專利名稱：一種快速檢測食品中致病菌的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及食品安全領域，具體地涉及一種能夠快速檢測食品中致病菌的檢測方法。
背景技術：
致病菌是影響食品安全的重要生物因素，目前已經(jīng)受到消費者和工業(yè)生產(chǎn)的廣泛關注。和傳統(tǒng)的基于培養(yǎng)的方法相比，PCR是檢測生命物質的里程碑式發(fā)現(xiàn)。PCR技術可以在很短時間內將幾個甚至一個目標序列擴增到幾百萬個拷貝。這樣，對于致病菌檢測提供了一種可靠、快速、特異的檢測方法，理論上說只要存在一個致病菌的目標序列，PCR方法就可以檢測出。然而，當把PCR應用于食品樣品檢測時(比如牛奶)，脂肪、蛋白質和其他的食品成分會強烈的抑制PCR反應。雖然PCR反應具有極強的擴增能力，但是它對于抑制物質非常的敏感。因此，為了有效的除去或者減少抑制物，在PCR之前對食品樣品進行預處理是必不可少的。通常增菌培養(yǎng)和分離濃縮是常常采用的方法。對于前者，檢測時間大大提高了，因此，后者對于快速檢測食品中的致病菌具有很大的潛力。目前的比較優(yōu)異的前處理方法是磁性分離技術，其中免疫磁性分離技術研究較多。中國專利 201210035468.5,201110143730.3,201210308227.3,201110029946.7、201010550114.5中都是應用免疫磁珠進行分離。然而，致病菌是非常復雜的抗原物質，優(yōu)質的適合應用的抗體難于制備，有時可能會對于同一種屬的一些致病菌不能結合，有時又可能和其他種屬致病菌交叉反應。而且從食品樣品中分離出致病菌分離率并不高，在此基礎上還要提取基因組DNA，進一步增加了損耗。此外，抗體制備困難、成本高，以及在儲存和運輸過程中易于變性。于是研究者開始試圖用其他的生物分子來代替抗體進行致病菌分離，比如IgG、萬古霉素和D-甘 露糖。然而，迄今為止這些方法尚不能應用于實際食品樣品檢測當中。作為另一種選擇，一些研究者試圖直接用磁性核酸探針從食品樣品中分離和濃縮致病菌DNA而并非致病菌本身，但是也存在一些問題，比如，一種捕獲磁性探針只能針對一種致病菌，不能同時檢測多種致病菌，成本高等。研究一種可以磁性分離食品中不同致病菌的基因組DNA，而且可以同時分離多種致病菌的基因組DNA，將磁珠與捕獲物直接用于PCR檢測，將使得食品中致病菌檢測更加簡便、快速、廣泛且成本低廉，對于食品安全的檢測是十分必要的。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種靈敏度高、快速、成本低廉、應用廣泛的基于非標記的氨基化納米磁珠捕獲痕量基因組DNA結合PCR技術快速檢測食品中致病菌的檢測方法。主要包括以下步驟:(I)氨基磁珠的制備
a)制備Fe3O4磁性納米粒子；b)娃包被Fe3O4磁性納米粒子； c)去除未被硅包被的裸露Fe3O4磁性納米粒子，得硅包磁珠；d)氨基化硅包磁珠，得氨基磁珠；(2)待檢樣品制備將預處理后的待檢食品樣品離心，收集沉淀，將沉淀復溶于緩沖溶液中，加入蛋白酶、表面活性劑以及溶菌酶孵育，后用沸水浴并用酚氯仿抽提得待檢樣品；(3)將氨基磁珠與待檢樣品混合，恒溫振蕩，磁性分離后洗滌，得吸附有致病菌DNA的氨基磁珠；(4)將吸附有致病菌DNA的氨基磁珠加入PCR體系中進行PCR檢測。其中所述步驟(I)氨基磁珠的制備中，步驟a)制備Fe3O4磁性納米粒子所采用的方法為，用共沉淀法將二價鐵化合物與三價鐵化合物在氨水的催化下共沉淀生成水溶性的Fe3O4磁性納米粒子；此步驟中的磁性納米粒子在實際應用中并不僅限于Fe3O4磁性納米粒子，之所以選用，是因為相比而言共沉淀法制備的Fe3O4磁性納米粒子條件溫和、價格低廉、綠色環(huán)保，而且磁性能也完全可以應用于生物分離應用。步驟b)硅包被Fe3O4磁性納米粒子所采用的方法為，

由表面活性劑、油相、水相、助劑配制反相微乳液體系，以氨水為催化劑水解正硅酸乙酯制成硅包被的Fe3O4磁性納米粒子；所述反相微乳液體系的各組分配比為，表面活性劑:油相:水相:助劑體積比為大約為4:16:1:4，加入反相微乳液體系中的Fe3O4磁性納米粒子的量(w/v)為0.1-0.4%，單位為g/ml。所述表面活性劑優(yōu)選為曲拉通100，所述油相優(yōu)選為環(huán)己烷，所述水相為去離子水，所述助劑優(yōu)選為正己醇?；蛘哂肧tdber法[W.Siober,A.Fink, E.Bohn.Controlled growth of monodisperse silica spheres in the microsizerange.Journal of Colloid and Interface Science, 1968，26，62-69.]在乙醇/水溶液中用氨水催化正硅酸乙酯制成硅包被的Fe3O4磁性納米粒子；這兩種方法都可以有效的將正硅酸乙酯水解，在Fe3O4磁性納米粒子的表面包上一層二氧化硅，二氧化硅因為其化學惰性對后續(xù)的PCR影響較小，而且二氧化硅層可以非常容易進行氨基化改性。步驟c)去除未被硅包被的裸露Fe3O4磁性納米粒子所采用的方法為，用鹽酸進行浸泡，然后洗滌去除未被硅包被的裸露Fe3O4磁性納米粒子；或者重復一次b)步驟，進行二次包裹，確保沒有裸露的Fe3O4磁性納米粒子存在；此步驟是為了除去裸露存在的Fe3O4,實驗證明，F(xiàn)e3O4對PCR反應具有強烈的抑制作用?？梢赃x擇其中一種方法，也可以兩種方法都采用，以達到去除裸露的Fe3O4磁性納米粒子的目的。步驟d)氨基化硅包磁珠所采用的方法為，用氨基化硅烷偶聯(lián)劑對硅包磁珠進行修飾，使其表面修飾氨基；或者在所述二次包裹的同時加入氨基化硅烷偶聯(lián)劑進行氨基化修飾；硅包磁珠經(jīng)氨基化修飾以后即得氨基磁珠。其中所述步驟(2)待檢樣品制備中，將預處理后的食品樣品進行離心處理，收集沉淀，其中可能含有菌體，將沉淀復溶于一定pH值以及離子濃度的緩沖溶液中，同時添加蛋白酶以及溶菌酶孵育處理，并同時加入表面活性劑，為了充分釋放致病菌核酸以及去除蛋白質等雜質干擾，同時進行沸水浴以及酚氯仿抽提，得到待檢樣品；所述表面活性劑選自吐溫20、曲拉通100和十二烷基磺酸鈉中的一種或多種，所述PH為7-10，所述緩沖溶液為TE緩沖溶液。蛋白酶的作用一方面是水解食品中的蛋白質類PCR抑制物，另一方面也起到水解菌體的作用，尤其是對于革蘭氏陰性菌。溶菌酶主要是針對革蘭氏陽性菌的肽聚糖層，如果目標檢測物中不含有革蘭氏陽性菌，可以不采用。其中所應用的表面活性劑同樣也起到兩個作用，一方面可以使得蛋白質等PCR抑制物變性，另一方面也可使得基因組核酸充分分離釋放。中性表面活性劑(如曲拉通100)的選擇，以及緩沖溶液PH7-10等參數(shù)也至關重要，它會影響到氨基磁珠與基因組DNA的結合。將步驟(3)所述的吸附有致病菌DNA的氨基磁珠直接用于PCR反應體系，并沒有進行洗脫，實驗證明經(jīng)過包被的氨基磁珠對于PCR反應基本沒有影響，此外，同時也發(fā)現(xiàn)，食品處理物中的蛋白質等可以很好的包被磁珠，不進一步包被并不影響后續(xù)的PCR實驗。磁性分離得到的磁珠與致病菌基因組DNA結合物既可以用于普通PCR、也可以用于多重PCR同時檢測多種致病菌，此外，也可以用于熒光定量PCR進行定量檢測。本發(fā)明的要點是:所制備的氨基化硅包磁珠必須確保其表面充分的包被二氧化硅，徹底避免表面暴露的Fe3O4磁性納米粒子。食品的處理遵循的原則是盡量的釋放其中致病菌的基因組DNA，并盡可能的去除蛋白質等PCR抑制物，此外，食品處理物與氨基磁珠混合的體系也嚴格需要一定的條件，在合適的PH值、溫度等作用下才會達到較好的結合作用。磁珠與基因組DNA結合物直接用于PCR檢測，無需洗脫處理。此發(fā)明可以快速、簡單、靈敏、特異的檢測食品中的某種或多種致病菌污染。具體方法包括以下幾個步驟:(I)制備Fe3O4磁性納米粒子，將二價鐵化合物與三價鐵化合物按照摩爾比1:2混合，所述二價鐵化合物優(yōu)選為FeSO4.7Η20，所述三價`鐵化合物優(yōu)選為FeCl3.6Η20，加入氨水至pH值為8-11，在通氮氣的氛圍下50°C -100°C加熱，劇烈電動攪拌約30_60min。磁性分離，反復用無水乙醇與水洗滌數(shù)次，干燥。(2)硅包被Fe3O4磁性納米粒子:由表面活性劑曲拉通100、油相環(huán)己烷、水相、助劑正己醇配制成反相微乳液體系，加入Fe3O4磁性納米粒子，超聲混合，加入正硅酸乙酯(TE0S),以氨水為催化劑水解正硅酸乙酯制成二氧化硅包被的Fe3O4磁性納米粒子，優(yōu)選地反相微乳液體系中表面活性劑:油相:水相:助劑體積比為4:16:1:4，加入反相微乳液體系中的Fe3O4磁性納米粒子的質量為每50ml體系加入0.05-0.2g ;也可用St^ber法在乙醇/水溶液中用氨水催化正硅酸乙酯包硅。后者所得粒徑一般比前者大。(3)去除未被硅包被的裸露Fe3O4磁性納米粒子:用鹽酸浸泡24h，優(yōu)選鹽酸濃度為0.l_3mol/L，然后洗滌去除雜質；或者也可以重復一次(2)步驟，進行二次包裹，確保沒有裸露的Fe3O4磁性納米粒子存在?？梢詥为毑捎闷渲幸环N方法，也可以兩者都用。采用二次包被的方法得到的磁珠粒徑將較大。(4)氨基化硅包磁珠:用氨基化硅烷偶聯(lián)劑配置成1%_5%的甲苯溶液，加入硅包磁珠，在氮氣氛圍下加熱到30°C-100°C，回流3h-12h，得氨基磁珠?；蛘咭部梢栽诙伟耐瑫r加入一些氨基化硅烷偶聯(lián)劑進行氨基化修飾。優(yōu)選氨基化硅烷偶聯(lián)劑為3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)。(5)待檢樣品制備:取生牛奶 10-25ml，3000-8000r/min 離心 20min，加入 450 μ ITE緩沖溶液(ΡΗ7-10，其中含表面活性劑、蛋白酶K、溶菌酶)，37°C孵育30_100min，沸水浴IOmin后迅速置于冰上冷卻，然后加入250 μ I Tris-飽和酚，250 μ I氯仿/異戊醇混合液(24:1，V/V),6000-12000r/min 離心 5min，吸取上層清液。(6)向吸取的清液中加入20 μ g氨基磁珠(ASMNP)，30-80 V 1400r/min振蕩30min,用TE緩沖溶液洗滌一次，收集沉淀到PCR管。(7)將收集到的吸附有致病菌DNA的氨基磁珠加入PCR體系中進行PCR檢測。本發(fā)明以氨基化硅包磁珠為載體，將食品進行一定處理，可以直接用氨基硅包磁珠非特異的結合其中的致病菌基因組DNA，因為其沒有菌株特異性，所以可以用于檢測任何存在于牛奶中的致病菌，并且結合多重PCR可以同時檢測多種致病菌。本發(fā)明的優(yōu)點是:1、檢測方法快速。2、檢測結果靈敏度高。3、檢測目標廣泛。4、可以進行多種檢測。5、檢測成 本低廉。6、既可作半定量檢測，又可做定量檢測。


圖1為原子力顯微鏡(AFM)觀測到的氨基磁珠對提純的沙門氏菌(Salmonella)基因組DNA吸附(b)、氨基磁珠對于牛奶樣品中沙門氏菌基因組DNA吸附(c)以及氨基磁珠(a)。圖2為氨基磁珠吸附人工污染牛奶樣品中沙門氏菌基因組DNA后直接PCR的檢測限。圖3為氨基磁珠吸附人工污染牛奶樣品中單增李斯特菌(L.monocytogenes)基因組DNA后直接PCR的檢測限。圖4為氨基磁珠吸附人工污染牛奶樣品中沙門氏菌與單增李斯特基因組DNA后直接進行多重PCR的檢測限。本發(fā)明實施例中所用試劑均可通過市售獲得，所用沙門氏菌(Salmonella)和單增李斯特菌(L.monocytogenes)均購自廣東省微生物菌種保藏中心(GIMCC)。
具體實施例方式以下結合附圖通過實施例對本發(fā)明做進一步說明。實施例1:氨基磁珠吸附人工污染的牛奶中沙門氏菌基因組DNA結合PCR快速檢測原奶中沙門氏菌Fe3O4磁性納米粒子的制備=Fe3O4磁性納米粒子通過共沉淀法制備。0.02molFeCl3.6H20和0.0lmol FeSO4.7H20溶解于150ml去離子水中，滴加氨水至pH值11，在氮氣保護下加熱到85°C，并不斷的攪拌，加熱持續(xù)時間為25min，然后冷卻至室溫。黑色沉淀物用乙醇和去離子水反復清洗，最后真空干燥。娃包Fe3O4磁性納米粒子的制備:用反相微乳液法制備娃包Fe3O4磁性納米粒子，將32.0ml曲拉通100,128.0ml環(huán)己燒，8.0ml去離子水，32.0ml正己醇，280mg Fe3O4磁性納米粒子混合超聲組成反相微乳液體系，加入2.0ml正硅酸乙酯(TE0S)，然后加入1.2ml氨水，室溫下磁力攪拌反應24h,丙酮破乳。高速離心，乙醇多次洗漆,最后用0.lmol/L的鹽酸溶液浸泡24h，最終洗滌干燥待用。氨基化修飾:3_氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)被用來進行氨基化修飾，從上述制備好的硅包Fe3O4磁性納米粒子中稱取200mg加入30ml體積分數(shù)為3%的APTES甲苯溶液中，先超聲lOmin，然后氮氣保護，90°C加熱12h。用乙醇與去離子水反復洗滌，最后真空干燥。取用沙門氏菌(GMT1.022)人工梯度污染的生牛奶10ml，6000r/min離心20min，收集沉淀，加入450 μ I含0.5%曲拉通100的TE緩沖溶液，加入40 μ 120 μ g/ μ I的蛋白酶K，37°C孵育30min，沸水浴IOmin后迅速置于冰上冷卻，然后加入250 μ I Tris-飽和酚，250 μ I的氯仿/異戊醇(24:1，V/V)混合液，12000r/min離心5min,吸取上層清液，加入20 yg ASMNP, 600C 1400r/min振蕩30min，用TE緩沖溶液洗滌一次，收集沉淀到PCR管。檢測沙門氏菌的引物通過Blast比對選定沙門氏菌特有序列，然后用Primer5設計，并用實驗室內菌株進行了驗證，上下游引物分別為AGCACAGGCGTTTATGGT與GGCGACTGGCTTCTTTAT。PCR 擴增體系為 25 μ 1，包含 Ix Taq buffer, 1.5mM MgCl2, 0.1mMdNTP，400nM引物和1.5U Taq DNA polymerase，最終用無菌水補足體積。PCR擴增沙門氏菌條件為94°C預變性5min;35個循環(huán):95°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸40s;最后72°C延伸8min。PCR產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖進行電泳，EB染色。經(jīng)過梯度人工污染生牛奶檢測證實(圖2，從I到7泳道依次 為沙門氏菌污染量為8xl05cfu/ml、8xl04cfu/ml、8xl03cfu/ml、SxlO^fu/mUSxlO^fu/mUSxlO^fu/mUSxlO^cfu/ml 人工污染牛奶的樣品的檢測結果)，檢測生牛奶中的沙門氏菌檢測限可以到達8cfu/ml。此結果與目前報道的免疫磁珠分離結合PCR (IMS-PCR)檢測致病菌污染基本一致，在靈敏度一致的基礎上，此方法因為是非特異的，可以用于任何一種致病菌以及同時存在的多種致病菌污染，所以其優(yōu)越性遠遠高于只能檢測一種致病菌的IMS-PCR。實施例2:氨基磁珠吸附人工污染的原奶中單增李斯特基因組DNA結合PCR快速檢測原奶中單增李斯特菌Fe3O4磁性納米粒子的制備同實施例1。娃包Fe3O4磁性納米粒子的制備:將25ml乙醇、6.5ml /K，以及Iml氨水混合,此為A液；將25ml乙醇與0.5ml正硅酸乙酯混合，并加入0.1g Fe3O4磁性納米粒子，此為B液。將A液與B液混合，常溫攪拌12h。乙醇與水分別多次洗滌，然后于lmol/L鹽酸溶液中，浸泡 24h。氨基化修飾步驟同實施例1。取用單增李斯特菌(GM1.229)人工梯度污染的生牛奶10ml，6000r/min離心20min，加入450 μ I含0.5%曲拉通100的TE緩沖溶液，加入40 μ 140 μ g/ μ I的溶菌酶，37°C孵育30min，沸水浴IOmin后迅速置于冰上冷卻，然后加入250 μ ITris-飽和酚，250 μ I的氯仿/異戊醇(24:1，V/V)混合液，12000g/min離心5min，吸取上層清液，加入20 μ gASMNP, 60°C，1400g/min振蕩30min，用TE緩沖溶液洗滌一次，收集沉淀到PCR管。檢測單增李斯特菌的引物通過Blast比對單增李斯特菌特有序列，然后對此序列用Primer5設計引物，并用實驗室內菌株進行驗證，上下游引物分別為GCAAGCCACTATCCAAACAC 與 GAGCAACCACTCATCAGCTT。PCR 擴增體系為 25 μ 1，包含 Ix Taqbuffer, 1.5mM MgCl2, 0.1mM dNTP, 400nM 引物和 1.5U Taq DNA polymerase,最終用無菌水補足體積。PCR擴增沙門氏菌條件為94°C預變性5min;35個循環(huán):95°C變性30s，60 °C退火30s，72°C延伸40s;最后72°C延伸8min.PCR產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖進行電泳，EB染色。經(jīng)過梯度人工污染生牛奶檢測證實(圖3，從I到8泳道依次為單增李斯特菌污染量為 2.6xl04cfu/ml, 2.6xl03cfu/ml, 2.6xl02cfu/ml, 1.3xl02cfu/ml, 2.6xl02cfu/ml, 26cfu/ml, 13cfu/ml, 2.6cfu/ml, 1.3cfu/ml人工污染牛奶的樣品的檢測結果),檢測生牛奶中的單增李斯特菌檢測限可以到達13cfu/ml。由此 可見，此方法不但適用于革蘭氏陰性菌，同樣也適用于革蘭氏陽性菌，而且檢測靈敏度基本相當。實施例3:氨基磁珠吸附人工污染的原奶中致病菌基因組DNA結合PCR快速檢測原奶中沙門氏菌與單增李斯特菌Fe3O4納米粒子的制備與硅包Fe3O4納米粒子的制備和實施例1相同。對硅包Fe3O4納米粒子進行二次包被:將25ml乙醇、6.5ml水，以及Iml氨水混合，此為A液；將25ml乙醇與0.5ml正硅酸乙酯混合，并加入0.1g經(jīng)一次包被的硅包磁性納米粒子，此為B液。將A液與B液混合，常溫攪拌12h。氨基化修飾步驟同實施例1。 取用沙門氏菌和單增李斯特菌人工梯度污染的生牛奶IOml，6000r/min離心20min，加入450μ I含0.5%曲拉通100的TE緩沖溶液，加入40 μ 120 μ g/μ I的蛋白酶K、40 μ 140 μ g/μ I的溶菌酶，37°C孵育30min,沸水浴IOmin后迅速置于冰上冷卻,然后加入250 μ I Tris-飽和酚，250 μ I 的氯仿 / 異戊醇(24:1，V/V)混合液，12000r/min 離心 5min，吸取上層清液，加入20 μ g ASMNP, 60°C 1400r/min振蕩30min，用TE緩沖溶液洗滌一次，收集沉淀到PCR管。應用多重PCR同時檢測沙門氏菌與單增李斯特菌，這兩種菌引物分別為:上游引物ACCGCTGGTGAAACGACA，下游引物GCGACGGCAGTGCTTATT ;以及上游引物GCTGAAGAGATTGCGAAAGAAG，下游引物 CAAAGAAACCTTGGAITTGCGG，PCR 擴增體系均為 25 μ 1，包含 Ix Taq buffer, 1.5mM MgCl2, 0.1mM dNTP, 400nM 引物和 1.5U Taq DNA polymerase,最終用無菌水補足體積。PCR擴增條件為94°C預變性5min; 35個循環(huán):95°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸40s;最后72°C延伸8min。PCR產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖進行電泳，EB染色。經(jīng)過梯度人工污染生牛奶檢測證實(圖4，I到10泳道分別為沙門氏菌、單增李斯特菌混合污染量為 3xl04cfu/ml、5xl04cfu/ml ；3xl03cfu/ml>5xl03cfu/ml ;3xl02cfu/ml、5xl02cfu/ml ；30cfu/ml>50cfu/ml ； 15cfu/ml>25cfu/ml ；3cfu/ml>5cfu/ml ；1.5cfu/ml>2.5cfu/ml ；
0.3cfu/ml、0.5cfu/ml ；0.15cfu/ml、0.25cfu/ml ；0cfu/ml>0cfu/ml,的人工污染牛奶的檢測結果)，同時檢測生牛奶中的沙門氏菌和單增李斯特菌檢測限分別可以到達15cfu/ml和25cfu/ml。此結果證明，此方法不但能應用于檢測任意一種致病菌，而且能夠同時檢測多種致病菌，這是以致病菌抗體為核心的IMS-PCR無法達到的。以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例，并不用于限制本發(fā)明，對于本領域的技術人員來說，本發(fā)明可以有更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內，所作的任何修改、改進等，均應包括在本發(fā)明 的保護范圍之內。
權利要求
1.一種快速檢測食品中致病菌的方法，包括以下步驟: (1)氨基磁珠的制備 a)制備Fe3O4磁性納米粒子； b)娃包被Fe3O4磁性納米粒子； c)去除未被硅包被的裸露Fe3O4磁性納米粒子，得硅包磁珠； d)氨基化硅包磁珠，得氨基磁珠； (2)待檢樣品制備 將預處理后的待檢食品樣品離心，收集沉淀，將沉淀復溶于緩沖溶液中，加入表面活性齊U、蛋白酶和溶菌酶孵育，后用沸水浴并用酚氯仿抽提得待檢樣品； (3)將氨基磁珠與待檢樣品混合，恒溫振蕩，磁性分離后洗滌，得吸附有致病菌基因組DNA的氨基磁珠； (4)將吸附有致病菌基因組DNA的氨基磁珠加入PCR體系中進行PCR檢測。
2.根據(jù)權利要求1所述的快速檢測食品中致病菌的方法，其特征在于: 所述步驟(I)氨基磁珠的制備中， 步驟a)制備Fe3O4磁性納米粒子所采用的方法為，用共沉淀法將二價鐵化合物與三價鐵化合物在氨水的催化下共沉淀生成水溶性的Fe3O4磁性納米粒子； 步驟b)硅包被Fe3O4磁性納米粒子所采用的方法為， 由表面活性劑、油相、水相、助劑配制反相微乳液體系，以氨水為催化劑水解正硅酸乙酯制成硅包被的Fe3O4磁性納米粒子；或者 用St0ber法在乙醇/水溶液中用氨水催化正硅酸乙酯制成硅包被的Fe3O4磁性納米粒子; 步驟c)去除未被硅包被的裸露Fe3O4磁性納米粒子所采用的方法為， 用鹽酸浸泡，然后洗滌去除未被硅包被的裸露Fe3O4磁性納米粒子；或者 重復一次b)步驟，進行二次包裹，確保沒有裸露的Fe3O4磁性納米粒子存在； 步驟d)氨基化硅包磁珠所采用的方法為， 用氨基化硅烷偶聯(lián)劑對硅包磁珠進行修飾，使其表面修飾氨基；或者在所述二次包裹的同時加入氨基化硅烷偶聯(lián)劑進行氨基化修飾。
3.根據(jù)權利要求2所述的快速檢測食品中致病菌的方法，其特征在于: 所述步驟(I)的步驟a)中，所述二價鐵化合物為FeS04.7H20，所述三價鐵化合物為FeCl3.6H20，二價鐵化合物與三價鐵化合物的摩爾比為1:2。
4.根據(jù)權利要求2所述的快速檢測食品中致病菌的方法，其特征在于: 所述步驟(I)的步驟b)中，所述反相微乳液體系的各組分配比為:表面活性劑:油相:水相:助劑體積比大約為4:16:1:4，加入反相微乳液體系中的Fe3O4磁性納米粒子的量(w/V)為 0.1-0.4%ο
5.根據(jù)權利要求2或4所述的快速檢測食品中致病菌的方法，其特征在于: 所述表面活性劑為曲拉通100，所述油相為環(huán)己烷，所述水相為去離子水，所述助劑為正己醇。
6.根據(jù)權利要求2所述的快速檢測食品中致病菌的方法，其特征在于: 所述步驟(1)的步驟c)中，所述鹽酸濃度為0.l_3mol/L，鹽酸浸泡時間為15_30h。
7.根據(jù)權利要求2所述的快速檢測食品中致病菌的方法，其特征在于: 所述步驟(I)的步驟d)中，氨基化硅包磁珠采用的方法為將氨基化硅烷偶聯(lián)劑配置成體積分數(shù)為1%_5%的甲苯溶液，加入硅包磁珠，在氮氣氛圍下加熱到30°C -100°C，回流3h-12h。
8.根據(jù)權利要求1、2或7所述的快速檢測食品中致病菌的方法，其特征在于: 所述的氨基化硅烷偶聯(lián)劑為3-氨丙基三乙氧基硅烷。
9.根據(jù)權利要求1所述的快速檢測食品中致病菌的方法，其特征在于: 所述步驟(2)中，所述表面活性劑選自吐溫20、曲拉通100和十二烷基磺酸鈉中的一種或多種，所述緩沖溶液為TE緩沖溶液。
10.根據(jù)權利要求1所述的快速檢測食品中致病菌的方法，其特征在于:所述步驟(4)中，所述PCR檢測選自普通PCR、多重PCR或熒光定量PCR中的任意一種檢測方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及食品安全領域，一種基于非標記的氨基化納米磁珠捕獲痕量基因組脫氧核糖核酸(DNA)結合聚合酶鏈式反應(PCR)快速檢測食品中致病菌的方法?，F(xiàn)有技術的缺點是國標培養(yǎng)方法需要增菌，檢測時間長；免疫檢測方法需要高質量的抗體，且一種抗體只對應一種致病菌；單純的PCR檢測技術也需要前增菌，檢測時間長。本發(fā)明方法為制備適合于加入PCR體系中的氨基磁珠，捕獲經(jīng)過簡單處理的食品樣品中的DNA，最終結合物直接進行PCR檢測。本發(fā)明的優(yōu)點是檢測快速；價格低廉；靈敏度高；可針對不同致病菌檢測，且可同時檢測多種致病菌；可做半定量檢測或定量檢測。
文檔編號C12Q1/68GK103160577SQ20131004626
公開日2013年6月19日 申請日期2013年2月5日 優(yōu)先權日2013年2月5日
發(fā)明者史賢明, 白亞龍, 施春雷, 宋明輝, 王大鵬, 崔妍 申請人:上海交通大學