專利名稱：一種醫(yī)用人羊膜組織儲備庫的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人體組織儲備庫的構(gòu)建方法，具體地說涉及一種醫(yī)用人羊膜組織儲備庫的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
隨著社會的不斷發(fā)展和人民生活水平的不斷提高及人口老齡化，由各種疾病導致的慢性難愈合創(chuàng)面創(chuàng)面也日益增多，已經(jīng)成為嚴重危害人民身心健康、降低其生活和工作質(zhì)量，以及增加社會醫(yī)療保障負擔的重要原因。尤其是肛周疾病不僅術(shù)后創(chuàng)面難愈合，而且換藥時患者創(chuàng)口疼痛難忍，創(chuàng)面容易出血或滲血，包扎困難，易被糞便污染，限制患者活動時間長等，給患者造成極大的軀體上和精神上的痛苦。與此同時，因慢性難愈合創(chuàng)面治療所花費的醫(yī)療資源也明顯增加。慢性難愈合創(chuàng)面的防控已經(jīng)成為近年來國內(nèi)乃至國際創(chuàng)面治療的一個難點。人羊膜是胎盤的最內(nèi)層，構(gòu)成胎盤的胎兒部分。它是人胚胎時期羊膜囊擴大的囊壁，附著于絨毛膜內(nèi)表面的透明薄膜。在妊娠晚期，羊膜與絨毛膜雖與緊密相貼但能與絨毛膜完全分開。羊膜組織光滑為含單 層上皮細胞的半透明組織，無血管、神經(jīng)和淋巴管，具有一定的彈性。正常羊膜厚度為0.02-0.5mm，是人體最厚的基底膜。羊膜的基底膜的形態(tài)與皮膚基底膜非常相似，且主要由層粘連蛋白和IV型膠原組成。此外人羊膜是醫(yī)療廢棄物，來源廣泛，取材方便，其作為一種生物敷料較早用于燒傷創(chuàng)面的覆蓋，不僅可以降低創(chuàng)面的炎癥促進上皮化而且抑制瘢痕的形成。但是，實時獲取用與肛周手術(shù)創(chuàng)面的新鮮或凍存滅菌的羊膜組織膜片存在很大的難度，因此，尋找簡單、有效的羊膜保存方法則具有重要的臨床意義和經(jīng)濟意義。人羊膜組織來源豐富容易獲得，含有很多有優(yōu)勢的特征如免疫原性低，抗炎效果顯著而且在獲取細胞的時候也不會損傷人的胚胎等。因此，認為羊膜組織是再生醫(yī)學領(lǐng)域很有應用前景的一種生物材料。但是，目前在足月生產(chǎn)之后一般羊膜與其他胎兒附屬物要求都被丟棄了。因此，無論何時需要，在使用胎膜作為羊膜來源的情況下，難以在分娩之后立即收集胎膜組織。事實上，對胎盤組織的工業(yè)應用(胎盤注射液、胎盤化妝品等)來說，在分娩之后收集的胎盤組織被冷藏以便使用。但新鮮羊膜僅僅從分娩之后立即收集的胎膜中才能大量獲得。即胎膜組織娩出數(shù)小時之后或者經(jīng)長時間冷藏的胎膜組織得到大量羊膜非常困難。由于這種原因，為了在臨床應用中使用來自胎膜的大量羊膜，迫切需要開發(fā)從新鮮的胎膜中制備大量羊膜及冷凍儲存的工藝。人組織儲備庫是在約_80°C冰箱(深低溫)儲存人體組織或搜集存儲組織資源的場所。一個完善的組織庫應具備隨時隨地將健康組織提供臨床使用的能力。目前，在世界范圍內(nèi)，波蘭和印度等國家已建立人體組織儲存庫，儲存骨髓、骨和羊膜等人體組織。人羊膜組織儲備庫所做的工作是將胎膜采集后經(jīng)過分離獲得羊膜冷凍并儲存起來，可分為資料庫和實物庫。資料庫所做的工作是將健康提供者的羊膜進行資料登記，實物庫則是在進行資料登記的同時，采集和儲存健康提供者可供臨床使用的羊膜。目前，國內(nèi)尚無人羊膜組織儲備庫，每年大量的羊膜被廢棄，羊膜資源嚴重流失。因此，本發(fā)明的發(fā)明人付出了許多努力來制備來自胎膜的大量新鮮羊膜且采用輻照滅菌技術(shù)，構(gòu)建人羊膜組織儲備庫，于_80°C冰箱深低溫冷凍儲存大量的人羊膜膜片以便其臨床實時實踐應用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題而提供一種充分利用胎兒附屬物一羊膜為資源的醫(yī)用人羊膜組織儲備庫的構(gòu)建方法。本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
一種醫(yī)用人羊膜組織儲備庫的構(gòu)建方法，包括下述步驟:
(1)人羊膜的選材嚴格遵循供體符合醫(yī)學標準并建立資料檔案；
(2)取供體符合醫(yī)學標準剖腹產(chǎn)或正常分娩的胎膜，從胎膜上鈍性分離羊膜；(3)用磷酸鹽緩沖液或0.9%生理鹽水反復漂洗后，任意剪成一定大小的圓形或方形的膜片，并用無菌縫合線對基底膜面層進行標記；
(4)用含1000U/ml慶大霉素和2.5 μ g/ml 二性霉素B的磷酸鹽緩沖液或0.9%生理鹽水浸泡30 40分鐘；
(5)置入含4% 100%甘油的磷酸鹽緩沖液或0.9%生理鹽水混合液75ml 250m無菌細胞培養(yǎng)瓶中或塑料袋中，置于-20 _80°C深低溫冰箱中冷凍保存；
(6)將上述方法制得的人羊膜片，用鈷60輻照滅菌處理后，輻照劑量為25kGy，即獲得醫(yī)用人羊膜組織片；
(7)將醫(yī)用人羊膜組織片置于-20 -80°C深低溫冰箱冷凍儲存，按膜片面積大小和娩出新生兒性別進行保存，建立可供檢索的羊膜組織膜片信息檔案，即構(gòu)建出醫(yī)用人羊膜組織儲備庫。上述全部過程均在無菌環(huán)境中進行操作。本發(fā)明的優(yōu)點如下:
本發(fā)明所獲得醫(yī)用人羊膜組織儲存于細胞培養(yǎng)瓶和塑料袋中，用含4%甘油的磷酸鹽緩沖液(PBS)或0.9%生理鹽水的培養(yǎng)基，置_80°C深低溫冰箱冷凍儲存，可得到大量人羊膜組織用于臨床創(chuàng)面治療和科學研究。本發(fā)明醫(yī)用人羊膜組織儲備庫的構(gòu)建方法，可從胎膜中獲得大量的羊膜組織，建立系統(tǒng)工程技術(shù)組織儲存庫，它是一種將現(xiàn)有資源充分利用的有效方法，根據(jù)本發(fā)明的方法，存儲于庫內(nèi)的羊膜，能夠長期保存而不失活性，突破了人羊膜組織用于治療的及時性和有效性的技術(shù)瓶頸，為臨床及時提供人羊膜組織膜片治療各種急性或慢性創(chuàng)面。因此，該方法可被用于有效制備管理儲存人羊膜組織片，其操作簡單易行，建庫成本低廉，富有應用前
旦
ο


:
圖1是新鮮羊膜的組織結(jié)構(gòu)圖。

圖2是冷凍羊膜的組織結(jié)構(gòu)圖。圖3是實施例3用冷凍羊膜組織膜片貼敷于壞死性筋膜炎創(chuàng)面的圖示。
具體實施方式
:
下面結(jié)合附圖和具體實施例詳細描述本發(fā)明。實施例1:
本發(fā)明醫(yī)用人羊膜組織儲備庫的構(gòu)建方法，包括下述步驟:
(1)人羊膜的選材嚴格遵循供體符合醫(yī)學標準并建立資料檔案；
(2)取供體符合醫(yī)學標準剖腹產(chǎn)的胎膜，從胎膜上鈍性分離羊膜；如圖1所示。(3)用0.9%生理鹽水反復漂洗后剪成一定大小的長方形的膜片，如IOX 12cm2并用無菌縫合線對基底膜面層進行標記；
(4)用含1000U/ml慶大霉素和2.5 μ g/ml 二性霉素B的0.9%生理鹽水浸泡30分鐘；
(5)置入含4%甘油的0.9%生理鹽水混合液75ml無菌細胞培養(yǎng)瓶中，置于_80°C深低溫冰箱中冷凍保存；
(6)將上述方法制得的人羊膜組織膜片，用鈷60輻照消毒滅菌處理后，輻照劑量25kGy，獲得醫(yī)用人羊膜組織膜片，置于-80°C深低溫冰箱中冷凍保存；即制備出建庫所需的人羊膜組織膜片，如圖2所示。上述操作過程均在嚴格無菌環(huán)境內(nèi)進行，為保證羊膜組織不受污染，所使用的
`0.9%生理鹽水均加入1000U/ml慶大霉素和2.5ug/ml 二性霉素B。羊膜來源的安全控制:取健康正?；蚱矢巩a(chǎn)后的胎膜組織，排除乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、梅毒、獲得性免疫缺陷病毒、巨細胞病毒和衣原體等，對孕婦進行跟蹤檢測，檢測結(jié)果記入每個羊膜的生產(chǎn)記錄檔案。將所獲得的羊膜組織儲存在-80°C深低溫冰箱里，作為庫存的產(chǎn)品。將其詳細信息(包括供者姓名、年齡、住院號、新生兒性別和化驗檢查信息等)輸入電腦數(shù)據(jù)庫，建立完善的數(shù)據(jù)檔案備查詢。實施例2
(O人羊膜的選材嚴格遵循供體符合醫(yī)學標準并建立資料檔案；
(2)取供體符合醫(yī)學標準正常分娩的胎膜，從胎膜上鈍性分離羊膜；
(3)用磷酸鹽緩沖液(PBS)水反復漂洗后剪圓形直徑7cm并用無菌縫合線對基底膜面層進行標記；
(4)用含1000U/ml慶大霉素和2.5 μ g/ml 二性霉素B的磷酸鹽緩沖液(PBS)浸泡40分鐘；
(5)置入含10%甘油的磷酸鹽緩沖液(PBS)混合液150ml塑料袋中，置于_80°C深低溫冰箱中冷凍保存；
(6)將上述方法制得的人羊膜組織膜片，用鈷60輻照滅菌處理后，輻照劑量25kGy，獲得醫(yī)用人羊膜組織膜片，置于-80°C深低溫冰箱中冷凍保存；即制備出人羊膜組織膜片。在臨床試驗時，將上述庫儲存羊膜室溫解凍后備用。將肛腸外科藏毛竇術(shù)后創(chuàng)面進行常規(guī)清創(chuàng)，剔除壞死的表皮和膿性分泌物，清創(chuàng)后創(chuàng)面4X4X3 cm3用消毒紗布浸沾干創(chuàng)面后，開始貼敷膜片，取大于創(chuàng)面外緣Icm的膜片即直徑5cm膜片，按無菌縫合線進行基底膜面層標記將膜片基底膜面貼敷與創(chuàng)面，并使羊膜組織膜片與創(chuàng)面緊密貼敷之間無氣泡，觀察至創(chuàng)面晾干或濕潤無大量滲出物即可。膜片外不需要用其他任何敷料再行對創(chuàng)面進行包扎，患者膜片貼敷后，疼痛明顯減輕，臨床疼痛評分1-2分或無疼痛。身體活動不受限。急性創(chuàng)面經(jīng)局部消毒處理后使用該膜片僅需貼敷一次即可直至創(chuàng)面痊愈，無須反復換藥。實施例3
(O人羊膜的選材嚴格遵循供體符合醫(yī)學標準并建立資料檔案；
(2)取供體符合醫(yī)學標準剖腹產(chǎn)的胎膜，從胎膜上鈍性分離羊膜；
(3)用0.9%生理鹽水反復漂洗后剪成直徑是19X 19cm2并用無菌縫合線進行基底膜面層標記；
(4)用含1000U/ml慶大霉素和2.5 μ g/ml 二性霉素B的0.9%生理鹽水浸泡30分鐘；
(5)置入一盛有準備好滅菌的含100%甘油的0.9%生理鹽水混合液250ml無菌細胞培養(yǎng)瓶中，置于-80°C深低溫冰箱中冷凍保存；
(6)將上述方法制得的人羊膜組織膜片，用鈷60輻照滅菌處理后，輻照劑量25kGy，獲得醫(yī)用人羊膜組織膜片，置于-80°C深低溫冰箱中冷凍保存；即制備出建庫所需的人羊膜組織膜片。在臨床試驗時，將上述庫儲存羊膜組織膜片室溫解凍。將外科患者壞死性筋膜炎(左側(cè)腹股溝區(qū))手術(shù)常規(guī)清創(chuàng)，剔除壞死的表皮、異物。徹底清創(chuàng)后該創(chuàng)面達15X8X7cm3大小，用消毒無菌紗布浸沾干創(chuàng)面后，開始貼敷膜片，取大于創(chuàng)面外緣Icm的羊膜組織膜片，將已標記的基底膜面層膜片貼敷在創(chuàng)面上，并且使膜片與創(chuàng)面之間緊密貼敷無氣泡，如圖3所示。膜片外不需要用其他敷料包扎，創(chuàng)面晾干或濕潤后活動不受限。保持了創(chuàng)面基底部肉芽新鮮，減少了抗生素的應用。因為本病為嚴重感染創(chuàng)面，創(chuàng)面滲出液過多時，羊膜組織片會自行脫落或被溶解，則需換藥重新貼敷羊膜組織膜片直至羊膜組織膜片與創(chuàng)面緊密貼敷，此時創(chuàng)面不再需要進行患藥直至創(chuàng)面 痊愈。創(chuàng)面貼敷后，患者行走活動不受限，疼痛明顯減輕，臨床疼痛評分0-1分，減輕了患者的痛苦和醫(yī)護人員的勞動強度，治療療程短，降低了醫(yī)療費用。本發(fā)明醫(yī)用人羊膜組織儲備庫內(nèi)地膜片也適合于各種手術(shù)后切口、壓瘡、燙傷、燒傷和糖尿病相關(guān)創(chuàng)面等各種急性或慢性創(chuàng)面。
權(quán)利要求
1.一種醫(yī)用人羊膜組織儲備庫的構(gòu)建方法，其特征是包括下述步驟: (1)人羊膜的選材嚴格遵循供體符合醫(yī)學標準并建立資料檔案； (2)取供體符合醫(yī)學標準剖腹產(chǎn)或正常分娩的胎膜，在胎膜娩出5 10分鐘內(nèi)，從胎膜上鈍性分離羊膜； (3)用磷酸鹽緩沖液或0.9%生理鹽水反復漂洗后剪成膜片并用無菌縫合線對基底膜面層進行標記； (4)用含1000U/ml慶大霉素和2.5 μ g/ml 二性霉素B的磷酸鹽緩沖液或0.9%生理鹽水浸泡30 40分鐘； (5)置入一盛有含4% 100 %甘油的磷酸鹽緩沖液或0.9%生理鹽水混合液75 250ml無菌細胞培養(yǎng)瓶或塑料袋中，置于-20 _80°C冰箱中冷凍保存； (6)將上述方法制得的人羊膜片，用鈷60輻照滅菌，輻照劑量為25 35kGy處理后，獲得醫(yī)用人羊膜組織膜片； (7)將上述醫(yī)用人羊膜組織膜片置于-20 -80°C深低溫冰箱冷凍儲存，按膜片面積大小和提供羊膜的新生兒不同性別進行保存，建立可供檢索的羊膜組織片信息檔案，即構(gòu)建出醫(yī)用人羊膜組織儲備庫。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的醫(yī)用人羊膜組織儲備庫的構(gòu)建方法，其特征是所述1000U/ml慶大霉素和2.5 μ g/ml 二性霉素B的0.9%生理鹽水或磷酸鹽緩沖液浸泡時間為40分鐘。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的醫(yī)用人羊膜組織儲備庫的構(gòu)建方法，其特征是所述的甘油為10%滅菌甘油。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的醫(yī)用人羊膜組織儲備庫的構(gòu)建方法，其特征是所述的滅菌方法，采用鈷60輻照，輻照劑量25kGy。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的醫(yī)用人羊膜組織儲備庫的構(gòu)建方法，其特征是所述的低溫冰箱冷凍的溫度為_80°C。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種醫(yī)用人羊膜組織儲備庫的構(gòu)建方法，包括下述步驟1、人羊膜的選材及建檔；2、取供體符合醫(yī)學標準剖腹產(chǎn)或正常分娩的胎膜，分離絨毛膜留取羊膜；3、羊膜用磷酸鹽緩沖液反復漂洗后，剪成膜片；4、用含1000U/ml慶大霉素和2.5μg/ml二性霉素B的磷酸鹽緩沖液浸泡；5、置入含4%～100%甘油的磷酸鹽緩沖液混合液的無菌細胞培養(yǎng)瓶或塑料袋中，于-20-80℃冷凍保存；6、將人羊膜片用鈷60輻照滅菌處理后，獲得醫(yī)用人羊膜組織膜片；7、將羊膜組織膜片置于-80℃冷凍儲存，建立可供檢索的羊膜組織膜片檔案，即構(gòu)建出具有保存時間長并可及時有效用于臨床治療的人羊膜組織膜片儲備庫。
文檔編號C12N5/073GK103074295SQ20131004623
公開日2013年5月1日 申請日期2013年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月6日
發(fā)明者施萍, 龐希寧, 王竟 申請人:施萍