專利名稱：防治煙草青枯病拮抗菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及防治煙草青枯病拮抗菌，同時還涉及該拮抗菌在防治煙草土傳病害方面的應(yīng)用，屬于生物防治領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
煙草青枯病是一類重要的煙草土傳病害，它通常侵染煙草根部，引起作物根部乃至全株的病害，造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。煙草青枯病是一種由布可氏桿菌(Ralstoniasolanacearum)引起的系統(tǒng)性侵染病，煙株一旦染病往往造成整株死亡，其危害往往是毀滅性的，因此常常給煙草生產(chǎn)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。煙草青枯病病原菌主要隨植物殘體遺落于土壤中越冬，也能在種子內(nèi)或田間其它寄主體內(nèi)越冬，帶菌的土壤、病殘組織和含有病菌的有機肥料等是該病的主要初染源，病害的傳播主要靠灌溉水、雨水、帶病苗、農(nóng)具、病土以及人畜的活動等。
目前，生產(chǎn)上主要采用抗病品種和作物輪作等農(nóng)業(yè)措施來防治煙草土傳病害病，但是由于抗病品種需要抗病基因多樣化，并且受環(huán)境的影響比較大，防治效果不理想。作物輪作也是防治煙草青枯病的有效方法之一，但是由于我國人多地少，生產(chǎn)中正常的輪作措施無法實現(xiàn)。植物病理學(xué)家認(rèn)為植物發(fā)病與寄主、病原菌和環(huán)境這三個因素有密切關(guān)系，當(dāng)病原菌與易感寄主相遇在適宜的環(huán)境中，植物就開始發(fā)病，如果修改或根除這三者中的任何一個，就可以減輕或控制植物病害。
大量研究表明，煙田土壤中不僅存在引起煙草病害的微生物而且也存在多種多樣的非致病性的、提高煙草生命力的有益微生物，因而煙草的生物防治以及生態(tài)防治日益受到重視。生物防治措施是利用有益微生物降低植物病原菌對植物的危害，生態(tài)防治則是通過向土壤引入拮抗微生物、培肥土壤和提高土壤中生物多樣性等措施，進(jìn)而使土壤微生態(tài)達(dá)到平衡，最終通過土壤中不同生物之間的拮抗與競爭實現(xiàn)對土壤病害的防治。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供防治煙草青枯病拮抗菌。
為了實現(xiàn)以上目的，本 發(fā)明所采用的技術(shù)方案是提供防治煙草青枯病拮抗菌，所述的拮抗菌為臘狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)QJ-1和黑曲霉(Aspergillusniger)Ty_3 ；其中，蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)QJ-1，保藏單位:中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址:中國武漢武漢大學(xué)，保藏日期:2012年7月5日，保藏號:CCTCC N0:M2012271 ;黑曲霉(Aspergillus niger)Ty-3，保藏單位:中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址:中國武漢武漢大學(xué)，保藏日期:2011年7月8日，保藏號=CCTCC N0:M2011241。
本發(fā)明防治煙草青枯病拮抗菌的篩選方法，包括以下步驟:
I)病原菌分離
選取煙草青枯病發(fā)病的煙株，對煙桿進(jìn)行清洗、消毒，取煙桿上病斑，將感病部位維管束組織切塊后放入牛肉膏蛋白胨細(xì)菌平板培養(yǎng)；待青枯病病原菌生長為菌絲時，挑取菌落純化、培養(yǎng)，接種于牛肉膏蛋白胨斜面保存；2)病原菌致病性鑒定播撒煙草種子，待煙株生長至有維管束組織時，破壞煙草根部并將培養(yǎng)好的青枯病病原菌的菌懸液倒入根部，保持高溫高濕，30d后觀察發(fā)病情況；3) 土壤微生物的分離取染病煙株根際周圍的土壤，加入無菌水，震蕩后靜置，對土壤溶液進(jìn)行濃度梯度稀釋，取稀釋溶液分別在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏一號培養(yǎng)基和孟加拉紅培養(yǎng)基上均勻涂布，培養(yǎng)，挑取單菌落純化并接種至相應(yīng)的斜面培養(yǎng)基保存；4)拮抗菌篩選將培養(yǎng)的不同土壤微生物與青枯病的病原菌在NA培養(yǎng)基上進(jìn)行對峙培養(yǎng)，判斷有無拮抗作用；5)拮抗作用測定用無菌水洗出青枯病病原菌，制備菌懸液，并將菌懸液與NA培養(yǎng)基混合，放置凝固成平板，將對峙培養(yǎng)測出的具有拮抗作用的土壤微生物單個和兩兩混合接種在平板上培養(yǎng)，測定土壤微生物對病原菌的抑菌斑或抑菌帶的大??；6 )對拮抗菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察；7 )對拮抗菌進(jìn)行鑒 定分類。本發(fā)明的目的還在于提供防治煙草青枯病拮抗菌在微生物菌劑方面的應(yīng)用。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案還在于提供防治煙草青枯病拮抗菌在微生物菌劑方面的應(yīng)用。本發(fā)明防治煙草青枯病拮抗菌菌劑的生產(chǎn)方法:將純化的拮抗菌QJ-1和Ty-3分別接種到NA培養(yǎng)基上，于32°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，取5mL無菌水倒斜面，輕輕振蕩，然后準(zhǔn)確吸取ImL菌懸液加入到裝有150mL無菌NA液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，放到32°C的水浴搖床震蕩培養(yǎng)1山然后將培養(yǎng)好的菌懸液按照質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的接種量分別加入到滅菌的麥麩中，32°C培養(yǎng)3d，風(fēng)干即為QJ-1和Ty-3的單菌菌劑。單菌菌劑中QJ-1和Ty_3分別達(dá)到108cfu/g，然后將兩種單菌菌劑按質(zhì)量1:1的比例混合，即為拮抗菌菌劑。本發(fā)明的目的還在于提供防治煙草青枯病拮抗菌在微生物有機肥方面的應(yīng)用。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案還在于提供防治煙草青枯病拮抗菌在微生物有機肥方面的應(yīng)用。本發(fā)明的防治煙草青枯病拮抗菌微生物有機肥的生產(chǎn)方法:按質(zhì)量分?jǐn)?shù)8 12%的添加量把菌劑加入腐熟有機肥均勻地混合，調(diào)節(jié)水分至50 60%，堆成50 80cm的堆垛，堆置5 7d即得。本發(fā)明從改善土壤微生物方面著手，從原位土壤篩選拮抗菌，并研究了防治煙草青枯病拮抗菌在微生物菌劑和微生物有機肥中的應(yīng)用。拮抗菌與有機肥料混合制得的微生物有機肥料能顯著降低煙草青枯病，該肥料提供有效營養(yǎng)和功能菌，并使拮抗菌在土壤中迅速定殖，調(diào)節(jié)土壤微生態(tài)平衡抑制青枯病。通過向煙田施用這種功能性有機肥能夠達(dá)到提高煙株自身抵御青枯病的能力，提高煙葉品質(zhì)和減少化肥、農(nóng)藥用量的目的。


圖1為從原位土壤中分離得到的細(xì)菌菌株QJ-1的革蘭氏染色；圖2為從原位土壤中分離得到的真菌菌株Ty-3 ；圖3為QJ-1和Ty-3混合與青枯病菌對峙生長I天；圖4為Ty-3孢子的顯微形態(tài)圖。
具體實施例方式煙草青枯病病原菌取自福建省邵武市煙區(qū)具有較典型病癥的煙株，并取病株根際周圍的土壤。培養(yǎng)基的配制:牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:NaCl 5g，牛肉膏3g，蛋白胨10g，瓊脂20g，加水定容至1L，ρΗ7.4 7.6，121°C 滅菌 20min。高氏一號培養(yǎng)基:可溶性淀粉20g, KNO3 lg, K2HPO4 0.5g，MgSO4.7H20 0.5g，NaCl0.5g，F(xiàn)eSO4.7H20 0.0lg，瓊脂20g, pH7.4 7.6。配制時，先用少量冷水，將淀粉調(diào)成糊狀，倒入少于所需水量的沸水中，在火上加熱，邊攪拌邊依次逐一溶化其他成分，溶化后，補足水分到IOOOmL,調(diào)pH，121°C滅菌20min。孟加拉紅培養(yǎng)基:蛋白胨5g，葡萄糖10g，KH2PO4 lg, MgSO4.7H20 0.5g，瓊脂20g，1/3000孟加拉紅溶液lOOmL，氯霉素0.lg。上述各成分加入蒸餾水中溶解后，再加孟加拉紅溶液。另用少量乙醇溶解氯霉素 ，加入培養(yǎng)基中，分裝后，121°C滅菌20min。NA培養(yǎng)基:酵母浸膏12g，蔗糖20g, K2HPO4 4g，瓊脂20g, ρΗ7.0 7.2，加水定容到1L，121°C滅菌20min。NA液體培養(yǎng)基與NA培養(yǎng)基的區(qū)別在于，NA液體培養(yǎng)基不加瓊脂。麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基(MEA):麥芽汁150mL，瓊脂3g，pH自然(約6.4)，121°C滅菌20mino實施例1、煙草青枯病拮抗菌的分離與篩選I)病原菌分離分離病菌前，先將煙桿沖洗干凈，再用75%的酒精對煙桿和小刀消毒，接著在無菌條件下用小刀剖開煙株莖桿上的病斑，將感病部位維管束組織切成若干小塊，用滅菌的鑷子夾取煙塊放入牛肉膏蛋白胨細(xì)菌平板培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，每皿中放5塊，重復(fù)3皿，培養(yǎng)溫度為32°C，培養(yǎng)時間為48h。待青枯病煙塊與培養(yǎng)基接觸處長出白色流動性菌落并且向外分散細(xì)小菌體，接種于牛肉膏蛋白胨保存。顯微照片顯示青枯病病原菌菌體桿狀，兩端鈍圓，有鞭毛，無莢膜，革蘭氏染色陰性。2)致病性鑒定選用煙草K326為試驗品種。于盆缽內(nèi)將煙草種子播種后，待煙株生長到有維管束組織時，將煙草的根部破壞并將培養(yǎng)好的青枯病病原菌稀釋濃度梯度制成菌懸液，于煙草根圍倒入50mL菌懸液，并保持高溫高濕。30d后觀察發(fā)病情況。根據(jù)Koch氏法則，將青枯病發(fā)病煙株中分離的病原菌株接種到健康煙草植株上，以測定其致病性。將分離出的青枯病病原供試菌株接種20株健康煙草，經(jīng)過30d后有15株煙草出現(xiàn)了青枯病癥狀。3) 土壤微生物的分離
取得青枯病煙株根際周圍的土壤10g，放入90mL無菌水的三角瓶中，震蕩30min后靜置20min，然后稀釋至10'Kr5和l(T6g/mL，分別吸取不同濃度的溶液0.1mL在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏一號培養(yǎng)基和孟加拉紅培養(yǎng)基上均勻涂布，每種重復(fù)3皿,置于32°C溫箱中培養(yǎng)48h后，挑取單菌落進(jìn)行純化并移入相應(yīng)的斜面培養(yǎng)基上保存。經(jīng)過平板稀釋涂布分離，從土壤中共獲得5種細(xì)菌、4種真菌和4種放線菌。將細(xì)菌分別編號為QJ-1到QJ-5，真菌編號為Ty-1到Ty-4，放線菌編號為QF-1到QF-4。細(xì)菌中QJ-1為革蘭氏陽性菌，其余4株菌均為革蘭氏陰性菌，QJ-1革蘭氏染色照片如圖1所示。Ty-3的菌落形態(tài)圖如圖2所示。4)拮抗菌株的 篩選將分離得到的土壤微生物和青枯病病原菌在NA培養(yǎng)基上進(jìn)行對峙培養(yǎng)。培養(yǎng)基涂布青枯病病原菌，中間接種分離得到的土壤微生物，兩菌相距均為3mm，于2d后檢查培養(yǎng)結(jié)果，根據(jù)菌落發(fā)展速度、菌落之間有無抑制帶等來判斷分離的土壤微生物對病原菌有無拮抗作用。通過對峙培養(yǎng)，從分離得到的土壤微生物中篩選出3株對煙草青枯病病菌具有拮抗作用的菌株，分別為QJ-UQJ-3和Ty-3。5)拮抗作用測定用無菌水洗出培養(yǎng)24h的青枯病的病原菌，制成菌懸液，吸取ImL的菌懸液于滅菌后的培養(yǎng)皿中，然后倒入45-50°C的的NA培養(yǎng)基15mL，放置2h凝固后成平板，將對峙培養(yǎng)測出的具有拮抗作用的土壤微生物單個和兩兩混合接種在平板上培養(yǎng)，每種重復(fù)3皿，于32°C下培養(yǎng)2d后觀察病原菌的生長情況，并測定土壤微生物對病菌的抑菌斑或抑菌帶的大小，其中QJ-1和Ty-3混合菌抑菌帶最大，達(dá)到9mm，具有較好的抑制青枯病病原菌的作用，如圖3所示。6)拮抗機理QJ-1和Ty-3對煙草青枯病病菌的拮抗機理:QJ-1和Ty-3能產(chǎn)生某些代謝產(chǎn)物，該物質(zhì)能有效抑制青枯病病原菌的生長，兩者混合互相促進(jìn)抑制病原菌物質(zhì)的產(chǎn)生，增強抑菌能力。實施例2、形態(tài)學(xué)觀察QJ-1菌初期菌落平展，乳白色，光滑，不透明。Ty-3菌初期白色菌絲，后產(chǎn)生深棕色或黑褐色孢子，孢子豐富。實施例3、拮抗菌的鑒定分類經(jīng)中科院微生物研究所鑒定結(jié)果為:1、QJ-1 為臘狀芽抱桿菌(Bacillus cereus)。I)細(xì)胞形態(tài)及理化試驗結(jié)果革蘭氏陽性，細(xì)胞為桿狀，細(xì)胞直徑大于I μ m，形成芽孢，芽孢不膨大；VP試驗、甲基紅試驗、淀粉水解、分解酪素、水解明膠、接觸酶、氧化酶、硝酸鹽還原反應(yīng)、利用檸檬酸鹽均呈陽性；產(chǎn)酸反應(yīng)表現(xiàn)為:葡萄糖陽性，木糖、L-阿拉伯糖、甘露醇、乳糖陰性。2) 16S rRNA基因序列測定結(jié)果GCAGTCGAGC GATGGATTAA GAGCTTGCTC TTATGAAGTT AGCGGCGGACGGGTGAGTAA CACGTGGGTA ACCTGCCCAT AAGACTGGGA TAACTCCGGG
AAACCGGGGC TAATACCGGA TAACATTTTGAACTGCATGG TTCGAAATTG
AAAGGCGGCT TCGGCTGCCA CTTATGGATGGACCCGCGTC GCATTAGCTA
GTTGGTGAGG TAACGGCTCA CCAAGGCAACGATGCGTAGC CGACCTGAGA
GGGTGATCGG CCACACTGGG ACTGAGACACGGCCCAGACT CCTACGGGAG
GCAGCAGTAG GGAATCTTCC GCAATGGACGAAAGTCTGAC GGAGCAACGC
CGCGTGAGTG ATGAAGGCTT TCGGGTCGTAAAACTCTGTT GTTAGGGAAG
AACAAGTGCT AGTTGAATAA GCTGGCACCTTGACGGTACC TAACCAGAAA
GCCACGGCTA ACTACGTGCC AGCAGCCGCGGTAATACGTA GGTGGCAAGC
GTTATCCGGA ATTATTGGGC GTAAAGCGCGCGCAGGTGGT TTCTTAAGTC
TGATGTGAAA GCCCACGGCT CAACCGTGGAGGGTCATTGG AAACTGGGAG
ACTTGAGTGC AGAAGAGGAA AGTGGAATTCCATGTGTAGC GGTGAAATGC
GTAGAGATAT GGAGGAACAC CAGTGGCGAAGGCGACTTTC TGGTCTGTAA
CTGACACTGA GGCGCGAAAG CGTGGGGAGCAAACAGGATT AGATACCCTG
GTAGTCCACG CCGTAAACGA TGAGTGCTAAGTGTTAGAGG GTTTCCGCCC
TTTAGTGCTG AAGTTAACGC ATTAAGCACTCCGCCTGGGG AGTACGGCCG
CAAGGCTGAA ACTCAAAGGA ATTGACGGGGGCCCGCACAA GCGGTGGAGC
ATGTGGTTTA ATTCGAAGCA ACGCGAAGAACCTTACCAGG TCTTGACATC
CTCTGAAAAC CCTAGAGATA GGGCTTCTCCTTCGGGAGCA GAGTGACAGG
TGGTGCATGG TTGTCGTCAG CTCGTGTCGTGAGATGTTGG GTTAAGTCCC
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ATCGCGGATC AGCATGCCGC GGTGAATACGTTCCCGGGCC TTGTACACAC
CGCCCGTCAC ACCACGAGAG TTTGTAACACCCGAAGTCGG TGGGGTAACC
TTTTCAAAAT
3)gyrB基因序列測定結(jié)果
TGACGGCGGC GGTTATAAAG TTTCTGGTGGTTTGCATGGT GTTGGGGCAT
CTGTAGTAAA TGCTCTATCA ACAGAACTAGAGGTATTTGT ACATCGTGAA
GGTAAAATCC ATTATCAAAA ATACGAAAGAGGTATTCCAG TTGCGGATTT
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CAGCTTTAAC TCGTGTGATT AACGATTACG GTCGTAAAAA TAGTATTTTAAAAGATGCAG ACAGTAACTT AACTGGCGAG GATGTTCGTG AAGGTTTAACTGCAATCGTA TCAATTAAAC ATCCAAATCC ACAATTTGAA GGACAAACGAAGACGAAACT TGGGAATAGT GAAGCGAGAA CGATTACAGA GTCTGTGTTTTCAGAGGCAT TTGAAAAGTT CTTACTAGAA AACCCAAACG TTGCACGAAAAATTGTGGAA AAAGGTACGA TGGCAGCACG TGCGCGTGTT GCAGCGAAAAAAGCACGTGA ATTAACACGC CGTAAGAGTG CGTTAGAAGT TTCAAGCTTACCTGGTAAAT TAGCAGATTG CTCTTCAAAA GATCCAGCAA TTAGCGAAATTTATATTGTA GAGGGTGATT CTGCCGGCGG ATCAGCAAAG CAAGGTCGTGACCGTCACTT CCAGGCGATT TTACCGCTAA AGGGTAAAAT TATTAACGTTGAAAAAGCAA GATTAGATAA AATTTTATCT AACGATGAAG TGCGTACAATTATTACTGCA ATTGGTACGA ACATTGGCGG AGATTTTGAT ATTGAGAAAGCTCGTTATCA TAAAGTTATT ATTATGACGG ACGCCGACGT CGACGGCTCGCACATCCG4)發(fā)酵條件 種子培養(yǎng)基為NA液體培養(yǎng)基，發(fā)酵初始pH為7.5，250mL三角瓶裝瓶量為150mL，32°C搖床轉(zhuǎn)數(shù)為150r/min，發(fā)酵時間為24h，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的接種量接種到麩皮中培養(yǎng)72h后，自然晾干至水分含量小于30%。2、Ty-3 為黑曲霉(Aspergillus niger)I)菌落形態(tài)及顯微特征麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基(MEA)上菌落生長快，25°C黑暗條件下7天菌落直徑50 63mm,質(zhì)地絨狀；產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)大量形成，分生孢子頭深褐色至黑褐色，初期球形，后期裂開為幾個柱狀結(jié)構(gòu)；菌落背面淺褐色，無水溶性色素。分生孢子梗高大，寬6 15 μ m,壁光滑,直或彎曲；頂囊球形，直徑22 30 μ m,全部表面可育；產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)雙層；分生孢子近球形，淺到褐色，壁粗糙或具小刺，3.0 4.8 μ m。未見有性孢子如圖4所示。2) rRNA基因序列測序結(jié)果:(包括18S rRNA 片段，ITSl、5.8S rRNA、ITS2 區(qū)全序列及 28S rRNA 序列片段)GATCCGAGGTCACCTGGAAAGAATGGTTGGAAAACGTCGGCAGGCGCCGGCCAATCCTACAGAGCATGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGATCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCCGGAGAGGGGGACGGCGACCCAACACACAAGCCGGGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTAGTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCATTGTTGAAAGTTTTAACTGATTGCATTCAATCAACTCAGACTGCACGCTTTCAGACAGTGTTCGTGTTGGGGTCTCCGGCGGGCACGGGCCCGGGGGGCAGAGGCGCCCCCCCGGCGGCCCACAAGCGGCGGGCCCGCCGAAGCAACAGGGTACAATAGACACGGATGGGAGGTTGGGCCCAAAGGACCCGCACTCGGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTTAC4)發(fā)酵條件種子培養(yǎng)基為NA液體培養(yǎng)基，發(fā)酵初始pH為7.5，250mL三角瓶裝瓶量為150mL，32°C搖床轉(zhuǎn)數(shù)為150r/min，發(fā)酵時間為24h，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的接種量接種到麩皮中培養(yǎng)72h后，自然晾干至水分含量小于30%。實施例4、拮抗菌菌劑的生產(chǎn)將純化的拮抗菌QJ-1和Ty-3分別接種到NA斜面培養(yǎng)基上，于32°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，取5mL無菌水倒斜面，輕輕振蕩，然后準(zhǔn)確吸取ImL菌懸液加入到裝有150mL無菌NA液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，放到32°C的水浴搖床震蕩培養(yǎng)ld，然后將培養(yǎng)好的菌懸液按照質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的接種量分別加入到滅菌的麥麩中，32°C培養(yǎng)3d，風(fēng)干即為QJ-1和Ty-3的單菌菌劑。單菌菌劑中QJ-1和Ty-3分別達(dá)到108cfu/g，然后將兩種單菌菌劑按質(zhì)量1:1的比例混合，即為拮抗菌菌劑。實施例5、微生物有機肥的生產(chǎn)按質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的接種量把拮抗菌菌劑加入腐熟有機肥中均勻地混合，調(diào)節(jié)水分至50-60%，堆成80cm的堆 垛，堆置5d后即得。腐熟有機肥的制備方法:畜禽糞便調(diào)節(jié)水分至50-60%，堆成1.1m高，每天翻堆，堆肥溫度逐漸升高，當(dāng)溫度下降至接近室溫時，發(fā)酵結(jié)束，即為腐熟的有機肥。實驗例1、防治煙草青枯病效果分析1,2012年在福建省邵武市煙區(qū)進(jìn)行大田試驗I)施肥時期:本發(fā)明通過兩次施用微生物有機肥達(dá)到抑制青枯病的目的。第一次，將微生物有機肥以基肥形式施入，使土壤中有益菌在煙株生長的前期就能夠大量增加，從而抑制病原菌在土壤中的生長，使其數(shù)量大大減少。第二次，在當(dāng)?shù)厍嗫莶〖磳l(fā)生時以追肥(高濃度菌肥:水=1:10)的形式施入，利用有益菌的大量繁殖來抵抗青枯病菌的生長和繁殖。2)供試土壤及區(qū)組設(shè)計:土壤為砂質(zhì)壤土，地勢平坦，排灌方便，基礎(chǔ)肥力為:有機質(zhì)40.6g/kg、堿解氮198.5mg/kg、速效磷(P2O5) 20.52mg/kg、速效鉀(K2O) 80.43mg/kg，pH 為 5.52。供試烤煙品種為K326。采用漂浮育苗技術(shù)育苗，用膜下小苗移栽技術(shù)移栽，移栽后按優(yōu)質(zhì)煙生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范要求進(jìn)行管理。每個處理三個重復(fù)，各小區(qū)的栽培技術(shù)措施、管理操作要求基本保持一致。試驗共設(shè)置四個處理:處理A:對照，當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)施肥與管理；處理B:微生物有機肥以基肥(250g/株)形式施入；處理C:微生物有機肥以基肥(200g/株)+追肥(灌根50g/株)形式施入；處理D:微生物有機肥以追肥(灌根50g/株)形式施入。3)調(diào)查測定項目在當(dāng)?shù)厍嗫莶“l(fā)病期間，觀察記錄不同處理青枯病初發(fā)病的日期、發(fā)病率及發(fā)病速度并計算病情指數(shù)，從發(fā)病開始，每周記錄一次；病情分級標(biāo)準(zhǔn)按全國煙草行業(yè)煙草病害調(diào)查分級標(biāo)準(zhǔn)Yc/T39—1996進(jìn)行，青枯病調(diào)查方法:0級，全株無??；1級，莖部偶有退綠條斑，或(和)以下葉片或頂葉輕度凋萎，或下部少數(shù)葉片出現(xiàn)病斑；2級，莖部有明顯黑色條斑但未達(dá)煙株頂部，或(和)病側(cè)半數(shù)以上或部分腰葉以上葉片凋萎；3級，莖部黑色條斑到達(dá)煙株頂部，或(和)病側(cè)葉片全部凋萎，或全株大部分葉片凋萎；4級，病株枯死。病情指數(shù)和防治效果按煙草病害藥效試驗方法Yc/T40-1996計算:
權(quán)利要求
1.防治煙草青枯病拮抗菌，其特征在于，所述的拮抗菌為蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)QJ-1 和黑曲霉(Aspergillus niger) Ty-3 ;其中，臘狀芽孢桿菌(BacillusCereUS)QJ-l，保藏單位:中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址:中國武漢武漢大學(xué)，保藏日期:2012 年 7 月 5 日，保藏號:CCTCCN0:M2012271o
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的防治煙草青枯病拮抗菌，其特征在于，所述黑曲霉(Aspergillus niger)Ty-3，保藏單位:中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址:中國武漢武漢大學(xué)，保藏日期:2011年7月8日，保藏號=CCTCC N0:M2011241。
3.防治煙草青枯病拮抗菌在微生物菌劑方面的應(yīng)用。
4.防治煙草青枯 病拮抗菌在微生物有機肥方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了防治煙草青枯病拮抗菌及其應(yīng)用，該拮抗菌為蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)QJ-1和黑曲霉(Aspergillus niger)Ty-3；其中，QJ-1保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址中國武漢武漢大學(xué)，保藏日期2012年7月5日，保藏號CCTCC NO:M2012271；Ty-3保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址中國武漢武漢大學(xué)，保藏日期為2011年7月8日，保藏號CCTCCNO:M2011241。本發(fā)明的拮抗菌蠟狀芽孢桿菌QJ-1和黑曲霉Ty-3組合可制成菌劑，將菌劑與有機物料發(fā)酵制成的微生物有機肥能提供有效營養(yǎng)和功能菌，有效的防治煙草青枯病。
文檔編號C12N1/14GK103146600SQ20131004617
公開日2013年6月12日 申請日期2013年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月5日
發(fā)明者李紅麗, 盧阿虔, 王巖 申請人:鄭州大學(xué)