專利名稱：梭菌auh-jlc39及其在鳶尾黃素轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種菌株及其應(yīng)用，尤其是一種梭菌AUH-幾C39及其在鳶尾黃素轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
葛花又稱葛條花，為豆科植物野葛O0Weraria lobata (Wild.) Ohwi)或甘葛藤iPueraria thomsonii Benth.)的干燥花蕾。據(jù)中華人民共和國藥典記載，葛花性甘、涼，用于解酒醒脾，治傷酒發(fā)熱，煩渴，不思飲食，長期以來被用于緩解酒后嘔吐等癥狀。藥理學(xué)研究結(jié)果表明，葛花具有 護肝、降血糖、降血脂以及類雌激素等多種藥理活性。葛花是我國傳統(tǒng)中藥，其主要藥效成分是異黃酮類化合物，葛花中的異黃酮主要由葛花苷(kakkalide)、次葛花苷(Kakkalidone)、鳶尾黃素(tectorigenin)、鳶尾苷(tectoridin)、尼泊爾鳶尾異黃酮(irisolidon)等多酹輕基化合物組成,盡管產(chǎn)地不同各組分含量也有明顯差異，但一般以葛花苷含量最高。有研究表明，葛花苷、次葛花苷和鳶尾苷等結(jié)合型糖苷在酸性條件下可被水解為鳶尾黃素費廣芬，2008，4:24-26);實際上，葛花不管是做成中成藥還是作為湯藥熬服，最終都要經(jīng)口服進入體內(nèi)，葛花中的眾多藥理活性成分均存在被胃腸道微生物菌群降解的可能性。Yong Chen等就曾在灌喂鳶尾苷的大鼠尿液中檢測到了鳶尾苷代謝產(chǎn)物鳶尾黃素和二氫鳶尾黃素iPharm.Pharmacol.,2008,60:709-716),由于從未有人在天然葛花提取物中檢測到二氫鳶尾黃素，因而推測是大鼠腸道微生物菌群將鳶尾苷轉(zhuǎn)化為鳶尾黃素，鳶尾黃素再進一步被轉(zhuǎn)化為二氫鳶尾黃素，但有關(guān)二氫鳶尾黃素的生理和藥理活性，迄今尚未見任何報道。近年來有大量文獻對鳶尾黃素的藥理活性進行了報道，2011年中南大學(xué)藥學(xué)院王霆教授等針對鳶尾黃素的藥理作用專門撰寫了綜述(中康麥學(xué)，2011，9 (12):913-916)。鳶尾黃素又稱鳶尾苷元，其化學(xué)名為5，7，4’ -三羥基-6-甲氧基異黃酮，鳶尾黃素在很多方面均表現(xiàn)出了較強的藥理作用:如抗氧化和清除自由基、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌和抗骨質(zhì)疏松(即類似雌激素樣作用)、保護肝臟、抗癌、抗炎、降低血糖和減少糖尿病并發(fā)癥、抗動脈粥樣硬化、抗過敏和治療肺纖維化等(中康身學(xué)，2011，9 (12):913-916)。一方面，代謝產(chǎn)物二氫鳶尾黃素與底物鳶尾黃素在化學(xué)結(jié)構(gòu)上極為相似，二者在結(jié)構(gòu)上的唯一差異就在于C2-C3之間是飽和鍵還是不飽和鍵。鳶尾黃素的C2-C3之間為不飽和雙鍵，而二氫鳶尾黃素的C2-C3間則為飽和單鍵。由于二氫鳶尾黃素與底物鳶尾黃素結(jié)構(gòu)類似，通過構(gòu)效關(guān)系可以推測，代謝產(chǎn)物二氫鳶尾黃素應(yīng)該具有與底物鳶尾黃素相似的生理和藥理活性。另一方面，體外清除自由基實驗結(jié)果表明，在所檢測濃度范圍內(nèi)(0.25-1.0毫摩爾/升)，二氫鳶尾黃素對二苯代苦味酰基自由基(1，1-Diphenyl- 2-Picrylhydrazyl,即DPPH)的體外清除能力均極顯著高于底物鳶尾黃素(P〈0.01)。尤為值得一提的是，相同濃度下(0.25-1.0毫摩爾/升)二氫鳶尾黃素和鳶尾黃素對DPPH自由基的清除作用均極顯著高于高活性植物雌激素雌馬酚(p〈0.01)。非天然產(chǎn)物雌馬酚為大豆異黃酮黃豆苷原的微生物代謝產(chǎn)物，經(jīng)研究證實，在一定濃度范圍內(nèi)，代謝產(chǎn)物雌馬酚體外清除超氧陰離子自由基和DPPH自由基能力顯著高于大豆異黃酮黃豆苷原和染料木素，同時也顯著高于二氫黃豆苷原(dihydrodaidzein)、二氫染料木素(dihydrogenistein)、去氧甲基安哥拉紫檀素(0-desmethylangolensin)等大豆異黃酮的其它微生物代謝產(chǎn)物U辦.ric.Aooi/ Chem.2010,58:11548-11552)。抗氧化實驗結(jié)果表明，雌馬酹的抗氧化活性是其底物黃豆苷原的100多倍(及/r.J.Cancer,1997，33:2384-2389);藥理學(xué)研究表明，雌馬酚在抗癌、防治骨質(zhì)疏松和心腦血管疾病等方面的活性在大豆異黃酮及其代謝產(chǎn)物中是最高的。由于自由基常與癌癥、炎癥等多種疾病直接相關(guān)，利用化合物的抗氧化特性有效清除體內(nèi)過剩自由基已成為一些重大疾病防治的重要手段。二氫鳶尾黃素在相同濃度下表現(xiàn)出遠高于其底物鳶尾黃素的體外清除自由基能力，這預(yù)示代謝產(chǎn)物二氫鳶尾黃素的生理和藥理活性會高于底物鳶尾黃素，與底物鳶尾黃素相比，產(chǎn)物二氫鳶尾黃素將具有更廣闊的研發(fā)前景和市場競爭力。但迄今未見從自然界中分離和人工合成二氫鳶尾 黃素的報道，也未見將鳶尾黃素轉(zhuǎn)化為二氫鳶尾黃素的單一微生物菌株的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種梭菌AUH-幾C39及其在鳶尾黃素轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用，解決了二氫鳶尾黃素的微生物生物合成問題及其資源匱乏問題，對新藥研發(fā)具有極大的推動作用。本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
一種梭菌sp.) AUH-JLC39，保藏號為 CGMCC N0.7221。墻M Clostridium sp.AUH-JLC39 (KC523278)是從雞糞便中分離得到的一株革蘭氏陽性嚴格厭氧細菌菌株，該菌株在厭氧工作站內(nèi)能將中藥葛花提取物的酸水解物(即鳶尾黃素)高效轉(zhuǎn)化為二氫鳶尾黃素。有關(guān)鳶尾黃素向二氫鳶尾黃素的轉(zhuǎn)化過程，推測是鳶尾黃素在菌株sp.AUH-JLC39 (為方便書寫,在這里將菌株sp.AUH-JLC39簡稱JLC39，以下均使用該轉(zhuǎn)化菌株的簡稱形式，菌株JLC39與W^Clostridiumsp.AUH-JLC39為同一菌株)分泌的還原酶作用下被加氫還原成二氫鳶尾黃素，根據(jù)葛花中所含異黃酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)、葛花苷在小白鼠體內(nèi)代謝情況以及實驗結(jié)果，推測二氫鳶尾黃素的生物合成途徑可能如下圖所示:
權(quán)利要求
1.一種梭菌(C/oWrit/iws sp.) AUH-JLC39，保藏號為 CGMCC N0.7221。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的梭菌AUH-幾C39在鳶尾黃素轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用，其特征在于包括下述步驟: (1)菌株AUH-JLC39的培養(yǎng) 將低溫冷凍保存的梭菌AUH-JLC39融化并按10-15%接種量接種到盛有新鮮BHI液體培養(yǎng)基的試管中，在厭氧工作站內(nèi)37° C下培養(yǎng)20-24小時；再以10-15%接種量將試管中的菌株AUH-JLC39重新轉(zhuǎn)接到盛有新鮮BHI液體的培養(yǎng)基中，繼續(xù)在厭氧工作站內(nèi)培養(yǎng)18-24小時作為種子液； (2)底物鳶尾黃素與菌株AUH-JLC39共培養(yǎng)與代謝產(chǎn)物的分離純化 ①底物鳶尾黃素與菌株AUH-JLC39共培養(yǎng) 將菌株AUH-JLC39的種子液按10-15%接種量轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，根據(jù)三角瓶中培養(yǎng)基體積加入濃度為40-60毫摩爾/升鳶尾黃素母液，使得鳶尾黃素在培養(yǎng)基中的濃度為0.8-1.0毫摩爾/升，然后在厭氧工作站內(nèi)培養(yǎng)48-60小時，即可將底物鳶尾黃素高效轉(zhuǎn)化為二氫鳶尾黃素； ②代謝產(chǎn)物的分離純化 用等體積的乙酸乙酯將三角瓶內(nèi)培養(yǎng)物萃取2次，萃取液過濾后蒸干，加入100%甲醇溶液，用制備柱在HPLC上進行分離制備二氫鳶尾黃素。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種梭菌AUH-JLC39，保藏號為CGMCCNo.7221，及其在鳶尾黃素轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。梭菌(Clostridiumsp.)AUH-JLC39在鳶尾黃素轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用包括下述步驟將菌株JLC39的種子液按10-15%接種量轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基中并加入底物鳶尾黃素,在厭氧工作站內(nèi)靜置培養(yǎng)48-60小時；用等體積乙酸乙酯將培養(yǎng)物萃取2次，萃取液蒸干后用制備柱在HPLC上對產(chǎn)物進行分離制備。本發(fā)明的菌株能將鳶尾黃素高效轉(zhuǎn)化為二氫鳶尾黃素，產(chǎn)物二氫鳶尾黃素對二苯代苦味酰基自由基(DPPH)的體外清除率極顯著高于底物鳶尾黃素(p<0.01)，解決了二氫鳶尾黃素的微生物生物合成問題及其資源匱乏問題，對新藥研發(fā)具有極大的推動作用。
文檔編號C12P17/06GK103146598SQ20131004508
公開日2013年6月12日 申請日期2013年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月5日
發(fā)明者王秀伶, 郭常亮, 邵子強, 劉明月 申請人:河北農(nóng)業(yè)大學(xué)