南藏雞(采自平均海拔3600m的山南 地區(qū))、日喀則藏雞(采自平均海拔3850m的日喀則地區(qū))、尼西藏雞(采自平均海拔3300m 的云南迪慶州)以及北京藏雞(從西藏林芝地區(qū)引進(jìn)，并飼養(yǎng)在北京第4代的群體)、白來 航雞、矮小隱性白雞、壽光雞、絲羽烏骨雞、北京油雞(后6個(gè)群體均購(gòu)自北京中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 實(shí)驗(yàn)種雞場(chǎng))等群體檢測(cè)雞iNOS基因5，上游-1422bp的PCR-Bsm I-RFLP多態(tài)性分布頻 率，檢測(cè)方法用實(shí)施例2所述的方法進(jìn)行，檢測(cè)結(jié)果如表1所示。表1雞iNOS基因5'調(diào)控區(qū)的SNP多態(tài)性分布品種海拔N基因型頻率(％)基因頻率(％)(m)AAACCCAC林芝藏雞29006021.751.626.747.552.5拉薩藏雞36504012.552.535.038.861.2山南藏雞36004020.042.537.541.358.7曰喀則藏雞38504012.535.052.530.070.0尼西藏雞33002213.650.036.438.661.4北京藏雞5824.148.327.648.351.7壽光雞4082.512.55.088.811.2北京油雞3086.710.03.391.78.3絲羽烏骨雞30100001000白來航雞30100001000矮小雞30100001000藏雞的高原型突變等位基因C頻率高于低地雞群，不同地區(qū)的藏雞群頻率也存在 差別，其中日喀則藏雞C頻率最高，為70. 0% ；其次為尼西藏雞和拉薩藏雞，分別為61. 4% 和61.2%。林芝海拔較低，該地區(qū)藏雞C等位基因頻率也較低，為52.5%。不同地區(qū)藏雞 的突變等位基因C頻率可能與海拔有一定的關(guān)系，5個(gè)地區(qū)藏雞C頻率與海拔相關(guān)分析發(fā) 現(xiàn)，相關(guān)系數(shù)0. 8115，相關(guān)顯著檢驗(yàn)P值為0. 0954。結(jié)果表明突變CC型可能為藏雞高原適 應(yīng)性基因型。實(shí)施例4本發(fā)明篩選的遺傳標(biāo)記與低氧孵化率的關(guān)聯(lián)分析及應(yīng)用低氧適應(yīng)性是一個(gè)復(fù)雜的性狀，可能包括分子、細(xì)胞、組織、器官和整體各水平的 變化，影響雞在高海拔環(huán)境的生長(zhǎng)、繁殖和生產(chǎn)性能。低氧孵化是雞是否能適應(yīng)高原環(huán)境的 關(guān)鍵階段，藏雞在高原低氧條件下仍保持高的孵化率，本發(fā)明選擇孵化率這一典型的低氧 反應(yīng)敏感性狀進(jìn)行本發(fā)明遺傳標(biāo)記的效應(yīng)分析。收集飼養(yǎng)在中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)種雞場(chǎng)的藏雞種蛋，采用低氧模擬孵化機(jī)(吳常信，張 浩，茍瀟.國(guó)家實(shí)用新型專利，全自動(dòng)低氧模擬孵化機(jī)，專利號(hào)ZI 2004 20066829.3)，設(shè) 定氧氣濃度為13.0% (相當(dāng)于4000米海拔)進(jìn)行低氧孵化，其余條件正常(溫度37.8°C; 濕度60% ；每2小時(shí)翻蛋一次)。低氧孵化期間不開箱照蛋，保證氧濃度穩(wěn)定，21天后逐一 打開死胚蛋殼鑒別死亡日齡，并采集所有死胚和活雛的組織樣品。提取個(gè)體總DNA，采用實(shí) 施例2中建立的PCR-RFLP技術(shù)，鑒定13. 0%低氧孵化的藏雞死胚和活雛的iNOS基因5’側(cè) 翼區(qū)PCR-Bsm I-RFLP多態(tài)基因型。檢測(cè)結(jié)果見表2所示。藏雞活雛比死胚AA基因型頻率 低，CC基因型頻率高，而雜合基因型頻率相近；卡方分析顯示活雛和死胚基因型分布頻率 差異顯著(P <0.05)，活雛的突變等位基因C的頻率升高。結(jié)果說明，藏雞iNOS基因5’側(cè) 翼區(qū)的該SNP與低氧適應(yīng)性相關(guān)聯(lián)。北京飼養(yǎng)的藏雞來源于3000m左右的藏雞群體，該SNP 的基因型分布可能已經(jīng)平衡在3000m海拔左右的水平。低氧模擬孵化氧濃度為13.0%，相 當(dāng)于4000m左右海拔的氧分壓，這樣的低氧對(duì)于該藏雞群體可能會(huì)打破原來平衡，使有利 突變基因頻率增加。表2藏雞低氧孵化活雛和死胚間iNOS基因SNP多態(tài)分布.
類別N二倍型頻率％單倍型頻率％AAACCCA C北京藏雞5824.148.327.648.3 51.7藏雞活雛3815.847.436.839.5 60.5藏雞死胚3426.552.920.652.9 47.權(quán)利要求
雞低氧適應(yīng)性分子遺傳標(biāo)記，該遺傳標(biāo)記為SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，或該序列中至少包含第70位堿基的特異性片段。
2.用于擴(kuò)增權(quán)利要求1所述分子遺傳標(biāo)記的引物或鑒定權(quán)利要求1所述分子遺傳標(biāo)記 的探針。
3.含有權(quán)利要求1所述引物或探針的試劑盒。
4.權(quán)利要求1所述的分子遺傳標(biāo)記、權(quán)利要求2所述引物或探針在耐低氧雞選育中的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的雞為藏雞。
6.耐低氧雞選育方法，其特征在于，通過檢測(cè)樣品雞基因組DNA中的SEQID No. 1所示 核苷酸序列的第70位堿基，篩選出該堿基為C的雞。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，用SEQID No. 2和3所示的引物以樣品雞基 因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化克隆測(cè)序，來鑒定SEQ ID No. 1所示核苷酸序 列的第70位堿基。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，用SEQID No. 2和3所示的引物以樣品雞基 因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用Bsm I酶切PCR產(chǎn)物，并進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)。
9.雞低氧適應(yīng)性分子遺傳標(biāo)記方法，其特征在于用SEQID No. 2和3所示的引物以樣 品雞基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用Bsm I酶切PCR產(chǎn)物，并進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種雞低氧適應(yīng)性分子遺傳標(biāo)記，該遺傳標(biāo)記為SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，或該序列中至少包含第70位堿基的特異性片段。研究表明，A70C突變與低氧適應(yīng)性相關(guān)聯(lián)，CC型突變表現(xiàn)出更高的低氧適應(yīng)性。通過該遺傳標(biāo)記可以篩選低氧適應(yīng)性較強(qiáng)的雞種，用于雞的輔助育種。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101967477SQ20101050345
公開日2011年2月9日 申請(qǐng)日期2010年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月30日
發(fā)明者張 浩, 彭俊飛, 茍文鈺, 鮑海港 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)