專利名稱：腸出血性大腸桿菌o157基因缺失疫苗的制作方法
發(fā)明所屬領(lǐng)域本發(fā)明涉及腸出血性大腸桿菌O157減毒疫苗，特別是涉及失去了致病能力但保留其特異免疫原性的ler/stx雙基因缺失突變的腸出血性大腸桿菌O157疫苗菌株。本發(fā)明進(jìn)一步涉及基于所說的減毒菌株的腸出血大腸桿菌疫苗、其生產(chǎn)方法及其在預(yù)防人的腸出血性大腸桿菌O157感染以及預(yù)防腸出血性大腸桿菌O157在反芻動物消化道中定居和繁殖中的應(yīng)用。
發(fā)明的技術(shù)背景腸出血性大腸桿菌(EHEC)是世界范圍內(nèi)流行的一類重要的食物源性病原菌，其主要是通過被污染的食物進(jìn)入體內(nèi)，導(dǎo)致被感染者發(fā)生出血性或非出血性腹瀉、出血性結(jié)腸炎和溶血性尿路綜合癥(Riley，LW.et al，The New EnglandJournal of Medicine，308(12)681-685，1983；Levine，MM.，Journal ofInfectious Diseases，155377-389，1987)。EHEC有多個(gè)血清型，其中最典型的是能夠引起人腸上皮細(xì)胞粘附和脫落(A/E)損傷的O157:H7血清型菌株。大腸桿菌O157:H7菌株具有很強(qiáng)的感染力，大約100-200個(gè)細(xì)菌即可通過胃酸屏障，在腸道內(nèi)大量繁殖并引發(fā)腸道感染(Rowe PC et al.，J.Pediatr.，12421-26，1994)。
近年來，對EHEC O157:H7的全基因組、毒力和致病基因及其調(diào)控的研究不斷深入并取得新的進(jìn)展(例如參見美國專利5,798,260；6,365,723；Science，2771453-1462，1997)。目前已經(jīng)知道，編碼A/E損傷的所有必要基因均位于細(xì)菌染色體上一個(gè)稱為腸細(xì)胞脫落位點(diǎn)(LEE)的編碼毒力相關(guān)基因的特殊區(qū)域——致病島內(nèi)。可引起A/E損傷的大腸桿菌都含有LEE致病島或其同源序列(McDamidl，TK et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，921664-1668，1995)。LEE致病島可分為四個(gè)多順反子，其中多順反子LEE1內(nèi)的第一個(gè)開放閱讀框是編碼LEE致病島轉(zhuǎn)錄活化因子并正調(diào)控LEE致病島表達(dá)的ler(LEE-encodingregulator)基因(Elliott，SJ et al.，Infect.Immun. 674260-4263，1999)。
腸出血性大腸桿菌O157:H7的另一個(gè)重要毒力因子是插入到染色體內(nèi)的原噬菌體編碼的志賀毒素(Stx)(O’Brien，AD et al.，J.Infect.Dis.146763-769，1982；Perna，NT et al.，Infect.Immun.66(8)3810-3817，1998)。由A和B兩個(gè)亞基組成的志賀毒素可在腸道中殺傷上皮細(xì)胞，導(dǎo)致以血性痢疾或無血性腹瀉為臨床特征的腸道炎性損傷。毒素被吸收入血后，可損傷腎小球內(nèi)皮細(xì)胞，造成溶血性尿路綜合癥并進(jìn)而導(dǎo)致腎衰竭。
為了治療腸出血性大腸桿菌O157:H7感染，目前主要還是使用大劑量抗生素。然而，由于抗生素治療可導(dǎo)致嚴(yán)重的腸道菌群失調(diào)和耐藥菌株的發(fā)生，而且某些抗生素會裂解細(xì)菌菌體而引起毒素釋放，所以臨床上大多不主張使用抗生素治療，希望盡早找到一種能夠有效地預(yù)防和治療EHEC O157感染的細(xì)菌疫苗。
美國專利5,354,661號描述了抗腸出血性大腸桿菌O157:H7和大腸桿菌026:H11的單克隆抗體。美國專利6,410,024號描述了大腸桿菌O157:H7志賀樣毒素的抗原決定基、抗這種毒素的抗體及其作為治療和診斷劑的應(yīng)用。美國專利6,365,723號公開了基于大腸桿菌脂多糖O-側(cè)鏈抗原決定基的抗體及口服疫苗。美國專利6,291,435號公開了含有單糖或多糖的復(fù)合物及其在降低EHEC毒力和治療EHEC感染中的應(yīng)用。美國專利6,485,902號公開了使用噬菌體(例如V5)減低腸道內(nèi)大腸桿菌O157水平的方法。美國專利6,383,496號描述了具有RpoS+表型和多基因突變的減毒傷寒沙門氏桿菌、其生產(chǎn)方法及其在疫苗中作為基因遞送載體的應(yīng)用。然而，迄今尚未見有關(guān)成功地制備EHEC O157細(xì)菌疫苗的報(bào)道。
發(fā)明的目的本發(fā)明的一個(gè)目的是提供活的腸出血性大腸桿菌O157:H7減毒菌株，所說的菌株缺失了部分致病基因并保留有足夠的免疫原性。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的部分致病基因是細(xì)菌染色體中的部分ler基因和stx基因。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，所說的細(xì)菌菌株是以遺傳工程方法由親代細(xì)菌細(xì)胞產(chǎn)生的。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，所說的親代細(xì)菌細(xì)胞是野生型腸出血性大腸桿菌O157:H7菌株的細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供生產(chǎn)如上限定的菌株的方法，該方法包括(1)擴(kuò)增得到腸出血性大腸桿菌O157:H7細(xì)胞的部分缺失的ler基因及其旁側(cè)序列DNA片段并將其克隆到適當(dāng)?shù)妮d體中；(2)用步驟(1)得到的重組載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞；(3)使步驟(2)的含重組載體的宿主細(xì)胞與野生型出血性大腸桿菌O157:H7細(xì)胞接觸并發(fā)生DNA轉(zhuǎn)移；(4)傳代培養(yǎng)步驟(3)得到的腸出血性大腸桿菌O157:H7細(xì)胞并篩選得到細(xì)菌染色體中缺失了部分ler基因和stx基因的突變細(xì)胞株。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的腸出血性大腸桿菌O157:H7細(xì)胞是野生型腸出血大腸桿菌O157:H7菌株。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的部分缺失的ler基因片段是缺失了中間部分279個(gè)堿基的ler基因片段及其部分旁側(cè)序列。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的載體是自殺性質(zhì)粒pCVD442。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的宿主細(xì)胞是大腸桿菌SM10λpir。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中步驟(2)的宿主細(xì)胞內(nèi)重組載體向腸出血性大腸桿菌O157:H7細(xì)胞中轉(zhuǎn)移是通過細(xì)胞接合轉(zhuǎn)導(dǎo)方式實(shí)現(xiàn)的。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的染色體中缺失部分ler基因是通過重組載體中部分缺失的ler基因及其旁側(cè)序列DNA與染色體中相應(yīng)DNA區(qū)段發(fā)生同源重組交換實(shí)現(xiàn)的。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的傳代的次數(shù)為大約10-15次。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中傳代導(dǎo)致攜帶stx基因的原噬菌體的丟失。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供用于免疫接種人以預(yù)防腸出血性大腸桿菌O157感染的疫苗組合物，或免疫接種反芻動物以防止腸出血性大腸桿菌O157在其腸道定居繁殖而污染肉制品和外界環(huán)境的疫苗組合物，所說的疫苗組合物含有如上限定的活的腸出血性大腸桿菌O157:H7減毒細(xì)胞株，以及一種或多種醫(yī)藥上可接受的載體或賦形劑。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的活的腸出血性大腸桿菌O157:H7減毒細(xì)胞株是細(xì)菌染色體上缺失了部分ler基因和完整stx基因的突變細(xì)胞株。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的疫苗組合物還可含有一種或多種免疫增強(qiáng)劑、免疫佐劑或免疫調(diào)節(jié)劑。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供預(yù)防人的EHEC O157感染或反芻動物的EHECO157帶菌狀態(tài)的方法，該方法包括給所說的人或反芻動物投用預(yù)防有效量如上限定的疫苗組合物。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的反芻動物指牛、羊、駱駝和鹿。
附圖簡要說明

圖1顯示重組自殺質(zhì)粒pCVD442∷Δler的構(gòu)建流程。
圖2顯示重組自殺質(zhì)粒pCVD442∷Δler的酶切產(chǎn)物和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠(1％)電泳圖譜。其中泳道1是分子量標(biāo)記物；泳道2是重組質(zhì)粒的SacI/Xba I雙酶切片段；泳道3是引物f和引物i的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道4是引物d和Bord 751的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
圖3顯示本發(fā)明的EHEC O157:H7(Δler)菌株和對照菌株的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠(1％)電泳圖譜。其中泳道1是菌株EHEC O157:H7(Δler)；泳道2是菌株EHEC O157:H7(pCVD442∷Δler)；泳道3是萘啶酮酸抗性的野生型菌株EHEC O157:H7(NalR)；泳道4是野生型菌株EHEC O157:H7；泳道5是分子量標(biāo)記物。
圖4顯示基因突變的EHEC O157:H7(Δler/Δstx)的DNA和EHEC O157:H7原噬菌體DNA的PCR鑒定的瓊脂糖凝膠(1％)電泳圖譜。其中泳道1是分子量標(biāo)記物；泳道2和3分別是使用引物FSZ7/FSZ8擴(kuò)增的本發(fā)明的EHEC O157:H7(Δler/Δstx)菌株DNA和野生型EHEC O157:H7菌株DNA；泳道4和5分別是使用引物FSZ5/FSZ7擴(kuò)增的本發(fā)明的EHEC O157:H7(Δler/Δstx)菌株DNA和野生型EHEC O157:H7菌株DNA；泳道6和7分別是使用引物FSZ5/FSZ6擴(kuò)增的本發(fā)明的EHEC O157:H7(Δler/Δstx)菌株DNA和野生型EHEC O157:H7菌株DNA。
圖5A和5B分別顯示與野生型野生型EHEC O157:H7或本發(fā)明減毒突變的EHECO157:H7(Δler/Δstx)細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物上清共保溫的Vero靶細(xì)胞的形態(tài)和生長狀況。
圖6A和6B分別顯示接種野生型EHEC O157:H7細(xì)胞(A)或本發(fā)明突變的EHEC O-157:H7(Δler/Δstx)細(xì)胞(B)后，模型小鼠的組織病理學(xué)改變。圖中顯示的組織從左到右依次是肺組織、肝組織和腸組織。
發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明提供腸出血性大腸桿菌減毒活疫苗，特別是提供失去了致病能力但保留有特異免疫原性的ler/stx雙基因缺失突變的腸出血大腸桿菌O157:H7菌株。本發(fā)明進(jìn)一步提供基于所說的突變菌株的腸出血大腸桿菌減毒疫苗、其生產(chǎn)方法及其在預(yù)防人的腸出血性大腸桿菌O157感染和預(yù)防反芻動物的EHEC O157帶菌狀態(tài)中的應(yīng)用。
腸出血大腸桿菌(EHEC)最重要的毒性是能夠?qū)Ρ桓腥镜娜四c上皮細(xì)胞造成粘附與脫落(A/E)損傷，并且所說的損傷與腸致病性大腸桿菌(EPEC)和兔致病性大腸桿菌(RDEC-1)引起的腸細(xì)胞損傷基本相同。
現(xiàn)在已經(jīng)知道，編碼A/E損傷相關(guān)蛋白質(zhì)的所有基因均位于細(xì)菌染色體上的一個(gè)特定區(qū)域——LEE致病島內(nèi)。對EHEC的代表性菌株O157:H7的LEE致病島全基因序列的分析研究顯示，致病島內(nèi)包括有41個(gè)開放閱讀框架(ORF)(Perna，NT et al.，Infect.Immun.，66(8)3810-17，1998)。
LEE致病島中的第一個(gè)開放閱讀框架是ler(LEE-encoded regulator)基因。ler基因的表達(dá)產(chǎn)物L(fēng)er作為轉(zhuǎn)錄活化因子，其表達(dá)可激活LEE致病島內(nèi)其他相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。腸上皮細(xì)胞表面A/E損傷的發(fā)生是LEE致病島內(nèi)所有致病相關(guān)基因在特定條件下協(xié)同表達(dá)的結(jié)果。已知Ler蛋白是組氨酸樣非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)(H-NS)調(diào)節(jié)因子家族的成員(Arankel，G et al.，Mol.Microbiol.，30911-21，1999)。后者在各種致病性腸細(xì)菌之間具有很高的保守性，并且在結(jié)構(gòu)和功能上均屬于DNA結(jié)合蛋白(Bertin，P et al.，Mol.Microbiol.，31319-29，1998)。H-NS蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上包括位于N-末端的聚合區(qū)和位于C-末端的DNA結(jié)合區(qū)。兩個(gè)區(qū)域通過一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)(Loop 1)相連，并且其中N-末端區(qū)域又包括兩個(gè)亞區(qū)。研究證實(shí)，EHEC的A/E損傷相關(guān)基因和某些A/E損傷無關(guān)基因的表達(dá)受控于同樣存在于LEE致病島內(nèi)的ler基因，即ler基因?qū)EE致病島內(nèi)的致病(特別是致A/E損傷)基因和某些損傷無關(guān)基因起正調(diào)節(jié)作用(參見Elliott，J et al.，Infect.Immun.，68(11)，6615-26，2000；Arankel，Get al.，Mol.Microbiol.，30911-21，1998)。研究還發(fā)現(xiàn)，EHEC與EPEC和RDEC-1在LEE致病島基因結(jié)構(gòu)上具有大約95％的同源性。
引起腸上皮細(xì)胞A/E損傷的另一個(gè)主要基因是作為LEE致病島第22個(gè)開放閱讀框架的eae基因。在EHEC O157:H7 EDL933菌株中，eae基因(2802bp)編碼包括933個(gè)氨基酸殘基的細(xì)菌細(xì)胞粘附相關(guān)蛋白質(zhì)。eae基因在EHEC和EPEC之間也有很高的同源性。
腸出血大腸桿菌O157:H7的再一個(gè)毒力因子是由插入到細(xì)菌染色體上的原噬菌體編碼的志賀毒素(Stx)。Stx家族主要包括Stx 1和Stx 2兩種類型。Stx1的編碼序列具有高度保守性，而Stx 2的編碼序列則又分為幾個(gè)亞型。志賀毒素家族成員的基本結(jié)構(gòu)均包括A和B兩個(gè)亞基。在A和B亞基的協(xié)同作用下，Stx進(jìn)入細(xì)胞并發(fā)揮糖苷酶活性，干擾真核宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡(Tech，VL and O’brien，AD，Mol.Microbiol.，51206-20，1997；Sears，CL and Kaper，JB，Microbiol.Rev.，60167-215，1996)。在腸道中，Stx殺傷腸上皮細(xì)胞，導(dǎo)致廣泛的炎性組織損傷，致使宿主出現(xiàn)血性痢疾或無血性腹瀉等癥狀。如果毒素被吸收入血，還可引起溶血性尿路綜合癥等嚴(yán)重病癥。另外，編碼志賀毒素的原噬菌體一個(gè)重要特點(diǎn)是在傳代過程中有丟失的可能性。腸出血大腸桿菌O157:H7毒力因子的上述這些特征，為構(gòu)建本發(fā)明的疫苗株提供了依據(jù)。
作為一種活的減毒細(xì)菌疫苗株，應(yīng)該在減毒和免疫原性這兩種性質(zhì)間保持平衡。也就是說，這樣的疫苗株不應(yīng)在正常宿主體內(nèi)引發(fā)任何疾病或損傷，同時(shí)被接種后能夠刺激相關(guān)淋巴組織或細(xì)胞發(fā)揮其免疫原活性。然而在本發(fā)明之前，這種理想的平衡一直沒有實(shí)現(xiàn)。推測這可能是由于(1)沒有找到特別適于被刪除的毒力基因；(2)自然條件下EHEC O157:H7對任何實(shí)驗(yàn)動物都不感染，因而難以評價(jià)細(xì)菌的致病性和免疫原性。
本發(fā)明人現(xiàn)已成功地構(gòu)建了保持這種平衡的腸出血大腸桿菌O157:H7減毒細(xì)胞株。本發(fā)明的細(xì)胞株是部分缺失了ler基因和整個(gè)stx基因的雙基因缺失突變細(xì)胞株。我們的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步證實(shí)，本發(fā)明的基因工程細(xì)胞株失去了對Vero細(xì)胞和活體動物模型的致病性，并且具有預(yù)防繼后野生型EHEC O157:H7感染的免疫原性。
為了得到本發(fā)明的減毒細(xì)胞株，本發(fā)明人在以前成功地構(gòu)建了部分ler基因缺失的兔致病大腸桿菌疫苗菌株，并深入研究了該菌株的生長狀態(tài)、致病性和免疫原性的基礎(chǔ)上，在制備本發(fā)明的腸出血性大腸桿菌O157:H7減毒細(xì)胞株的實(shí)踐中，確定以ler基因作為首先被部分缺失的靶基因，然后再以傳代培養(yǎng)方法造成另一個(gè)毒力基因——stx基因的丟失，從而得到失去了致病性但保留有足夠免疫原性的腸出血性大腸桿菌O157:H7減毒細(xì)胞株。
簡單地說，為本發(fā)明的目的，首先利用腸出血大腸桿菌O157:H7菌株作為起始材料，以聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法由該起始菌株的染色體DNA擴(kuò)增得到缺失了279bp的片段，將所說的片段克隆到攜帶氨芐青霉素抗性基因的自殺質(zhì)粒pCVD442(CVD，University of Maryland)中，得到攜帶部分缺失的ler基因(Δler)的重組質(zhì)粒pCVD442∷Δler(參見圖1)。用所說的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌SM10λpir宿主細(xì)胞，并借助接合轉(zhuǎn)導(dǎo)方法將重組自殺質(zhì)粒pCVD442∷Δler從SM10λpir轉(zhuǎn)到EHEC O157:H7中。然后篩選對氨芐青霉素敏感的突變菌株并用PCR方法鑒定之。繼而通過細(xì)菌對氨芐青霉素敏感性、萘啶酮酸(Nal)抗性以及對蔗糖的耐受力篩選和PCR鑒定技術(shù)，以獲得EHEC O157 ler基因缺失菌株。鑒于攜帶stx基因的原噬菌體的不穩(wěn)定性，對如上得到的細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，使含有Δler基因的重組菌株進(jìn)一步消除了攜帶stx基因的原噬菌體，最終得到ler/stx雙基因缺失的腸出血性大腸桿菌突變菌株EHEC O157:H7(Δler/Δstx)。
因此，本發(fā)明的方法包括以下步驟(1)擴(kuò)增得到腸出血性大腸桿菌O157:H7細(xì)胞的部分缺失的ler基因片段并將其克隆到適當(dāng)?shù)妮d體中；(2)用步驟(1)得到的重組載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞；(3)將步驟(2)的宿主細(xì)胞內(nèi)的重組載體轉(zhuǎn)到腸出血大腸桿菌O157:H7細(xì)胞中；(4)傳代培養(yǎng)步驟(3)得到的腸出血大腸桿菌O157:H7細(xì)胞并篩選得到細(xì)菌染色體缺失了部分ler基因和全部stx基因的突變細(xì)胞株。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的腸出血性大腸桿菌O157:H7細(xì)胞是野生型腸出血性大腸桿菌O157:H7菌株。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的部分缺失的ler基因片段是缺失了中間部分279個(gè)堿基的ler基因片段及其部分旁側(cè)序列DNA。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的載體是自殺質(zhì)粒pCVD442。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的宿主細(xì)胞是大腸桿菌SM10λpir。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，其中步驟(2)的宿主細(xì)胞內(nèi)重組載體向腸出血性大腸桿菌O157:H7細(xì)胞中轉(zhuǎn)移是以細(xì)胞接合轉(zhuǎn)導(dǎo)方式實(shí)現(xiàn)的。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的傳代的次數(shù)為大約10-15次。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，其中傳代導(dǎo)致編碼stx基因的原噬菌體的丟失。
更具體地說，首先根據(jù)已報(bào)道的EHEC O157:H7染色體上調(diào)節(jié)基因ler及其兩旁側(cè)DNA序列設(shè)計(jì)并合成彼此互補(bǔ)的兩對引物，以聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法從EHEC O157:H7菌株染色體DNA擴(kuò)增ler基因的兩旁側(cè)序列，然后連接所得到的兩個(gè)片段(片段1和2)，得到缺失了中間部分279bp(相當(dāng)于基因組第4619825-4620103位堿基)的Δler基因片段。然后再將所說的片段與pGEM-T載體(Promega公司)連接并用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。擴(kuò)增后提取質(zhì)粒并進(jìn)行Δler片段鑒定。
另一方面，用適當(dāng)?shù)暮怂醿?nèi)切酶消化攜帶氨芐青霉素抗性基因的自殺載體pCVD442，并將消化產(chǎn)物與用同樣內(nèi)切酶消化得到的Δler基因片段連接，得到重組自殺載體pCVD442∷Δler(參見圖1)。然后，用此連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌SM10λpir感受態(tài)細(xì)胞，得到大腸桿菌SM10λpir(pCVD442∷Δler)(見圖2)。
本發(fā)明中使用的自殺質(zhì)粒pCVD442攜帶有氨芐青霉素抗性基因、sacB基因和RP4基因，因此(1)可借助氨芐青霉素抗性標(biāo)志篩選成功地發(fā)生了質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)的菌株；(2)R6K是依賴于pir基因編碼的π蛋白的復(fù)制起始位點(diǎn)，因此攜帶該基因的自殺質(zhì)粒pCVD442只能在含有pir基因的菌株(包括本發(fā)明中使用的大腸桿菌SM10λpir)內(nèi)復(fù)制；(3)sacB基因編碼果聚糖蔗糖酶，而表達(dá)sacB的革蘭氏陰性菌(包括本發(fā)明中使用的攜帶自殺質(zhì)粒的細(xì)菌)不能在含5％蔗糖的培養(yǎng)基上生長，因此自殺質(zhì)粒pCVD442的這一特征可為菌株篩選提供了一種有用的手段；(4)RP4能夠誘導(dǎo)細(xì)菌接合并促使質(zhì)粒在細(xì)菌間直接轉(zhuǎn)移。
在本發(fā)明中，我們將缺失突變的ler基因插入到pCVD442的多克隆位點(diǎn)內(nèi)，然后再將所得到的質(zhì)粒pCVD442∷Δler轉(zhuǎn)化到受體菌SM10λpir中，由于宿主菌SM10λpir能夠編碼π蛋白，因此帶有R6K質(zhì)粒復(fù)制起始位點(diǎn)的質(zhì)粒pCVD442∷Δler可穩(wěn)定地存在于受體菌SM10λpir內(nèi)并在其中復(fù)制。
本發(fā)明采用接合轉(zhuǎn)導(dǎo)方法將質(zhì)粒pCVD442∷Δler轉(zhuǎn)入受體菌。在宿主菌EHEC O157:H7內(nèi)，質(zhì)粒上部分缺失的ler基因與染色體上的完整ler基因經(jīng)同源重組發(fā)生基因交換，用PCR的方法即可篩選并鑒定出所需的ler基因缺失的突變菌株。
為此，分別培養(yǎng)作為受體菌的腸出血大腸桿菌O157:H7細(xì)胞(該菌株具有萘啶酮酸抗性)，和如上得到的作為供體菌的大腸桿菌SM10λpir(pCVD442∷Δler)。按適當(dāng)比例混合兩種細(xì)菌的培養(yǎng)物并在不含抗生素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜。然后基于兩種細(xì)菌接合轉(zhuǎn)導(dǎo)后所獲得的抗性，在含有氨芐青霉素和萘啶酮酸的瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)并篩選因發(fā)生了質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)而獲得具有兩種抗性的菌株。由于EHEC O157:H7受體細(xì)菌染色體上的ler基因與質(zhì)粒上的Δler基因發(fā)生了同源重組，而且DNA交換后EHEC O157:H7細(xì)菌丟失了自殺載體，因此重組菌株EHECO157:H7(Δler)只含有缺失了279bp的單倍體Δler基因。經(jīng)PCR擴(kuò)增后，ler基因在瓊脂糖凝膠電泳中只呈現(xiàn)一條缺失了279bp的較短的特異帶。然后用菌株EHEC O157:H7(Δler)的染色體作為模板，以PCR擴(kuò)增ler基因片段。分離、純化、測序和序列比較表明，菌株O157:H7(Δler)基因組中缺失了ler基因中間部分的279個(gè)堿基(參見圖3)。
基因敲除是基于DNA同源重組技術(shù)發(fā)展起來的在分子水平上剔除或取代某個(gè)特定基因，然后通過研究基因敲除后個(gè)體的表型性狀變化來推測被敲除之基因的功能的一項(xiàng)技術(shù)。一般說來，由于外源DNA與宿主細(xì)胞DNA自然發(fā)生同源重組的機(jī)率非常低，因此對成功地進(jìn)行了基因敲除的宿主細(xì)胞的篩選是一件非常困難的工作。
本發(fā)明中利用自殺質(zhì)粒pCVD442作為重組基因載體，借助同源重組敲除野生型EHEC O157:H7菌株的ler基因。為此，首先將中間缺失了279bp的ler基因片段插入到pCVD442中，并用所得到的重組質(zhì)粒pCVD442∷Δler轉(zhuǎn)導(dǎo)受體菌EHECO157:H7。自殺質(zhì)粒pCVD442∷Δler在EHEC O157:H7細(xì)胞中可能有三種前途(1)無論是否發(fā)生同源重組，質(zhì)粒都將存在于宿主菌中并形成ler基因二倍體菌株；(2)未發(fā)生同源重組并且宿主菌丟失了質(zhì)粒DNA，即宿主菌未發(fā)生任何變化；(3)發(fā)生了同源重組并且宿主菌丟失了質(zhì)粒DNA，宿主菌EHEC O157基因組發(fā)生ler基因缺失突變。在第一種情況下，即使發(fā)生了同源重組(即染色體上的ler基因交換到了質(zhì)粒上)，但因攜帶完整ler基因的質(zhì)粒依然存在于宿主菌中而不能將其用作本發(fā)明的減毒菌株。第二種情況下，因?yàn)闆]有發(fā)生同源重組并直接丟失了質(zhì)粒，所以宿主菌染色體并未發(fā)生任何變化(即仍然帶有完整的ler基因)。只有在第三種情況下，由于發(fā)生了同源重組(即質(zhì)粒上的ler缺失基因被交換到了宿主菌染色體上)，而且質(zhì)粒也已丟失，所以宿主菌內(nèi)沒有完整的ler基因(參見圖3)。這就是我們期望得到的目的菌株，該菌株與起始菌株的區(qū)別在于其ler基因缺失了中間部分279bp。
然后在適當(dāng)?shù)腖B培養(yǎng)基中對如上篩選的缺失了部分ler基因序列的重組EHEC O157:H7細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)傳代培養(yǎng)。傳至第10-15代后收集細(xì)胞并分離染色體DNA。根據(jù)已報(bào)道的EHEC O157:H7菌株原噬菌體及其旁側(cè)DNA序列，設(shè)計(jì)另外兩對引物并以PCR方法分別擴(kuò)增如上得到的突變菌株EHEC O157:H7(Δler)和野生型EHEC O157:H7的原噬菌體及其旁側(cè)DNA序列，然后進(jìn)行序列比較。結(jié)果表明，EHEC O157:H7(Δler)經(jīng)系列傳代后，進(jìn)一步消除了stx基因(參見圖4)。將經(jīng)過如此基因工程改造的腸出血大腸桿菌定名為EHEC O157:H7(Δler/Δstx).根據(jù)用于專利程序微生物保藏布達(dá)佩斯條約的規(guī)定，該菌株已保藏在中國普通微生物保藏管理中心(CGMCC)。
Stx毒素(又稱為Vero毒素)是由整合到細(xì)菌染色體上的溶原性噬菌體編碼的，是EHEC O157:H7的重要毒力因子。本發(fā)明中，我們在篩選ler基因缺失突變株的同時(shí)還鑒定了目的菌株的stx基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過細(xì)菌傳代培養(yǎng)(傳至第10-15代)，ler基因缺失突變株被消除了攜帶Stx毒素編碼序列的原噬菌體DNA。我們用野生型EHEC O157:H7細(xì)菌的染色體作為模板，以PCR的方法鑒定了ler基因缺失突變株的原噬菌體DNA。因?yàn)榛谠删wDNA插入位點(diǎn)兩旁側(cè)DNA序列設(shè)計(jì)的引物只能從菌株EHEC O157:H7(Δler/Δstx)的DNA擴(kuò)增得到原噬菌體旁側(cè)序列，而不能從中間保留有原噬菌體DNA的模板擴(kuò)增得到同樣的電泳帶，所以可用此方法證實(shí)所構(gòu)建的菌株是否丟失了編碼Stx毒素的原噬菌體DNA序列。由圖6所示的結(jié)果可以看出，使用基于原噬菌體插入位點(diǎn)兩旁側(cè)序列設(shè)計(jì)的引物只能擴(kuò)增得到重組菌染色體上原噬菌體DNA的旁側(cè)序列，而用野生型EHECO157:H7細(xì)菌的染色體作為模板則不能擴(kuò)增得到相應(yīng)的序列。經(jīng)DNA序列分析進(jìn)一步證實(shí)，本發(fā)明的突變菌株EHEC O157:H7(Δler/Δstx)確實(shí)已缺失了編碼Stx毒素的原噬菌體DNA序列(相當(dāng)于細(xì)菌基因組中第1246019-1308726位堿基)。
為了評價(jià)本發(fā)明基因工程改造的腸出血大腸桿菌O157:H7減毒細(xì)胞株的致病性和免疫原活性，我們分別觀察了本發(fā)明的細(xì)胞株對靶細(xì)胞(HEp-2)的體外細(xì)胞粘附活性，對Vero細(xì)胞的毒性作用以及對活體動物(小鼠)的致病性。實(shí)驗(yàn)中，使用野生型腸出血大腸桿菌O157:H7細(xì)胞作為對照。
野生型EHEC O157:H7細(xì)菌對人喉癌上皮細(xì)胞株表現(xiàn)有顯著的局灶性細(xì)胞粘附活性，而本發(fā)明的EHEC O157:H7(Δler/Δstx)突變細(xì)胞株則因缺失了ler基因?qū)EE致病島中其他基因的轉(zhuǎn)錄活化作用，致使細(xì)胞不能表達(dá)足夠的緊密素(由LEE致病島中的eae基因編碼)和相關(guān)粘附因子，從而降低了對靶細(xì)胞的粘附活性。
Stx是細(xì)菌合成并分泌到細(xì)胞外的一種外毒素。在另一項(xiàng)體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)中，將Vero細(xì)胞(作為靶細(xì)胞)分別與不同濃度的野生型或本發(fā)明的EHEC O157:H7細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物上清共保溫后，可見野生型細(xì)菌培養(yǎng)物上清作用的靶細(xì)胞呈圓形改變并有細(xì)胞脫落現(xiàn)象，而減毒細(xì)菌培養(yǎng)物上清作用的靶細(xì)胞則保持正常形態(tài)和生長狀態(tài)(參見圖5)。
因?yàn)橥ǔ５膶?shí)驗(yàn)動物對野生型EHEC O157:H7缺乏敏感性，所以為了完成體內(nèi)生物學(xué)活性實(shí)驗(yàn)，必須首先建立EHEC O157:H7細(xì)菌感染模型。為此，我們預(yù)先用絲裂霉素C和萘啶酮酸處理斷奶不久的小鼠。其中投用絲裂霉素旨在降低動物的機(jī)體抵抗力，而投用萘啶酮酸的目的則是為了抑制動物腸道內(nèi)的正常菌群，以利于繼后接種的對萘啶酮酸具有抗性的野生型EHEC O157:H7或突變的EHECO157:H7(Δler/Δstx)細(xì)菌在動物腸道中的大量繁殖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，預(yù)先用絲裂霉素C和萘啶酮酸處理的小鼠在接種EHEC O157:H7后體重明顯減輕，并于4-6日內(nèi)全部死亡；病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，動物的肝、腎、肺和腸等器官均出現(xiàn)明顯的病理學(xué)損傷。相反，接種本發(fā)明的EHEC O157(Δler/Δstx)細(xì)菌的小鼠則生長正常，并且各主要臟器均未見明顯病理學(xué)改變(參見圖6)。這些結(jié)果表明，本發(fā)明的基因缺失突變菌株EHEC O157(Δler/Δstx)具有良好的安全性。
為進(jìn)行基因缺失突變菌株EHEC O157(Δler/Δstx)的免疫原性評價(jià)，進(jìn)行了主動免疫攻毒實(shí)驗(yàn)和被動免疫攻毒實(shí)驗(yàn)。在主動免疫攻毒實(shí)驗(yàn)中，將20只乳鼠隨機(jī)平分為兩組，一組為免疫組，另一組為對照組(不免疫)。免疫組每只免疫接種5×109CFU的EHEC O157(Δler/Δstx)。14天后兩組小鼠分別以7.2×108CFU的EHEC O157強(qiáng)毒株攻毒。結(jié)果未進(jìn)行免疫接種的對照組10只小鼠4天內(nèi)全部死亡，而免疫組10只小鼠有6只小鼠存活，證實(shí)EHEC O157(Δler/Δstx)菌株具有較好的免疫原性。
在被動免疫實(shí)驗(yàn)中，2只3月齡的母鼠分別以10×1010CFU的EHEC O157(Δler/Δstx)口服免疫接種，7天后以同樣的劑量加強(qiáng)免疫。而對照組的母鼠不免疫。免疫的母鼠所生的19只乳鼠和對照的母鼠所生的10只乳鼠，在7日齡以每只6×108CFU的EHEC O157強(qiáng)毒株經(jīng)消化道攻毒。結(jié)果未進(jìn)行免疫母鼠所生的乳鼠全部死亡，而免疫母鼠所生的乳鼠全部存活。證實(shí)EHEC O157(Δler/Δstx)菌株免疫接種可提供完全的被動免疫保護(hù)作用。
這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分證實(shí)，所構(gòu)建的EHEC O157(Δler/Δstx)基因缺失突變疫苗候選株具有良好的安全性和免疫原性，可提供良好的免疫保護(hù)作用。本發(fā)明的減毒突變菌株保留了其親代野生型菌株的固有免疫原性，因此有可能作為活的減毒細(xì)胞株，用于制備預(yù)防腸出血大腸桿菌O157感染的疫苗制劑。
在自然條件下任何實(shí)驗(yàn)動物均不被EHEC O157細(xì)菌感染，因而難以獲得相應(yīng)的動物模型。鑒于致病大腸桿菌的代表性菌株REPEC O103和RDEC-1與出血性大腸桿菌O157:H7具有相似的主要毒力基因群和致病機(jī)理，并可導(dǎo)致相似的特征性A/E病變，因此研究REPEC O103和RDEC-1主要毒力基因與細(xì)菌致病性和免疫原性的關(guān)系，也可以為EHEC O157疫苗的研制提供有價(jià)值的參考數(shù)據(jù)。
在使用REPEC O103和RDEC-1 ler基因缺失突變株完成的安全性實(shí)驗(yàn)中，給家兔接種REPEC O103 ler基因缺失突變株和RDEC-1 ler基因缺失突變株后，未發(fā)現(xiàn)被接種動物產(chǎn)生任何臨床癥狀和組織病理學(xué)變化。相反，接種相應(yīng)野生型強(qiáng)毒性細(xì)胞株的對照組家兔則產(chǎn)生了典型的組織病理改變甚至最終導(dǎo)致死亡。在免疫保護(hù)性實(shí)驗(yàn)中，接種ler基因缺失突變的REPEC O103細(xì)胞株14天后，被試動物足可耐受繼后野生型REPEC O103強(qiáng)毒細(xì)胞株的攻毒。
鑒于EHEC O157與兔致病大腸桿菌REPEC O103和RDEC-1在基因結(jié)構(gòu)以及致病機(jī)理上的相似性，由兔致病大腸桿菌REPEC O103和RDEC-1的ler基因缺失突變株的研究結(jié)果也可以推斷，本發(fā)明的EHEC O157(Δler/Δstx)基因缺失突變株也應(yīng)具有良好的免疫原性，并且完全有可能作為一種減毒疫苗細(xì)胞株，用于生產(chǎn)針對EHEC O157感染的免疫預(yù)防制劑。
因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供了免疫接種人或反芻動物以預(yù)防腸出血性大腸桿菌O157感染的疫苗組合物，所說的疫苗組合物含有如上限定的活的腸出血大腸桿菌O157:H7細(xì)胞，以及一種或多種醫(yī)藥上可接受的載體或賦形劑根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的活的腸出血大腸桿菌O157:H7減毒細(xì)菌是細(xì)菌染色體上缺失了部分ler基因和完整stx基因的突變細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的疫苗組合物還可含有一種或多種包括弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑在內(nèi)的免疫增強(qiáng)劑或免疫調(diào)節(jié)劑。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供免疫接種人或反芻動物以預(yù)防腸出血性大腸桿菌O157:H7感染的方法，該方法包括給所說的人和反芻動物投用預(yù)防有效量如上限定的疫苗組合物。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的反芻動物包括牛、羊、駱駝和鹿。
本發(fā)明的疫苗組合物可通過口服或胃腸道外途徑預(yù)防接種人，使之獲得針對EHEC O157感染的主動免疫力。另外，也可通過口服或胃腸道外途徑預(yù)防接種包括牛、羊、駱駝和鹿在內(nèi)的反芻動物，以預(yù)防腸出血性大腸桿菌O157在反芻動物消化道中定居和繁殖。
可以使用疫苗生產(chǎn)領(lǐng)域已知的常規(guī)方法，將本發(fā)明的減毒細(xì)胞原液或其稀釋液與一種或多種醫(yī)藥上可接受的載體或賦形劑混合，并根據(jù)需要制成適于口服或非口服給藥的單位計(jì)量形式的疫苗組合物。適于胃腸道外給藥的制劑可含有無菌水或鹽水、聚乙二醇、油等常用的賦形劑。特別是，可以使用生物相容的、生物可降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物、聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物作為賦形劑，制備本發(fā)明疫苗組合物的緩釋制劑。
具體地說，可以使用乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇和甲基纖維素等賦形劑，淀粉、海藻酸鈉、羧甲基纖維素鈣和結(jié)晶纖維素等崩解劑，硬脂酸鎂和滑石等潤滑劑，明膠、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纖維素和羥丙基纖維素等黏結(jié)劑，和蔗糖脂肪酸酯、山梨醇脂肪酸酯等表面活性劑，以及著色劑、矯味劑、香料、分散劑等輔助成分，以常規(guī)方法制備片劑或膠囊形式的疫苗組合物。
或者，可以使用水、生理鹽水、植物油(如橄欖油和花生油)、油酸乙酯和丙二醇等溶劑，氯化鈉和葡萄糖等等滲劑，苯酚、甲酚、對位羥基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、度米酚和山梨酸等防腐劑，抗壞血酸和焦磷酸鈉等抗氧化劑，以常規(guī)方法制備可注射形式的疫苗組合物。在任何情況下，所說的可注射制劑均應(yīng)是無菌和可流動并適于通過注射器注射給藥的。另外，在生產(chǎn)、運(yùn)輸和儲存條件下，所說的制劑還必須是穩(wěn)定的。
為了改善本發(fā)明疫苗組合物的熱穩(wěn)定性和有效儲存期限，可以將細(xì)菌細(xì)胞原液或其稀釋液按適當(dāng)比例與疫苗保護(hù)劑或穩(wěn)定劑混合，然后以常規(guī)方法凍干，制成本發(fā)明疫苗組合物的凍干制劑。其中所說的保護(hù)劑或穩(wěn)定劑例如可以由人血清白蛋白或明膠、海藻糖、谷氨酸鈉、尿素以及山梨醇和/或甘露醇等成分組成。
為了提高本發(fā)明疫苗組合物的免疫接種效果，可以在組合物中加入一種或多種免疫增強(qiáng)劑或免疫調(diào)節(jié)劑。所說的免疫增強(qiáng)劑或免疫調(diào)節(jié)劑包括但不只限于完全或不完全弗氏佐劑。
下列實(shí)施例旨在進(jìn)一步舉例說明，而不是限制本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解到，在不背離本發(fā)明的精神和原則的前提下，對本發(fā)明的任何平行改變和改動都將落入本發(fā)明的待批權(quán)利要求范圍內(nèi)。
實(shí)施例實(shí)施例1腸出血性大腸桿菌O-157:H7減毒細(xì)胞株的構(gòu)建(1)部分缺失的ler基因DNA片段的擴(kuò)增和鑒定按照圖1所示流程構(gòu)建攜帶部分缺失的ler基因(Δler)的重組質(zhì)粒載體。為此，首先分別使用基于ler基因及其旁側(cè)序列設(shè)計(jì)并合成的下列兩對引物(下文中提到的所有引物均以5′-3′方向顯示)引物f(GAGCTCTTTCGCCGAATG)(SEQID NO1)和g(CTCTATAAGCTGAATGTA)(SEQ ID NO2)，以及引物h(TACATTCAGCTTATAGAGGACACTGAAGAAGAA)(SEQ ID NO3)和i(TCTAGATTACGAGTAGAAC)(SEQ ID NO4)，由腸出血大腸桿菌(EHEC)O157:H7染色體DNA(作為PCR模板)擴(kuò)增得到缺失了中間部分279個(gè)堿基(bp)的ler基因的兩旁側(cè)序列。其中引物f和g擴(kuò)增得到長736bp的ler基因的旁側(cè)序列(稱為片段1)，引物h和i擴(kuò)增得到長745bp的ler基因的旁側(cè)序列(稱為片段2)。其中擴(kuò)增反應(yīng)混合物(10×PCR緩沖液2.5μl，dNTP(2.5mmol/L)2μl，MgCl2溶液2μl，引物各0.5μl，模板1.0μl，Taq DNA聚合酶2U)的總體積為25μl。PCR循環(huán)共進(jìn)行30次。
由于引物g與引物h的5’端18個(gè)堿基互補(bǔ)配對，所以如上得到的片段1和片段2經(jīng)瓊脂糖凝膠純化后，可互為模板經(jīng)再次PCR擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)兩片段連接，得到中間缺失了279bp的ler基因缺失片段(Δler)。
純化并回收Δler片段后，將其連接到pGEM-T載體上，并用連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α細(xì)胞。挑選(基于培養(yǎng)皿上的藍(lán)白斑和氨芐青霉素抗性)并培養(yǎng)被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞后提取重組質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定和PCR鑒定以及序列分析。瓊脂糖凝膠電泳和測序結(jié)果顯示，所得的Δler片段具有預(yù)期大小，其中缺失的堿基片段相當(dāng)于基因組第4619825-4620103位堿基的核苷酸序列。
(2)pCVD442∷Δler重組自殺載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌SM10λpir細(xì)胞中提取自殺質(zhì)粒pCVD442并用限制性內(nèi)切酶SacI/XbaI消化質(zhì)粒DNA，然后使用DNA純化試劑盒(Promega公司)回收并純化pCVD442酶切片段。同時(shí)用SacI/XbaI消化重組質(zhì)粒pGEM-T∷Δler并回收Δler(SacI/XbaI)片段(1463bp)。然后，在T4 DNA連接酶存在下使如上酶切并回收的自殺質(zhì)粒pCVD442與Δler片段連接，得到重組自殺質(zhì)粒pCVD442∷Δler(圖1)。用所得到的連接產(chǎn)物(5μl)轉(zhuǎn)化大腸桿菌SM10λpir感受態(tài)細(xì)胞，然后篩選陽性SM10(pCVD442∷Δler)細(xì)胞并提取質(zhì)粒DNA，分別進(jìn)行酶切鑒定和PCR鑒定。鑒定結(jié)果表明，SM10(pCVD442∷Δler)細(xì)胞中重組自殺質(zhì)粒pCVD442∷Δler所攜帶的Δler片段與預(yù)期的大小相同(圖2)。
(3)接合轉(zhuǎn)導(dǎo)在含有萘啶酮酸(Nal，50μg/ml)的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)作為接合受體菌的EHEC O157:H7(NalR)，并在含有氨芐青霉素(Amp，100μg/ml)的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)作為供體菌的大腸桿菌SM10(pCVD442∷Δler)。37℃培養(yǎng)過夜后收集菌體細(xì)胞，并用LB培養(yǎng)基重懸菌體細(xì)胞，并按4∶1的體積比例混合EHEC O157:H7(NalR)和SM10(pCVD442∷Δler)。濾膜過濾所得混合物后，將濾膜置于無抗生素的瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜(37℃)。收集細(xì)菌并系列稀釋，然后在含有萘啶酮酸(50μg/ml)和氨芐青霉素(100μg/ml)的瓊脂平板上繼續(xù)培養(yǎng)過夜。
培養(yǎng)后挑取單個(gè)菌落并提取DNA，使用引物f(GAGCTCTTTCGCCGAATG)(SEQ IDNO5)和Boed 751(AGTTCAGTTATCGTTATCGTT)(SEQ ID NO6)進(jìn)行PCR擴(kuò)增并篩選ler基因二倍體菌株。該菌株的特征是含有質(zhì)粒pCVD442∷Δler。然后再以此菌株DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果得到兩條大小不同的被擴(kuò)增Δler片段的電泳帶。這些結(jié)果表明，受體菌EHEC O157:H7(NalR)和供體菌SM10(pCVD442∷Δler)之間已成功地發(fā)生了接合轉(zhuǎn)導(dǎo)，并致使所得到的菌株EHECO157:H7(NalR)攜帶有來自供體菌SM10(pCVD442∷Δler)的重組質(zhì)粒pCVD442∷Δler，將該菌株命名為EHEC O157:H7(pCVD442∷Δler)。
(4)重組菌株EHEC O157:H7(Δler)的篩選和鑒定將EHEC O157:H7(pCVD442∷Δler)劃線接種于含萘啶酮酸(Nal，50μg/ml)和氨芐青霉素(Amp，100μg/ml)的LB瓊脂平板上，挑取單個(gè)菌落后重新接種于5ml含萘啶酮酸(50μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。過夜培養(yǎng)物經(jīng)系列稀釋后分別涂于含蔗糖的LB(50μg/ml Nal，5％Sucrose，無NaCl)瓊脂平板上，29℃下培養(yǎng)過夜。然后挑取蔗糖培養(yǎng)基篩選的單個(gè)菌落分別接種于只含萘啶酮酸(50μg/ml)和只含氨芐青霉素(100μg/ml)的LB平板上繼續(xù)培養(yǎng)并進(jìn)行PCR鑒定，以篩選所需的EHEC O157:H7(Δler)菌株。
由于EHEC O157:H7染色體上的ler基因與質(zhì)粒上的Δler基因發(fā)生同源重組和交換，而且交換后EHEC O157:H7菌株可丟失自殺載體，所以篩選得到的基因缺失重組菌株O157:H7(Δler)只含有單倍體缺失了279bp的Δler基因，經(jīng)PCR擴(kuò)增后只能得到一條缺失了279bp的較短的特異帶(圖3)。
為了鑒定如上得到的重組菌株O157:H7(Δler)，首先以該菌株的染色體DNA為模板，使用引物Boed 751(AGTTCAGTTATCGTTATCGTT)(SEQ ID NO6)和Primerd(TTAACTAAATGGAAA)(SEQ ID NO7)擴(kuò)增ler基因片段，純化(1％的瓊脂糖凝膠)并回收PCR產(chǎn)物后進(jìn)行序列測定，以確定所構(gòu)建菌株的ler基因缺失情況。
然后，分別對野生型EHEC O157:H7、具有萘啶酮酸抗性的野生型EHECO157:H7(NalR)、攜帶重組自殺質(zhì)粒的EHEC O157:H7(pCVD442∷Δler)以及本發(fā)明的EHEC O157:H7(Δler)等四個(gè)菌株的染色體DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增并比較它們的eae，stx2和fliC鞭毛基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的EHEC O157:H7(Δler)菌株不僅缺失了部分ler基因，同時(shí)通過傳代培養(yǎng)，消除了stx2基因，將該菌株命名為EHEC O157:H7(Δler/Δstx)。
(5)EHEC O157:H7(Δler/Δstx)菌株原噬菌體及其旁側(cè)序列的鑒定與序列分析根據(jù)已報(bào)道的EHEC O157:H7菌株染色體上的原噬菌體DNA及其兩旁側(cè)序列，設(shè)計(jì)并合成如下四條引物FSZ5(GCCGTGCCGCCTCTCTC)(SEQ ID NO8)，F(xiàn)SZ6(CAGAATTACCGAAGATCGTCC)(SEQ ID NO9)，F(xiàn)SZ7(TCGCAGTAACCTTAGTGC)(SEQID NO10)和FSZ8(CGTATAGTGCGCCGGAAG)(SEQ ID NO11)。按如下方案對本發(fā)明菌株和野生型O157:H7菌株的原噬菌體及其旁側(cè)序列進(jìn)行PCR鑒定。
然后，再用引物FSZ7和FSZ8擴(kuò)增本發(fā)明構(gòu)建的基因缺失突變菌株的特異片段，回收并純化后，使用引物FSZ8進(jìn)行序列分析。
從圖4所示的電泳分析結(jié)果可以看出，以野生型O157:H7菌株的DNA為模板，引物用FSZ5/FSZ6和FSZ5/FSZ7能擴(kuò)增出該菌株染色體上的原噬菌體DNA帶。以EHEC O157:H7(Δler/Δstx)菌株的染色體DNA為模板，則不能擴(kuò)增得到相應(yīng)的片段。而使用基于原噬菌體旁側(cè)序列設(shè)計(jì)并合成的引物對FSZ7/FSZ8，能擴(kuò)增出菌株EHEC O157:H7(Δler/Δstx)染色體上的原噬菌體旁側(cè)DNA序列。以野生型EHEC O157:H7菌株的染色體DNA為模板，則因原噬菌體序列過長而不能擴(kuò)增得到相應(yīng)的DNA片段。此結(jié)果表明，菌株EHEC O157:H7(Δler/Δstx)已丟失了編碼stx基因的原噬菌體DNA序列。
分析引物FSZ7和FSZ8之PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列，結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)本發(fā)明的缺失突變菌株在缺失部分ler基因的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步缺失了編碼Stx毒素的原噬菌體DNA序列，其缺失的原噬菌體序列為野生型EHEC O157基因組中第1246019-1308726位堿基的DNA，其缺失長度為62708個(gè)堿基。
實(shí)施例2腸出血性大腸桿菌O157:H7減毒細(xì)胞株的生物學(xué)鑒定(1)Vero細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)于37℃和5％CO2通氣條件下，在DMEM營養(yǎng)液中將Vero細(xì)胞培養(yǎng)至細(xì)胞單層，經(jīng)胰蛋白酶消化后轉(zhuǎn)移到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(1ml/孔)，繼續(xù)培養(yǎng)至長滿細(xì)胞單層。同時(shí)，37℃振蕩培養(yǎng)EHEC O157:H7和O157:H7(Δler/Δstx)細(xì)菌細(xì)胞(16-20小時(shí))，分別取5μl接種于5ml LB中，37℃振蕩培養(yǎng)16-20h，然后離心并過濾收集濾液。
分別將如上得到的EHEC O157:H7或O157:H7(Δler/Δstx)細(xì)菌培養(yǎng)物上清液按遞減容積(200，100，50，10，6，3，1和0.2μl)加到培養(yǎng)的Vero細(xì)胞單層上。以相應(yīng)容積的LB培養(yǎng)基作為對照。同樣在37℃和5％CO2通氣條件下培養(yǎng)24小時(shí)后，觀察細(xì)胞形態(tài)和生長狀況。
結(jié)果可見，在Vero細(xì)胞單層上加0.2μl野生型EHEC O157:H7細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物上清液共保溫后，即可導(dǎo)致靶細(xì)胞的形態(tài)改變(細(xì)胞變圓)、脫落和死亡。相反，加200μl本發(fā)明EHEC O157:H7(Δler/Δstx)細(xì)菌培養(yǎng)物上清液共保溫的Vero細(xì)胞則未出現(xiàn)任何形態(tài)學(xué)和生長狀況改變(圖5)。
(2)細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)在6孔培養(yǎng)板的各孔中置入15×15mm的蓋玻片，然后加入HEp-2細(xì)胞懸液(在DMEM營養(yǎng)液中)并在37℃和5％CO2環(huán)境下培養(yǎng)至蓋玻片上80-90％的區(qū)域長滿單層細(xì)胞。換新鮮的DMEM營養(yǎng)液后，并在營養(yǎng)液中加入D-甘露糖至終濃度為0.5％。然后各孔分別加入野生型O157:H7和O157:H7(Δler/Δstx)細(xì)菌(4×106個(gè)活菌/孔)，并在同樣條件下培養(yǎng)3小時(shí)。培養(yǎng)后，用磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)小心清洗蓋玻片5次。然后處理樣品，并在掃描電子顯微鏡下觀察細(xì)菌對細(xì)胞的粘附。觀察結(jié)果電鏡顯示，野生型O157:H7細(xì)菌對HEp-2細(xì)胞表現(xiàn)有局灶性粘附作用，而本發(fā)明的EHEC O157:H7(Δler/Δstx)細(xì)菌細(xì)胞未見有這樣的活性。
(3)小鼠模型安全性實(shí)驗(yàn)將24只斷奶小鼠(體重約10-15g)隨機(jī)分為四組，每組6只。接種細(xì)菌細(xì)胞前兩天，第1、2和3組動物每只腹腔內(nèi)注射絲裂霉素C(2.5mg/kg)，第4組動物注射蒸餾水作為對照，并在各組動物的飲用水中加入萘啶酮酸(50μg/ml)。第3天，給第1組動物口服接種約4×108個(gè)EHEC O157:H7(Δler/Δstx)細(xì)菌細(xì)胞，第2組動物口服接種約4×108個(gè)野生型EHEC O157:H7細(xì)菌細(xì)胞。第3組為未接種細(xì)菌細(xì)胞的陰性對照組，第4組為空白對照組。接種后每日稱重并觀察動物生長狀況。觀察結(jié)束后對實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。
觀察結(jié)果可見，預(yù)先用絲裂霉素C和萘啶酮酸處理并接種野生型細(xì)菌的所有陽性對照組動物均體重減輕并在第4-6天內(nèi)死亡，而預(yù)先用絲裂霉素C和萘啶酮酸處理并接種本發(fā)明的減毒細(xì)菌的所有實(shí)驗(yàn)組動物均存活，并且平均體重基本接近于未接種細(xì)菌細(xì)胞的陰性和空白對照組動物。
第14天，處死尚存活的動物并對各組所有動物進(jìn)行尸體解剖和大體與鏡下病理學(xué)檢查。結(jié)果大體可見陽性對照組動物的肺臟大面積淤血；肝臟顏色發(fā)暗并輕度腫脹；腎臟呈暗黃色。顯微鏡下則可見肺泡壁毛細(xì)血管屈曲擴(kuò)張并有大量紅細(xì)胞浸潤；肝細(xì)胞索紊亂、肝細(xì)胞呈水皰樣變性并且肝小葉結(jié)構(gòu)異常；腸粘膜細(xì)胞呈卡他性炎性改變。實(shí)驗(yàn)組動物未見明顯的組織學(xué)改變(圖6)。
序列表<110>馮書章<120>腸出血性大腸桿菌O157基因缺失疫苗<141>
<160>11<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物。
<400>1GAGCTCTTTC GCCGAATG 18<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物。
<400>2CTCTATAAGC TGAATGTA 18<210>3<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物。
<400>3TACATTCAGC TTATAGAGGA CACTGAAGAA GAA 33<210>4<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物。
<400>4TCTAGATTAC GAGTAGAAC 19
<210>5<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物。
<400>5GAGCTCTTTC GCCGAATG 18<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物。
<400>6AGTTCAGTTA TCGTTATCGT T 21<210>7<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物。
<400>7TTAACTAAAT GGAAA 15<210>8<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物。
<400>8GCCGTGCCGC CTCTCTC 17<210>9<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物。
<400>9CAGAATTACC GAAGATCGTC C 21
<210>10<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物。
<400>10TCGCAGTAAC CTTAGTGC 18<210>11<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物。
<400>11CGTATAGTGC GCCGGAAG 18
權(quán)利要求
1.腸出血性大腸桿菌O157:H7減毒細(xì)胞株，特征在于所說的細(xì)菌細(xì)胞株缺失了部分致病基因并保留有足夠的免疫原性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)胞株，其中所說的部分致病基因是細(xì)菌染色體中的部分ler基因和stx基因。
3.生產(chǎn)如權(quán)利要求1限定的細(xì)胞株的方法，該方法包括(1)由EHEC O157:H7的染色體為模板，擴(kuò)增得到腸出血性大腸桿菌O157:H7細(xì)胞的部分缺失ler基因片段并將其克隆到適當(dāng)?shù)妮d體中；(2)用步驟(1)得到的重組載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞；(3)使步驟(2)的宿主細(xì)胞與野生型出血性大腸桿菌O157:H7細(xì)胞接觸并發(fā)生DNA交換；(4)傳代培養(yǎng)步驟(3)得到的腸出血性大腸桿菌O157:H7細(xì)胞并篩選得到細(xì)菌染色體中缺失了部分ler基因和stx基因的突變細(xì)胞株。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所說的腸出血性大腸桿菌O157:H7細(xì)胞是野生型腸出血性大腸桿菌O157:H7的菌株。
5.權(quán)利要求3的方法，其中所說的部分缺失的ler基因片段是缺失了中間部分279堿基的ler基因片段。
6.權(quán)利要求3的方法，其中所說的適當(dāng)?shù)妮d體是自殺載體pCVD442。
7.權(quán)利要求3的方法，其中所說的宿主細(xì)胞是大腸桿菌SM10λpir。
8.利要求3的方法，其中步驟(3)的宿主細(xì)胞與腸出血大腸桿菌O157:H7細(xì)胞接觸并發(fā)生DNA交換，是通過細(xì)菌接合轉(zhuǎn)導(dǎo)和同源性交換的方法實(shí)現(xiàn)的。
9.權(quán)利要求3的方法，其中所說染色體中缺失了stx基因是通過細(xì)菌傳代培養(yǎng)消除攜帶stx基因的原噬菌體方法實(shí)現(xiàn)的。
10.免疫接種人以預(yù)防腸出血性大腸桿菌O157感染的疫苗組合物，所說的疫苗組合物含有如權(quán)利要求1限定的腸出血性大腸桿菌O157:H7減毒細(xì)胞株，以及一種或多種醫(yī)藥上可接受的免疫增強(qiáng)劑、免疫調(diào)節(jié)劑或賦形劑。
11.免疫接種反芻動物以預(yù)防腸出血性大腸桿菌O157在消化道的定居和繁殖的疫苗組合物，所說的疫苗組合物含有如權(quán)利要求1限定的腸出血性大腸桿菌O157:H7減毒細(xì)胞株，以及一種或多種醫(yī)藥上可接受的免疫增強(qiáng)劑、免疫調(diào)節(jié)劑或賦形劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及腸出血性大腸桿菌疫苗，特別是涉及消除了致病能力但保留其特異免疫原性的ler/stx雙基因缺失突變的腸出血性大腸桿菌O157H7菌株。本發(fā)明進(jìn)一步涉及基于所說的基因突變菌株的腸出血性大腸桿菌O157疫苗、其生產(chǎn)方法及其在免疫接種人以預(yù)防人腸出血性大腸桿菌O157感染和免疫接種反芻動物以預(yù)防腸出血性大腸桿菌O157在反芻動物消化道的定居和繁殖中的應(yīng)用。
文檔編號C12N15/63GK1600849SQ0315753
公開日2005年3月30日 申請日期2003年9月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月24日
發(fā)明者馮書章, 劉軍, 孫洋 申請人:馮書章