專利名稱：一種抗煙草青枯病的枯草芽孢桿菌菌劑的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種抗煙草青枯病的菌劑，具體地說是一種抗煙草青枯病的枯草芽孢桿菌菌劑的制備方法，屬于生物菌劑領域。
背景技術：
煙草青枯病是一種細菌病害，在各煙區(qū)普遍發(fā)生，常常暴發(fā)流行，造成毀滅性損失。該病病源青枯雷爾氏菌和青枯假單胞桿菌，能侵染30余科的200多種植物。對煙草、 番茄、花生及馬鈴薯侵害更明顯。常與黑脛病等根莖病害混合發(fā)生，危害更嚴重。枯草芽孢桿菌(feciBm subtiHs)廣泛存在于自然界中，該菌作為植物病害生物防治細菌之一，由于該菌能產生耐熱的芽孢，即易于生產、菌劑的加工，又易于存活、定植和繁殖。批量生產工藝簡單，成本也較低，施用方便，儲存期長，而且其菌劑的穩(wěn)定性與化學農藥的相容性、以及與不同植物不同年份防治效果的一致性方面均優(yōu)于不產生芽孢的細菌和真菌，是一種較理想的生防微生物。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于，提供了一種對煙草青枯病害具有高效、無毒、安全以及對環(huán)境無污染的微生物枯草芽孢菌劑的制備方法。在芽孢桿菌發(fā)酵后期，通過合理調節(jié)發(fā)酵生產參數(shù)的控制、添加調配功能性的有機氮源，促使芽孢桿菌在后期代謝性生長，產生堿性蛋白的代謝，再通過調整發(fā)酵工藝控制參數(shù)，促使菌體形成芽孢，當菌體芽孢形成率達到陽 65%以上時，不再做發(fā)酵液pH的調整，讓其自然變化，當發(fā)酵液菌體形成芽孢率在85%以上，最終發(fā)酵液pH值自然提高至 7. 7 8.0時，發(fā)酵結束。本發(fā)明的技術方案
一種抗煙草青枯病的枯草芽孢桿菌菌劑的制備方法，包括以下步驟
1、菌種活化對保藏的枯草芽孢桿菌進行活化培養(yǎng)至芽孢脫落；
活化所用的培養(yǎng)基配方為牛肉胨3g，蛋白胨5g，瓊脂16g，水定容至IOOOml ；用于枯草芽孢桿菌的活化及活菌數(shù)的測定；
2、搖床擴大培養(yǎng)將活化后的枯草芽孢桿菌接種到液體培養(yǎng)基中進行搖床擴大培養(yǎng)。 初始PH值為7. 0 7. 2，培養(yǎng)溫度為30°C，搖床轉速為200rpm，至15 20%的芽孢脫落為止；
所用的液體培養(yǎng)基的配方為玉米粉6. 5g，葡萄糖2. 5g，豆餅粉10. Ig,魚粉2. 5g， CaCO3 3. 5g, (NH4)2SO4 0. 5g, K2HPO4 0. 15g, MgSO4 · 7H20 0. lg, MnSO4 · H2O 0. lg，水定容至 500ml。3、種子罐擴大培養(yǎng)在無菌操作下，將搖床擴大培養(yǎng)得到的菌液接入到含有種子罐培養(yǎng)基的種子罐內，初期通風比1 0. 25，即一立方發(fā)酵液一分鐘通氣量為0.25立方， 后期通風比1 1 ；同時，控制發(fā)酵液的PH值為6. 9 7. 3，溫度為32°C，發(fā)酵罐的攪拌轉速為80 220 rpm ；至芽孢桿菌進入對數(shù)生長期的后期；
及時進行對種子發(fā)酵液的檢查和對芽孢桿菌生長狀況的觀測；菌種接種后1 菌體生長處于指數(shù)生長中期；當芽孢桿菌進入對數(shù)生長期的后期，進行無菌轉種接入發(fā)酵罐，進行發(fā)酵；
所用的種子罐培養(yǎng)基配方為玉米粉12. 98g，葡萄糖5g，豆餅粉20. lg，魚粉5g，CaCO3 6. 90g, (NH4)2SO4 lg, K2HPO4 0. 3g, MgSO4 · 7H20 0. 2g, MnSO4 · H2O 0. 2g，水定容至 1000ml。4、發(fā)酵罐發(fā)酵
將培養(yǎng)至指數(shù)生長期后期的種子罐菌液在無菌條件下轉入裝有發(fā)酵罐培養(yǎng)基的發(fā)酵罐，罐裝量為發(fā)酵罐容積的70%，進行發(fā)酵罐的前期培養(yǎng)和后期培養(yǎng)；
(1)發(fā)酵罐前期培養(yǎng)方法為對接入種子液的發(fā)酵罐，溫度觀 32°C，pH6.9 7. 3，通風量1 0. 25 1. 1，攪拌轉速150 180 rpm ；保持發(fā)酵液總糖含量0. 35 0. 6%、總氮含量30 45ng/ml，培養(yǎng)至芽孢形成率55 65%，進入發(fā)酵后期；
發(fā)酵罐前期培養(yǎng)期間要及時檢查和觀測菌種生長狀況，隨著菌種的增長，菌體密度的增加，逐漸加大通風量，增加溶氧，提高轉速，以配合菌種生長的需氧量，同時，通過與發(fā)酵罐相連的無菌補液罐來維持發(fā)酵液PH值；
(2)發(fā)酵罐后期培養(yǎng)方法為不再調節(jié)發(fā)酵液pH值，使用有機氮源調節(jié)發(fā)酵液的總氮含量，控制總氮含量在40ng/ml以上，培養(yǎng)至芽孢形成率80%以上、pH值7. 7以上，后期發(fā)酵結束；
所述的發(fā)酵罐培養(yǎng)基的配方為玉米粉12. 98g，葡萄糖5g，豆餅粉20. Ig,魚粉5g， CaCO3 6. 90g, (NH4)2SO4 lg, K2HPO4 0. 3g, MgSO4 · 7H20 0. 2g, MnSO4 · H2O 0. 2g，水定容至 1000ml ；
所述的有機氮源的制備方法為將花生餅粉、黃豆餅粉、棉子餅粉、酵母粉、蠶蛹粉、魚粉按照重量比為1 :1:1:1:1: 1的比例混合，調制成重量分數(shù)為9% 16%的混合溶液，加入到反應釜內；然后在反應釜內通過流加質量分數(shù)為6 10%的鹽酸控制溶液的 PH為6. 0，來進行消化水解，同時保持溫度120°C、壓力0. IMPa，水解25分鐘，提取水解液； 向水解液中加入重量分數(shù)為15%的玉米漿和重量比為1 :1:1:1: 1的纈氨酸、L-色氨酸、色氨酸、硫氨基酸組成的混合氨基酸溶液，配成固形物含量為重量分數(shù)16% 18%的有機氮源，比例為水解液、玉米漿和混合氨基酸溶液的混合質量比為1 1 1。5、菌劑的制備
發(fā)酵結束后，降低發(fā)酵通風比至1 0.08，維持發(fā)酵罐壓力0.02MPa，降低攪拌轉速至 20rpm，對發(fā)酵液降溫至10°C以下；
通過膜過濾濃縮處理，將發(fā)酵液體積濃縮至原來的1/5 1/8。添加濃縮液體積量的 0. 07%調配緩沖保護劑(磷酸二氫鈉與磷酸氫二鈉混合而成的pH8. 0的溶液)，混合均勻后， 對濃縮后的發(fā)酵液進行噴霧干燥處理，得到菌劑產品。所述的噴霧干燥方法為對干燥塔、旋風分離器進行30分鐘的120°C的熱風滅菌， 然后降低熱風溫度至80°C，依次開啟引風機、鼓風機、加熱器、進料泵、閉風器，調整物料流量至150 180Kg/h、通風量至5000 8000m3/h，開啟隔膜泵泵入調配好的發(fā)酵液，進行產品的噴霧干燥，得到成品菌劑，菌粉質量指標為水分小于3. 5%，每克菌數(shù)大于2000億，菌體芽孢形成率大于85% ；芽孢大量出現(xiàn)的時間均在發(fā)酵菌的對數(shù)生長期和以后的一段時間，在偏堿環(huán)境中有利于芽孢的形成。發(fā)酵過程分的四個生長時期一延遲期、對數(shù)生長期、發(fā)酵前期和發(fā)酵后期；延遲期約為2 3h，發(fā)酵9小時進入對數(shù)生長時期，菌體生長非常的迅速，菌體數(shù)量增長很快，發(fā)酵13小時有10%的芽孢形成。在不調節(jié)pH值得情況下，在發(fā)酵的前11個小時 PH值一直在下降，從7. 2下降至6. 0 ；發(fā)酵13小時后，菌種開始逐漸分泌堿性蛋白抗生素， PH開始逐漸上升，最終達到7. 7以上。在這過程中，通過后期補加有機氮源，使得菌體形成代謝性生長，堿性蛋白抗生素提高了 30ng/ml以上，同時利于芽孢的正常生成，最終獲得一種高效抗煙草青枯病的枯草芽孢菌劑。與現(xiàn)有的方法相比本發(fā)明方法的優(yōu)勢是除了得到形成芽孢的休眠菌體，還得到提高了 30ng/ml以上的堿性蛋白抗生素，同時，提高了菌體芽孢形成率達85%以上。本發(fā)明菌劑的使用方法和使用量如下
1、制成菌體濃度約2000萬個/ mL的菌液，約為一克菌粉配制成1升菌液。2、對田間發(fā)病煙草根部位、外表面均勻噴施抗菌菌液；或者煙苗移植過程中，對煙苗根部噴施，菌體濃度約2000萬個/ mL,噴施量5ml/株，這樣用量更少，效果更好。3、每畝煙草使用量650克左右。本發(fā)明菌劑的防病、治療效果如下 一、防治效果
1、煙苗移種根部處理
(1)對移種煙苗根部處理，生長三周后，煙苗病發(fā)現(xiàn)象為0. 09%。(2)未作處理煙苗發(fā)病率7. 1%。2、移苗前，沒做噴施處理，移苗后，對田間煙草噴施處理和未作噴施處理對比 (1)對田間煙草噴做施處理，煙草發(fā)病率為0.36%。(2)未作處理煙苗發(fā)病率7. 1%。從以上結果可以看出對田間煙草噴未做噴施處理的發(fā)病率是做過噴施處理的20 倍左右，該菌劑防治效果良好。二、治療效果
發(fā)病煙草菌劑噴施處理對出現(xiàn)的發(fā)病病株，進行菌體濃度約3000萬個/ mL的菌液對發(fā)病菌株的根部、病株表面噴施，噴施量每株50ml左右；空白對照對發(fā)病菌株僅僅噴施水。結果對于噴施水的煙葉，3天后，枯萎率達49%，6天后94%枯萎。經菌液處理的病株，在3天后，91 %的病株發(fā)病狀況得到初步控制，6天后87%發(fā)病株得到好轉，隨后繼續(xù)生長，表現(xiàn)出了較好的治療效果。說明經過本發(fā)明的菌液處理后，能有較好治療效果，減少煙農的損失。本發(fā)明的優(yōu)點在于在菌體發(fā)酵的這過程中，通過后期補加有機氮源，使得菌體形成代謝性生長，提高堿性蛋白抗生素的產生，同時利于芽孢的正常生成，最終獲得一種高效抗煙草青枯病的枯草芽孢菌劑。
具體實施例方式以下對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行說明，應當理解，此處所描述的優(yōu)選實施例僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
除非另有說明，本發(fā)明中所采用的百分數(shù)均為重量百分數(shù)。實施例1
一種抗煙草青枯病的枯草芽孢桿菌菌劑，其制備方法包括以下步驟
1、菌種活化對從市場上購買的斜面保藏的枯草芽孢桿菌B908活化培養(yǎng)至芽孢脫落；
活化培養(yǎng)基(NA)配方為牛肉胨3g，蛋白胨5g，瓊脂16g，水定容至IOOOml ；
2、搖床擴大培養(yǎng)將活化后的枯草芽孢桿菌接種到液體培養(yǎng)基中進行搖床擴大培養(yǎng)， 初始PH值為7. 0，培養(yǎng)溫度為30°C，搖床轉速為200rpm，至15%的芽孢脫落為止；
所用的液體培養(yǎng)基的配方為玉米粉6. 5g，葡萄糖2. 5g，豆餅粉10. Ig,魚粉2. 5g， CaCO3 3. 5g, (NH4)2SO4 0. 5g, K2HPO4 0. 15g, MgSO4 · 7H20 0. lg, MnSO4 · H2O 0. lg，水定容至 500ml ；
3、種子罐擴大培養(yǎng)在無菌操作下，將搖床擴大培養(yǎng)后得到的菌液接入到含有種子罐培養(yǎng)基的種子罐內，初期通風比量1 0. 25，后期通風比1 1 ；同時，控制發(fā)酵液的pH值為6. 9，溫度為32°C，發(fā)酵罐的攪拌轉速為SOrpm ；至芽孢桿菌進入對數(shù)生長期的后期；
所用的種子罐培養(yǎng)基配方為玉米粉12. 98g，葡萄糖5g，豆餅粉20. lg，魚粉5g，CaCO3 6. 90g, (NH4)2SO4 lg, K2HPO4 0. 3g, MgSO4 · 7H20 0. 2g, MnSO4 · H2O 0. 2g，水定容至 1000ml ；
4、發(fā)酵罐發(fā)酵
將培養(yǎng)至指數(shù)生長期后期的種子罐菌液在無菌條件下轉入裝有發(fā)酵罐培養(yǎng)基的發(fā)酵罐，罐裝量為發(fā)酵罐容積的70%，進行發(fā)酵罐的前期培養(yǎng)和后期培養(yǎng)；
(1)發(fā)酵罐前期培養(yǎng)對接入種子液的發(fā)酵罐，溫度^°C，pH6.9，通風量1 0. 25，攪拌轉速150rpm ；保持發(fā)酵液總糖含量0. 35%、總氮含量30ng/ml，培養(yǎng)至芽孢形成率55%，進入發(fā)酵后期；
(2)發(fā)酵后期培養(yǎng)不再調節(jié)發(fā)酵液pH值，使用有機氮源補充發(fā)酵液的總氮含量，控制總氮含量在40ng/ml以上，培養(yǎng)至綜合芽孢形成率80%以上，pH值7. 7以上，發(fā)酵結束；
所述的發(fā)酵罐培養(yǎng)基的配方為玉米粉12. 98g，葡萄糖5g，豆餅粉20. Ig,魚粉5g， CaCO3 6. 90g, (NH4)2SO4 lg, K2HPO4 0. 3g, MgSO4 · 7H20 0. 2g, MnSO4 · H2O 0. 2g，水定容至 1000ml ；
所述的有機氮源的制備方法為將等質量的花生餅粉、黃豆餅粉、棉子餅粉、酵母粉、蠶蛹粉、魚粉混合，調制成重量分數(shù)為9% 16%的混合溶液，加入到反應釜內；然后在反應釜內通過流加質量分數(shù)為6 10%的鹽酸控制溶液的pH為6. 0，來進行消化水解，同時保持溫度120°C、壓力0. IMPa，水解25分鐘，提取水解液；向水解液中加入重量分數(shù)為15%的玉米漿和等質量的纈氨酸、L-色氨酸、色氨酸、硫氨基酸組成的混合氨基酸溶液，配成固形物含量為重量分數(shù)16% 18%的有機氮源，比例為水解液、玉米漿和混合氨基酸溶液的混合質量比為1 1 1 ；
5、菌劑的制備
發(fā)酵結束后，降低發(fā)酵通風比至1 0.08，維持發(fā)酵罐正壓0.02MPa，降低攪拌轉速至 20rpm，對發(fā)酵液降溫至至10°C以下；
通過膜過濾濃縮處理，將發(fā)酵液體積濃縮至原來的1/5。添加濃縮液體積量的0. 07%調配緩沖保護劑(即磷酸二氫鈉與磷酸氫二鈉配成的PH8. 0的混合溶液)混合均勻后，對濃縮后的發(fā)行噴霧干燥處理；所述的噴霧干燥方法為對干燥塔、旋風分離器進行30分鐘的120°C的熱風滅菌，然后降低熱風溫度至80°C，依次開啟引風機、鼓風機、加熱器、進料泵、閉風器，調整物料流量 150Kg/小時、通風量5000m3/小時，開啟隔膜泵泵入調配好的發(fā)酵液，進行產品的噴霧干燥， 得到成品菌劑。
實施例2
一種抗煙草青枯病的枯草芽孢桿菌菌劑，其制備方法包括以下步驟
1、菌種活化對從市場上購買的斜面保藏的枯草芽孢桿菌B908活化培養(yǎng)至芽孢脫落；
活化培養(yǎng)基(NA)配方為牛肉胨3g，蛋白胨5g，瓊脂16g，水定容至IOOOml ；
2、搖床擴大培養(yǎng)將活化后的枯草芽孢桿菌接種到液體培養(yǎng)基中進行搖床擴大培養(yǎng)， 初始PH值為7. 1，培養(yǎng)溫度為30°C，搖床轉速為200rpm，至18%的芽孢脫落為止；
所用的液體培養(yǎng)基的配方為玉米粉6. 5g，葡萄糖2. 5g，豆餅粉10. Ig,魚粉2. 5g， CaCO3 3. 5g, (NH4)2SO4 0. 5g, K2HPO4 0. 15g, MgSO4 · 7H20 0. lg, MnSO4 · H2O 0. lg，水定容至 500ml ；
3、種子罐擴大培養(yǎng)在無菌操作下，將搖床擴大培養(yǎng)后的菌液接入到含有種子罐培養(yǎng)基的種子罐內，初期通風比量1 0. 25，后期通風比1 1 ；同時，控制發(fā)酵液的pH值為 7. 1，溫度為32°C，發(fā)酵罐的攪拌轉速為150 rpm ；至芽孢桿菌進入對數(shù)生長期的后期；
所用的種子罐培養(yǎng)基配方為玉米粉12. 98g，葡萄糖5g，豆餅粉20. lg，魚粉5g，CaCO3 6. 90g, (NH4)2SO4 lg, K2HPO4 0. 3g, MgSO4 · 7H20 0. 2g, MnSO4 · H2O 0. 2g，水定容至 1000ml ；
4、發(fā)酵罐發(fā)酵
將培養(yǎng)至指數(shù)生長期后期的種子罐菌液在無菌條件下轉入裝有發(fā)酵罐培養(yǎng)基的發(fā)酵罐，罐裝量為發(fā)酵罐容積的70%，進行發(fā)酵罐的前期培養(yǎng)和后期培養(yǎng)；
(1)發(fā)酵罐前期培養(yǎng)對接入種子液的發(fā)酵罐，溫度30°C，pH7.1，通風量1 0.7，攪拌轉速165 rpm ；保持發(fā)酵液總糖含量0. 5%、總氮含量38ng/ml，培養(yǎng)至芽孢形成率60%，進入發(fā)酵后期；
(2)發(fā)酵后期培養(yǎng)不再調節(jié)發(fā)酵液pH值，使用有機氮源補充發(fā)酵液的總氮含量，控制總氮含量在40ng/ml以上，培養(yǎng)至綜合芽孢形成率80%以上，pH值7. 7以上，發(fā)酵結束；
所述的發(fā)酵罐培養(yǎng)基的配方為玉米粉12. 98g，葡萄糖5g，豆餅粉20. Ig,魚粉5g， CaCO3 6. 90g, (NH4)2SO4 lg, K2HPO4 0. 3g, MgSO4 · 7H20 0. 2g, MnSO4 · H2O 0. 2g，水定容至 1000ml ；
所述的有機氮源的制備方法為將等質量的花生餅粉、黃豆餅粉、棉子餅粉、酵母粉、蠶蛹粉、魚粉混合，調制成重量分數(shù)為13%的混合溶液，加入到反應釜內；然后在反應釜內通過流加質量分數(shù)為8%的鹽酸控制溶液的pH為6. 0，來進行消化水解，同時保持溫度120°C、 壓力0. IMPa，水解25分鐘，提取水解液；向水解液中加入重量分數(shù)為15%的玉米漿和由等質量的纈氨酸、L-色氨酸、色氨酸、硫氨基酸組成的混合氨基酸溶液，配成固形物含量為重量分數(shù)17%的有機氮源，比例為水解液、玉米漿和混合氨基酸溶液的混合質量比為1 1 1 ；
5、菌劑的制備
發(fā)酵結束后，降低發(fā)酵通風比至1 0. 08，維持發(fā)酵罐正壓0. 02MPa,降低攪拌轉速至 20rpm，對發(fā)酵液降溫至至10°C以下；通過膜過濾濃縮處理，將發(fā)酵液體積濃縮至原來的1/6。添加濃縮液體積量的0. 07%調配緩沖保護劑(即磷酸二氫鈉與磷酸氫二鈉配成的PH8. 0的混合溶液)混合均勻后，對濃縮后的發(fā)行噴霧干燥處理；
所述的噴霧干燥方法為對干燥塔、旋風分離器進行30分鐘的120°C的熱風滅菌，然后降低熱風溫度至80°C，依次開啟引風機、鼓風機、加熱器、進料泵、閉風器，調整物料流量 16^(g/小時、通風量6500m3/小時，開啟隔膜泵泵入調配好的發(fā)酵液，進行產品的噴霧干燥， 得到成品菌劑。
實施例3
一種抗煙草青枯病的枯草芽孢桿菌菌劑，其制備方法包括以下步驟
1、菌種活化對從市場上購買的斜面保藏的枯草芽孢桿菌B908活化培養(yǎng)至芽孢脫落；
活化培養(yǎng)基(NA)配方為牛肉胨3g，蛋白胨5g，瓊脂16g，水定容至IOOOml ；
2、搖床擴大培養(yǎng)將活化后的枯草芽孢桿菌接種到液體培養(yǎng)基中進行搖床擴大培養(yǎng)， 初始PH值為7. 2，培養(yǎng)溫度為30°C，搖床轉速為200rpm，至20%的芽孢脫落為止；
所用的液體培養(yǎng)基的配方為玉米粉6. 5g，葡萄糖2. 5g，豆餅粉10. Ig,魚粉2. 5g， CaCO3 3. 5g, (NH4)2SO4 0. 5g, K2HPO4 0. 15g, MgSO4 · 7H20 0. lg, MnSO4 · H2O 0. lg，水定容至 500ml ；
3、種子罐擴大培養(yǎng)在無菌操作下，將搖床擴大培養(yǎng)后的菌液接入到含有種子罐培養(yǎng)基的種子罐內，初期通風比量1 0. 25，后期通風比1 1 ；同時，控制發(fā)酵液的pH值為 7. 3，溫度為32°C，發(fā)酵罐的攪拌轉速為220 rpm ；至芽孢桿菌進入對數(shù)生長期的后期；
所用的種子罐培養(yǎng)基配方為玉米粉12. 98g，葡萄糖5g，豆餅粉20. lg，魚粉5g，CaCO3 6. 90g, (NH4)2SO4 lg, K2HPO4 0. 3g, MgSO4 · 7H20 0. 2g, MnSO4 · H2O 0. 2g，水定容至 1000ml ；
4、發(fā)酵罐發(fā)酵
將培養(yǎng)至指數(shù)生長期后期的種子罐菌液在無菌條件下轉入裝有發(fā)酵罐培養(yǎng)基的發(fā)酵罐，罐裝量為發(fā)酵罐容積的70%，進行發(fā)酵罐的前期培養(yǎng)和后期培養(yǎng)；
(1)發(fā)酵罐前期培養(yǎng)對接入種子液的發(fā)酵罐，溫度32°C，pH7.3，通風量1 1.1，攪拌轉速180 rpm ；保持發(fā)酵液總糖含量0. 6%、總氮含量45ng/ml，培養(yǎng)至芽孢形成率65%，進入發(fā)酵后期；
(2)發(fā)酵后期培養(yǎng)不再調節(jié)發(fā)酵液pH值，使用有機氮源補充發(fā)酵液的總氮含量，控制總氮含量在40ng/ml以上，培養(yǎng)至綜合芽孢形成率80%以上，pH值7. 7以上，發(fā)酵結束；
所述的發(fā)酵罐培養(yǎng)基的配方為玉米粉12. 98g，葡萄糖5g，豆餅粉20. Ig,魚粉5g， CaCO3 6. 90g, (NH4)2SO4 lg, K2HPO4 0. 3g, MgSO4 · 7H20 0. 2g, MnSO4 · H2O 0. 2g，水定容至 1000ml ；
所述的有機氮源的制備方法為將等質量的花生餅粉、黃豆餅粉、棉子餅粉、酵母粉、蠶蛹粉、魚粉混合，調制成重量分數(shù)為16%的混合溶液，加入到反應釜內；然后在反應釜內通過流加質量分數(shù)為6 10%的鹽酸控制溶液的pH為6. 0，來進行消化水解，同時保持溫度 120°C、壓力0. IMPa，水解25分鐘，提取水解液；向水解液中加入重量分數(shù)為15%的玉米漿和由等質量的纈氨酸、L-色氨酸、色氨酸、硫氨基酸組成的混合氨基酸溶液，配成固形物含量為重量分數(shù)18%的有機氮源，比例為水解液、玉米漿和混合氨基酸溶液的混合質量比為 1:1:1;5、菌劑的制備
發(fā)酵結束后，降低發(fā)酵通風比至1 0. 08，維持發(fā)酵罐正壓0. 02MPa,降低攪拌轉速至 20rpm，對發(fā)酵液降溫至至10°C以下；
通過膜過濾濃縮處理，將發(fā)酵液體積濃縮至原來的1/8。添加濃縮液體積量的0. 07%調配緩沖保護劑(即磷酸二氫鈉與磷酸氫二鈉配成的PH8. 0的混合溶液)混合均勻后，對濃縮后的發(fā)行噴霧干燥處理；
所述的噴霧干燥方法為對干燥塔、旋風分離器進行30分鐘的120°C的熱風滅菌，然后降低熱風溫度至80°C，依次開啟引風機、鼓風機、加熱器、進料泵、閉風器，調整物料流量 ISOKg/小時、通風量8000m3/小時，開啟隔膜泵泵入調配好的發(fā)酵液，進行產品的噴霧干燥， 得到成品菌劑。 最后應說明的是以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明， 盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，對于本領域的技術人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換。 凡在本發(fā)明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。
權利要求
1.一種抗煙草青枯病的枯草芽孢桿菌菌劑的制備方法，其特征在于由以下方法制備而成(1)菌種活化對保藏的枯草芽孢桿菌進行活化培養(yǎng)至芽孢脫落；(2)搖床擴大培養(yǎng)將活化后的枯草芽孢桿菌接種到液體培養(yǎng)基中進行搖床擴大培養(yǎng)， 初始PH值為7. 0 7. 2，培養(yǎng)溫度為30°C，搖床轉速為200rpm，至15 20%的芽孢脫落為止；(3)種子罐擴大培養(yǎng)在無菌操作下，將搖床擴大培養(yǎng)得到的菌液接入到含有種子罐培養(yǎng)基的種子罐內，初期通風比1 0.25，后期通風比1 1 ；同時，控制發(fā)酵液的pH值為 6. 9 7. 3，溫度為32°C，發(fā)酵罐的攪拌轉速為80 220 rpm ；至芽孢桿菌進入對數(shù)生長期的后期；(4)發(fā)酵罐發(fā)酵將培養(yǎng)至指數(shù)生長期后期的種子罐菌液在無菌條件下轉入裝有發(fā)酵罐培養(yǎng)基的發(fā)酵罐，罐裝量為發(fā)酵罐容積的70%，進行發(fā)酵罐的前期培養(yǎng)和后期培養(yǎng)；(5)菌劑的制備發(fā)酵罐發(fā)酵結束后，降低發(fā)酵通風比至1 0.08，維持發(fā)酵罐壓力 0. 02MPa,降低攪拌轉速至20rpm，對發(fā)酵液降溫至10°C以下；然后通過膜過濾濃縮處理，將發(fā)酵液體積濃縮至原來的1/5 1/8 ；再添加調配緩沖保護劑，混合均勻后，對濃縮后的發(fā)酵液進行噴霧干燥處理，得到菌劑產品。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種抗煙草青枯病的枯草芽孢桿菌菌劑的制備方法，其特征在于所述的步驟(1)活化所用的培養(yǎng)基配方為牛肉胨3g，蛋白胨5g，瓊脂16g，水定容至 1000ml。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種抗煙草青枯病的枯草芽孢桿菌菌劑的制備方法，其特征在于所述的步驟(2)的液體培養(yǎng)基的配方為玉米粉6.5g，葡萄糖2. 5g，豆餅粉10. lg，魚粉 2. 5g, CaCO3 3. 5g, (NH4)2SO4 0. 5g, K2HPO4 0. 15g, MgSO4 · 7H20 0. lg, MnSO4 · H2O 0. lg，水定容至500ml。
4.根據(jù)權利要求1所述的一種抗煙草青枯病的枯草芽孢桿菌菌劑的制備方法，其特征在于所述的步驟(3)的種子罐培養(yǎng)基配方為玉米粉12. 98g，葡萄糖5g，豆餅粉20. lg，魚粉 5g, CaCO3 6. 90g, (NH4)2SO4 lg, K2HPO4 0. 3g, MgSO4 · 7H20 0. 2g, MnSO4 · H2O 0. 2g，水定容至 IOOOml0
5.根據(jù)權利要求1所述的一種抗煙草青枯病的枯草芽孢桿菌菌劑的制備方法，其特征在于所述的步驟(4)的發(fā)酵罐培養(yǎng)基的配方為玉米粉12. 98g，葡萄糖5g，豆餅粉20. Ig, 魚粉 5g, CaCO3 6. 90g, (NH4)2SO4 lg, K2HPO4 0. 3g, MgSO4 · 7H20 0. 2g, MnSO4 · H2O 0. 2g，水定容至1000ml。
6.根據(jù)權利要求1所述的一種抗煙草青枯病的枯草芽孢桿菌菌劑的制備方法，其特征在于所述的步驟(4)的發(fā)酵罐前期培養(yǎng)方法為對接入種子液的發(fā)酵罐，溫度觀 32°C， !16.9 7.3，通風量1 0. 25 1. 1，攪拌轉速150 180 rpm ；保持發(fā)酵液總糖含量 0. 35 0. 6%、總氮含量30 45ng/ml，培養(yǎng)至芽孢形成率55 65%，進入發(fā)酵后期。
7.根據(jù)權利要求1所述的一種抗煙草青枯病的枯草芽孢桿菌菌劑的制備方法，其特征在于所述的步驟(4)的發(fā)酵罐后期培養(yǎng)方法為使用有機氮源調節(jié)發(fā)酵液的總氮含量，控制總氮含量在40ng/ml以上，培養(yǎng)至芽孢形成率80%以上、pH值7. 7以上，后期發(fā)酵結束。
8.根據(jù)權利要求7所述的一種抗煙草青枯病的枯草芽孢桿菌菌劑的制備方法，其特征在于所述的步驟(4)的有機氮源的制備方法為將花生餅粉、黃豆餅粉、棉子餅粉、酵母粉、蠶蛹粉、魚粉按照重量比為1 :1:1:1:1: 1的比例混合，調制成重量分數(shù)為 9% 16%的混合溶液，加入到反應釜內；然后在反應釜內通過流加質量分數(shù)為6 10%的鹽酸控制溶液的PH為6. 0，來進行消化水解，同時保持溫度120°C、壓力0. IMPa,水解25分鐘， 提取水解液；向水解液中加入重量分數(shù)為15%的玉米漿和重量比為1 1 1 1 1的纈氨酸、L-色氨酸、色氨酸、硫氨基酸組成的混合氨基酸溶液，配成固形物含量為重量分數(shù) 16% 18%的有機氮源，比例為水解液、玉米漿和混合氨基酸溶液的混合質量比為1 1 1。
9.根據(jù)權利要求1所述的一種抗煙草青枯病的枯草芽孢桿菌菌劑的制備方法，其特征在于所述的步驟(5)的噴霧干燥方法為對干燥塔、旋風分離器進行30分鐘的120°C的熱風滅菌，然后降低熱風溫度至80°C，依次開啟引風機、鼓風機、加熱器、進料泵、閉風器，調整物料流量至150 180Kg/h、通風量至5000 8000m3/h，開啟隔膜泵泵入調配好的發(fā)酵液， 進行產品的噴霧干燥，得到成品菌劑，菌粉質量指標為水分小于3. 5%，每克菌數(shù)大于2000 億個，菌體芽孢形成率大于85%。
10.根據(jù)權利要求1所述的一種抗煙草青枯病的枯草芽孢桿菌菌劑的制備方法，其特征在于所述的調配緩沖保護劑為由磷酸二氫鈉與磷酸氫二鈉混合而成的PH8. 0的溶液， 添加量為濃縮液體積量的0. 07%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗煙草青枯病的枯草芽孢桿菌菌劑的制備方法，包括菌種活化、搖床擴大培養(yǎng)、種子罐擴大培養(yǎng)、發(fā)酵罐發(fā)酵和菌劑的制備等步驟制備而成；本發(fā)明的優(yōu)點在于在菌體發(fā)酵的這過程中，通過后期補加有機氮源，使得菌體形成代謝性生長，提高堿性蛋白抗生素的產生，同時利于芽孢的正常生成，最終獲得一種高效抗煙草青枯病的枯草芽孢菌劑。
文檔編號A01P1/00GK102258059SQ201110195718
公開日2011年11月30日 申請日期2011年7月13日 優(yōu)先權日2011年7月13日
發(fā)明者史蘭東, 呂玉成, 薛明政 申請人:山東玉成生化農藥有限公司