專利名稱：重組人源組織型纖溶酶原激活劑溶栓酶及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及重組人源組織型纖溶酶原激活劑溶栓酶及其制備方法。
背景技術(shù)：
已知人體內(nèi)凝血現(xiàn)象是由血纖蛋白的聚合而引起的，例如人體對損傷組織的修復(fù)、心肌梗塞及腦血栓病血塊的形成等。纖維蛋白溶酶(纖溶酶)可以使血凝塊收縮和溶解血纖蛋白。纖溶酶通常是以無活性的纖溶酶原的形式存在于血漿中，在纖溶酶原激活酶類的激活下，纖溶酶原可以成為有活性的纖溶酶。因此，纖溶酶原激活酶類可以作為溶栓酶在臨床上用于治療心肌梗塞、腦血栓等病癥。目前臨床上使用的溶栓酶基本上屬于纖溶酶原激活酶類，如尿激酶、組織型纖溶酶原激活劑(tPA)、鏈激酶及葡激酶等，它們不直接溶解血栓，而是通過激活反應(yīng)，啟動人體自身溶栓體系。
上述這些溶栓酶的來源不同，其作用機理也不盡相同。鏈激酶和葡激酶來源于細菌類，尿激酶和tPA來源于人類基因。葡激酶是通過和纖溶酶原結(jié)合使其分子變形并暴露活性位點而成為有活性的纖溶酶；而尿激酶、tPA則通過水解纖溶酶原的第560位Arg和第561位Val之間的鍵，改變其主體結(jié)構(gòu)而使其成為有活性的纖溶酶。
組織型纖溶酶原激活劑和葡激酶的作用機理雖然不同，但在激活纖溶酶原的過程中，血栓的存在可加快其反應(yīng)速度，即具有血栓特異性，因而使這兩種溶栓酶優(yōu)于其它的溶栓酶。但因葡激酶是細菌蛋白，易引起人體的顯著免疫反應(yīng)；尿激酶雖然是從人的尿液中提取的產(chǎn)物，但需要收集大量的尿液，其生產(chǎn)工藝不方便，成本高，且無血栓特異性。因此，作為人體本身的基因表達產(chǎn)物，并具有血栓特異性的組織型纖溶酶原激活劑是較好的溶栓酶，所以廣泛應(yīng)用于臨床上。盡管人源tPA是優(yōu)秀的溶栓酶，但仍存在很多缺陷(Johns JA等，Circulation，1988，78∶545-546；Thomson
PL等，Lacent，1988，1∶203-207)，如藥物代謝半衰期短，只有4分鐘，藥效發(fā)揮時間有限，臨床上不得不采用高劑量，多次使用及點滴操作的方法。更重要的是由于心肌梗塞、腦血栓病人體內(nèi)纖溶酶原激活劑抑制素PAI-1(纖溶酶原激活劑抑制物)的含量較高，tPA的活性會受到其抑制作用而顯著降低。此外，目前tPA的生產(chǎn)是采用鼠類卵巢細胞轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，成本極高。因此，迫切需要一種對纖溶酶原激活劑抑制物抗性高、成本低、藥物代謝半衰期合適的人源tPA溶栓酶。本發(fā)明者已申請了一項有關(guān)重組人源tPA溶栓酶的專利(重組新溶栓酶及其制備方法和應(yīng)用，申請?zhí)?011298.5)，其中的重組新溶栓酶通過將天然的人源tPA氨基酸序列的第1 26和第1 27位精氨酸置換為丙氨酸，從而改進了其對纖溶酶原激活劑抑制物的抗性和藥物代謝半衰期，但其抗抑制物的抗性還不夠強，在添加抑制劑時，tPA的活力降低仍較明顯。因此，有必要進一步提高重組人源tPA溶栓酶的抗抑制物能力，以滿足臨床上對使用溶栓酶的要求。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)以上所述，用現(xiàn)有技術(shù)制備的人源tPA溶栓酶其抗纖溶酶原激活劑抑制物的抗性較低，因此，在臨床使用中所需要的劑量較高。為了解決此問題，本發(fā)明者經(jīng)過廣泛深入的研究，通過對人源tPA氨基酸序列進行氨基酸置換的修飾，利用DNA重組技術(shù)，制備出具有較高纖溶酶原激活劑抑制物抗性、藥物代謝半衰期適中、成本低的重組人源tPA溶栓酶。因此，本發(fā)明的目的是提供一種對纖溶酶原激活劑抑制素PAI-1抗性高、成本低、藥物代謝半衰期適中的重組人源tPA溶栓酶。
本發(fā)明的另一個目的是提供制備該溶栓酶的方法。本發(fā)明的目的通過以下方案實現(xiàn)1、提供一種重組人源tPA溶栓酶的氨基酸序列，該序列如序列表中SEQ IDNO1所示，其中N端的第78和第79位氨基酸由天然人源tPA的精氨酸置換為丙氨酸。
2、提供編碼以上1中所述的重組人源tPA溶栓酶氨基酸序列的cDNA，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO2所示。
3、構(gòu)建包含以上2中所述的cDNA的重組表達載體。
4、用上述構(gòu)建的重組表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主細胞，獲得保藏號為CGMCC0898的重組大腸桿菌轉(zhuǎn)化體，通過培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，從培養(yǎng)物獲得重組人源tPA溶栓酶，該酶具有如序列表中SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。
為了制備重組人源tPA溶栓酶，首先從含有人類大腦cDNA的λgt11噬菌體基因庫中篩選出天然人源tPA的cDNA。按照SambrookJ等，分子克隆實驗室指南，第二版所述的方法，用含人類大腦cDNA的λgt11噬菌體感染大腸桿菌Y109r-細胞株，通過λ噬菌體噬斑原位雜交法，以32p標記的3個纖溶酶原激活劑活性中心的DNA片段混合物為探針，進行雜交，得到陽性噬菌體；然后采用液體培養(yǎng)法，用陽性噬菌體重新感染大腸桿菌Y1090r-，提取噬菌DNA后，通過PCR反應(yīng)在該DNA兩端附加克隆位點，并插入載體質(zhì)粒pET11a(Ikeda RA等，Gene，1992，117265-269)中，得到質(zhì)粒pbhPA，用雙脫氧鏈終止法測定插入片段的序列，證實該片段為天然人源tPA。
己知溶纖酶原激活劑抑制素PAI-1通過與tPA氨基酸序列中帶正電荷的氨基酸殘基結(jié)合而抑制其酶活力，因此，為了獲得對溶纖酶原激活劑抑制物抗性高的tPA溶栓酶，必須對天然人源tPA氨基酸序列(己知該序列如美國專利4766075中所述)進行置換修飾，并根據(jù)修飾的方案設(shè)計突變引物，以上述含有天然人源tPAcDNA插入片段的質(zhì)粒pbhPA為模板，通過PCR擴增得到重組表達載體。
對天然人源tPA氨基酸序列進行置換修飾的指導(dǎo)原則是將帶正電荷的兩個鄰近的精氨酸置換為不帶電荷的丙氨酸。在天然tPA氨基酸序列中，兩個精氨酸鄰近的部位有兩處第78、79位和第126、127位。根據(jù)上述原則，氨基酸修飾方案可以有3種(1)第78、79位精氨酸置換為丙氨酸；(2)第126、127位精氨酸置換為丙氨酸；(3)78、79位和第126、127位精氨酸均置換為丙氨酸。其中方案(2)已在本發(fā)明人提出的專利申請0011298.5中描述；另外，根據(jù)本發(fā)明人的研究結(jié)果，由方案(3)構(gòu)建的表達載體其表達的重組人源tPA溶栓酶幾乎失去了重組天然人源tPA溶栓酶的全部活性。因此，本發(fā)明選用方案(1)，以上述含有天然人源tPAcDNA插入片段的質(zhì)粒pbhPA為模板，使用兩個互補的突變引物進行PCR擴增反應(yīng)，即得到重組表達載體pHPA-1，通過雙脫氧鏈終止法測定PCR擴增的突變片段，確認其中編碼兩個相鄰精氨酸的CGCAGG密碼子突變?yōu)榫幋a兩個相鄰丙氨酸的GCGGCA密碼子，由于編碼氨基酸的密碼子的簡并性，編碼丙氨酸的密碼子有數(shù)種，本發(fā)明選擇的密碼子是優(yōu)先在大腸桿菌中表達的密碼子。
然后，用上述構(gòu)建的重組表達載體pHPA通過氯化鈣法(Sambrook J等，分子克隆實驗室指南，第二版，55-56)轉(zhuǎn)化含質(zhì)粒pDC952(Nicholson KL等，Nature Structure Biology 1998，5793-802)的大腸桿菌BL21(DE3)，得到轉(zhuǎn)化體HPA-1BL21(DE3)(以下簡稱為HPA-1BL21)。其中pDC952質(zhì)粒含有DnaY基因，DnaY產(chǎn)生tRNAargAGG/AGA，它有利于富含argAGG/AGA的哺乳動物基因(如tPA溶栓酶)在大腸桿菌宿主細胞株中的表達。由于pDC952質(zhì)粒的選擇標記為氯霉素，pHPA-1質(zhì)粒的選擇標記為氨芐青霉素，因此，在培養(yǎng)HPA-1BL21使其表達重組人源tPA溶栓酶時，挑選在含氨芐青霉素和氯霉素的LB平板培養(yǎng)基上生長的HPA-1BL21菌落，接入含氨芐和氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，經(jīng)半乳糖苷酶誘導(dǎo)劑(IPTG)誘導(dǎo)后得到重組人源tPA溶栓酶包涵體。包涵體經(jīng)過尿素和巰基乙醇裂解，用谷胱甘肽復(fù)性，陽離子交換樹脂純化后，即得到有溶栓作用的重組人源tPA溶栓酶。
另一方面本發(fā)明還研究了重組人源tPA溶栓酶的血栓特異性、對纖溶酶原激活劑抑制物的抗性、溶解血栓的活性、藥物代謝半衰期等功能。纖溶酶原激活酶活性一般采用多肽底物Val-Lea-Lys-pNA進行測定(PohlG等，F(xiàn)ibrinolysis，1991，517-29)。該底物通常為無色，在纖溶酶作用下呈黃色(吸收峰為405nm)。本發(fā)明的重組人源tPA溶栓酶的活力可根據(jù)其激活纖溶酶原生成有活性的纖溶酶，從而引起反應(yīng)物在405nm下吸光度的變化來定量測定。
為了測定重組人源tPA的血栓特異性，在CNBr分解的人源纖維蛋白原的存在下，測定其酶活性。在反應(yīng)液中加入了CNBr分解的人源纖維蛋白原，經(jīng)CNBr分解的人源纖維蛋白原含有FCB-2和FCB-5片段，F(xiàn)CB-2和FCB-5是存在于血栓表面的具有刺激和加速溶栓過程的主要有效部分。在CNBr分解的人源纖維蛋白原的存在下，重組人源tPA的溶解血栓活性明顯提高(參見圖2)，顯示其具有的血栓特異性。
在血栓病人的血漿中，纖溶酶原激活劑抑制物的濃度較高，纖溶酶原激活劑抑制物直接影響溶栓藥，例如組織型纖溶酶原激活劑的藥效。為了測定重組人源tPA溶栓酶對纖溶酶原激活劑抑制物的抗性，在測定其酶活性時，加入纖溶酶原激活劑抑制物，結(jié)果表明，在該抑制物存在下，其酶活性稍有降低，但與天然重組人源tPA溶栓酶相比，其抗纖溶酶原激活劑抑制物的抗性大幅度增加(參見圖3)。
用平板測量法(Pohl等，F(xiàn)ibrinolysis，1991，517-29)測定重組人源tPA溶栓酶溶解血栓的活性，結(jié)果表明該酶有溶解血栓的活性(參見圖4)。
此外，重組人源tPA的藥物代謝半衰期的測定方法是對新西蘭白兔注射本發(fā)明的重組人源tPA溶栓酶(1mg/Kg)，然后分析該溶栓酶隨時間遞減的情況，由此確定其半衰期為20分鐘(參見圖5)。
根據(jù)以上的分析測定結(jié)果，證明了本發(fā)明的重組人源tPA溶栓酶具有血栓特異性、對纖溶酶原激活劑抑制物的抗性，以及溶解血栓的活性，其藥物代謝半衰期為20分鐘，能充分發(fā)揮其藥效而又不因半衰期過長而引起對人體的副作用，從而使本發(fā)明的溶栓酶可以用于制備臨床上使用的治療心肌梗塞、腦血栓等心血管疾病的藥物。
因此，與現(xiàn)有的臨床上使用的溶栓酶比較，本發(fā)明有以下優(yōu)點1.本發(fā)明的溶栓酶來源于人類基因，臨床上使用時不會引起人體的顯著免疫反應(yīng)；2.具有血栓特異性，用于治療心肌梗塞、腦血栓等病癥時，其療效優(yōu)于其他溶栓酶；3.對纖溶酶原激活劑抑制物有強的抗性，用于治療心肌梗塞、腦血栓等病癥時，其療效優(yōu)于其他溶栓酶；4.藥物代謝的半衰期適中，能充分發(fā)揮藥效，副作用小；5.與其他生產(chǎn)溶栓酶的方法相比，本發(fā)明利用基因工程技術(shù)，由微生物轉(zhuǎn)化體系制備，因此可以大規(guī)模生產(chǎn)，產(chǎn)品成本低。


圖1.表達重組人源tPA溶栓酶的轉(zhuǎn)化體的構(gòu)建流程2.重組人源tPA溶栓酶的血栓特異性圖中■表示添加血栓纖維(CNBr分解的人源纖維蛋白原)；口表示不添加血栓纖維。
圖3.重組人源tPA溶栓酶對纖溶酶原激活劑抑制物的抗性圖中所示為各種溶栓酶在纖溶酶原激活劑抑制物有無時的活性，■表示添加抑制物；口表示不添加抑制物；其中1是比較例1制備的重組天然人源tPA溶栓酶；2是本發(fā)明的重組人源tPA溶栓酶；3是比較例2制備的重組人源tPA溶栓酶-2；4是比較例3制備的重組人源tPA溶栓酶-3。
圖4.重組人源tPA溶栓酶溶解血栓的活性圖中箭頭所示斑點處為重組人源tPA溶栓酶的作用位置。
圖5重組人源tPA溶栓酶的藥物代謝半衰期以下通過實施例對本發(fā)明作進一步說明。
具體實施方法實例例1、重組人源tPA溶栓酶的制備(1)重組人源tPA溶栓酶表達載體的構(gòu)建重組人源tPA溶栓酶表達載體的構(gòu)建過程如圖1所示。首先從含人類大腦cDNA的λgt11噬菌體基因庫中篩選出人源tPAcDNA。按照噬菌體噬斑原位雜交法(SambrookJ等，分子克隆實驗室指南，第二版，154-160)用含濃度為108pfu/ml人類大腦cDNA的λgt11噬菌體感染大腸桿菌Y1090r-細胞株，在不同稀釋梯度的噬菌體中加入大腸桿Y1090r-，噬菌體稀釋液組成為45mM Tris、100mMNaCl和0.01％明膠(pH7.4)，加入的大腸桿菌預(yù)先在含有0.2％麥芽糖和1 0mM MgSO4的LB中培養(yǎng)18小時。感染后的細胞液和10倍體積含0.7％瓊脂的LB(49℃)混合，加入培養(yǎng)皿中，鋪成平板，24小時后形成透明噬菌斑。將透明的噬菌斑轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，然后將載有噬菌體的膜浸泡于0.5M NaOH，1MNaCl的溶液中2分鐘、0.8M磷酸緩沖液(pH6.7)中2分鐘、10XSSC(140mM檸檬酸鈉，1.5M NaCl，pH7.0)中1分鐘。用短波UV烤箱照射5分鐘固定后進行雜交(68℃，15h)，雜交溶液為5×SSC，1×Denharts溶液，0.7×106cpm/ml32P標記的探針，0.1％SDS和90μg/ml鮭魚DNA。探針采用纖溶酶原激活劑的3個活性中心的DNA片段混合物，其序列分別為5’-gg(c/g)gattc(c/g)ggaggc-3’；5’-gacaatga(c/t)attgcg-3’，和5’-gccgccca(c/t)tgcttc-3’。這些序列分別對應(yīng)于氨基酸序列G-D-S*-G-G；D-N-D*-I-A，和A-A-H*-C-F(*號表示活性中心)。
雜交后，用陽性噬菌體制備噬菌體DNA(SambrookJ等，分子克隆實驗室指南，第二版，161-162)，其方法是挑選陽性噬菌體重新感染大腸桿菌Y1090r-，逐步擴大培養(yǎng)，得到300ml噬菌體消化液。經(jīng)50tg/mlRNase A和10U/ml DNaseI消化2小時(37℃)后，用4.5M NaCl和12.5％PEG8000沉淀，回收噬菌體DNA(15000×g，離心30分鐘)，再用苯酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，得到噬菌體DNA，以此為模板，通過PCR擴增，在該DNA兩端附加克隆位點，5’端為限制性酶NdeI(catatg)位點，3’端為BamHI(ggattc)位點。
PCR反應(yīng)體積為100μl，其中包括20mM Tris(pH8.8)，10mM MgSO4，0.2mMdNTP，100ng噬菌體DNA，以及，正向引物、反向引物各200ng。引物的序列分別為正向引物如序列表中SEQ ID NO3所示；反向引物如序列表中SEQ ID NO4所示。
PCR反應(yīng)條件反應(yīng)溶液升溫至94℃時，每100μl反應(yīng)液中加入5U Pfu聚合酶開始反應(yīng)。反應(yīng)程序為94℃變性1分鐘，50℃退火1分鐘，68℃延伸3分鐘，共反應(yīng)25個循環(huán)。所得的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后用NdeI和BamHI酶切，然后插入同樣用NdeI和BamHI酶切的載體pET11a中(Nicholson KL等，Nature Structure Biology 1998，5793-802)，得到插入該PCR擴增片段的質(zhì)粒pbhPA。經(jīng)雙脫氧鏈終止法測定序列(SambrookJ等，分子克隆，實驗室指南，第二版，第十三章)，確定所得噬菌體DNA為天然人源tPAcDNA(已知該序列如美國專利4766075中所述)。
根據(jù)上述本發(fā)明對天然人源tPA氨基酸序列的修飾方案(1)，采用PCR方法使質(zhì)粒pbhPA中的天然人源tPAcDNA基因發(fā)生突變，將N端第78和79位兩個鄰近的帶正電的精氨酸置換為不帶電荷的的丙氨酸。為此，用質(zhì)粒pbhPA為模板，使用兩個互補的突變引物，進行PCR反應(yīng)。其中之一如序列表中SEQ ID NO5所示5’-GCCACGTGCGTAAGAACGCGGCACTGACGTGGGAGTAC-3’，另一個如序列表中SEQ ID NO6所示5’GTACTCCCACGTCAGTGCCGCGTTCTTCAGCACGTGGC-3’，其中下畫線部分為突變序列。
進行突變的PCR反應(yīng)條件如下反應(yīng)體積100μl，其中含有50mM Tris(pH8.5)，25mMKCl，1.5mMMgSO4，0.2mM dNTP，50ng質(zhì)粒模板，5U Pfu聚合酶和兩個突變引物各100ng。
PCR反應(yīng)程序94℃變性1分鐘，39℃退火1分鐘，68℃延伸9分鐘，反應(yīng)進行20個循環(huán)。用酒精沉淀PCR產(chǎn)物，干燥后用Dpnl分解模板，酚-氯仿抽提、乙醇沉淀后得到質(zhì)粒pHPA-1，將質(zhì)粒pHPA-1轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109，用雙脫氧鏈終止法測定其中插入的突變后的重組人源tPAcDNA的序列(SambrookJ等，分子克隆，實驗室指南，第二版，第十三章)，結(jié)果如序列表中SEQ ID NO2所示，由此可確認編碼兩個相鄰的精氨酸密碼子CGCAGG突變?yōu)榫幋a丙氨酸的密碼子GCGGCA，并由此序列推測得到該序列編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO1，該質(zhì)粒pHPA-1即為重組人源tPA溶栓酶表達載體。
(2)重組人源tPA的表達將(1)所得的重組表達載體pHPA-1用氯化鈣法(SambrookJ等，分子克隆實驗室指南，第二版，55-56)轉(zhuǎn)化含有質(zhì)粒pDC952(Ikeda RA等，Gene 1992，117265-269)的大腸桿菌BL21，并在含氨芐青霉素和氯霉素的LB平板上篩選對氨芐和氯霉素有抗性的轉(zhuǎn)化菌株，將此氨芐和氯霉素抗性的轉(zhuǎn)化菌株涂在含有氨芐和氯霉素的LB平板上，37℃下培養(yǎng)12小時后，挑取單個菌落接種于含氨芐和氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm下培養(yǎng)，增殖至吸光度為0.5(600nm)時，加入IPTG(終濃度為1mM)誘導(dǎo)4小時，可得到表達的重組人源tPA溶栓酶。表達的溶栓酶蛋白在細胞內(nèi)形成包涵體，用尿素(8M)和還原劑巰基乙醇(0.1M)在室溫(23℃)反應(yīng)3小時，裂解包涵體，溶液中的包涵體濃度為10mg/ml。隨后將溶解后的包涵體加入復(fù)性溶液中進行活化反應(yīng)，復(fù)性溶液的組成為0.1M Tris(pH9.0)，0.1％Tween-20，0.5M精氨酸，1mM還原型谷胱甘肽和0.2mM氧化型谷胱甘肽，復(fù)性在23℃下反應(yīng)20-48小時，復(fù)性后的蛋白質(zhì)在0.1M醋酸鈉緩沖液(pH4.2)中透析(4℃)后，加入強酸性陽離交換樹脂(SP-Sephadex)柱中使其吸附，樹脂吸附重組人源tPA溶栓酶后，先用高濃度鹽溶液(1M NaCl，0.1M醋酸鈉緩沖液，pH4.2)洗脫，然后用超濾裝置(North Carolina SRT公司，超濾膜截留量為10KD)濃縮，最后用10mMTris，0.5M精氨酸，pH7.4溶液透析(4℃)，即得到純化的重組人源tPA溶栓酶。將所得的酶液在SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳，出現(xiàn)39KD的條帶(人源tPA溶栓酶)，表明重組表達載pHPA-1，己轉(zhuǎn)入了宿主菌株，該轉(zhuǎn)化菌株命名為重組大腸桿菌轉(zhuǎn)化體HPA-1BL21(DE3)，并于2003年2月28日以保藏號CGMCC0898保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)。
比較例1重組天然人源tPA溶栓酶的制備(1)重組天然人源tPA溶栓酶表達載體的構(gòu)建按照實施例1中所述完全相同的方法制備質(zhì)粒pbhPA，該質(zhì)粒即為重組天然人源tPA溶栓酶表達載體。
(2)重組天然人源tPA溶栓酶的表達除了用表達載體pbhPA代替重組人源tPA溶栓酶的表達載體pHPA-1以外，其余與實施例1中的(2)所述相同，轉(zhuǎn)化體為重組大腸桿菌bhPABL21(DE3)，最終得到純化的重組天然人源tPA溶栓酶。
比較例2重組人源tPA溶栓酶-2的制備(1)重組人源tPA溶栓酶-2表達載體pHPA-2的構(gòu)建除了進行突變的PCR反應(yīng)中所用的兩個引物為序列表中SEQ ID NO7所示5’GCCATCTTTGCCAAGCACGCGGCATCGCCCGGAGAG-3’，和序列表中SEQ ID NO8所示5’-CTCTCCGGGCGATGCCGCGTGCTTGGCAAAGATGGC-3’之外，其余與實施例1完全相同。所得的表達載體為pHPA-2，其中，編碼tPA氨基酸序列的N端第126和127位精氨酸的密碼子CGCAGG突變?yōu)榫幋a丙氨酸的密碼子GCGGCA。
引物序列中下畫線部分為突變序列。
(2)重組人源tPA溶栓酶-2的表達除了用表達載體pHPA-2代替實施例1的(2)中的表達載體pHPA-1以外，其余與實施例1中的(2)所述相同，得到轉(zhuǎn)化體重組大腸桿菌HPA-2BL21(DE3)最終獲得純化的重組人源tPA溶栓酶-2。
比較例3重組人源tPA溶栓酶-3的制備(1)重組人源tPA溶栓酶-3表達載體pHPA-3的構(gòu)建除了進行突變的PCR反應(yīng)中所用的模板為pHPA-1，以及所用的兩個引物為序列表中SEQ ID NO7所示5’-GCCATCTTTGCCAAGCACGCGGCATCGCCCGGAGAG-3’，
和序列表中SEQ ID NO8所示5’-CTCTCCGGGCGATGCCGCGTGCTTGGCAAAGATGGC-3’之外，其余與實施例1完全相同。所得的表達載體為pHPA-3，其中，編碼tPA氨基酸序列的N端兩個相鄰的第78、79位和第126、127位精氨酸的密碼子CGCAGG均突變?yōu)榫幋a丙氨酸的密碼子GCGGCA。
引物序列中下畫線部分為突變序列。
(2)重組人源tPA溶栓酶-3的表達除了用表達載體pHPA-3代替實施例1的(2)中的表達載體pHPA-1以外，其余與實施例1中的(2)所述相同，得到轉(zhuǎn)化體重組大腸桿菌HPA-3BL21(DE3)，最終獲得純化的重組人源tPA溶栓酶-3。
實施例3重組人源tPA溶栓酶活性的分析測定(1)纖溶酶原激活酶活性的測定方法纖溶酶原激活酶的活性一般是采用多肽底物Val-Leu-1ys-pNA進行測定(Pohl G等，F(xiàn)ibrinolysis，1991，517-29)。該底物通常為無色，在纖溶酶作用下呈黃色(吸收峰為405nm)。本發(fā)明的重組人源tPA溶栓酶的活性可根據(jù)其激活纖溶酶原生成有活性的纖溶酶，從而引起反應(yīng)物在405nm下的吸光度變化來定量測定。反應(yīng)溶液的組成為0.1MTris(pH7.5)，0.09％Tween-20，10μg/ml人源纖溶酶原和0.25mg/ml Val-Leu-lys-pNA。反應(yīng)溫度為37℃，加入10μg/ml重組人源tPA溶栓酶后，反應(yīng)12分鐘，測定405nm下的吸光度變化。
(2)重組人源tPA溶栓酶血栓特異性的測定在CNBr分解的人源纖維蛋白原存在下測定重組人源tPA栓酶活性。在上述的酶活性測定反應(yīng)溶液中添加CNBr分解的人源纖維蛋白原50tg/ml，然后加入純化的重組人源tPA溶栓酶10μg/ml，按上述同樣方法測定405nm下的吸光度變化，結(jié)果如圖2所示。在CNBr分解的人源纖維蛋白原存在下，重組人源tPA溶栓酶的活性明顯升高，顯示其具有血栓特異性。
(3)重組人源tPA溶栓酶對纖溶酶原激活劑抑制物抗性的測定在上述(1)的酶活性測定反應(yīng)溶液中，加入重組人源tPA溶栓酶和纖溶酶原激活劑抑制物的混和液，加入量為反應(yīng)溶液體積的1/10，加入之前將混和液在37℃保溫1小時?；旌鸵旱慕M成為0.1MTris(pH7.5)，10tg/ml重組人源tPA溶栓酶和8μg/ml纖溶酶原激活劑抑制物，然后按上述同樣方法測定405nm下的吸光度變化。測定結(jié)果如圖3所示，圖中1是比較例1制備的重組天然人源tPA溶栓酶；2是實施例1制備的本發(fā)明的重組人源tPA溶栓酶；3是比較例2制備的重組人源tPA溶栓酶-2；4是比較例3制備的重組人源tPA溶栓酶-3。由圖3可知，在不存在抑制物時，本發(fā)明的重組人源tPA溶栓酶、比較例2制備的重組人源tPA溶栓酶-2、比較例3制備的重組人源tPA溶栓酶-3的酶活性分別為天然重組人源tPA溶栓酶的90％、55％和11％；在抑制物存在時，本發(fā)明的重組人源tPA溶栓酶、比較例2制備的重組人源tPA溶栓酶-2、比較例3制備的重組人源tPA溶栓酶-3的酶活性分別為天然重組人源tPA溶栓酶的1500％、730％和30％。由此可見本發(fā)明所采用的氨基酸修飾方案是最佳的方案。
(4)重組人源tPA溶栓酶溶解血栓的活性的測定用平板測量法測定重組人源tPA溶栓酶溶解血栓的活性。將100℃下溶化的1.5％瓊脂糖降溫到49℃，和等體積的保持在49℃的0.1MTris(pH7.5)，0.09％吐溫-20，10μg/ml人源纖溶酶原和100μg/ml人源纖維蛋白原溶液混合，并加入50μg/ml牛源凝血酶。在培養(yǎng)皿中凝固后，滴下10μL重組人源tPA溶栓酶溶液(10μg/ml)，在37℃保溫1小時，觀察透明斑點，測定結(jié)果如圖4所示。由圖可見較大的透明斑點，表明本發(fā)明的重組人源tPA溶栓酶具有較高的溶解血栓的活性。
實施例四重組人源tPA溶栓酶藥物代謝半衰期的測定藥物在血漿中的半衰期是影響藥效的重要指標，它直接影響該藥劑有效劑量的確定。使用新西蘭白兔測定重組人源tPA溶栓酶在血漿中的半衰期，注射重組人源tPA溶栓酶后，測量重組人源tPA溶栓酶抗原在血漿中含量的遞減，其結(jié)果如圖5所示，半衰期為20分鐘。
本發(fā)明作為溶栓酶可用于制備抗血栓的藥物，治療心肌梗塞、腦血栓等心血管病癥。
重組人源溶酸酶ST25SEQUENCE LISTING<110>青島海瀾德醫(yī)藥科技有限公司<120>重組人源組織型纖溶酶原激活劑溶栓酶及其制備方法<130>Patentln 3.1<160>8<170>Patentln version 3.1<210>1<211>356<212>PRT<213>Homo sapiens<400>1Met Ala Ser Glu Gly Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Ash Gly Ser Ala1 5 10 15Tyr Arg Gly Thr His Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro20 25 30Trp Asn Ser Met lle Leu Ile Gly Lys Val Tyr Thr Ala Gln Asn Pro35 40 45Ser Ala Gln Ala Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro50 55 60Asp Gly Asp Ala Lys Pro Trp Cys His Val Leu Lys Asn Ala Ala Leu65 70 75 80Thr Trp Glu Tyr Cys Asp Val Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg85 90 95Gln Tyr Ser Gln Pro Gln Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp100 105 110lle Ala Ser His Pro Trp Gln Ala Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg
重組人源溶酸酶ST25115 120125Ser Pro Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys130 135 140Trp Ile Leu Ser Ala Ala His Cys Phe Gin Glu Arg Phe Pro Pro His145 150 155 160His Leu Thr Val Ile Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Val Pro Gly Glu165 170 175Glu Glu Gln Lys Phe Glu Val Glu Lys Tyr Ile Val His Lys Glu Phe180 185 190Asp Asp Asp Thr Tyr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gln Leu Lys Ser195 200 205Asp Ser Ser Arg Cys Ala Gln Glu Ser Ser Val Val Arg Thr Val Cys210 215 220Leu Pro Pro Ala Asp Leu Gln Leu Pro Asp Tyr Thr Glu Cys Glu Leu225 230 235 240Ser Gly Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg245 250 255Leu Lys Glu Ala His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser260 265 270Gln His Leu Leu Asn Arg Thr Val Thr Asp Asn Ｍet Leu Cys Ala Gly275 280 285Asp Thr Arg Ser Gly Gly Pro Gln Ala Ash Leu His Asp Ala Cys Gln290 295 300Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu ValCys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr
重組人源溶酸酶ST25305 310 315 320Leu Val Gly Ile Ile Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gln Lys Asp Val325 330 335Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp340 345 350Asn Met Arg Pro355<210>2<211>1068<212>DNA<213>Homo sapiens<400>2atggcctctg agggaaacag tgactgctac tttgggaatg ggtcagccta ccgtggcacg 60cacagcctca ccgagtcggg tgcctcctgc ctcccgtgga attccatgat cctgataggc120aaggtttaca cagcacagaa ccccagtgcc caggcactgg gcctgggcaa acataattac180tgccggaatc ctgatgggga tgccaagccc tggtgccacg tgctgaagaa cgcggcactg240acgtgggagt actgtgatgt gccctcctgc tccacctgcg gcctgagaca gtacagccag300cctcagtttc gcatcaaagg agggctcttc gccgacatcg cctcccaccc ctggcaggct360gccatctttg ccaagcacag gaggtcgccc ggagagcggt tcctgtgcgg gggcatactc420atcagctcct gctggattct ctctgccgcc cactgcttcc aggagaggtt tccgccccac480cacctgacgg tgatcttggg cagaacatac cgggtggtcc ctggcgagga ggagcagaaa540tttgaatgcg aaaaatacat tgtccataag gaattcgatg atgacactta cgacaatgac600attgcgctgc tgcagctgaa atcggattcg tcccgctgtg cccaggagag cagcgtggtc660cgcactgtgt gccttccccc ggcggacctg cagctgccgg actggacgga gtgtgagctc720tccggctacg gcaagcatga ggccttgtct cctttctatt cggagcggct gaaggaggct780catgtcagac tgtacccatc cagccgctgc acatcacaac atttacttaa cagaacagtc840
重組人源溶酸酶ST25accgacaaca tgctgtgtgc tggagacact cggagcggcg ggccccaggc aaacttgcac900gacgcctgcc agggcgattc gggaggcccc ctggtgtgtc tgaacgatgg ccgcatgact960ttggtgggca tcatcagctg gggcctgggc tgtggacaga aggatgtccc gggtgtgtac 1020acaaaggtta ccaactacct agactggatt cgtgacaaca tgcgaccg1068<210>3<211>40<212>DNA<213>Homo sapiens<400>3ggaattccat atggcctctg agggaaacag tgactgctac 40<210>4<211>38<212>DNA<213>Homo sapiens<400>4cgggatcctc acggtcgcat gttgtcacga atccagtc 38<210>5<211>38<212>DNA<213>Homo sapiens<400>5gccacgtgct gaagaacgcg gcactgacgt gggagtac 38<210>6<211>38<212>DNA<213>Homo sapiens<400>6gtactcccac gtcagtgccg cgttcttcag cacgtggc 38<210>7<211>36
重組人源溶酸酶ST25<212>DNA<213>Homo sapiens<400>7gccatctttg ccaagcacgc ggcatcgccc ggagag36<210>8<211>36<212>DNA<213>Homo sapiens<400>8ctctccgggc gatgccgcgt gcttggcaaa gatggc 3權(quán)利要求
1.一種重組人源組織型纖溶酶激活劑溶栓酶，其特征在于它的氨基酸序列如SEQ ID NO1所示，其中N端的第78、79位氨基酸殘基由天然人源組織型纖溶酶激活劑的精氨酸置換為丙氨酸。
2.編碼權(quán)利要求1所述的人源組織型纖溶酶激活劑溶栓酶的cDNA，它的核苷酸序列如SEQ ID NO2所示。
3.一種重組表達載體，其特征在于它包含權(quán)利要求2所述的cDNA。
4.一種制備重組人源組織型纖溶酶激活劑溶栓酶的方法，其特征在于該方法包括用權(quán)利要求3所述的重組表達載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，獲得轉(zhuǎn)化體，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，從培養(yǎng)物中獲得重組人源組織型纖溶酶激活劑溶栓酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于其中的宿主細胞是大腸桿菌細胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于其中的轉(zhuǎn)化體是保藏號為CGMCC0898的重組大腸桿菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組人源組織型纖溶酶原激活劑溶栓酶、該酶的氨基酸序列、編碼該氨基酸序列的cDNA以及利用含有該cDNA的表達載體制備所述重組人源組織型纖溶酶激活劑溶栓酶的方法。重組人源組織型纖溶酶激活劑溶栓酶對纖溶酶原激活劑抑制物的抗性高、具有血栓特異性和溶解血栓的活性，而且對人體無免疫反應(yīng)；此外，該酶便于大量生產(chǎn)、成本低，因此，可以作為溶栓酶用于制備抗血栓的藥物，治療心肌梗塞、腦血栓等心血管病癥。
文檔編號C12N9/68GK1490406SQ03156919
公開日2004年4月21日 申請日期2003年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月15日
發(fā)明者竇德獻 申請人:青島海瀾德醫(yī)藥科技有限公司