專利名稱：具有高直鏈淀粉含量水稻的培育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物學(xué)科，尤其涉及作物育種與植物基因工程領(lǐng)域，屬于生物和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用技術(shù)。更具體地說，本發(fā)明涉及改變水稻胚乳淀粉生物合成的基因表達(dá)，從而在水稻胚乳生產(chǎn)具高直鏈淀粉分子組分的淀粉。
背景技術(shù)：
近幾十年來，由于矮化育種和雜種優(yōu)勢(shì)的利用，我國(guó)水稻品種的畝產(chǎn)和總產(chǎn)有了大幅度的增加，食用稻米生產(chǎn)已相對(duì)過剩。我國(guó)稻米品質(zhì)育種在80年代初起步，二十多年來已取得了矚目的進(jìn)展，育成了一批各有特色的優(yōu)質(zhì)品種。但是，目前高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)品種不多，優(yōu)質(zhì)米的生產(chǎn)無論從質(zhì)量上或數(shù)量上都還未能滿足人民生活水平日益提高的需要。另外，以往講稻米品質(zhì)育種，只是注意食用品質(zhì)方面，對(duì)工業(yè)用的稻米品質(zhì)缺乏研究甚至是空白。從目前生產(chǎn)上大面積應(yīng)用的非糯水稻品種(作為糧食用途)的品質(zhì)看，目前直鏈淀粉含量比較集中于兩類一類是含低或較低直鏈粉含量的，在12～18％之間，如常規(guī)的粳稻(16～18％)、重要的秈型雜交稻親本(以恢復(fù)系居多，12～16％)。其次是直鏈淀粉含量偏高的類型，如常規(guī)的早秈品種、重要的秈型雜交稻親本(由早秈品種轉(zhuǎn)育成的不育系)，它們的直鏈淀粉含量一般在22％以上，有的高達(dá)25％以上。另外，隨著食品以及其他工業(yè)的發(fā)展，對(duì)各種特定類型淀粉的需求量不斷增長(zhǎng)。因此，應(yīng)該注重開展特殊用途、專門用途稻米品種的選育，如極低直鏈淀粉含量、酒米、極高直鏈淀粉含量等工業(yè)用途品種的選育。
在稻米各種各樣的用途中，適宜的直鏈淀粉含量是首要考慮的目標(biāo)性狀。對(duì)直鏈淀粉含量的要求往往根據(jù)食米人群的特點(diǎn)、工業(yè)用途不同而要求不同。作為食用糧食，人們一般都傾向于中等偏低的直鏈淀粉含量。但不同地區(qū)或人群的要求又有所不同，這在前面已有說明。北方以粳米為主，直鏈淀粉含量一般偏低，在16-18％，煮成的飯比較粘軟；南方稻區(qū)以秈米為主，直鏈淀粉含量要求稍高一些，在20-22％之間是比較理想的。在食品工業(yè)應(yīng)用上，不同直鏈淀粉含量的稻米也有不同的用途。低直鏈淀粉含量的稻米一般可用于制作嬰兒食品，而直鏈淀粉含量高的適用于制粉、制絲、味精、釀啤、蒸谷米等。傳統(tǒng)糕團(tuán)要求以糯米為主，這是由于它的粘性較好；而釀酒時(shí)對(duì)直鏈淀粉含量也有一定的要求。傳統(tǒng)的紹興酒之類的米酒，都以糯米為原料。在糖果生產(chǎn)中，大量需求的是直鏈淀粉含量較高的淀粉和酸水解的淀粉。在純工業(yè)利用上，目前對(duì)于高直鏈淀粉含量的水稻要求較為迫切。特別是在含淀粉生物降解型塑料生產(chǎn)中，需要高直鏈淀粉含量的淀粉，所得制品具有較好的機(jī)械性能。但水稻中往往缺乏這種種質(zhì)資源，而在玉米等作物中已有具特高直鏈淀粉含量的專用品種。因此，通過一定的技術(shù)路線培育高直鏈淀粉含量的水稻，是符合市場(chǎng)需要的。
技術(shù)方案本發(fā)明的目的是提供一種通過基因工程技術(shù)來抑制水稻內(nèi)源分支酶基因的表達(dá)，培育可用于工業(yè)上的一種高直鏈淀粉含量水稻的培育方法。
本發(fā)明技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的它包括(1)制備包括編碼水稻分支酶基因或其片段的嵌合基因，其中的分支酶基因或其片段的上游一側(cè)以反義的方向可操作地連接到可在水稻種子胚乳組織中高效特異表達(dá)的啟動(dòng)子核酸片段上，并且其下游一側(cè)連接到可用于轉(zhuǎn)錄終止的適當(dāng)調(diào)控序列的核酸片段上；(2)再用嵌合基因轉(zhuǎn)化水稻。
其中編碼分支酶的基因可以為cDNA，也可以是基因組結(jié)構(gòu)基因，這個(gè)基因或其片段的核酸片段源自水稻本身。
所述水稻分支酶包括兩類，即水稻分支酶SBE1和水稻分支酶SBE3，以上兩種酶分別由分支酶基因sbe1和分支酶基因sbe3編碼。
其中的編碼分支酶基因或其片段的核酸片段編碼水分支酶SBE1和SBE3的全部或一部分。
其中的編碼分支酶基因或其片段的核酸片段是以反義的結(jié)構(gòu)構(gòu)建在嵌合基因中，或者以可形成基于雙鏈RNA的發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)的形式構(gòu)建在嵌合基因中。
構(gòu)件的嵌合基因，分別制備sbe1或sbe3基因或其片段的嵌合基因，或制備同時(shí)含有上述兩個(gè)基因或其片段的嵌合基因。
本發(fā)明通過基因工程技術(shù)選育具有高直鏈淀粉含量水稻品種的方法，可克服常規(guī)育種中高直鏈淀粉含量水稻資源不足的限制，直鏈淀粉含量最高的可達(dá)55.9％，超過現(xiàn)有水稻品種一倍或更多。并可生產(chǎn)出適用于特殊工業(yè)用途的專用水稻品種。


附圖1是本發(fā)明克隆并用于構(gòu)建反義嵌合基因的水稻sbe1基因的全長(zhǎng)cDNA序列。
附圖2是本發(fā)明克隆并用于構(gòu)建反義嵌合基因的水稻sbe3基因的全長(zhǎng)cDNA序列。
附圖3是本發(fā)明中構(gòu)建的含有反義分支酶基因的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖。
附圖4是導(dǎo)入反義分支酶基因?qū)D(zhuǎn)基因水稻種子中內(nèi)源分支酶活性的影響。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明具體的操作程序及技術(shù)要點(diǎn)如下(1)分支酶基因或其基因片段的克隆。根據(jù)已公開發(fā)表的水稻分支酶基因sbe1和sbe3基因的核苷酸序列，設(shè)計(jì)引物，采用PCR技術(shù)從水稻基因組DNA中擴(kuò)增這兩個(gè)基因編碼區(qū)的部分片段，或者采用RT-PCR技術(shù)從水稻未成熟種子胚乳總RNA中克隆出這兩個(gè)基因編碼區(qū)的全長(zhǎng)或部分片段。在克隆上述基因或基因片段的同時(shí)，在被克隆基因或基因片段的5’和3’末端分別設(shè)計(jì)并加接上特定的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，以便于隨后的反義嵌合基因的構(gòu)建。申請(qǐng)人按上述方法，已成功地從水稻品種武運(yùn)粳7號(hào)中克隆了編碼sbe1和sbe3的全長(zhǎng)cDNA或其部分片段。
(2)反義載體的構(gòu)建。利用已克隆的sbe1和sbe3基因或其部分片段，反向地連接到可在水稻種子胚乳中特異表達(dá)的啟動(dòng)子下游，并在反義sbe1或sbe3基因片段的下游接上可終止基因轉(zhuǎn)錄的終止子(如農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶基因的終止子NOS)，組成反義嵌合基因。然后再將該反義嵌合基因克隆到可適用于轉(zhuǎn)化水稻的載體上。其要點(diǎn)是①用于構(gòu)建的分支酶基因或其片段，可以是編碼該酶的全長(zhǎng)cDNA，也可以編碼區(qū)的部分核苷酸片段，或者是結(jié)構(gòu)基因中含有編碼區(qū)部分片段的核苷酸序列。
②用于指導(dǎo)反義分支酶基因的啟動(dòng)子，是使用可在水稻胚乳中特異性高表達(dá)基因的啟動(dòng)子，例如水稻蠟質(zhì)基因、水稻谷蛋白基因或水稻分支酶基因的啟動(dòng)子。
③在構(gòu)建反義載體時(shí)，可將sbe1和sbe3兩個(gè)分支酶基因的反義基因或其片段分別構(gòu)建在兩個(gè)載體上，在轉(zhuǎn)化時(shí)可采用共轉(zhuǎn)化導(dǎo)入同一水稻品種中或分別導(dǎo)入不同水稻植株中；也可將兩個(gè)反義基因構(gòu)建在同一載體上，以便采用一次轉(zhuǎn)化即可將兩個(gè)反義基因同時(shí)導(dǎo)入同一個(gè)水稻品種中。
④應(yīng)用RNAi技術(shù)。除采用反義RNA技術(shù)外，還可利用RNAi技術(shù)，構(gòu)建可形成dsRNA的嵌合基因構(gòu)件。
(3)反義分支酶基因向水稻的轉(zhuǎn)化。采用農(nóng)桿菌、基因槍或花粉管通道等介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，將(2)中構(gòu)建的反義分支酶嵌合基因分別導(dǎo)入水稻品種中。其要點(diǎn)是①當(dāng)sbe1和sbe3兩個(gè)分支酶基因的反義嵌合基因分別構(gòu)建在不同的載體上時(shí)，可先分別將這兩個(gè)反義基因?qū)氩煌乃局仓曛校缓笤偻ㄟ^常規(guī)雜交聚合兩個(gè)反義基因入同一轉(zhuǎn)基因水稻植株中；②或者采用共轉(zhuǎn)化方法，將兩個(gè)反義分支酶基因同時(shí)導(dǎo)入同一轉(zhuǎn)基因水稻植株中。
(4)轉(zhuǎn)基因水稻中內(nèi)源分支酶基因的表達(dá)分析。獲得轉(zhuǎn)基因水稻植株后，在轉(zhuǎn)基因水稻植株生長(zhǎng)期取葉片樣，提取總DNA，采用PCR和Southern雜交技術(shù)鑒別反義分支酶基因的整合。然后，在水稻開花后，從水稻未成熟種子中提取總RNA進(jìn)行Northern雜交分析，以檢測(cè)內(nèi)源分支酶基因的轉(zhuǎn)錄是否受到抑制；進(jìn)一步可從未成熟種子或成熟種子中提取蛋白質(zhì)，通過測(cè)定Q酶活性鑒別分支酶的活性是否有下降，或者查可靠地方法，即通過分支酶免疫制備的抗體采用免疫雜交技術(shù)分析特定分支酶是表達(dá)量是否有改變。
(5)轉(zhuǎn)基因水稻成熟種子中淀粉組分及結(jié)構(gòu)的分析。采用經(jīng)典的淀粉含量分析方法，如碘比色法測(cè)定水稻成熟種子中的直鏈淀粉含量，以確定轉(zhuǎn)基因水稻中的淀粉組成與未轉(zhuǎn)化的相比有否改變；下面結(jié)合具體的最佳實(shí)施例說明實(shí)施例1利用水稻分支酶基因編碼區(qū)部分片段構(gòu)建反義嵌合基因，導(dǎo)入水稻后對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻種子中淀粉合成的影響。
(1)水稻分支酶基因編碼區(qū)部分片段的克隆。以粳稻品種武運(yùn)粳7號(hào)基因組總DNA為模板，用與分支酶sbe1基因特異的一對(duì)引物B1P1(5’-GATGGTGTACACTGGGATCCT-3’)和B1P2(5’-GATCCCGGGTATAGCATTGATGTAAC-3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分離出了長(zhǎng)度為683bp的基因組DNA稱為B1F1片段，包含有水稻sbe1基因第5外顯子3’端21bp、第5內(nèi)含子全序列(108 bp)以及第6外顯子5’端554 bp序列。同時(shí)，又用與sbe1 cDNA特異的一對(duì)引物B1P3(5’-GAGGATCCGTGGCAATGTTCGCCTGAG-3’)和B1P4(5’-TAACCCGGGAATACGATCAACCCATG-3’)、或與sbe3 cDNA特異的一對(duì)引物B3P3(5’-GCGGATCCTGAGTAGCACGGAGCCAAAG-3’)和B3P4(5’-AGTCCCGGGTAGGCATTCCACTGACATC-3’)，從水稻品種IR36胚乳來源的cDNA文庫(kù)中分別擴(kuò)增出了特異性的PCR產(chǎn)物，分子量大小分別約為519bp和640bP，分別稱為B1F2片段和B3F1片段。B1F2片段位于sbe1 cDNA的5’端，在起始密碼子ATG后92bp與610bp間(包含了第2至第5外顯子的序列)；B3F1片段位于sbe3 cDNA編碼區(qū)的中間，在起始密碼子ATG后965bp與1604bp間。
(2)反義分支酶嵌合基因表達(dá)載體的構(gòu)建。為構(gòu)建含反義分支酶基因片段的嵌合基因、并適宜于農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻，將上述克隆的B1F1、B1F2和B3F1片段反向后分別插入農(nóng)桿菌雙元載體p1301B HS(蔡毅等，2002)中。分別構(gòu)建成了由水稻分支酶sbe1基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的、含反義分支酶基因部分片段的3個(gè)工程質(zhì)粒p13B1、p13B2和p13B3，它們T-DNA區(qū)的結(jié)構(gòu)如附圖2所示。同時(shí)，又構(gòu)建了由水稻蠟質(zhì)基因啟動(dòng)子控制的、含反向B1F2和B3F1片段的工程質(zhì)粒p13WB1、p13WB3(附圖2)。
(3)轉(zhuǎn)反義分支酶基因水稻植株的獲得。按申請(qǐng)人已建立的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻的程序(劉巧泉等1998，陳秀花等2001)，以粳稻品種武香粳9號(hào)以及秈稻品種龍?zhí)馗和特青未成熟胚來源的初生愈傷組織為轉(zhuǎn)化受體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)獲得了將上述構(gòu)建的5個(gè)含反義分支酶基因的工程質(zhì)粒分別導(dǎo)入，并獲得了較多的轉(zhuǎn)基因水稻植株。大多數(shù)轉(zhuǎn)基因水稻植株移栽入大田后，絕大多數(shù)能正常生長(zhǎng)、開花并結(jié)實(shí)。
(4)轉(zhuǎn)基因水稻植株胚乳中分支酶活性的分析。在轉(zhuǎn)基因水稻植株開花后10天、20天和30天，從部分植株上分別取20粒種子，對(duì)其胚乳中的分支酶活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表和圖4.15。由表中可見，轉(zhuǎn)基因水稻植株種子胚乳中分支酶的活性較未轉(zhuǎn)化對(duì)照植株中有明顯下降，但不同轉(zhuǎn)基因植株間以及同一轉(zhuǎn)基因植株的不同種子間下降的幅度不同。由分支酶活性的分析，說明轉(zhuǎn)入反義分支酶基因后，分支酶基因的表達(dá)活性受到了抑制。
(5)轉(zhuǎn)基因水稻成熟種子中直鏈淀粉含量的變化。轉(zhuǎn)基因水稻植株成熟后按單株收獲種子，從每一轉(zhuǎn)化子中挑選一個(gè)單株，對(duì)其成熟種子的直鏈淀粉含量進(jìn)行分析。用碘比色法測(cè)定水稻成熟種子中的直鏈淀粉含量。首先對(duì)每一轉(zhuǎn)化子的一個(gè)單株進(jìn)行混測(cè)，每一樣品做兩個(gè)重復(fù)，然后從中選擇直鏈淀粉含量提高幅度較大的植株，再對(duì)其種子進(jìn)行單粒測(cè)定。部分T0代轉(zhuǎn)基因水稻植株成熟種子的直鏈淀粉含量測(cè)定結(jié)果列于表1中。從表1中數(shù)據(jù)可見，在粳稻品種中轉(zhuǎn)入反義分支酶sbe3基因(工程質(zhì)粒為p13WB3，代號(hào)為B3)后，種子的直鏈淀粉含量有了一定程度的提高，如B3-47、B3-60與對(duì)照相比存在顯著提高(t0.05)，分別提高了19.62％和14.50％。而轉(zhuǎn)反義分支酶Sbe1基因的植株(工程質(zhì)粒為p13WB3，代號(hào)為B1)種子中直鏈淀粉含量的提高不明顯。將反義sbe1基因轉(zhuǎn)入秈稻品種后，轉(zhuǎn)基因植株成熟種子的直鏈淀粉含量與未轉(zhuǎn)化對(duì)照植株相比，不但沒有提高反而有所下降了。其中代號(hào)為B1-2(20.32％)的下降得最多，比未轉(zhuǎn)化對(duì)照(27.87％)降低了27.09％。另外B1-5(24.54％)、B1-3(22.47％)、B1-4(23.27％)與未轉(zhuǎn)化對(duì)照相比也都下降了，下降幅度分別為11.95％、18.94％和16.05％。當(dāng)將反義sbe3基因轉(zhuǎn)入秈稻后，轉(zhuǎn)基因植株成熟種子的直鏈淀粉含量與未轉(zhuǎn)化對(duì)照植株相比無明顯變化。
表1 導(dǎo)入反義分支酶基因部分片段后轉(zhuǎn)基因水稻T0代植株成熟種子中的直鏈淀粉

*表示與未轉(zhuǎn)化對(duì)照相比，直鏈淀粉含量有顯著提高(5％顯著水平)。
實(shí)施例2利用水稻分支酶基因全長(zhǎng)cDNA序列構(gòu)建反義嵌合基因，導(dǎo)入水稻后對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻種子中淀粉合成的影響。
(1)水稻分支酶基因Sbe1和Sbe3 cDNA的克隆。通過改良的RT-PCR法了合成了水稻未成熟種子胚乳cDNA庫(kù)，并以此為模板，用PCR技術(shù)從粳稻品種武運(yùn)粳7號(hào)中克隆了分別編碼SBE1和SBE1II的兩個(gè)基因Sbe1和Sbe3。序列分析表明，克隆Sbe1和Sbe3基因的大小分別為2490bp和2481bp，包含了基因完整的編碼序列。附圖1為全長(zhǎng)的Sbe1和Sbe3 cDNA核苷酸序列。
(2)全長(zhǎng)反義分支酶嵌合基因表達(dá)載體的構(gòu)建以及轉(zhuǎn)基因水稻植株的獲得。利用我們已克隆的水稻谷蛋白GT1基因翻譯起始密碼子上游1.3kb長(zhǎng)的啟動(dòng)子區(qū)序列。將此Gt1啟動(dòng)子與反向的sbe1和sbe3基因全長(zhǎng)cDNA以及Nos終止子構(gòu)建成融合基因，再將這一融合基因構(gòu)建在雙元載體pCAMBIA1300的多克隆位點(diǎn)中，獲得了雙元載體pYH698和pYH612。鑒定正確的雙元載體經(jīng)凍融法導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105中，用于農(nóng)菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化。按實(shí)施例1中所述轉(zhuǎn)化方法，分別將全長(zhǎng)的反義分支酶基因sbe1和sbe3導(dǎo)入水稻品種武香粳9號(hào)中，獲得轉(zhuǎn)基因水稻植株。
(3)轉(zhuǎn)基因水稻成熟種子中直鏈淀粉含量的變化。按實(shí)施例1中所述測(cè)定方法分析了轉(zhuǎn)基因水稻植株成熟種子中的直鏈淀粉含量。部分T0代轉(zhuǎn)基因水稻植株成熟種子的直鏈淀粉含量測(cè)定結(jié)果列于表2。轉(zhuǎn)入反義分支酶基因后，種子的直鏈淀粉含量有一定程度的提高，如導(dǎo)入全長(zhǎng)反義sbe3基因(轉(zhuǎn)基因植株編號(hào)為612)的轉(zhuǎn)基因水稻植株612-7、612-11和612-31與未轉(zhuǎn)化對(duì)照相比，直鏈淀粉含量有顯著提高(t0.05)，分別提高了18.32％、16.77％和13.19％。而轉(zhuǎn)入全長(zhǎng)反義Sbe1基因的轉(zhuǎn)基因植株(代號(hào)為698)種子中的直鏈淀粉含量無明顯提高。
表2 武香粳9號(hào)轉(zhuǎn)全長(zhǎng)反義分支酶基因水稻T0代部分植株成熟種子的直鏈淀粉直鏈淀粉含量(％)植株代號(hào)重復(fù)一 重復(fù)二 平均值698-1219.902118.577119.240698-1720.234219.421719.828698-1519.142919.649119.396698-6 19.716017.520118.618698-8 20.408318.398519.403612-7 21.865122.286922.076*612-2518.644119.232218.938612-9 20.311619.358819.835612-1121.579722.113021.846*612-3120.400921.822721.112*未轉(zhuǎn)化對(duì)照18.480418.822818.652*表示與未轉(zhuǎn)化對(duì)照相比，直鏈淀粉含量有顯著提高(5％顯著水平)。
實(shí)施例3將反義的sbe1和sbe3兩個(gè)嵌合基因同時(shí)導(dǎo)入同一水稻植株后，對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻種了中淀粉合成的影響。
(1)反義sbe1和sbe3嵌合基因向同一水稻植株的聚合。采用常規(guī)雜交的方法，分別以導(dǎo)入有反義sbe1和sbe3嵌合基因的轉(zhuǎn)基因水稻植株為父母本進(jìn)行配組雜交，所獲F1雜交種植成F1植株。該雜種株經(jīng)PCR和Southern雜交鑒定，確實(shí)同時(shí)含有兩個(gè)反義嵌合基因。
(2)聚合反義sbe1和sbe3嵌合基因的轉(zhuǎn)基因水稻未成熟種子中的淀粉分支酶活性分析。表3顯示聚合有兩個(gè)反義分支酶基因的轉(zhuǎn)基因雜種植株上未成熟種子中的淀粉分支酶活性要明顯低于未轉(zhuǎn)化對(duì)照植株未成熟種子中的淀粉分支酶活性。說明將sbe1和sbe3基因同時(shí)抑制后，未成熟種子中淀粉分支酶活性可明顯降低。
(3)轉(zhuǎn)基因雜種水稻成熟種子中的直鏈淀粉含量。雜種水稻種子成熟后，按單株收獲。對(duì)每一單株的種子進(jìn)行直鏈淀粉含量的測(cè)定，結(jié)果如表4所列。從表中可以看出，轉(zhuǎn)基因雜種水稻成熟種子的直鏈淀粉含量較未轉(zhuǎn)化對(duì)照有明顯提高，其中單粒最高的達(dá)55.90％。說明同時(shí)抑制SBE1和SBE1II基因的表達(dá)后，確實(shí)可以較大幅度地提高水稻種子中直鏈淀粉的相對(duì)含量。
表3 部分轉(zhuǎn)反義sbe1和sbe3基因雜種水稻未成熟種子中的淀粉分支酶活性平均值雜種編號(hào) 組合 單粒未成熟種子分支酶活性(％)(％)19.54 13.70 13.51 13.04 12.16C2905-1 協(xié)青早-sbe1/龍?zhí)馗?sbe3 10.96
10.39 9.59 8.86 7.23 1.5451.72 43.40 36.76 28.95 26.98C2913-1 協(xié)青早-sbe1/龍?zhí)馗?sbe3 28.7926.98 22.73 21.54 15.38 13.465.71 60.29 60.00 59.38 57.14C2918-4 協(xié)青早-sbe1/龍?zhí)馗?sbe3 51.8750.00 44.44 42.63 37.04 32.0850.00 27.78 22.39 20.99 18.75C2946 協(xié)青早-sbe1/龍?zhí)馗?sbe3 20.3015.94 10.14 9.43 7.2575.41 67.31 66.67 65.71 62.30C2933 協(xié)青早/龍?zhí)馗? 60.7860.98 55.00 55.00 50.91 48.48
表4 轉(zhuǎn)基因雜種水稻成熟種子中的直鏈淀粉含量混測(cè)雜種編號(hào) 組合 單粒種子直鏈淀粉含量(％)(％)36.95 35.87 35.84 35.81 34.85C2905-1 協(xié)青早-sbe1/龍?zhí)馗?sbe3 30.0034.58 34.15 33.97 33.20 29.7237.00 36.26 36.21 36.10 35.53C2913-1 協(xié)青早-sbe1/龍?zhí)馗?sbe3 24.3934.53 34.04 33.16 32.98 31.3932.29 31.81 31.29 30.88 30.70C2918-4 協(xié)青早-sbe1/龍?zhí)馗?sbe3 26.4730.60 30.14 29.68 28.84 28.0955.90 50.90 45.25 45.00 42.19C2910-4 龍?zhí)馗?sbe1/特青-sbe3 32.1735.88 35.50 35.00 32.50 30.9430.13 29.98 29.50 29.26 28.28C2942-3 特青-sbe1/龍?zhí)馗?sbe3 25.0226.69 24.50 23.13 22.03 21.5431.31 29.38 29.10 29.10 28.06C2878 未轉(zhuǎn)化對(duì)照龍?zhí)馗?協(xié)青早 26.0727.77 27.54 27.32 27.08 26.0731.97 31.78 31.64 31.10 30.56D2918 未轉(zhuǎn)化對(duì)照特青/龍?zhí)馗? 27.4630.18 30.16 29.61 29.00 28.6權(quán)利要求
1.一種具有高直鏈淀粉含量水稻的培育方法，其特征在于，它包括(1)制備包括編碼水稻分支酶基因或其片段的嵌合基因，其中的分支酶基因或其片段的上游一側(cè)以反義的方向可操作地連接到可在水稻種子胚乳組織中高效特異表達(dá)的啟動(dòng)子核酸片段上，并且其下游一側(cè)連接到可用于轉(zhuǎn)錄終止的調(diào)控序列的核酸片段上；(2)再用嵌合基因轉(zhuǎn)化水稻。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有高直鏈淀粉含量水稻的培育方法，其特征在于，其中編碼分支酶的基因可以為cDNA，也可以是基因組結(jié)構(gòu)基因，這個(gè)基因或其片段的核酸片段源自水稻本身。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的具有高直鏈淀粉含量水稻的培育方法，其特征在于，所述水稻分支酶包括兩類，即水稻分支酶SBE1和水稻分支酶SBE3，以上兩種酶分別由分支酶基因sbe1和分支酶基因sbe3編碼。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的具有高直鏈淀粉含量水稻的培育方法，其特征在于，其中的編碼分支酶基因或其片段的核酸片段編碼水分支酶SBE1和SBE3的全部或一部分。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有高直鏈淀粉含量水稻的培育方法，其特征在于，其中的編碼分支酶基因或其片段的核酸片段是以反義的結(jié)構(gòu)構(gòu)建在嵌合基因中，或者以可形成基于雙鏈RNA的發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)的形式構(gòu)建在嵌合基因中。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的具有高直鏈淀粉含量水稻的培育方法，其特征在于，構(gòu)建的嵌合基因是分別制備sbe1或sbe3基因或其片種子的水段的嵌合基因，或制備同時(shí)含有上述兩個(gè)基因或其片段的嵌合基因。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物學(xué)科，尤其涉及作物育種與植物基因工程領(lǐng)域，屬于生物和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用技術(shù)。本發(fā)明的方法是，它包括(1)制備包括編碼水稻分支酶基因或其片段的嵌合基因，其中的分支酶基因或其片段的上游一側(cè)以反義的方向可操作地連接到可在水稻種子胚乳組織中高效特異表達(dá)的啟動(dòng)子核酸片段上，并且其下游一側(cè)連接到可用于轉(zhuǎn)錄終止的調(diào)控序列的核酸片段上；(2)再用嵌合基因轉(zhuǎn)化水稻。本發(fā)明由于采用基因工程技術(shù)選育具有高直鏈淀粉含量水稻品種的方法，可克服常規(guī)育種中高直鏈淀粉含量水稻資源不足的限制，直鏈淀粉含量最高的可達(dá)55.9％，超過現(xiàn)有水稻品種一倍或更多。并可生產(chǎn)出適用于特殊工業(yè)用途的專用水稻品種。
文檔編號(hào)C12N15/52GK1537941SQ0315835
公開日2004年10月20日 申請(qǐng)日期2003年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月25日
發(fā)明者顧銘洪, 劉巧泉, 于恒秀, 陳秀花 申請(qǐng)人:揚(yáng)州大學(xué)