專利名稱：新的硅藻錳型超氧化物歧化酶及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種硅藻錳型超氧化物歧化酶蛋白質(zhì)及其基因，制造該蛋白質(zhì)的載體、宿主細胞及方法，以及含有該蛋白質(zhì)的組合物。
背景技術：
自由基(free radical)是指含有一個或多個不成對電子而獨立存在的原子或分子，可依其未成對電子所在位置而區(qū)分成以碳、氧、氮或硫為中心的自由基；不同型態(tài)的自由基其化學反應差異相當大，大部分的自由基具有較高的自由能并處于不穩(wěn)定狀態(tài)，容易以它特有的強氧化作用功擊鄰近的分子，并產(chǎn)生大量的加成物，使分子發(fā)生鏈式反應，影響極大。
氧是維持生命所必須的基本組成，亦是形成活性氧分子(reactive oxygenspecies；ROS)的前體，在大氣中是以穩(wěn)定的三重態(tài)氧(triplet state oxygen)存在；氧可以經(jīng)由數(shù)種途徑活化，形成的一系列的中間產(chǎn)物如超氧陰離子(.O2-和過氧化氫(H2O2)，或者吸收能量激發(fā)為單線態(tài)氧(singlet oxygen)；在細胞中平常代謝及還原輔酶II(NADPH)氧化系統(tǒng)中所產(chǎn)生的副產(chǎn)物包括H2O2、.OH及.O2-都包括在ROS范圍內(nèi)，其中有些是自由基，而含氧的自由基稱氧自由基(oxyradicals)；氧自由基與其它非自由基活性氧亦合稱為ROS。
當自由基的產(chǎn)生及防御自由基的能力兩者不平衡時便會產(chǎn)生氧化應激(oxidative stress)，而氧化應激可能會引起細胞的功能喪失及細胞死亡；導致許多重要疾病的發(fā)生，包括老化、白內(nèi)障、癌癥、自體免疫失調(diào)和心血管疾病等；同樣也會造成細胞蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸的功能改變。
(a)對脂質(zhì)的傷害脂質(zhì)和脂蛋白的不飽和脂肪酸對自由基引起的氧化特別敏感，細胞膜不飽和脂肪酸的氧化是人體內(nèi)常發(fā)生的氧化現(xiàn)象；ROS，特別是.OH的過量產(chǎn)生非常容易起始細胞膜的脂質(zhì)氧化，脂質(zhì)氧化不僅會破壞脂質(zhì)，也會造成膜上蛋白質(zhì)的破壞如受體和酶，而且會使膜的電位及流動性改變造成細胞膜對離子的通透性大增；多不飽和脂肪酸受到自由基攻擊后會形成脂質(zhì)自由基，而且氧會與這些自由基反應而形成過氧化自由基(peroxyl radicals)與H2O2，這些化合物會繼續(xù)進行鏈反應而導致膜的損壞。
(b)對蛋白質(zhì)的傷害蛋白質(zhì)在氧化狀態(tài)下其氨基酸殘基會受到多種的氧化修飾，如蛋白羰基(carbonyls)的形成；而許多ROS也可以氧化蛋白質(zhì)上的-SH，使許多重要的酶失活；由于蛋白質(zhì)上經(jīng)常會結(jié)合過渡金屬離子，因而H2O2會在蛋白質(zhì)的特定位置上形成.OH，使蛋白質(zhì)成為被攻擊目標。
(c)對DNA的傷害在細胞內(nèi)，DNA是自由基攻擊的一個重要目標；.OH政擊DNA時會造成多種化學性的改變，進而造成DNA堿基的修飾、交聯(lián)(cross-linking)、DNA堿基與蛋白質(zhì)結(jié)合及DNA斷裂等，例如脫氧鳥苷受到.OH攻擊產(chǎn)生8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxydeoxyguanosine，8-OHDG)，其為DNA受到氧化傷害的標記。
超氧化物歧化酶(SOD)廣泛存在于需氧或厭氧的真核或原核生物中，SOD能將·O2-催化成O2或H2O2，提供了生物體抵抗毒性氧所帶來的破壞與傷害，其反應式()(Fridovich，I.Superoxiddismutases.Adv.Enzymol.1986，58，62-97.)。SOD是含金屬的蛋白酶，根據(jù)其活性位置所結(jié)合的金屬輔酶因子的不同一般可區(qū)分成銅鋅型、錳型及鐵型三種類型(Harris，J.I.；et al.Structural comparisons of superoxidedismutases.Eur.J.Biochem.1980，106，297-303.)，Mn-SOD在1970年首先由Keele等人由大腸桿菌中分離出來，呈淡紅色，主要位于原核細胞與真核細胞的線粒體中。蛋白質(zhì)的活性隨著亞基活性中心錳離子的價數(shù)改變而改變，當活性中心錳離子帶正二價電荷時具有酶的催化能力；當活性中心錳離子帶正三價電荷時則呈靜息狀態(tài)(resting state)，不具有酶的催化能力，Mn-SOD多為由兩個蛋白質(zhì)單體組成的二聚體，但亦有發(fā)現(xiàn)四聚體甚或三聚體的存在，其每個單體分子量約19～22kDa，每個蛋白質(zhì)單體中含有一個錳離子，其由His26，His81，Asp175，His179與錳離子連鍵，而His30，His31，Trp133，Tyr181則組成Mn-SOD的活性部位，人類的細胞線粒體基質(zhì)中所含有的Mn-SOD基因位于染色體上6q25的位置上。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明系提供一種硅藻錳型超氧化物歧化酶蛋白質(zhì)及其基因，及制造該蛋白質(zhì)的載體及宿主細胞。本發(fā)明自硅藻克隆并表達一錳型超氧化物歧化酶(Mn-SOD)。該酶可去除自由基并因此可應用于化妝品、燙傷藥膏及皮膚移植等。
蛋白質(zhì)本發(fā)明涉及一種硅藻錳型超氧化物歧化酶蛋白質(zhì)，包含SEQ IDNO1(如圖1)所示的氨基酸序列。根據(jù)本發(fā)明，具有與本發(fā)明硅藻錳型超氧化物歧化酶蛋白質(zhì)相同的清除自由基功能的等價物亦包含于本發(fā)明的范圍內(nèi)。如本文所使用，術語″清除自由基的功能等價物″為一具有與本發(fā)明硅藻錳型超氧化物歧化酶蛋白質(zhì)的清除自由基功能相同的蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，本發(fā)明蛋白質(zhì)包含如SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，克隆出具有清除自由基活性的硅藻錳型超氧化物歧化酶蛋白質(zhì)，其具有SEQ ID NO1的氨基酸序列，并包含217個氨基酸。將本發(fā)明硅藻Mn-SOD氨基酸序列與其它物種Mn-SOD序列加以比較，發(fā)現(xiàn)與Mn離子結(jié)合有關的4個氨基酸(His27，His75，Asp169，His173)與活性區(qū)8個氨基酸中提供連鍵形成二聚體的2個氨基酸(Glu172，Tyr176)，均為高度保守區(qū)域。此外，本發(fā)明亦發(fā)現(xiàn)硅藻錳型超氧化物歧化酶蛋白質(zhì)的N端具有一段與蛋白質(zhì)運送有關的序列(transit peptide sequence)。優(yōu)選地，本發(fā)明硅藻錳型超氧化物歧化酶蛋白質(zhì)具有良好的比活性，pH值穩(wěn)定性，熱穩(wěn)定性，蛋白酶穩(wěn)定性及化學藥劑穩(wěn)定性。例如，本發(fā)明硅藻錳型超氧化物歧化酶蛋白質(zhì)具下列特性酶比活性約為2150U/mg；在65℃加熱10分鐘后，仍能維持相當高(約88％)的活性；經(jīng)4～12.0的pH值處理，對其活性無影響；經(jīng)4％SDS處理，硅藻錳型超氧化物歧化酶蛋白質(zhì)或活性都沒有明顯改變；在不同濃度的咪唑(imidazole)下反應后，進行電泳，經(jīng)蛋白質(zhì)染色及活性染色后硅藻錳型超氧化物歧化酶蛋白質(zhì)或活性都沒有明顯改變；加入酶液量1/20的胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)或胰蛋白酶(trypsin)，在37℃下反應不同時間之后，進行電泳分析，經(jīng)蛋白質(zhì)染色及活性染色的結(jié)果發(fā)現(xiàn)硅藻錳型超氧化物歧化酶蛋白質(zhì)或活性都沒有明顯改變。
根據(jù)本發(fā)明，硅藻錳型超氧化物歧化酶蛋白質(zhì)的制備是在可容許該蛋白質(zhì)表達的條件下，培養(yǎng)包含編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的核酸分子的宿主細胞及回收該蛋白質(zhì)。
核酸本發(fā)明提供一種分離的核酸分子，包含編碼具SEQ ID NO1(見圖1)所示硅藻錳型超氧化物歧化酶蛋白質(zhì)氨基酸序列的核酸序列。本文所使用的術語″核酸分子″意指包括DNA分子(如cDNA或基因組DNA)、RNA分子(如mRNA)、使用核苷擬似物所產(chǎn)生的DNA或RNA擬似物及其衍生物、片段及同源物。核酸分子可為單鏈或雙鏈，但以雙鏈DNA優(yōu)選。本文所使用的術語″分離的核酸″分子意為分離自存于天然來源的其它核酸。
根據(jù)本發(fā)明，核酸可僅包含編碼錳型超氧化物歧化酶蛋白質(zhì)生物活性的部分片段。本文所使用的術語″片段″意指編碼仍具生物活性的錳型超氧化物歧化酶蛋白質(zhì)片段的核苷酸序列部分。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的分離的核酸分子具有SEQ ID NO1的核苷酸序列(見圖1)或其簡并序列(擺動假說，Wobblehypothesis)。在另一優(yōu)選實施方案，本發(fā)明分離的核酸分子包括如SEQ IDNO1所示的核苷酸序列，其全長為1081bp，翻譯區(qū)有651bp，可以翻譯出217個氨基酸。本發(fā)明核酸分子與其它植物來源的序列比較，有高的相似性。本發(fā)明核酸所編碼的錳型超氧化物歧化酶蛋白質(zhì)可將超氧自由基催化成氧分子或過氧化氫，提供了生物體抵抗毒性氧所帶來的破壞與傷害。如本領域人員所認同的，基于基因密碼的簡并性(擺動假說)，可制得許多編碼本發(fā)明錳型超氧化物歧化酶蛋白質(zhì)的核酸。因此，針對一已被鑒定的特定氨基酸序列，本領域人員可在不改變錳型超氧化物歧化酶蛋白質(zhì)的氨基酸序列的情況下，藉簡單修飾一或多個密碼而制出各種不同核酸。
根據(jù)本發(fā)明，編碼錳型超氧化物歧化酶蛋白質(zhì)的核酸可使用標準雜交及克隆技術來分離。特別地，本發(fā)明核酸可使用標準克隆及篩選技術，自硅藻(diatom)的cDNA庫分離出來。本發(fā)明核酸的擴增(amplification)可根據(jù)標準PCR擴增技術，使用cDNA、mRNA或基因組DNA作為模板及適當?shù)墓押塑账嵋锒?。?jīng)擴增的核酸可克隆至適當載體并通過DNA序列分析來鑒定。
表達載體及宿主系統(tǒng)本發(fā)明亦提供一表達載體，包含本發(fā)明的核酸。優(yōu)選地，本發(fā)明表達載體包含一編碼如SEQ ID NO1所示的錳型超氧化物歧化酶蛋白質(zhì)核酸序列。
本文所使用的術語″表達載體″系可直接表達連接至其上的基因核酸分子。優(yōu)選的載體為彼等可自行復制及表達連接于其上的核酸者。一般言的，可用于重組DNA技術的表達載體通常為″載體″形式，一般為環(huán)狀雙鏈的DNA，在其為載體形式時并未融合至染色體。
本發(fā)明編碼錳型超氧化物歧化酶蛋白質(zhì)或其功能等價物的核酸序列可插入適當?shù)谋磉_載體中以表達具生物活性的錳型超氧化物歧化酶蛋白質(zhì)。該表達載體需含有插入編碼序列的轉(zhuǎn)錄及翻譯等必要元件。根據(jù)本發(fā)明，本領域人員可利用熟知的方法構建含有編碼錳型超氧化物歧化酶蛋白質(zhì)及適當轉(zhuǎn)錄及翻譯控制元件的表達載體。此等方法包括體外重組DNA技術，合成技術及體內(nèi)基因重組技術等。
本發(fā)明另一目的是提供包含表達載體的宿主細胞，該載體包含編碼錳型超氧化物歧化酶蛋白質(zhì)的核酸序列。本文所使用的術語″宿主細胞″為可經(jīng)載體(如質(zhì)粒)感染的宿主細胞。根據(jù)本發(fā)明，許多宿主系統(tǒng)可用于包含且表達編碼錳型超氧化物歧化酶蛋白質(zhì)的序列。此等宿主系統(tǒng)包括但不限于微生物(如以重組質(zhì)?；虮磉_載體轉(zhuǎn)化的細菌)、酵母菌(如以酵母菌表達載體轉(zhuǎn)化的酵母菌)、或動物細胞系統(tǒng)。優(yōu)選地，本發(fā)明的宿主細胞為大腸桿菌及酵母菌。本發(fā)明將硅藻錳型超氧化物歧化酶蛋白質(zhì)的cDNA在大腸桿菌或酵母菌系統(tǒng)表達，確實能表達出具有活性的重組蛋白質(zhì)，經(jīng)親和層析進行快速純化后，獲得純的錳型超氧化物歧化酶蛋白質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明的一優(yōu)選實施方案，本發(fā)明系以pET-20b(+)為表達型載體的構建；設計N端(DiMn-3)與C端引物(DiMn-4)，以錳型超氧化物歧化酶蛋白質(zhì)的cDNA為模板與DiMn-3及DiMn-4為引物進行PCR得到651 bp的DNA。將該DNA送入大腸桿菌中進行篩選，質(zhì)粒DNA的提取系使用限制酶EcoRI及NotI處理，所得片段與相同限制酶處理過的pET-20b(+)連接，送入大腸桿菌BL21(DE3)pLysS，并以IPTG在37℃下誘發(fā)其表達。電泳后作蛋白質(zhì)活性染色得知可獲得含有活性的蛋白質(zhì)，經(jīng)15％SDS-PAGE，于26kDa處可看到明顯色帶，此即為硅藻錳型超氧化物歧化酶蛋白質(zhì)。更優(yōu)選地，為方便超氧化物歧化酶蛋白質(zhì)穿過細胞膜，可在前端接上含有九個氨基酸的Tat，并將接上Tat的錳型超氧化物歧化酶蛋白質(zhì)DNA送入酵母菌中進行表達。
藥用組合物本發(fā)明亦包括一種藥用組合物，包含本發(fā)明的蛋白質(zhì)。除本發(fā)明蛋白質(zhì)外，該藥用組合物可含有適當?shù)乃幱每山邮艿妮d劑。
本發(fā)明的藥用組合物可以本領域已知的方式(例如通過常用方法)制造，該常用方法包括混合、溶解、制粒、制錠、磨細、乳化、包膠、包陷及/或冷凍干燥等步驟。
本發(fā)明的藥用組合物可通過任何途徑施用，此等途徑包括(但不限于)口服、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動脈內(nèi)、穿皮、皮下、腹膜腔內(nèi)、鼻內(nèi)或腸道施用。
實用性本發(fā)明硅藻來源的硅藻錳型超氧化物歧化酶蛋白質(zhì)，其活性皆比動物來源的超氧化物歧化酶蛋白質(zhì)為佳。因此，本發(fā)明硅藻來源的錳型超氧化物歧化酶蛋白質(zhì)在醫(yī)學、食品、學術研究等方面更具利用價值及貢獻。
本發(fā)明硅藻錳型超氧化物歧化酶蛋白質(zhì)可將超氧自由基催化成氧分子或過氧化氫，提供生物體抵抗毒性氧所帶來的破壞與傷害。本發(fā)明錳型超氧化物歧化酶蛋白質(zhì)應用于化妝品，可去除黑斑、雀斑及防止縐紋；添加于燙傷藥膏可加速傷口愈合；在整形外科的皮膚移植及人造皮移植應用中，可通過硅藻錳型超氧化物歧化酶蛋白質(zhì)防止移植皮膚的組織壞死，進而加速移植皮膚的縫合。
下列實例進一步說明本發(fā)明，但非欲限制本發(fā)明的范圍，任何本領域人員所知的替代和改變，均仍涵蓋于本發(fā)明的范圍中，而不偏離本發(fā)明的精神和目的。


圖1為硅藻錳型超氧化物歧化酶蛋白質(zhì)的核苷酸序列，全長為1.1kb；開放讀框(ORF)為648bp；編碼區(qū)域為217個氨基酸殘基；星號(*)為轉(zhuǎn)錄終止訊號。
具體實施例方式
硅藻錳型超氧化物歧化酶(Mn-SOD) cDNA的克隆由硅藻總RNA的提取、cDNA的合成、Mn-SOD中間片段基因的克隆及硅藻Mn-SOD cDNA的5′-RACE及3′-RACE基因克隆等程序達成。
硅藻總RNA的提取取0.2 g硅藻以液態(tài)氮急速冷凍，于研缽中磨成粉末后取出，馬上與20mL RNAclean(Hybaid)于25mL離心管中混合，震蕩15秒，置于4℃下5分鐘后以12,000xg在4℃離心15分鐘，離心后取上面水溶液層，大約有10mL。將水溶液吸至新離心管中加入與的等量的異丙醇混勻，置于4℃下15分鐘后也以12,000xg在4℃離心30分鐘，沉淀物即為RNA；倒掉水溶液，加入0.8mL70％乙醇洗滌RNA隨后以7,500xg在4℃下離心5分鐘，共清洗三次，干燥后儲存于-70℃?zhèn)溆谩?br> 硅藻cDNA的合成1.總RNA的去磷酸化將下列所有反應溶液加入于1.5mL的微量試管中并在冰上完成總RNA(μg/μL)(1～6μg)7μL10X CIP緩沖液 1μLRNASEOUT(40U/μL) 1μLCIP(10U/μL) 1μL總計 10μL小心均勻混合反應溶液，并稍微離心后置于50℃恒溫水浴槽中反應1小時。
反應作用后將離心管稍微離心并置于冰上。為去除蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，加入90μL H2O和100mL酚∶氯仿并小心混勻30秒，在室溫以1,3000xg離心5分鐘。吸取上層液(量約為100μL)至另一新試管中，添加2μL 10mg/mL貽貝肝糖(mussel glycogen)，10μL 3M醋酸鈉，pH5.2(GeneRacer KitVersion D，Invitrogen)，然后均勻混合再加入220μL 95％酒精，并小心混勻，置于-70℃冰箱中20分鐘。之后于4℃ 1,3000xg下離心20分鐘，離心沉淀的團塊即為RNA，小心吸除去上清液，再加入500μL 75％酒精輕拍數(shù)次進行洗滌，之后于4℃ 1,3000xg下離心2分鐘(重復此步驟3次)，離心后小心吸除酒精，之后于室溫下干燥RNA團塊，將干燥后的RNA團塊以7μL的DEPC水溶解后，可得到7μL的去磷酸化的RNA溶液，再進行下一階段去除mRNA 5′蓋結(jié)構的步驟。
2.去除mRNA 5′蓋結(jié)構將下列所有反應溶液加入于1.5mL的微量試管中并在冰上完成去磷酸化的RNA7μL10X TAP緩沖液1μLRNASEOUT(40U/μL)1μLTAP(0.5U/μL)1μL總計 10μL將混合的反應溶液小心混勻，并稍微離心后置于37℃的水浴槽中反應1小時。
反應作用后將離心管稍微離心并置于冰上，然后加入90μL DEPC水和100μL酚∶氯仿并小心混勻30秒，在室溫以13,000xg離心5分鐘，吸取上層液(約為100μL)至另一新的試管中，添加2μL 10mg/mL貽貝肝糖，10μL3M醋酸鈉，pH5.2(GeneRacer Kit Version D，Invitrogen)，混合均勻后再加入220μL 95％酒精，并小心混勻，置于-70℃冰箱中20分鐘，之后在4℃下以13,000xg離心20分鐘，離心沉淀的團塊即為RNA。小心吸去上清液，并加入500μL 75％酒精輕拍數(shù)次進行洗滌，之后于4℃下13,000xg離心2分鐘(重復此步驟3次)。離心后小心吸除酒精，之后在室溫下干燥RNA團塊。將干燥后的RNA團塊用7μL的DEPC水溶解后，可得到7μL的去蓋的mRNA溶液，接著再進行下一個步驟。
3.GeneRacer RNA寡聚物與去蓋mRNA的連接先將7μL的RNA溶液吸出并加入已經(jīng)裝有GeneRacer RNA寡聚物(0.25mg，1μL GeneRacer RNA Oligo)的試管中，混合均勻并置于65℃水浴槽中加熱分鐘(這是為了解開RNA二級結(jié)構)。接著再迅速置于冰上冷卻，并加入于下列反應溶液中且混合均勻。
10X ligase緩沖液1μL10mM ATP1μLRNASEOUT(40U/μL) 1μLT4RNA ligase(5U/μL) 1μLTotal volume10μLGeneRacerRNA Oligo5′CGACUGGAGCACGAGGACACUGACAUGGACUGAAGGAGUAGAAA混勻后置于37℃水浴槽中反應1小時，反應后將試管稍微離心并置于冰上，然后加入90μL H2O和100μL酚∶氯仿并混勻30秒，在室溫以13,000xg離心5分鐘，吸取上層液(約為100μL)至另一新的試管中，添加2μL 10mg/mL貽貝肝糖，10μL 3M醋酸鈉，pH5.2(GeneRacer Kit Version D，Invitrogen)，然后均勻混合再加入220μL 95％酒精，并混勻，置于-70℃冰箱中20分鐘。之后在4℃下以13,000xg離心20分鐘，離心沉淀的團塊即為RNA。小心吸去上清液，加入500μL 75％酒精輕拍數(shù)次進行洗滌，之后在4℃下13,000xg離心2分鐘(重復此步驟3次)，離心后小心吸除酒精，之后在室溫下干燥RNA團塊2分鐘。將干燥后的RNA團塊用10μL的DEPC水溶解后，可得到10μL的連接mRNA溶液，接著再進行下一個步驟。
4.逆轉(zhuǎn)錄mRNA以合成cDNA將上一步驟10μL RNA溶液加入1μL GeneRacer RNA dT引物于65℃水浴槽中反應5分鐘(這是為了解開RNA二級結(jié)構)，接著再迅速放在冰上冷卻。并加入于下列反應溶液中且混合均勻。
100mM dNTPs(每一為25mM)1μL10X RT緩沖液 2μLAMV-RT(5U/μL) 1μL無菌水 4μLRNASEOUT(40U/μL) 1μL總計 20μLGeneRacer RNA dT5′GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T)18混勻后置于42℃水浴槽中反應1小時，反應后將試管置于85℃水浴槽中15分鐘以停止AMV-RT作用，稍微離心后存放在-20℃冰箱中。此時已經(jīng)完成接有設計GeneRacer Adapter的cDNA故可作為PCR的模板，進行之后的各種基因的克隆。
Mn-SOD中間片段基因的克隆從基因庫(GCG)中將目前已發(fā)表的各種不同物種的Mn-SOD氨基酸序列，進行比對并找出高保守區(qū)域，再依此區(qū)域設計兩段引物(cyaFe-3，cyaFe-4)并以硅藻的cDNA當模板進行聚合酶鏈反應(PCR)。
CyaFe-35′-GCTTATGATGCGTTAGAGCC-3′CyaFe-45′-TAAGCGTGTTCCCAAACGTC-3′硅藻cDNA 1μLCyaFe-3 10pmoleCyaFe-4 10pmole10XTaq DNA聚合酶緩沖液5μLTaq DNA聚合酶 2.5單位10mM dNTP 2μL加入無菌水至總計 50μL將上列反應物加至0.25mL試管中，進行PCR(95℃每30秒一循環(huán)，循環(huán)25次；42～55℃每30秒一循環(huán)，循環(huán)25次；72℃每30～60秒一循環(huán)，循環(huán)25次)。PCR反應結(jié)束后，可得cDNA產(chǎn)物，經(jīng)DNA電泳確認所要的插入DNA(inster DNA)大小后并經(jīng)由凝膠洗脫即可用來進行下一步的實驗，例如進行DNA重組、轉(zhuǎn)化并進一步篩選正反應株及分析其序列。
硅藻Mn-SOD cDNA的5′-RACE及3′-RACE基因克隆依據(jù)已克隆出的硅藻Mn-SOD片段序列，設計兩段引物(DiFe-3，DiFe-4)DiFe-3(for 3′-RACE)5′-AATCAAGACAATCCTTTGATG-3′DiFe-4(for 5′-RACE)5′-GTGTCCTCCTCCGTTGTTGCG-3′分別與Gene Racer Kit所附的Gene Racer 5′引物及Gene Racer 3′引物進行RACE PCR。
1.硅藻Mn-SOD 5′-RACE將下列反應物加至0.5mL微量試管中，進行5′-RACE(94℃每30秒一循環(huán)，循環(huán)25次；50℃每45秒一循環(huán)，循環(huán)25次；72℃每30秒一循環(huán)，循環(huán)25次)，硅藻cDNA 1μLDiFe-410pmoleGene Racer 5′巢式引物10pmole10XTaq DNA聚合酶緩沖液5μLTaq DNA聚合酶 2.5units10mM dNTP 1μL加入無菌水至總計 50μL2.硅藻Mn-SOD 3′-RACE將下列反應物加至0.5 mL試管中，進行3′-RACE PCR(94℃每30秒一循環(huán)，循環(huán)25次；50℃每45秒一循環(huán)，循環(huán)25次；72℃每30秒一循環(huán)，循環(huán)25次)，硅藻cDNA 1μLDiFe-310pmoleGene Racer 3′巢式引物10pmole10XTaq DNA聚合酶緩沖液5μLTaq DNA聚合酶 2.5單位10mM dNTP 1μL加入無菌水至總計 50μL各取1μL(5′-RACE或3′-RACE)PCR產(chǎn)物與0.5λ載體(PCR2.1)于室溫下進行連接反應，并分別送入宿主細胞(TOPO 10)進行轉(zhuǎn)化，并于37℃倒置培養(yǎng)12-16小時之后，挑選250～300個單一菌株于新的LB瓊脂培養(yǎng)基(含50μL/mL氨芐青霉素)上，待進一步篩選正反應株及分析其序列。
Mn-SOD cDNA的表達經(jīng)由PCR、凝膠的制備及電泳、亞克隆(subcloning)、在酵母菌表達型載體的構建、在pET-20b(+)表達型載體的構建、及蛋白質(zhì)的誘發(fā)與樣品的電泳分析等程序達成。
PCR程序?qū)⑾铝蟹磻嚵霞又?.5mL微量試管中，依序加入下列試劑模板DNA 0.2μg5′-正義引物 10pmol3′-反義引物 10pmol10X Taq DNA聚合酶緩沖液 5μL15mM Mgcl26μLTaq DNA聚合酶 2.5單位10mM dNTP 1.5μL加入無菌水至總計 50μL加入50～100μL礦物油，進行PCR(95℃變性每30秒一循環(huán)，循環(huán)25次；42～55℃每30秒一循環(huán)，循環(huán)25次；72℃每30秒一循環(huán)，循環(huán)25次)。PCR反應結(jié)束后，可得大量DNA產(chǎn)物，經(jīng)回收后可用來進行下一步的實驗，例如進行DNA重組，分析其序列。
凝膠的制備及電泳所用的凝膠為1.0％瓊脂糖膠，倒入1X TAE緩沖液以能完全覆蓋住膠為原則。取15μL PCR產(chǎn)物，加上其1/10體積的追蹤染劑(0.25％溴酚藍，0.25％二甲苯藍FF，30％甘油于水中)，注入孔中，另外也注入6μL的1kb DNA標記(B.B.I.)用來了解DNA樣品的大小，接著以100伏特的電壓進行電泳，待DNA染料移動至膠的2/3處，即可終止電泳。將完成電泳的膠以溴乙啶(EtBr)染色15分鐘后，放入水中退染，之后即可置于紫外光源箱下觀察，另外也以拍立得照相。
亞克隆1.PCR產(chǎn)物與載體連接與宿主細胞轉(zhuǎn)化取1μL PCR產(chǎn)物，加入1μL鹽溶液，1μL的無菌水與0.5μL的pCR2.1之后，于室溫下反應5分鐘以進行連接。取前述已連接好的重組DNA，加入18μL TOPO 10活性細胞中，置于冰上30分鐘，后置于42℃的水浴中30秒進行熱休克后立即置于冰上2分鐘，加入150μL SOC培養(yǎng)基，在37℃下振蕩培養(yǎng)60分鐘，將其均勻涂布在含有50μg氨芐青霉素/mL LB瓊脂糖的培養(yǎng)皿，在37℃培養(yǎng)12-16小時之后，挑選50-80個單一菌株于新的氨芐青霉素/mL LB瓊脂糖上，待進一步實驗。
2.菌體的轉(zhuǎn)印與放射性探針的制備將轉(zhuǎn)印紙覆于培養(yǎng)皿表面，并以針頭扎洞作定位之后，輕輕取出轉(zhuǎn)印紙，此時培養(yǎng)皿上的菌落(colony)轉(zhuǎn)印到轉(zhuǎn)印紙上，轉(zhuǎn)印工作完成。準備一淺盤，上覆3mm濾紙，倒入變性溶液(0.5M NaoH，1.5M NaCl)，倒入量以能充分濕潤3mm濾紙為原則，將轉(zhuǎn)印紙以吸附菌面朝上，放在濕潤的3mm濾紙之上7分鐘，接著取另一淺盤以中和溶液(1M tris-HCl，1M NaCl，pH7.5)充分濕潤3mm濾紙之上7分鐘。重復中和液步驟之后，將轉(zhuǎn)印紙置于烘箱中，以60-70℃烘干，需時40分鐘。之后，將轉(zhuǎn)印紙放于紫外交聯(lián)儀機器(Amersham)中，進行網(wǎng)狀連結(jié)15秒后，待進一步以放射性探針來篩選。
放射性探針的制備寡核苷酸(3pmole/μL)0.5μL10X T4聚核苷酸基酶緩沖液 3.0μL聚核苷酸基酶(12單位)1.5μL[r-32p]ATP 3.5μL
H2O 21.5μL總計 30.0μL混合均勻，置于37℃下反應30分鐘后。即完成放射性探針的制備，將放射性探針加入雜交溶液中，用來篩選我們所要的目標基因。
3.目標基因DNA的克隆取出前述經(jīng)網(wǎng)狀連結(jié)的轉(zhuǎn)印紙，加入以1.5X SSC及0.1％SDS配制成的洗劑，在44℃下震搖30分鐘，倒掉洗劑，加入不含放射性探針的雜交溶液(5XSSC.5X Denhardt溶液，0.5％SDS，100μg/mL鮭魚精子DNA)，目的為去除一些非特異性的結(jié)合，以降低背景值，此一過程稱之為預雜交。倒出雜交溶液，加入含有放射性探針的雜交溶液，置于44℃水浴震搖16小時以上，倒出含有放射性探針的雜交溶液，用前述洗劑，在44℃震搖分鐘，重復此一步驟2-4次。壓干轉(zhuǎn)印紙，進行放射自顯影(autoradiography)，沖片后，挑出正反應株。
4.細菌質(zhì)粒的純化與檢視挑出正反應株養(yǎng)于含氨芐青霉素(50μg/mL)的LB，于37℃下培養(yǎng)6-8小時。以10,000xg離心3分鐘，取得菌體沉淀物，加入200μL再懸浮溶液(50mM Tris，pH7.5，10mM EDTA振蕩，使菌體懸浮狀態(tài)。加入200μL溶裂液(0.2M NaOH，1％SDS)，輕輕的混勻，使菌體能被完全溶掉，質(zhì)粒能溶離出來。加入200μL中和液(1.32M醋酸鉀)，小心的混勻，而后以120,000xg離心10分鐘，取上清液，注于0.5mL離心管(含DNA吸附膜)，以12,000xg離心1分鐘，使DNA能吸附于膜上，之后加入700mL的洗滌溶液，以12,000xg離心2分鐘后。再以12,000xg離心2分鐘以去除殘留的酒精，最后加入50μL的熱水(60℃)靜置30秒后，以12,000xg離心2分鐘，收集離心下來的質(zhì)粒DNA作質(zhì)粒的限制酶反應與電泳分析。即取DNA以及適量的限制酶，加上10x reactin緩沖液，最后加無菌水使體積為10μL，在適當?shù)臏囟认路磻?小時，以1％瓊脂糖膠電泳分析，以確定嵌入DNA的大小。
5.序列測定利用ABI PRISM 377-96 DNA測序儀進行自動測序。
在酵母菌表達型載體的構建表達載體為pGAL4并在N-端(Mn-SOD)接上9個氨基酸的Tat，將其轉(zhuǎn)殖入酵母菌[CK16R(trp-ada-ura-)]作為表達宿主。
SODF5′-CGAATTC CTCGAG AAA AGA GAG GCT GAA GCT AGGAAG AAG CGG AGA CAG CGA CGA AGA AAT GCC TAC GCC GTC CCCGAC CTT AAA TAC-3′SODR5′-CGA ATTC CACGTG TCA ATG ATG ATG ATG ATG ATG TCCACG GAC AGG TAC TCC AGA CTT CTT-3′取1μL cDNA當模板，與上述引物(SODF，SODR)各10pmol進行PCR(94℃每30秒一循環(huán)，循環(huán)30次；55℃每30秒一循環(huán)，循環(huán)30次；72℃每1分鐘一循環(huán)，循環(huán)30次)，亞克隆后取6.5μL插入DNA與1.5μL pGAL4(皆先以Bam HI和pmlI處理連接，取前述已連接好的重組DNA，加入酵母菌(CK16R)活性細胞中，篩選挑出正反應株以進行蛋白質(zhì)表達。
在pET-20b(+)表達型載體的構建表達載體為pET-20b(+)，具有氨芐青霉素篩選標記可適用于多種大腸桿菌，除此之外含有多重克隆位(MCS)可承接外來基因。MCS之前為pel B領導序列，使表達出的蛋白質(zhì)能分泌到周質(zhì)(peri plast)中。另外在MCS后面則為His-tag，可快速純化重組白質(zhì)。利用GCG程序分析硅藻Mn-SOD cDNA并配合表達載體的克隆位置分別設計N端核酸引物如下DiMn-35′-GAATTC GAT GGC CTA CGC CGT CCC CGA CCT TA-3′Eco RI
DiMn-45′-GCGGCCGC TCC ACG GAC AGG TAC TCC AGA-3′Not I取1μL cDNA當模板，與上述引物各10pmol進行PCR(94℃每30秒一循環(huán)，循環(huán)25次；50℃每30秒一循環(huán)，循環(huán)25次；72℃每40秒一循環(huán)，循環(huán)30次)，亞克隆后取6.5μL 插入DNA與1.5μL pET-20b(+)(皆先以Eco RI和Not I處理)連接，篩選挑出正反應株以進行蛋白質(zhì)表達。
蛋白質(zhì)的誘發(fā)與樣品的電泳分析將篩選到的正反應株接種至500mL LB培養(yǎng)液中，在30℃，以150rpm振蕩培養(yǎng)，至OD600為0.8-1.0時，加入異丙基硫-β-D-半乳糖苷(isopropyl-thio-β-D-galactopyanoside)使最終濃度達1mM，同時另加20mL培養(yǎng)液于30℃繼續(xù)培養(yǎng)8小時之后，取培養(yǎng)好的菌液，以10,000xg離心5分鐘，除去上清液，加入1g玻璃球及4mL 10mM PBS(pH8.0)，打破菌體，以10000xg離心5分鐘，收集上清液后，再加入4mL緩沖液，重復此一萃取步驟，最后用4mL緩沖液再萃取一次，一共收集12mL上清液，此為粗蛋白質(zhì)樣品(crude exract)，待進一步的電泳，電泳的凝膠大小為10cm×8cm×0.75mm。
1.電泳凝膠的制備將鋁板與玻板拭凈后，和隔條(spacer)組合好，放入制膠模型中，再依下表所列的用量配制凝膠溶液分離凝膠，混勻并注入模型中，再加入適當?shù)乃畨浩?，約經(jīng)過1小時，凝膠形成后，移去水層，再注入堆積凝膠，并插上槽梳(comb)，待成膠即可。
2.電泳取適量樣品與樣品加載緩沖液混勻后注入凝膠孔洞中，以100伏特電壓進行電泳，天然-PAGE約需65分鐘，SDS-PAGE約需130z分鐘后中止電泳，小心取下凝膠，進行考馬斯藍(Coomassie blue)染色將凝膠浸于染劑中，均勻搖動30分鐘后，移去染劑，用無菌水清洗一次后，加入退染劑，退染12小時即可。
3.活性染色利用核黃素及光照條件下與TEMED反應，作為產(chǎn)生超氧的系統(tǒng)，氯化硝基四氮唑藍鹽(NBT)作為呈色劑。有SOD的凝膠區(qū)域，超氧陰離子被分解，NBT不發(fā)生還原反應，而呈現(xiàn)透明的亮帶。無SOD存在的區(qū)域，超氧陰離子與NBT發(fā)生還原反應，而生成藍紫色的甲(formaza)。操作過程首先將完成電泳的凝膠，浸泡于15mL 2.5mM NBT的水溶液中，避光搖動15分鐘，移去NBT溶液，以去離子水清洗凝膠后，再浸泡于15ml 8×10-5Mriboflavin及30mM TEMED的水溶液中，照光搖動，透明亮帶存在的區(qū)域為具有SOD活性的處。
4.凝膠的干燥將欲干燥的凝膠浸于10％甘油溶液中30分鐘，取一玻板及兩張配合玻板大小的玻璃紙，用水充分濕潤玻璃紙，后將其中的一張平鋪于玻板上，再放上所要干燥的凝膠，最后鋪上另一張玻璃紙，用塑料夾固定，置于室溫下陰干。
5.硅藻Mn-SOD的純化硅藻Mn-SOD的C端帶有6個His，可用Ni2+-次氮基三乙酸瓊脂糖凝膠超流(Ni2+-nitrilotriacetic acid Sepharose superflow)來進行親和層析純化，方法如下4mL的樹脂層析柱，用5vol.的PBS平衡，之后將12mL的粗蛋白質(zhì)樣品注入并收集流下來的液體(pass through)約10mL。再以5vol.20mM咪唑洗層析柱，繼的以4mL 250mM咪唑(溶于Tris-HCL或PBS)洗脫，共收集4個部分，其中有2個部分共8mL有收集到蛋白質(zhì)，因為含有咪唑，所以需經(jīng)過透析除去。
透析液含0.1％甘油的PBS將樣品約8mL裝入透析膜中，以透析夾夾好，放入含1L透析液的燒杯中，于4℃下透析4小時以上即可分裝待進一步分析。
6.硅藻Mn-SOD的分析先制作蛋白質(zhì)標準曲線(BSA standard curve)即分別取蛋白質(zhì)標準品(BSA，1.41mg/mL)1、2、3、4、5、6μL于其所對應的滅菌水中，使最后體積達800μL，之后分別加入呈色劑200μL室溫下反應5分鐘，測OD595并依吸光值求出蛋白質(zhì)標準曲線。將采收的樣品依相同方法測得吸光值即可由標準曲線求得蛋白質(zhì)含量。
酶活性測定(liquid assay)采用RANSOD kit進行酶活性測定利用黃嘌呤和黃嘌呤氧化酶(XOD)反應，作為超氧陰離子產(chǎn)生的來源，所產(chǎn)生的超氧陰離子與2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基酚)-5-苯基四唑氯鹽(INT)反應，產(chǎn)生一紅色的甲??；SOD的活性則依據(jù)甲生成受抑制的程度來測定。
XOD黃嘌呤→尿酸+.O2-INT+.O2-→formazaSOD2.O2-+2_H+→H2O2+O2(a)標準曲線的建立(依據(jù)RNASOD kit說明書)制作S1牛血Cu/Zn-SOD標準品(5.9U/mL)0.05mL。加入1.7mL的混合基質(zhì)(含0.05mM黃嘌呤，0.025mM INT，0.94mM EDTA，50mM CAPS緩沖液，pH10.2)取不同稀釋度的S1～S6?；旌途鶆蚝螅?.25mL黃嘌呤氧化酶(0.02U)，混勻于37℃反應，分別在30秒及3分鐘，測定其在波長595的吸光質(zhì)A1及A2，依據(jù)下列公式計算出抑制百分率后，以標準品的活性取對數(shù)作為橫軸，抑制百分率作為縱軸，經(jīng)過線性回歸后，得到標準曲線。
(A2-A1)/3＝ΔA標準品或樣品/min100-(ΔA標準品或樣品/min×100)/ΔAs1/分鐘＝抑制百分率
(b)樣品活性的測定與標準品的測定方法相同，得到反應時間30秒及3分鐘在波長595nm吸光值的變化，并換算成抑制百分率，對照標準曲線，即可求出樣品的SOD活性(U/mg)。
SOD胞外表達操作選用菌種By4741，經(jīng)表達載體構建、酵母菌轉(zhuǎn)型、蛋白質(zhì)表達等程序達成。
表達載體構建設計引物使其可以順利接上表達載體的α-Factor之后并和α-Factor的基因為內(nèi)架構，所以選擇限制酶切位為Xho I及Pml I，并在設計引物時F’端加入Xho I的限制酶切位，R’端加入Pml I限制酶切位分別命名如下SODF5’-CGAATTCCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGCCTACGCCGTCCCCGACCTTAAATAC-3’SODR5’-CGAATTCCACGTGTCATCCACGGACAGGTACTCCAGACTTCTT-3’50mM KCl10mM Tris-HCl pH8.31.5mM MgCl2500mM dNTP0.5mM SODF0.5mM SODR含有SOD基因的質(zhì)粒10ngPfu DNA聚合酶2.5單位加入無菌水至總計50μL混合均勻，進行PCR(94℃ 5分鐘→94℃每30秒一循環(huán)，循環(huán)25次；50℃每45秒一循環(huán)，循環(huán)25次；72℃每1分鐘一循環(huán)，循環(huán)25次→72℃7分鐘→4℃∞)，反應結(jié)束后以Viogene PCR純化Kit回收PCR的產(chǎn)物并以洋菜膠電泳檢視純化后的SOD DNA片段，其PCR片段的大小約為700bp。
將回收的PCR片段及酵母菌表達載體各以Xho I及Pml I限制酶37℃反應放置隔夜，以洋菜膠電泳檢視反應后的DNA片段并從洋菜膠中回收，此步驟使用Viogene DNA膠萃取Kit。
使用Yeastem商品yT4連接酶將限制酶反應完的表達載體及SOD PCR片段連接，反應溫度及時間為22℃，15分鐘。把連接完畢的SOD表達載體以Yeastem商品ECOS活性進行大腸桿菌轉(zhuǎn)型，并于37℃培養(yǎng)16小時。挑選正確的菌落大量培養(yǎng)并提取質(zhì)粒備用。
酵母菌轉(zhuǎn)化(a)制備轉(zhuǎn)化細胞i)方法1選取單一菌落并完全地在YPD培養(yǎng)皿上劃線，在28-32℃培養(yǎng)8～96小時，從細菌培養(yǎng)基表層刮取菌地，加入Yeastem商品SCOS混合液至110μl使試管中細菌濃度達5×107個/試管。
ii)方法2選取單一新鮮菌落加入1～10ml YPD培養(yǎng)液中，于28～32℃搖晃培養(yǎng)20～30小時直至飽和。將全部飽和培養(yǎng)液加入10～100mlYPD培養(yǎng)液中靜置8～24小時，以2000xg離心10分鐘，去掉上清夜，以無菌水清洗兩次去除殘余的YPD培養(yǎng)液，將沉淀物混合攪拌入110-115μl SCOS混合液(新制備，有無質(zhì)粒皆可)直至細菌濃度達5×107個/試管。
(b)制備SCOS混和液
i)在1.5ml試管中加入100μl SCOS緩沖夜。
ii)加入5μl DTT(保存于-20℃，放置于室溫水浴槽中快速溶解)。
iii)加入5μl cDNA(保存于-20℃，置于冰上溶解)。
iv)加入質(zhì)粒DNA(不超過5μl)。
(c)制備干式選擇性培養(yǎng)皿完全干燥的培養(yǎng)皿在Yeastem’s SCOS轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中可提供良好的轉(zhuǎn)化反應，因此建議在將培養(yǎng)皿疊置前先將無蓋培養(yǎng)皿至于無菌操作臺內(nèi)1小時左右，待其完全干燥。
(d)SCOS轉(zhuǎn)化i)將SCOS混合液與酵母菌懸浮細胞混合攪拌制成SCOS轉(zhuǎn)化混合液。
ii)將試管加蓋，置于45.5℃ 10～60分鐘。
iii)將轉(zhuǎn)化混合液直接涂敷于干燥培養(yǎng)皿(YNBD或SD瓊脂糖+補充物)，此程序20秒內(nèi)完成，將培養(yǎng)皿置于28-32℃ 2～4天。
蛋白質(zhì)表達取單一菌落(1～2mm)于10mL YNBD+TA中，此容器使用125mL燒瓶，并于30℃培養(yǎng)箱中以250rpm震蕩培養(yǎng)過夜，次日再加入15mLYNBD+TA并繼續(xù)以30℃、250rpm震蕩培養(yǎng)過夜。
當OD600達到2～3時，停止培養(yǎng)。將所有菌液以3000g室溫離心10分鐘并小心去除上清液，加入25ml已滅菌的去離子水沖洗沉淀的酵母細胞，沖洗酵母細胞的動作需重復兩次。
將上清液倒掉，加入25ml YNBGR培養(yǎng)基，均勻混合后將菌液倒入三角錐形瓶中繼續(xù)以30℃震蕩培養(yǎng)24小時。
將所有菌液以5000g、4℃離心10分鐘，收取上清液若馬上要進行蛋白質(zhì)分析，可將蛋白質(zhì)液置于4℃保存，要長期保存，請存放于-20～-70℃。
硅藻Mn-SOD性質(zhì)熱穩(wěn)定性(thermal stability)取10μL酶液(8μg)于1.5mL試管中，5管，分別于65℃加熱0、2、4、8、16分鐘后，置于冰上，進行電泳(15％天然膠)，膠分別作蛋白質(zhì)染色(2μg)及活性染色(6μg)。結(jié)果顯示此酶甚為安定，至65℃加熱其活性減少一半所需時間為14.7min，其降解常數(shù)為3.21×10-2min-1。
pH的影響取10μL酶液(8μg)，于1.5mL試管中，共10管，加入5μL不同pH值緩沖液0.2M檸檬酸鈉緩沖液(pH2.3、3.0、4.0or 5.0)，0.2M Tris-Hcl緩沖液(pH7.0、8.0or 9.0)，0.2M甘氨酸NaOH緩沖液(pH10.0或11.0)，0.2MKCl-NaOH緩沖液(pH12.0)，在37℃下反應1小時后，加入4μL樣品追蹤染劑，每管樣品分成2份各別注入膠槽中，進行電泳(15％天然膠)，分別作蛋白質(zhì)染色(2μg)及活性染色(6μg)。結(jié)果顯示以酸堿處理很穩(wěn)定，尤其至pH8～pH11處理1小時對酶活性并沒有影響。
SDS的影響取10μL酶液(8μg)，分別加入不同量的20％SDS，使SDS最終濃度為0、1、2、3、4％，在37℃下反應1小時后，進行電泳(15％天然膠)，分別作蛋白質(zhì)染色(2μg)或活性染色(6μg)。結(jié)果顯示SDS的處理亦很穩(wěn)定，濃度高至4％時只抑制23％。
咪唑的影響取10μL酶液(8μg)，分別加入不同量的咪唑，使咪唑最終濃度為0、0.2、0.4、0.8、1.6M，在37℃下反應1小時后，進行電泳(15％天然膠)，分別作蛋白質(zhì)染色(2μg)或活性染色(6μg)。結(jié)果顯示咪唑的處理亦很穩(wěn)定，必須高至1.6M時對活性才有抑制(70％)。
蛋白酶的影響1.取10μL酶液(8μg)，加入相當酶液量1/20的胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶于Tri-HCl緩沖液(pH8.5含20mM CaCl2)分別在37℃下反應1、2、3小時，進行電泳(15％天然膠)，分別作蛋白質(zhì)染色(2μg)或活性染色(6μg)。結(jié)果顯示胰蛋白酶的處理甚安定3小時候，活性只下降23％。胰凝乳蛋白酶處理亦很穩(wěn)定，3小時后，活性只下降33％。
唯以上所述者，僅系本發(fā)明部份優(yōu)選實施例說明，故凡應用本發(fā)明說明及申請專利范圍所為之等效方法的變化，理應包含在本發(fā)明的專利范圍內(nèi)。
權利要求
1.一種硅藻錳型超氧化物歧化酶蛋白質(zhì)，其包含SEQ ID NO1所示的氨基酸序列1 TTTGTGGCCTTTTGGATCGTAGCCATTATCCACTTTCCACTTCTGAAGCTCTTCCGTCCTATTTGCCGTCCTAATATCGTT82 AATACTATTATTTCTCCCACAACAATCAAAATCGACACAAAATTAGAGACCGGATCCAACACCCGTCGTGAAATTTTGC161 AGAAAGGAGCCGCCCTCGCCACTGTCGCATCCGTCCCCGCTGCTGCC208 AAT GCC TAC GCC GTC CCC GAC CTT AAA TAC CCC TTC GAA GCA CTG GAA CCA TAC ATT GAC GCA1 N A Y A V P D L K Y P F E A L E P Y I DA271 CCC ACC ATG AAA ATC CAC CAC GAT AAA CAC CAC GCC ACC TAC GTC GCC AAT ATC AAC AAG GCC22 P T M K I H H D K H H A T Y V A N I N K A334 ACT GAA GGC AAG CCT GAT GTC GAT ATT CTC GAG CTC CAA CTC AAC GCC CTC GAG GCA GGA CCC43 T E G K P D V D I L E L Q L N A L E A G P397 GCC GTC CGC AAC AAC GGA GGA GGA CAC TAC AAC CAT GCC TTC TTC TGG GAT GAA ATG GCT CCT64 A V R N N G G G H Y N H A F F W D E MA P460 CCC GAG GAG GCA AAG AAA ACT AAG CCC AGT GCC GAG CTG GAG GCC ATG ATC AAC AAA TCT TTT85 P E E A K K T K P S A E L E A M I N K S F523 GGA TCC ATA GAT GAG ATG AAG TCC GCA TTT GAG GCC CGA GCC GCC CCC GGT GCG CTC TTT GGA106 G S I D E M K S A F E A R A A P G A L F G586 TCT GGA TGG GTG TGG ATC TGT GTC AAT GCC GCA GGG AAT GAG TTG AAG CTC GTT GGA ACT CCT127 S G W V W I C V N A A G N E L K L V G T P649 AAT CAA GAC AAT CCT TTG ATG AAG GGC GTG GCT GAC GAG GTC ATG TTC CCT ATC CTT GGC TTG148 N Q D N P L M K G V A D E V M F P I L G L712 GAT GTT TGG GAA CAT GCT TAC TAC CTC AAG TAT CAA AAC CGC CGA CCG GAA TAT GTT TCT AAC169 D V W E H A Y Y L K Y Q N R R P E Y V S N775 TGG TGG AAC GTT GTT AAC TGG GAT AAG GTT TCG GAG AAC TTC GCT TAC GTT GTT GAG AAG AAG190 W W N V V N W D K V S E N F A Y V V E K K838 TCT GGA GTA CCT GTC CGT GGA TAA 861211 S G V P V R G*217CTTTGGATATTCTTGGTTCGGCCTTCATTGAGCAATCGCATCAATTGTTGCACGAATGTCTACTGCAGCTGCATCCAACAGACTATTTAAACAAAACAAAGGCTCAAACAGAATTAGGGCCCACATTGGTGCGCCAAATCTTTGGTCTTGATCCGTGTAGAAGGCTATCTATCATACTAAACATAATACAATCTTCTTATGTATAAAAAAAAAAAAAAAA1081
2.權利要求1的蛋白質(zhì)，其中與Mn離子結(jié)合有關的4個氨基酸(His27，His75，Asp169，His 173)與活性區(qū)8個氨基酸中提供連鍵形成二聚體的2個氨基酸(Glu172，Tyr176)，均為高度保守區(qū)域。
3.權利要求1的蛋白質(zhì)，其具有良好的比活性、pH值穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、蛋白酶穩(wěn)定性及化學藥劑穩(wěn)定性。
4.權利要求3的蛋白質(zhì)，其中該化學藥劑是咪唑。
5.一種分離的核酸，其包含編碼權利要求1所示氨基酸序列的核苷酸序列。
6.權利要求5的核酸，其SEQ ID NO1第1至207位核苷酸是與蛋白質(zhì)運送有關的序列。
7.權利要求6的核酸，其另接上含有九個氨基酸的Tat。
8.權利要求7的核酸，其送入酵母菌中進行表達。
9.一種表達載體，其包含權利要求5或7的核酸序列。
10.一種宿主細胞，其包含權利要求9的載體。
11.一種制造權利要求1的蛋白質(zhì)的方法，其包含下列步驟a)將權利要求10的宿主細胞，在可容許由該核酸分子編碼的蛋白質(zhì)表達的條件下培養(yǎng)；及b)自該宿主細胞培養(yǎng)液中回收該蛋白質(zhì)。
12.一種用于清除自由基的藥用組合物，其包含權利要求1的蛋白質(zhì)。
13.權利要求12的藥用組合物，其可用于化妝品、燙傷藥膏或皮膚移植。
14. 權利要求13的藥用組合物，其中該化妝品可去除黑斑、雀斑或防止縐紋。
15.權利要求13的藥用組合物，其中該燙傷藥膏可加速傷口愈合。
16.權利要求13的藥用組合物，其中該皮膚移植通過硅藻錳型超氧化物歧化酶蛋白質(zhì)防止移植皮膚的組織壞死，進而加速移植皮膚的縫合。
全文摘要
本發(fā)明涉及硅藻錳型超氧化物歧化酶(Mn－SOD)蛋白質(zhì)，其包含SEQ ID NO1所示的氨基酸序列、編碼該氨基酸序列的核酸、制造本發(fā)明蛋白質(zhì)的方法及上述物質(zhì)的用途。
文檔編號C12N15/81GK1600854SQ0315878
公開日2005年3月30日 申請日期2003年9月24日 優(yōu)先權日2003年9月24日
發(fā)明者林棋財, 官振群, 黃宗賢 申請人:益生生技開發(fā)股份有限公司, 林棋財