專利名稱：二次高速逆流色譜分離射干中異黃酮類單體化合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從鳶尾科植物射干中分離純化高 純度的單體化合物鳶尾苷、野鳶尾苷、鳶尾苷元、野鳶尾黃素和次野鳶尾黃素 素的方法。
背景技術(shù)：
射干為鸞尾科(/n'^3ceae)植物射干5etowcaw(sb C7w'"e^ (L.) DC.的干燥 根莖，具有解毒利咽，清肺祛痰之功效，主產(chǎn)于湖北、河南、江蘇、安徽，湖 南、浙江、貴州、云南等地亦產(chǎn)，在廣東、廣西少數(shù)地區(qū)用射干系干燥全草。 射干始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，藥理及臨床實(shí)驗(yàn)表明射干中異黃酮類化合物具有 顯著的抗炎、抗菌、抗病毒、清除自由基、抗過(guò)敏等生物活性與藥理作用。其 中鳶尾苷(Tectoridin)、野鳶尾苷(Iridin)、鳶尾苷元(Tectorigenin)、野鳶尾黃 素(Irigenin)和次野鳶尾黃素素(Irisflorentin)是射干中的主要活性成分(Xu YL, et al. J. Acta Bot Yunnan, 1999, 21 (1): 125-130; Li YQ, et al. J. Acta Pham Sin, 1986,21(11): 836-841; Li R, et al. J. Ch Pham Univer, 2003, 34(2): 122-124。)它們
的結(jié)構(gòu)式如下
鳶尾苷元(Tectorigenin) 野鳶尾黃素(Irigenin)
<formula>formula see original document page 4</formula>
"CH3
C!)CH3
次野鳶尾黃素(Irisflorentin)
、OCH3
目前，國(guó)內(nèi)外多采用柱色譜法和重結(jié)晶等傳統(tǒng)方法分離純化中藥射干中的 有效單體，這類方法或需使用大量有毒的有機(jī)溶劑，會(huì)造成環(huán)境污染；或成本 高且操作繁瑣，如聚酰胺填料，耗時(shí)費(fèi)力(HJPark,etal.Phytochemistry. 1999,51: 147; SalwaF Farag, et al. Phytochemistry. 1999， 50: 1407)，而且固定相對(duì)樣品有不 可逆性吸附作用，造成樣品損失嚴(yán)重。另外，由于射干中各主要成分與干擾組 分極性極為相近，通常無(wú)法在較短時(shí)間內(nèi)使目標(biāo)化合物得到有效的分離導(dǎo)致所 得產(chǎn)品純度不高，需借助多次重復(fù)制備進(jìn)行純化而造成目標(biāo)化合物損失較多。
高速逆流色譜(High-speed counter-current chromatography HSCCC)是一種 較新的液液分配色譜技術(shù)，它不用任何固體支撐體或載體而克服了傳統(tǒng)分離方 法對(duì)樣品的不可逆性吸附作用，滯留在柱中的樣品可以通過(guò)多種洗脫方式予以 完全回收，理論回收率為100%，同時(shí)還具有應(yīng)用范圍廣、適應(yīng)性好、操作簡(jiǎn)單、 分離效果好和重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。目前高速逆流色譜技術(shù)也用于中藥中有效單體 的分離純化，如彭金詠等以乙酸乙酯正丁醇水(2: 1: 3)為溶劑體系從白花 敗醬草從分離制備異牡荊苷和異葒草苷成分。(J.Y. Peng, et al. J Chromatogr A. 2005， 1074: 111-115)
國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)有將高速逆流色譜技術(shù)應(yīng)用于中藥射干中單體化合物的分離 純化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服柱色譜法和重結(jié)晶等傳統(tǒng)方法分離純化射干中有效單 體的缺點(diǎn)，提供一種制備工藝簡(jiǎn)單快速、回收率高、純度高且適于工業(yè)化生產(chǎn) 的從射干中分離純化異黃酮類單體化合物的方法。
射干中主要活性成分為中等極性異黃酮類成分，其中大多結(jié)構(gòu)十分相近， 傳統(tǒng)的制備液相色譜技術(shù)無(wú)法在短時(shí)間內(nèi)使各極性相近的異黃酮類化合物獲得 較好的分離。
本發(fā)明采用二次高速逆流色譜來(lái)分離射干中單體化合物，特別是采用兩套 不同溶劑體系高速逆流色譜技術(shù)將目標(biāo)化合物鳶尾苷、野鳶尾苷、鳶尾苷元、 野鳶尾黃素和次野鳶尾黃素與其他極性相近的干擾成分分離，從而獲得高純度 的目標(biāo)化合物。
本發(fā)明提供了一種從射干中分離純化單體化合物鳶尾苷、野鳶尾苷、鳶尾 苷元、野鳶尾黃素和次野鳶尾黃素素的方法，該方法包括如下步驟
A. 第一次高速逆流色譜分離純化
構(gòu)成高速逆流色譜固定相、流動(dòng)相的溶劑體系為正己垸:正丁醇甲醇:水 =1:4'丄5~2:6或乙酸乙酯正丁醇:水=2:1:3，在分液漏斗中充分振搖后靜止分 層，上相為固定相，下相為流動(dòng)相；先使逆流色譜儀柱子中充滿固定相，然后 使主機(jī)轉(zhuǎn)動(dòng)，再泵入流動(dòng)相，取射干粗提物溶于少量上相和下相,由進(jìn)樣閥進(jìn)樣， 根據(jù)檢測(cè)器譜圖接收流分"I"、 "II";對(duì)高速逆流固定相液進(jìn)行回收，揮干有機(jī) 溶劑，得第一次高速逆流固定相揮干物；
B. 第二次高速逆流色譜分離純化
構(gòu)成高速逆流色譜固定相、流動(dòng)相的溶劑體系為氯仿甲醇:水為4:2.7-3:2，對(duì)第一次高速逆流固定相揮干物進(jìn)行第二次分離，分離方法同步驟A;根
據(jù)檢測(cè)器譜圖接收流分"m" 、 "IV"和"V ";
流分"r，為野鳶尾苷，流分"n"為鳶尾苷，流分"in"為次野鳶尾黃素，流分 "iv"為野鳶尾黃素，流分"v"為鳶尾苷元。
上述第一次高速逆流色譜分離純化(步驟A)中的射干粗提物，是用以下
方法制得的將干燥射干粗粉以70% 100%乙醇水溶液超聲提取、微波提取或 加熱回流提取1 2次，過(guò)濾并合并濾液，將濾液減壓濃縮至固形物。較佳的是 以70%乙醇水溶液超聲提取。
上述第一次高速逆流色譜分離純化(步驟A)中構(gòu)成高速逆流色譜固定相、 流動(dòng)相的溶劑體系較佳的為正己烷:正丁醇甲醇:水=1:4丄5: 6、或正己烷:正丁 醇甲醇水=1:4:2:6。
上述第二次高速逆流色譜分離純化(步驟B)中構(gòu)成高速逆流色譜固定相、 流動(dòng)相的溶劑體系為氯仿甲醇水為4:2.7 2、或氯仿甲醇水為43:2。
在進(jìn)樣量為200mg的射干粗提物的高速逆流色譜的色譜圖中，野鳶尾苷的 保留時(shí)間范圍為200-220分鐘，鳶尾苷的保留時(shí)間范圍為235-260分鐘，次野鳶 尾黃素的保留時(shí)間范圍為29-34分鐘，野鳶尾黃素的保留時(shí)間范圍為38-44分鐘， 鳶尾苷元的保留時(shí)間范圍為54-60分鐘。
本發(fā)明的具體方法為
1. 制備射干粗提物
按常規(guī)將干燥射干粗分采用70%~100%乙醇水溶液超聲提取、加熱回流提 取或者微波輔助提取1 2次，過(guò)濾并合并濾液，濾液水浴條件下減壓揮干有機(jī)
溶劑，再真空干燥得射干粗提物，得率為14% 16%。
2. 高速逆流制備過(guò)程
(1) 首次高速逆流制備過(guò)程
將鳶尾苷和野鳶尾苷從射干粗提物中分離制備出來(lái)，構(gòu)成高速逆流色譜固
定相、流動(dòng)相的溶劑體系為正己烷正丁醇甲醇水=1: 4: 1.5~2: 6或乙酸 乙酯正丁醇水=2: 1: 3。在分液漏斗中充分振搖后靜止分層，上相為固定 相，下相為流動(dòng)相；先使逆流色譜儀柱子中充滿固定相，然后使主機(jī)轉(zhuǎn)動(dòng)，同 時(shí)將流動(dòng)相泵入，取步驟l中所得的提取物溶于少量上相和下相中，由進(jìn)樣閥進(jìn) 樣，根據(jù)檢測(cè)器譜圖接收流分"1"、 "II";采用高效液相色譜法對(duì)所得流分進(jìn)行 純度檢測(cè)(峰面積歸一化法)，測(cè)得流份"I"為單一色譜峰，純度98%以上，得
率為0.3%-0.5%，流份"II"亦為單一色譜峰，純度98%以上，得率為0.2%~0.4%;
實(shí)驗(yàn)結(jié)束，對(duì)高速逆流固定液進(jìn)行回收，揮干有機(jī)相，得苷元類化合物，得率為 1.7% 2.0%，主要含有鳶尾苷元、野鳶尾黃素和次野鳶尾黃素等異黃酮成分。
(2) 二次高速逆流制備過(guò)程 應(yīng)用二次高速逆流色譜分離純化一次高速逆流固定相揮干物，用溶劑體系
為氯仿甲醇水=4: 2.7 3: 2。操作步驟同第一步，按照?qǐng)D譜收集流分"III"、
"IV"、 "v"，通過(guò)液相色譜檢測(cè)流分純度(峰面積歸一化法)，得到三種異黃酮 類成分分別為次野鳶尾黃素，得率為0.2% 0.4;野鳶尾黃素，得率為0.3% 0.5%
和鳶尾苷元，得率為o.o7%~o.io%,純度均大于98%。對(duì)流份"r，、 "n"、 "m"、
"IV"、 "V"進(jìn)行MS、 1111^111和13€^0^分析，根據(jù)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn)，
流分"r，為野鳶尾苷，流分"ir，為鳶尾苷，流分"in"為次野鳶尾黃素，流分"w" 為野鳶尾黃素，流分"v"為鳶尾苷元。
本發(fā)明采用一定濃度乙醇超聲方法對(duì)藥材進(jìn)行快速、有效提取，在對(duì)目標(biāo) 組分分離純化過(guò)程中，針對(duì)射干中異黃酮類成分結(jié)構(gòu)、極性均十分相近的情況， 利用兩套溶劑體系不同的高速逆流色譜技術(shù)將目標(biāo)化合物與干擾組分分離，從 而從射干中制備得到高純度的鳶尾苷、野鳶尾苷、鳶尾苷元、野鳶尾黃素和次 野鳶尾黃素，方法簡(jiǎn)單快速且回收率高，克服了傳統(tǒng)制備方法操作繁瑣、分離 周期長(zhǎng)，樣品死吸附損失等缺點(diǎn)，并具有分離效率高、產(chǎn)品純度好、簡(jiǎn)便、適
于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。


圖1為射干經(jīng)超聲提取后粗提物的高效液相色譜圖
圖2為粗提物初次高速逆流色譜(hsccc)的色譜圖 圖3為初次高速逆流色譜固定相揮干復(fù)溶物的高效液相色譜圖 圖4為高速逆流色譜固定相揮干成分二次高速逆流色譜(hsccc)的色譜圖 圖5為首次hsccc分離流份"i "(野鳶尾苷)高效液相色譜圖
圖6為首次hsccc分離流分"n"(鳶尾苷)高效液相色譜圖 圖7為二次hsccc分離流分"m"(次野鳶尾黃素)高效液相色譜圖
圖8為二次hsccc分離流分"iv"(野鳶尾黃素)高效液相色譜圖 圖9為二次hsccc分離流分"v"(鳶尾苷元)高效液相色譜圖 圖io為粗提物初次高速逆流色譜(hsccc)連續(xù)進(jìn)樣的色譜圖
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。 實(shí)施例l:
1. 制備射干粗提物
取干燥射干藥材粗粉20g，用10倍量70%乙醇水溶液超聲提取2次，每次 30分鐘，過(guò)濾并合并濾液，6(TC水浴下減壓揮干有機(jī)相，真空干燥得射干粗提 物3.05g，得率15.3%。
2. 高速逆流色譜分離制備
應(yīng)用高速逆流色譜(深圳同田生化有限公司)將鳶尾苷、野鳶尾苷、鳶尾苷 元、野鳶尾黃素和次野鳶尾黃素素分離純化。
A.初次高速逆流色譜兩相溶劑體系為正己垸正丁醇甲醇水=1: 4: 1.5:
6。在分液漏斗中充分振搖后靜止分層，上相為固定相，下相為流動(dòng)相。先使逆 流色譜儀柱子中充滿固定相，然后使主機(jī)轉(zhuǎn)動(dòng)，同時(shí)泵入流動(dòng)相，逆流色譜柱
體積為300 ml，固定相保留率43%，流速1.5ml/min，轉(zhuǎn)速850 rpm，檢測(cè)波長(zhǎng)265 nm，取步驟(1)所得提取物粉末200mg溶解于10ml同體積上、下相中，由進(jìn) 樣閥進(jìn)樣，根據(jù)檢測(cè)器譜圖接收流分"1"、 "11"，見(jiàn)圖2。對(duì)兩部分進(jìn)行hplc 分析表明"I"與"n"均為單一色譜峰，純度分別為98.5%， 98.2%。對(duì)高速逆流 色譜儀中固定相(主要含有苷元類成分，見(jiàn)圖3)進(jìn)行回收，揮干有機(jī)相，得到
固體25.4mg，得率1.94%。
B.用溶劑體系為氯仿甲醇水=4: 2.7: 2高速逆流色譜進(jìn)行二次分離制備，
方法操作同步驟A，固定相保留率70%，流速2.0ml/min，轉(zhuǎn)速860rpm，檢測(cè) 波長(zhǎng)265nm，取步驟A回收固體溶于10ml同體積上、下相中，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣， 根據(jù)檢測(cè)器譜圖接收流分"Iir、 "IV"、 "V"，見(jiàn)圖4。對(duì)三部分流分進(jìn)行HPLC 純度分析表明三者都是單一成分，純度均大于98%。
HPLC分析條件為色譜柱YMC ODS-C18 (250 mmx4.6 mm i.d. 5 ^un);流動(dòng)相 為乙腈:水溶液，梯度洗脫程序如下0 30 min，乙腈的體積百分比由20%增至 30%; 30 60min，乙腈的體積百分比由30%增至60%; 60 80min，乙腈的體積 百分保持在60%;流速0.4mL/min;柱溫室溫；檢測(cè)波長(zhǎng)265 nm，在此條件 下所得各高效液相色譜圖見(jiàn)圖5-9，其中峰I為野鳶尾苷，峰II為鳶尾苷，峰III 為次野鳶尾黃素，峰VI為野鳶尾黃素，峰V為鳶尾苷元。將分離得到的"I "-"V" 流分有機(jī)相揮干，流分"I"得淡黃色粉末5.9mg，得率0.45%;流分"II"得淡黃色 粉末4.4mg，得率0.33°/。；流分"III"得淡黃色粉末3.9mg，得率0.30%;流分"IV" 得淡黃色粉末5.6mg，得率0.43。/。；流分"V"得淡黃色粉末1.3mg，得率0.10%。對(duì) 流分"I"-"V"進(jìn)行iHNMR、 ^CNMR和MS分析，經(jīng)結(jié)構(gòu)解析并與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)比對(duì),
確定流分i為野鳶尾苷，流分n為鳶尾苷，流分ni為次野鳶尾黃素，流分iv為 野鳶尾黃素，流分v為鳶尾苷元。具體數(shù)據(jù)為-.
流分"I，，UV X max(nm MeOH): 262.69。 ESI-MS:521[M-H]+, 359[M-H-Glc]+。 'HNMR (600M， DMSO) S: 12.卯(1H, s), 9.27 (1H, s), 8.50 (1H, s), 6.89 (1H， s)， 6.72 (1H, d， J=2.0)， 6.68 (1H, d, J=2.0)， 5.10 (1H, d， J=6.9)， 3.78 (3H, s), 3.76 (3H, s). 3.69 (3H， s) 13CNMR(DMSO, S):180.5(C隱4)， 154.9(C陽(yáng)5)， 147.0(C-4')， 156.7(C-7 )， 152.9(C-9 )， 155.6(C-2)， 136.4(C-6)， 110.4(C-2'), 125.9(C-r), 122.0(C-3), 150.3(C-3'), 104.6(C-10)，940(C-8), 55.8(6~OCH3)，60.3(4'-OCH3)， 59.9(5'-OCH3), 100.2(Glu-l), 73.1(Glu-2)， 76.7(Glu-3), 69.6(Glu-4), 77.3(Glc-5), 60.6(Glc-6)。
流分"II"UVXmax(nmMeOH): 201.10,263.40。 ESI-MS:461[M-H]+， 299[1VHKHcr。 'HNMR (600NiDMSO)5:12.94(1H, s)， 8.43(1H， s)， 7.40 (2H, d， J-8.4), 6.85 (2H, d, J=8.4), 6.88 (IH, s), 5.09 (1H， d， J=7.5) 。CNMR(DMSO,砂1肌8(C4X 152.9(C-5X 1575(C4)， 154.7(C-7), 152.4(C-9)， 152.9(C-2)， 132.5(C-6), 130.1(C國(guó)2', C-6')， 121.0 (C-l')， 122.1(C-3 ), 115.1(C-3', C-5')， 106.5(C-10)， 94.0(C-8), 60.3(6-OCH3)， 100.2(Glu-l)， 73.1(Glu-2)， 76.7(Glu-3)， 69.6(Glu-4), 77.3(Glc-5), 60.6(Glc-6)。
流分"III" UV人max(nm MeOH): 203.32， 263.95。 ESI-MS:385[M陽(yáng)H]+。 'HNMR (600M, DMSO) S: 8.29 (IH, s) 7.00 (2H， s), 6.83 (1H， s), 6.17 (2H, s), 4.09 (3H, s), 3.89 (6H， s), 3.87 (3H, s) 13CNMR(DMSO， S):173.7(C-4 ), 153.9(C-5)， 152.7(C-9)， 152.5(C-1), 150.6(C-3'， C-5'), 106.8(C隱2', C-6')， 140.5(C-7), 137.3(C-4')， 135.9(C-6)， 127.5(C-1')， 150.1(C-3')， 113.2(010)， 102.7(O-CH2-O), 93.6(C-8), 60.2(5-OCH3)， 60.8(4'-0CH3), 55.9(3',5'-OCH3)。
流分"IV，， UV X max(nm MeOH): 202.85， 264.64。 ESI-MS:359[M-H]+, 344[M-H-CH3]+。
'HNMR (600M, DMSO) 5: 13.0 (1H, s), 8.33 (1H, s), 7.35 (2H， d, J=1.6), 6.96 (2H， d, J=1.6), 6.70 (1H， s), 3.78 (IH， s), 3.74 (1H, s), 3.69 (1H, s) 13CNMR(DMSO, S):181.2(C-4)， 158.0(C-5), 154.7(C-7)， 154.0(C-2)， 152.9(C-9)， 152.7(C-5')， 150.2(C-3')， 136.4(C-4')， 131.6(C-6), 126.1(C-1')， 121.7(C-3), 126.1(C-1'), 110.4(C-10), 104.5(C-6')， 94.0(C-8), 60.0(6-OCH3)， 55.8(4'-OH3), 55.6(5'-0CH3)。
流分"V" UV X max(nm MeOH): 263.46。 ESI-MS:299[M-H]+, 284[M陽(yáng)H-CH3]+。 (600M, DMSO) S: 13.30 (1H， s), 8.29 (IH, s)， 7.36 (2H, d, J-9.0), 7.02 (2H, d, J=9.1)， 6.47 (IH, s) 3.78 (1H， s) 13CNMR(DMSO， S): 180.2(C-4)， 159.4(C-5), 159.2(C-4')， 154.7(C-7), 154.1(C-9), 153.7(C-2)， 136.3(C-6), 131.6(C-2',C-6'), 121.6(C-1')， 123.3(C-3), 115.0(C-3'，C-5'), 104.5(C-10)， 94.0(C-8), 59.9(6-OCH3)。
實(shí)施例2:
1. 制備射干粗提物 射干粗提物制備同實(shí)施例l。
2. 高速逆流色譜分離制備
應(yīng)用高速逆流色譜(深圳同田生化有限公司)將鳶尾苷、野鳶尾苷、鳶尾苷 元、野鳶尾黃素和次野鳶尾黃素素分離純化。
A. 鳶尾苷、野鳶尾苷的高速逆流分離制備
采用連續(xù)進(jìn)樣四次，每次進(jìn)樣量為200mg，每次節(jié)省進(jìn)樣前的平衡時(shí)間及進(jìn)樣 后出峰前的時(shí)間近4個(gè)小時(shí)，高速逆流條件固定相、流動(dòng)相的溶劑體系為正己
烷正丁醇甲醇水=1: 4: 1.5: 6。鳶尾苷、野鳶尾苷的高速逆流分離制備
方法、步驟同實(shí)施例l。在時(shí)間0min、 180min、 360min、 540min進(jìn)樣，得野鳶 尾苷23.6mg，得率0.45%;鳶尾苷17.6mg，得率0.34%。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)高速 逆流色譜儀中固定相進(jìn)行回收，揮干有機(jī)相，得到固體101.3mg,得率為1.93%。
B. 鳶尾苷元、野鳶尾黃素和次野鳶尾黃素的高速逆流分離制備
用溶劑體系為氯仿甲醇水=4: 2.7: 2高速逆流色譜進(jìn)行二次分離制備，鳶
尾苷元、野鳶尾黃素和次野鳶尾黃素的分離純化、純度檢測(cè)以及結(jié)構(gòu)鑒定的方
法、步驟同實(shí)施例l。次野鳶尾黃素得率為0.30%，野鳶尾黃素得率為0.43%， 鳶尾苷元得率為0.10%。
實(shí)施例3:
1.制備射干粗提物
取干燥射干藥材粗粉20g，用8倍量無(wú)水乙醇水溶液微波輔助提取1次，微 波功率800w，溫度70。C，提取時(shí)間10分鐘，過(guò)濾，濾液6(TC水浴下減壓揮干 有機(jī)相，真空干燥得射干粗提物2.89g，得率14.5%
2.高速逆流色譜分離制備
應(yīng)用高速逆流色譜(深圳同田生化有限公司)將鳶尾苷、野鳶尾苷、鳶尾苷 元、野鳶尾黃素和次野鳶尾黃素素分離純化。
A. 鳶尾苷、野鳶尾苷的高速逆流分離制備
初次高速逆流色譜兩相溶劑體系為乙酸乙酯正丁醇水=2: 1:3。鳶尾苷、 野鳶尾苷的分離純化、純度檢測(cè)以及結(jié)構(gòu)鑒定方法、步驟同實(shí)施例l。野鳶尾苷
的純度為98.3%，得率為0.42%;鳶尾苷的純度為98.0%，得率為0.31%。對(duì)高 速逆流色譜儀中固定相進(jìn)行回收，揮干有機(jī)相，得到固體24.7mg，得率1.78%。
B. 鳶尾苷元、野鳶尾黃素和次野鳶尾黃素的高速逆流分離制備 用溶劑體系為氯仿甲醇水=4: 3: 2高速逆流色譜進(jìn)行二次分離制備，鳶尾
苷元、野鳶尾黃素和次野鳶尾黃素的分離純化、純度檢測(cè)以及結(jié)構(gòu)鑒定方法、
步驟同實(shí)施例l。次野鳶尾黃素得率為0.27%;野鳶尾黃素得率為0.40%;鳶尾 苷元得率為0.09%。
實(shí)施例4:
1. 制備射干粗提物
取干燥射干藥材粗粉500g，用8倍量70%乙醇水溶液加熱回流2次，每次 60分鐘，過(guò)濾并合并濾液，濾液6(TC水浴下減壓揮干有機(jī)溶劑，真空干燥得射 干粗提物71g，得率14.2%。
2. 高速逆流色譜分離制備
應(yīng)用高速逆流色譜(深圳同田生化有限公司)將鳶尾苷、野鳶尾苷、鳶尾 苷元、野鳶尾黃素和次野鳶尾黃素素分離純化。二次高速逆流色譜條件、操作 步驟、純度檢測(cè)以及結(jié)構(gòu)鑒定的方法均同實(shí)施例l。野鳶尾苷純度為98.5%，得 率為0.39%;鳶尾苷純度為98.2%,得率0.28%。對(duì)初次高速逆流分離固定相進(jìn) 行回收，揮干有機(jī)相，得到固體24.6mg，得率1.75%。經(jīng)第二次高速逆流色譜 分離后，鳶尾苷元得率為0.07%，野鳶尾黃素得率為0.38%，次野鳶尾黃素得率 為0.24%。
權(quán)利要求
1、一種從射干中分離純化單體化合物鳶尾苷、野鳶尾苷、鳶尾苷元、野鳶尾黃素和次野鳶尾黃素素的方法，其特征在于該方法包括如下步驟A、第一次高速逆流色譜分離純化構(gòu)成高速逆流色譜固定相、流動(dòng)相的溶劑體系為正己烷∶正丁醇∶甲醇∶水＝1∶4∶1.5～2∶6或乙酸乙酯∶正丁醇∶水＝2∶1∶3，在分液漏斗中充分振搖后靜止分層，上相為固定相，下相為流動(dòng)相；先使逆流色譜儀柱子中充滿固定相，然后使主機(jī)轉(zhuǎn)動(dòng)，再泵入流動(dòng)相，取射干粗提物溶于少量上相和下相，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣，根據(jù)檢測(cè)器譜圖接收流分“I”、“II”；對(duì)高速逆流固定相液進(jìn)行回收，揮干有機(jī)溶劑，得第一次高速逆流固定相揮干物；B、第二次高速逆流色譜分離純化構(gòu)成高速逆流色譜固定相、流動(dòng)相的溶劑體系為氯仿∶甲醇∶水為4∶2.7～3∶2，對(duì)第一次高速逆流固定相揮干物進(jìn)行第二次分離，分離方法同步驟A；根據(jù)檢測(cè)器譜圖接收流分“III”、“IV”和“V”；流分“I”為野鳶尾苷，流分“II”為鳶尾苷，流分“III”為次野鳶尾黃素，流分“IV”為野鳶尾黃素，流分“V”為鳶尾苷元。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從射干中分離純化單體化合物鳶尾苷、野鳶尾苷、鳶尾苷元、野鳶尾黃素和次野鳶尾黃素素的方法，其特征在于第一次高速逆流色譜分離純化中的射干粗提物，是用以下方法制得的將干燥射干粗粉以70% 100%乙醇水溶液超聲提取、微波提取或加熱回流提取1 2次，過(guò)濾并合并濾液,將濾液減壓濃縮至固形物。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種從射干中分離純化單體化合物鳶尾苷、野鳶尾苷、 鳶尾苷元、野鳶尾黃素和次野鳶尾黃素素的方法，其特征在于其中的干燥射干 粗粉以70%乙醇水溶液超聲提取。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的一種從射干中分離純化單體化合物鳶尾苷、 野鳶尾苷、鳶尾苷元、野鳶尾黃素和次野鳶尾黃素素的方法，其特征在于第一 次高速逆流色譜分離純化中構(gòu)成高速逆流色譜固定相、流動(dòng)相的溶劑體系為正 己烷正丁醇甲醇:水=1:4:1.5:6。
5、根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的一種從射干中分離純化單體化合物鳶尾苷、 野鳶尾苷、鳶尾苷元、野鳶尾黃素和次野鳶尾黃素素的方法，其特征在于第一 次高速逆流色譜分離純化中構(gòu)成高速逆流色譜固定相、流動(dòng)相的溶劑體系為正 己烷:正丁醇甲醇水=1:4:2:6。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的一種從射干中分離純化單體化合物鳶尾苷、 野鳶尾苷、鳶尾苷元、野鳶尾黃素和次野鳶尾黃素素的方法，其特征在于第二 次高速逆流色譜分離純化中構(gòu)成高速逆流色譜固定相、流動(dòng)相的溶劑體系為氯 仿甲醇水為4:2.7:2。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的一種從射干中分離純化單體化合物鳶尾苷、 野鳶尾苷、鳶尾苷元、野鳶尾黃素和次野鳶尾黃素素的方法，其特征在于第二 次高速逆流色譜分離純化中構(gòu)成高速逆流色譜固定相、流動(dòng)相的溶劑體系為氯 仿甲醇水為4:3:2。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的一種從射干中分離純化單體化合物鳶尾苷、 野鳶尾苷、鳶尾苷元、野鳶尾黃素和次野鳶尾黃素素的方法，其特征在于在 進(jìn)樣量為200mg的射干粗提物的高速逆流色譜的色譜圖中，野鳶尾苷的保留時(shí) 間范圍為200-220分鐘，鳶尾苷的保留時(shí)間范圍為235-260分鐘，次野鳶尾黃素 的保留時(shí)間范圍為29-34分鐘，野鳶尾黃素的保留時(shí)間范圍為38-44分鐘，鳶尾 苷元的保留時(shí)間范圍為54-60分鐘。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及從射干中分離純化單體化合物鳶尾苷、野鳶尾苷、鳶尾苷元、野鳶尾黃素和次野鳶尾黃素素的方法。國(guó)內(nèi)外多采用柱色譜法和重結(jié)晶等分離純化射干中的有效單體，這些方法存在成本高且操作繁瑣、樣品損失嚴(yán)重等問(wèn)題。本發(fā)明采用二次高速逆流色譜來(lái)分離射干中單體化合物，特別是采用兩套不同溶劑體系高速逆流色譜技術(shù)將目標(biāo)化合物鳶尾苷、野鳶尾苷、鳶尾苷元、野鳶尾黃素和次野鳶尾黃素與其他極性相近的干擾成分分離，從而獲得高純度的目標(biāo)化合物。本發(fā)明操作簡(jiǎn)便、分離效率高、產(chǎn)品純度好，可連續(xù)進(jìn)樣，適于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A61K36/88GK101357933SQ20081004268
公開日2009年2月4日 申請(qǐng)日期2008年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月9日
發(fā)明者超 馮, 周婷婷, 崔莉俊, 鶴 張, 霽 李, 范國(guó)榮, 蕊 解, 瑛 謝, 俊 聞, 陳丹霞, 華 魏 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)