用于干細胞增殖和誘導的培養(yǎng)基的制作方法
【專利摘要】本申請公開了用于細胞生長、維持和誘導回復至較不成熟狀態(tài)的包含MUC1*激活配體的細胞培養(yǎng)基。
【專利說明】用于干細胞增殖和誘導的培養(yǎng)基
【技術領域】
[0001]本申請涉及干細胞生長培養(yǎng)基。本申請還涉及用于誘導成熟細胞或體細胞回復(revert)至較不成熟狀態(tài)(lessmature state)的培養(yǎng)基。
【背景技術】
[0002]干細胞療法持有不僅能夠治療而且能夠治愈許多后天疾病、可遺傳癥狀以及創(chuàng)傷損傷后果的前景。然而，在干細胞療法的前景能夠變?yōu)楝F(xiàn)實之前，在目前的科學知識以及需要克服的技術和監(jiān)管障礙中存在許多差距。首要問題涉及監(jiān)管問題。FDA將施加方針政策以確保在針對傳統(tǒng)藥物需要的那些之后期望被模型化的患者安全和產(chǎn)品再現(xiàn)性。這將意味著將需要從第I天使用確定的、可以計量的試劑并且在可再現(xiàn)性條件下生成開始作為干細胞的任何治療細胞。在干細胞衍生的細胞用于治療的情況下，這已經(jīng)不可能。傳統(tǒng)上，使用大量不確定組分的復雜混合物，人胚胎干(ES)細胞以及人誘導多能性干(iPS)細胞已經(jīng)體外繁殖。盡管也已經(jīng)使用人類飼養(yǎng)細胞，現(xiàn)行方法仍是在通常為鼠源(小鼠胚胎成纖維細胞:MEF)的成纖維細胞飼養(yǎng)細胞層上培養(yǎng)ES和iPS細胞。許多人認為使用來自另一物種的細胞是不安全的。除了不同動物物種的問題之外，需要飼養(yǎng)細胞層將另一非再現(xiàn)性層引入系統(tǒng)；干細胞的生長需要由成纖維細胞飼養(yǎng)細胞分泌的因子。這些需要的因子尚未確定或量化。在遠離使用飼養(yǎng)細胞的嘗試中，干細胞已經(jīng)在基質膠層上生長，所述基質膠層是獲得自小鼠肉瘤細胞的未確定和不可量化因子的混合物。然而，只有加入來自飼養(yǎng)細胞的條件培養(yǎng)基時，干細胞才能夠在基質膠層上生長。因此，基質膠方法不能提供用于產(chǎn)生細胞的確定條件。
[0003] 通常已知的能夠使人類干細胞生長的生長因子是堿性成纖維細胞生長因子(bFGF，也稱為FGF-2或簡單的FGF)。在開發(fā)能夠滿足針對人類干細胞治療的期望的FDA監(jiān)管的干細胞生長條件的努力中，近來的研究文章報導使用稱為“ES”且不包含動物組分但包含極高水平的bFGF(與標準4 ng/mL相比的100 ng/mL)加TGF-β的確定的培養(yǎng)基，人胚胎干細胞和iPS細胞能夠生長。該培養(yǎng)基和所有其他基于FGF的培養(yǎng)基的主要問題在于稱為“基”態(tài)或“原始(naive) ”態(tài)細胞的真正多能性干細胞在FGF中不穩(wěn)定(J.Hanna, A.ff.Cheng, K.Saha et al., Proc Natl Acad Sci U S A107 (20), 9222 (2010), JacobH.Hanna, Krishanu Saha, and Rudolf Jaenisch, Celll43(4), 508(2010),J.NicholsandA.Smith, Cell Stem Cell4 (6)，487 (2009))。這些報導總結:使用FGF或bFGF驅動人類干細胞從原始狀態(tài)進入“致敏(始發(fā)，primed)”狀態(tài)?！爸旅簟笔钦`稱。盡管致敏干細胞已經(jīng)進行了一定程度的分化，然而這不會“致敏”它們或設置它們以分化成功能的人細胞。與此相反的是正確的。目前，科學研究表明致敏干細胞不能夠分化成針對使用干細胞用于大多數(shù)(如果不是所有)治療應用需要的人體內(nèi)的任何細胞(FGF信號抑制人胚胎干細胞中的神經(jīng)誘導° Boris Greber, Philippe Coulon, Miao Zhang, Soren Moritz, Stefan Frank, ArnoldoJose MuIler—MoI ina, Marcos J Arauzo-Bravo, Dong Wook Han, Hans-Christian Pape andHans RScholer0 EMBO期刊(2011)30,4874-4884)。例如，F(xiàn)GF生長干細胞不能夠分化成針對治療神經(jīng)變性疾病如Parkinson' s或Alzheimer' s或治療外傷性脊髓損傷需要的所有類型的神經(jīng)元細胞。此外，研究者還不能夠使人類干細胞以協(xié)調方式分化，因此，它們隨機分化為許多細胞類型而用于療法，人類想要針對那種治療需要的單一類型的細胞。由于小鼠干細胞處于原始狀態(tài)，當使用它們工作時研究者沒有這些問題。ES培養(yǎng)基的另一問題是不被認為是生理相關的bFGF和TGF-β的異常高水平，因此，引起質疑的是生長因子的這些不自然的高水平是否將會引起另外的無法預料的問題。
[0004]總之，對于致敏和原始或基態(tài)干細胞之間的區(qū)別的近期研究的主體概括為FGF不是使得真正多能性人類干細胞生長的天然生長因子。在FGF存在下，不能夠維持處于真正多能性狀態(tài)(基態(tài)或原始態(tài))的人類干細胞的事實表明在本領域中存在鑒別和使用支持真正的多能性人類原始干細胞生長的真正的生長因子用于產(chǎn)生或維持用于人類治療法的人類干細胞的需要。用于原始干細胞的真正生長因子應該能夠在多種培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下起作用，包括期望藥物監(jiān)管機構要求的那些。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]在一個方面，本發(fā)明旨在用于細胞生長、維持和誘導回復至較不成熟狀態(tài)且包含MUC1*激活配體(activating ligand)的細胞培養(yǎng)基。在其中期望細胞增殖而不發(fā)生分化的情況下，細胞可以 是干細胞或祖細胞，或細胞可以是體細胞、成熟細胞或祖細胞，其中期望成熟細胞或祖細胞被誘導為多能性細胞。優(yōu)選地，細胞可以是人細胞。優(yōu)選地，培養(yǎng)基可以不含bFGF、TGF-13、或兩者。進一步地，在另一個方面，培養(yǎng)基可以不含血清。培養(yǎng)基可以進一步包含胰島素、硒、轉鐵蛋白、1-抗壞血酸或非必需氨基酸。
[0006]在另一個方面，MUC1*配體可以是NME家族蛋白。優(yōu)選地，NME家族蛋白可以是NMEl0 NMEl可以以二聚或設計(engineer)為具有兩個亞基(subunit)的單鏈的兩種單體存在?？商鎿Q地，NME家族蛋白可以是NME7或NME6。
[0007]在另一個方面，細胞培養(yǎng)基可以包含rho相關激酶抑制劑。細胞培養(yǎng)基可以包含鳥嘌呤交換因子抑制劑。鳥嘌呤交換因子抑制劑可以是六聚體形式的NMEl或獲得自(衍生自)NME1的肽。
[0008]在進一步的其他方面，細胞培養(yǎng)基可以進一步包含其他生長因子，如但不限于FGF-2 或 TGF- β。
[0009]在另一個方面，本發(fā)明旨在包括使細胞與NME家族蛋白的細胞培養(yǎng)基接觸以刺激干細胞或祖細胞生長或誘導細胞回復至較不成熟狀態(tài)的方法。
[0010]在該方法中，在其中期望細胞增殖而不發(fā)生分化的情況下，細胞可以是干細胞或祖細胞，或細胞可以是體細胞、成熟細胞或祖細胞，其中期望成熟細胞或祖細胞被誘導為多能性。優(yōu)選地，細胞可以是人細胞。優(yōu)選地，培養(yǎng)基可以不含bFGF、TGF-β、或兩者。進一步地，在另一個方面，培養(yǎng)基可以不含血清。培養(yǎng)基可以進一步包含胰島素、硒、轉鐵蛋白、1-抗壞血酸或非必需氨基酸。
[0011]優(yōu)選地，NME家族蛋白可以是NMEl。NMEl可以以二聚或設計為具有兩個亞基的單鏈的兩種單體存在。可替換地，NME家族蛋白可以是ΝΜΕ7或ΝΜΕ6。
[0012]在本發(fā)明方法的另一個方面，細胞培養(yǎng)基可以包含rho相關激酶抑制劑。細胞培養(yǎng)基可以包含鳥嘌呤交換因子抑制劑。鳥嘌呤交換因子抑制劑可以是六聚體形式的NMEl或獲得自NMEl的肽。在進一步的其他方面，細胞培養(yǎng)基可以進一步包含其他生長因子，如但不限于FGF-2或TGF- β。
[0013]在又一個方面，本發(fā)明涉及NME家族蛋白加上用于生長或維持干細胞或誘導為成熟細胞多能性的基礎培養(yǎng)基和非必需氨基酸的細胞培養(yǎng)基。
[0014]在另一個方面，本發(fā)明旨在包括使細胞與處于無血清最小培養(yǎng)基(基本培養(yǎng)基，minimal media)的NME家族蛋白細胞培養(yǎng)基接觸以刺激干細胞或祖細胞生長或誘導細胞回復至較不成熟狀態(tài)的方法。
[0015]在又一個方面，本發(fā)明旨在包含干細胞群的組合物，其中，組合物進一步包含含有NME家族蛋白的無血清培養(yǎng)基。
[0016]在又一個方面，本發(fā)明涉及在其上是結合至祖細胞或干細胞的配體的表面上生長干細胞的方法，包括使細胞與包含NME家族蛋白的培養(yǎng)基接觸。
[0017]在另一個方面，本發(fā)明旨在制造原始干細胞的純?nèi)后w(pure population)的方法，包括:(i)使細胞與包含NME家族蛋白的細胞培養(yǎng)基接觸以獲得原始干細胞的單集落(single colony) ； (ii)分離原始干細胞的單集落；以及(iii)使集落與包含NME家族蛋白的細胞培養(yǎng)基接觸以獲得原始干細胞的純?nèi)后w。在以上步驟(i)中，可以獲得約25%至60%、或30%至50%的原始狀態(tài)的細胞。在以上方法中，在步驟(iii)中，原始干細胞群體的純度可以是至少約80%、90%、99%或100%。
[0018]在另一個方面，本發(fā)明旨在由誘導多能性干細胞制造原始干細胞的純?nèi)后w的方法，包括:(i)使成熟細胞或祖細胞與包含NME家族蛋白的細胞培養(yǎng)基接觸以獲得原始干細胞的單集落；(ii)分離原始干細胞的單集落；以及(iii)使群體與包含NME家族蛋白的細胞培養(yǎng)基接觸以獲得原始干細胞的純?nèi)后w。步驟(i)中成熟細胞可以用多能性基因轉染。成熟細胞或祖細胞可以是體細胞、成真皮細胞(dermablast)或成纖維細胞。在以上步驟(i)中，可以獲得約25%至60%、或30%至50%的原始狀態(tài)的細胞。在以上方法中，在步驟
(iii)中，原始干細胞群體的純度可以是至少約80%、90%、95%、99%或100%。
[0019]在一個方面，細胞培養(yǎng)基和使用以上指出的細胞培養(yǎng)基的方法可以包括含具有約25kDa或約30kDa的分子量的NME7的細胞培養(yǎng)基。NME7蛋白可以是NME7-AB。細胞培養(yǎng)基可以包含rho相關激酶抑制劑、在PI3K或RAC通路中并且優(yōu)選不存在rho激酶抑制劑下的信號蛋白的激活劑。或，細胞培養(yǎng)基可以進一步包含抑制NMEl或NME2表達的核酸。
[0020]在又一個方面，本發(fā)明旨在產(chǎn)生人胚胎干細胞系的方法，包括:(i)使獲得自胚泡的細胞與包含NME家族蛋白的細胞培養(yǎng)基接觸；(ii)分離具有干細胞樣(stem-like)形態(tài)的長出物(outgrowth) ；(iii)使分離的長出物與包含NME家族蛋白的細胞培養(yǎng)基接觸；以及(iv)以及分離具有期望核型以及表明細胞是多能性的多能性基因和原始基因(na'ivegene)的表達水平(express level)的克隆。在該方法中,NME家族成員可以是NME7。NME7可以是NME7-AB。優(yōu)選地，包含NME家族成員的培養(yǎng)基可以不含F(xiàn)GF。以上方法可以包括抑制細胞中的NMEl和NME2的步驟。
[0021] 在另一個方面，本發(fā)明旨在產(chǎn)生人誘導多能性干細胞系的方法，包括:(i)使獲得自供體或患者的細胞與包含NME家族蛋白的細胞培養(yǎng)基接觸；(ii)使細胞與誘導表達多能性基因0CT4、S0X2、NANOG, KLF4、c-Myc或LIN28的試劑接觸；(iii)分離具有干細胞樣形態(tài)的細胞；(iv)使分離的細胞與包含NME家族蛋白的細胞培養(yǎng)基接觸；(V)分離具有期望的核型以及表明細胞是多能性的多能性基因的表達水平的克隆(克隆，clone);以及(vi)以及在包含NME家族成員的培養(yǎng)基中繁殖克隆。在該方法中，NME家族成員可以是NME7。NME7可以是NME7-AB。包含NME家族成員的培養(yǎng)基優(yōu)選不包含F(xiàn)GF。以上方法可以包括抑制細胞中的NMEl和NME2的步驟。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]由本文中以下給出的詳細描述以及僅通過說明給出而并非限制本發(fā)明的附圖，將更充分地理解本發(fā)明，并且，其中:
[0023]圖1示出了在匪23作為唯一的生長因子加上如描述的玻連蛋白表面上的Rho激酶抑制劑，Y27632的最小(基本，minimal)干細胞培養(yǎng)基“MM”中培養(yǎng)的完全融合(匯合，confluent)的未分化人類干細胞的放大的照相圖像。
[0024]圖2示出了在匪23作為唯一的生長因子而不存在如描述的玻連蛋白表面上的Rho激酶抑制劑，Y27632的最小干細胞培養(yǎng)基“MM”中培養(yǎng)的部分融合的未分化人類干細胞的放大的照相圖像。
[0025]圖3示出了具有bFGF、來自人類飼養(yǎng)細胞的50%條件培養(yǎng)基、HS27，加上如描述的玻連蛋白表面上的Rho激酶抑制劑Y27632的最小干細胞培養(yǎng)基“MM”中培養(yǎng)的完全融合的未分化人類干細胞的放大的照相圖像。
[0026]圖4示出了具有bFGF、來自人類飼養(yǎng)細胞的50%條件培養(yǎng)基、HS27，而不存在如描述的玻連蛋白表面上的Rho激酶抑制劑Y27632的最小干細胞培養(yǎng)基“MM”中培養(yǎng)的部分融合的未分化人類干細胞的放大的照相圖像。
[0027]圖5示出了具有匪23作為唯一的生長因子加上如描述的玻連蛋白表面上的Rho激酶抑制劑Y27632的完全確定的干細胞培養(yǎng)基(completely defined stem cellmedia) “MN6”中培養(yǎng)的融合的未分化人類干細胞放大的照相圖像。
[0028]圖6示出了具有匪23作為唯一的生長因子而不存在如描述的玻連蛋白表面上的Rho激酶抑制劑Y27632的完全確定的干細胞培養(yǎng)基“MN6”中培養(yǎng)的部分融合的未分化人類干細胞的放大的照相圖像。
[0029]圖7示出了具有匪23作為唯一的生長因子加上如描述的玻連蛋白表面上的Rho激酶抑制劑Y27632的最小的完全確定的干細胞培養(yǎng)基“MN2”中培養(yǎng)的部分融合的未分化人類干細胞的放大的照相圖像。
[0030]圖8示出了具有匪23作為唯一的生長因子而不存在如描述的玻連蛋白表面上的Rho激酶抑制劑Y27632的最小的完全確定的干細胞培養(yǎng)基“MN2”中培養(yǎng)的較差連接并分化的人類干細胞的放大的照相圖像。
[0031]圖9示出了為MN6加100ng/mL下的bFGF和TGF-β加如描述的玻連蛋白表面上的Rho激酶抑制劑Y27632的完全確定的干細胞培養(yǎng)基“E8”中培養(yǎng)的部分融合的未分化人類干細胞的放大的照相圖像。
[0032]圖10示出了為MN6加100ng/mL下的bFGF和TGF- β而不存在如描述的玻連蛋白表面上的Rho激酶 抑制劑Υ27632的完全確定的干細胞培養(yǎng)基“Ε8”中培養(yǎng)的較差連接且分化的人類干細胞的放大的照相圖像。
[0033]圖11A-11D示出了均具有匪23作為唯一的生長因子加抗-MUC1*抗體表面上的Rho激酶抑制劑Y27632的最小干細胞培養(yǎng)基“MM”、A、C或MN6培養(yǎng)基B、D中培養(yǎng)的完全融合的未分化人類干細胞的放大的照相圖像。
[0034]圖12A-12D示出了具有均具有抗-MUC1*抗體表面上的Rho激酶抑制劑Y27632的匪23B、D的mTeSRA、C或MN6培養(yǎng)基中培養(yǎng)的完全融合的未分化人類干細胞的放大的照相圖像。
[0035]圖13A-13D示出了與飼養(yǎng)細胞、基質膠(Matrigel)、玻連蛋白或抗-MUC1*涂覆的表面上的基于NME的培養(yǎng)基相比,用于基于FGF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的干細胞的多能性基因以及原始和致敏(始發(fā)態(tài)，primed)基因的RT-PCR測量結果的曲線圖。
[0036]圖14A-D示出了其中來自人類 干細胞和癌細胞的NME7結合至具有PSMGFR肽序列的合成肽的拉下試驗(pull-down assay)的蛋白質印跡。
[0037]圖15是以二價或一價抗體濃度的函數(shù)測定的癌細胞生長的曲線圖，表明刺激生長的MUC1*受體的二聚。MUCl陽性乳腺癌細胞ZR-75-30的生長通過加入二價(Ab)抗-MUC1*刺激并且通過加入一價Fab抑制。二價抗體的加入產(chǎn)生表明生長因子受體二聚化的特征鐘形生長曲線。MUCl陰性HEK 293細胞的生長不受二價或一價Fab抗-MUC1*的影響。當過量加入二價抗體時，存在結合至每一個受體的一個二價抗體而不是二聚每兩個受體的一個二價抗體，從而抑制生長。
[0038]圖16示出了 FPLC跡線的疊加(overlay)，其表征野生型NM23 (WT)或突變體匪23-S120G的三種不同制劑的不同多聚化狀態(tài)。野生型匪23示出了相應于六聚體的分子量的單峰和相應于較高階多聚體的肩(shoulder)。沒有復性(再折疊)的匪23-S120G(標記為“混合的”)的一種制劑具有相應于二聚體的主峰和四聚體的次峰。也沒有復性的匪23-S120G( “六聚體”)的另一種制劑具有具備較高階多聚體的肩的六聚體的主峰。NM23-S120G( “二聚體”)的復性制劑主要由二聚體組成。
[0039]圖17A 示出了 NM23-WT、混合的 NM23-S120G、NM23-S120G-六聚體和匪23-S120G- 二聚體的非還原性凝膠的照片，示出了野生型蛋白和S120G突變體的三種不同制劑的多聚化狀態(tài)。圖17B示出了結合連接至SPR芯片表面的MUC1*胞外結構域肽(PSMGFR)的不同的匪23多聚體的表面等離子體共振(SPR)測量結果。圖17C示出了表明僅匪23 二聚體結合至同源受體MUC1*的納米顆粒實驗的照片。MUC1*胞外結構域肽固定在金納米顆粒上。圖17D-G示出了針對它們支持多能性干細胞生長的能力測試的不同匪23-H1多聚體。
[0040]圖18示出了表明匪23-WT的多聚化狀態(tài)對重組NM23-S120G的三種不同制劑的天然非變性凝膠。
[0041]圖19示出了 A)NM23野生型(WT)和B)產(chǎn)生60%二聚體的“混合”NM23-S120G的制劑的SPR測量結果。
[0042]圖20示出了基質膠(a、b、d、e)以及用抗-MUC1*抗體、MN_C3 (C、f)涂覆的細胞培養(yǎng)板上的最小干細胞培養(yǎng)基中的8nM的匪23變體中培養(yǎng)的人類ES細胞、BGOlv/hOG系的照片，(a-c)變體是P96SAC2，(d_f)變體是P96SAC6。這些變體不能復性或純化，表明在使用之前它們不需要復性或純化。
[0043]圖21示出了 NM23-S120G(復性的，“RS”)的主要群體以FPLC跡線(a)中示出并且通過非還原PAGE (b)驗證的二聚體存在?；旌喜⑶乙?nM在最小干細胞培養(yǎng)基下使用僅通過FPLC純化部分的二聚體以生長人ES細胞、BGOlv/hOG系。人類干細胞的(c_e)照片示出:在8nM的匪23變體中培養(yǎng)，是否在基質膠(c、f)或在用抗-MUC1*抗體、麗-C3 (e)涂覆的細胞培養(yǎng)基板上產(chǎn)生多能性干細胞。
[0044]圖22示出已經(jīng)在用m LIF或NM23-S120G-RS補充的小鼠ES細胞最小培養(yǎng)基中的失活的MEF飼養(yǎng)細胞層上培養(yǎng)兩天的小鼠胚胎干(ES)細胞的照片。圖像表明在具有mLIF作為堿性生長因子的標準小鼠干細胞培養(yǎng)基中小鼠ES細胞與使用匪23 二聚體作為唯一的生長因子一樣生長。
[0045]圖23示出檢測匪23-S120G 二聚體中培養(yǎng)、MEF上的bFGF中培養(yǎng)的人類干細胞或人類乳腺癌細胞中NME1(A、D)、NME6(B、E)或NME7(C、F)的存在或MUC1*拉下試驗中的NME同種型的存在的蛋白質印跡的照片。
[0046]圖24示出了針對NME7特異性的抗體所探測的人胚胎干細胞溶解產(chǎn)物的蛋白質印跡的照片。
[0047]圖25示出了在大腸桿菌中表達的NME7-1⑷和NME7-2⑶的SDS-PAGE的照片。
[0048]圖25.1是來自NME7-1和NME7-2表達并且通過NTA-Ni柱純化的非還原SDS-PAGE凝膠，表明在~40kDa的期望分子量下有很少或沒有蛋白表達。
[0049]圖25.2是通 過NTA-Ni柱的NME7-1和NME7-2純化的洗脫物的蛋白質印跡，表明在~40kDa的期望分子量下有一些NME7-1和NME7-2表達。
[0050]圖26是來自NME7-AB和NME7-A表達并且通過NTA-Ni柱純化的非還原SDS-PAGE凝膠，表明對于NME7-AB在~30kDa的期望分子量下有良好表達(A)，但對于NME7-A在~14kDa的期望分子量下沒有良好表達(B)。
[0051]圖27 (A)是NME7-AB的尺寸排阻色譜法純化的洗脫曲線；⑶是來自NME7-AB峰部分的非還原SDS-PAGE凝膠；(C)是純化的NME7-AB的尺寸排阻色譜法的洗脫曲線。
[0052]圖28A-28D是涂板后(接種后，post-plating) I天的重組NME7-AB或重組匪23 (NMEl)純化二聚體中培養(yǎng)的人類iPS干細胞的放大的照片。
[0053]圖29A-29D是涂板后2天的重組NME7-AB或重組匪23 (NMEl)純化二聚體中培養(yǎng)的人類iPS干細胞的放大的照片。
[0054]圖30A-30D是涂板后3天的重組NME7-AB或重組匪23 (NMEl)純化二聚體中培養(yǎng)的人類iPS干細胞的放大的照片。
[0055]圖31A-31G示出了在基于FGF的培養(yǎng)基或基于NME的培養(yǎng)基中進行多能性誘導的體細胞的曲線圖和照片。A-C是示出多能性誘導過程的第4天和第20天下的多能性標記的RT-PCR測量結果的曲線圖。D-G示出了使用利用標準FGF培養(yǎng)基或省去一個多能性基因并且在NMEl 二聚體培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞的標準方法將代表性細胞誘導至多能性的共焦顯微鏡圖像的照片。
[0056]圖32A-32E示出了由癌細胞和干細胞的MUC1*拉下試驗導致的蛋白質印跡，其中，用針對NME1、NME6和NME7的抗體探測由MUC1*抗體拉下(pull down)的物種。
[0057]圖33A-33C示出了納米顆粒結合試驗的照片，其中，將MUC1*胞外結構域肽固定至SAM涂覆的納米顆粒上并且將NME蛋白以游離態(tài)添加至溶液中。由粉紅色至藍色的顏色變化表明溶液中的游離蛋白能夠同時結合至兩種不同納米顆粒的兩種肽上。
[0058]圖34A-34F示出了在標準FGF培養(yǎng)基或NME7培養(yǎng)基中生長，然后針對DAP1、0CT4和H3K27me3染色(如果細胞具有表明其不再是完全原始態(tài)的失活X染色體時，其染色在細胞核(紅點)中濃縮的組蛋白-3)的人胚胎干(ES)細胞的照片。
[0059]圖35示出了在NME1(NM23-S120G 二聚體)培養(yǎng)基中生長，然后針對DAP1、0CT4和H3K27me3(如果細胞具有表明其不再是完全原始態(tài)的失活X染色體時，其染色在細胞核(紅點)中濃縮的組蛋白-3)染色的人胚胎干(ES)細胞的照片。
[0060]圖36A-36H示出了在NME1(NM23-S120G 二聚體)培養(yǎng)基中生長，然后針對DAP1、0CT4和H3K27me3 (如果細胞具有表明其不再是完全原始態(tài)的失活X染色體時，其染色在細胞核(紅點)中濃縮的組蛋白-3)染色的人胚胎干(ES)細胞的照片。
[0061]圖37A-37D示出了在NME1(NM23-S120G 二聚體)培養(yǎng)基中生長，然后針對DAP1、0CT4和H3K27me3 (如果細胞具有表明其不再是完全原始態(tài)的失活X染色體時，其染色在細胞核(紅點)中濃縮的組蛋白-3)染色的人胚胎干(ES)細胞的照片。
[0062]圖38A-38H示出了在NME1(NM23-S120G 二聚體)培養(yǎng)基中生長，然后針對DAP1、0CT4和H3K27me3 (如果細胞具有表明其不再是完全原始態(tài)的失活X染色體時，其染色在細胞核(紅點)中濃縮的組蛋白-3)染色的人胚胎干(ES)細胞的照片。
[0063]圖39A-39H示出了在NME1(NM23-S120G 二聚體)培養(yǎng)基中生長，然后針對DAP1、0CT4和H3K27me3 (如果細胞具有表明其不再是完全原始態(tài)的失活X染色體時，其染色在細胞核(紅點)中濃縮的組蛋白-3)染色的人胚胎干(ES)細胞的照片。
[0064]圖40示出了前X染色體失活(pre-X-1nactivation)作為傳代數(shù)和細胞是否在NMEl或NME7中培養(yǎng)的函數(shù)的自動計數(shù)的細胞百分數(shù)的條形圖。
[0065]圖41A示出了來自其中起于1，000,3, 000或5，000單個接種細胞的離散群體用表明在基于NME的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的干細胞具有~20%的克隆效率的堿性磷酸酶染色的克隆效率(克隆效率，cloning efficiency)試驗的人胚胎干細胞的照片。
[0066]圖41B示出了來自其中起于1，000,3, 000或5，000單個接種細胞的離散群體用表明在基于FGF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的干細胞具有~I %的克隆效率的堿性磷酸酶染色的克隆效率試驗的人胚胎干細胞的照片。
[0067]圖41C示出了用于克隆效率試驗的細胞數(shù)計數(shù)的表格。
[0068]圖42示出了用抗-MUC1*抗體(MN-C3或MN-C8)涂覆，然后在存在或不存在rho激酶抑制劑(ROCi)的情況下，在最小干細胞培養(yǎng)基(MM)或甚至更小的稱為MN6的培養(yǎng)基中的NMEl 二聚體(“^23-RS”)中培養(yǎng)的6孔組織培養(yǎng)板上接種的人類iPS細胞第2天的照片(4X)。
[0069]圖43示出了用抗-MUC1*抗體(MN-C3或MN-C8)涂覆，然后在存在或不存在rho激酶抑制劑(ROCi)的情況下，在最小干細胞培養(yǎng)基(MM)或甚至更小的稱為MN6的培養(yǎng)基中的NMEl 二聚體(“^23-RS”)中培養(yǎng)的6孔組織培養(yǎng)板上接種的人類iPS細胞第2天的照片(IOX)。
[0070]圖44示出了用抗-MUC1*抗體(MN-C3或MN-C8)涂覆，然后在存在或不存在rho激酶抑制劑(ROCi)的情況下，在最小干細胞培養(yǎng)基(MM)或甚至更小的稱為MN6的培養(yǎng)基中的NME7中培養(yǎng)的6孔組織培養(yǎng)板上接種的人類iPS細胞第2天的照片(4X)。
[0071] 圖45示出了用抗-MUC1*抗體(MN-C3或MN-C8)涂覆，然后在存在或不存在rho激酶抑制劑(ROCi)的情況下，在最小干細胞培養(yǎng)基(MM)或甚至更小的稱為MN6的培養(yǎng)基中的NME7中培養(yǎng)的6孔組織培養(yǎng)板上接種的人類iPS細胞第2天的照片(IOX)。
[0072]圖46示出了用基質膠涂覆，然后在存在或不存在rho激酶抑制劑(ROCi)的情況下，在最小干細胞培養(yǎng)基(MM)或甚至更小的稱為MN6的培養(yǎng)基中的NME7中培養(yǎng)的6孔組織培養(yǎng)板上接種的人類iPS細胞第2天的照片(4X)。
[0073]圖47示出了用基質膠涂覆，然后在存在或不存在rho激酶抑制劑(ROCi)的情況下，在最小干細胞培養(yǎng)基(MM)或甚至更小的稱為MN6的培養(yǎng)基中的NME7中培養(yǎng)的6孔組織培養(yǎng)板上接種的人類iPS細胞第2天的照片(IOX)。
[0074]圖48示出了用基質膠涂覆，然后在存在或不存在rho激酶抑制劑(ROCi)的情況下，在最小干細胞培養(yǎng)基(MM)或甚至更小的稱為MN6的培養(yǎng)基中的NME7中培養(yǎng)的6孔組織培養(yǎng)板上接種的人類iPS細胞第4天的照片(IOX)。
[0075]圖49示出了用基質膠涂覆，然后在存在或不存在rho激酶抑制劑(ROCi)的情況下，在最小干細胞培養(yǎng)基(MM)或甚至更小的稱為MN6的培養(yǎng)基中的NME7中培養(yǎng)的6孔組織培養(yǎng)板上接種的人胚胎干(ES)細胞第3天的照片(IOX)。
[0076]圖50示出了用基質膠涂覆，然后在存在或不存在rho激酶抑制劑(ROCi)的情況下，在最小干細胞培養(yǎng)基(MM)或甚至更小的稱為MN6的培養(yǎng)基中的NMEl 二聚體(“^23-RS”)中培養(yǎng)的6孔組織培養(yǎng)板上接種的人胚胎干(ES)細胞第3天的照片(10X)。
[0077]圖51示出了在存在或不存在rho激酶抑制劑(ROCi)的情況下，用于接種在基于FGF的培養(yǎng)基(MM或E8中的標準bFGF)、或添加至MM培養(yǎng)基的NME7、或MN6培養(yǎng)基中培養(yǎng)的基質膠上的干細胞的多能性基因以及原始和致敏(primed)基因的RT-PCR測量結果的曲線圖。
[0078]圖52示出了用于接種在用識別MUC1*胞外結構域(MN-C3)的抗體涂覆并且在向其加入匪23 二聚體(NME1 S120G 二聚體)或NME 7的麗最小培養(yǎng)基中培養(yǎng)的塑料制品(plasticware)上的人胚胎干細胞的原始和致敏基因的RT-PCR測量結果的曲線圖。
[0079]圖53示出了用于接種在用抗-MUC1*抗體(C3)、MEF飼養(yǎng)細胞涂覆的塑料制品或基質膠上的人類ES細胞的多能性基因以及原始和致敏基因的RT-PCR測量結果的曲線圖。在最小培養(yǎng)基(MM)加NM23 (NMEI 二聚體)或NME7-AB中培養(yǎng)VITA/C3抗體表面上的細胞。在MM加FGF中培養(yǎng)通過MEF接種的細胞。在存在或不存在rho激酶抑制劑(ROCi)的情況下，在MM培養(yǎng)基或MN6培養(yǎng)基中的NME7中培養(yǎng)基質膠上的細胞用于單次傳代。
[0080]圖54示出了用于接種在用抗-MUC1*抗體(C3)、MEF飼養(yǎng)細胞涂覆的塑料制品或基質膠上的人類ES細胞的多能性基因以及原始和致敏基因的RT-PCR測量結果的曲線圖。在最小培養(yǎng)基(MM)加NM23 (NMEI 二聚體)或NME7-AB中培養(yǎng)VITA/C3抗體表面上的細胞。在MM加FGF中培養(yǎng)通過MEF接種的細胞。在存在或不存在rho激酶抑制劑(ROCi)的情況下，在MM培養(yǎng)基或MN6培養(yǎng)基中的匪23 (NMEI 二聚體)中培養(yǎng)基質膠上的細胞用于單次傳代。
[0081]圖55A-55C示出了表明NME7物種在干細胞溶解產(chǎn)物(A、C)和干細胞條件培養(yǎng)基(B)中表達的蛋白質印跡的照片。
[0082]圖56示出了探測其中一些0CT4、NME1、NME6或NME7被抑制而細胞在包含NME7的培養(yǎng)基中被培養(yǎng)的人類干細胞中的NME7物種的蛋白質印跡的照片。
[0083]圖57示出了其中由NME7拉下試驗獲得的蛋白質在凝膠、離體帶上分離并且通過質譜分析的SDS-PAGE凝膠的照片。質譜表明由NME7抗體拉下的低分子量(~23kDa)物種也是NME7，但是NME7物種中的肽序列均映射至NME7的NDPK A結構域。
[0084]圖58示出了來自表明NME7-AB使MUCI*胞外結構域肽二聚化的ELISA夾心式試驗的HRP信號的曲線圖。
[0085]圖59A-59B示出了表明NME6在大腸桿菌中表達和純化的SDS-PAGE凝膠的照片。
【具體實施方式】
[0086]定義
[0087]主要通過PSMGFR 序列(GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA (SEQID NO:6))定義MUC1*胞外結構域。由于MUCl裂解的確切部位取決于修剪其的酶，并且裂解酶根據(jù)細胞類型、組織類型或細胞進化的時間變化，MUC1*胞外結構域的準確序列可以在
N-端變化。
[0088]為數(shù)1-10個的NME家族蛋白是由于它們均具有至少一個NDPK (核苷二磷酸激酶)結構域而分組在一起的蛋白。在一些情況下，NDPK結構域在能夠催化ATP轉化為ADP方面不起作用。NME蛋白被正式稱為匪23蛋白、編號H1、H2等。在此，術語匪23和NME可互換。在此，術語NMEl、NME2、NME6和NME7用于指原始蛋白以及NME變體(變異體)。在一些情況下，這些變體在大腸桿菌中更易溶解、表達更好或比原始序列蛋白更易溶解。例如，如在說明書中使用的NME7可以指原始蛋白或變體，如由于變異使得可溶解、適當復性的蛋白在大腸桿菌中高產(chǎn)率表達的具有優(yōu)越的商業(yè)應用的NME7-AB。如本文中論及的“NME1”可與“匪23-H1”互換。還預期的是本發(fā)明不受限于NME蛋白的確切序列。貫穿本申請，可互換地使用也稱為匪23-S120G的突變體NME1-S120G。由于它們對于二聚體(但本文中可論及的是作為匪23 二聚體或NMEl 二聚體)形成的優(yōu)先性，優(yōu)選S120G突變體和P96S突變體。
[0089]如在本文中所論及的NME7旨在指原始NME7或增加產(chǎn)率、可溶解性或使得NME7更有效或商業(yè)更可行的其他性能的變體。
[0090]如在本文中使用的，F(xiàn)GF、FGF_2、或bFGF是指成纖維細胞生長因子。
[0091] 如在本文中使用的，Rho相關激酶抑制劑可以是小分子肽或蛋白(Rath N，OlsonMF.Rho-associated kinases in tumorigenesis: re-considering ROCK inhibition forcancer therapy.EMBO Rep.2012 ；13(10):900-8)。rho 相關激酶抑制劑的實例是 Y27632、HA-1077 (也稱為法舒地爾)、H-1152 和 thiazovivin (Olson MF.(針對 ROCK 激酶抑制劑的應用)Application for ROCK kinase inhibition.Curr Opin Cell Biol.2008 ；20(2):242-8 ;Watanabe K，Ueno M，Kamiya D，et al.(ROCK 抑制劑允許相關人胚胎干細胞的生存)A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stemcells.Nat Bio techno 1.2007 ；25 (6): 681-6 ;Brei ten lechner C，Gassel M，Hidaka H，etal.Protein kinase A in complex with Rho-kinase inhibitors Y—27632，F(xiàn)asudil，andH-1152P:structural basis of selectivity.Structure.2003 ； 11 (12):1595-607 ；LinT，Ambasudhan R，Yuan X，et al.A chemical platform for improved induction of humaniPSCs.Nat Methods.2009 ；6(11):805-8)。除了 Rho激酶抑制劑之外，本發(fā)明想象使用代替Rho激酶抑制劑的相關路徑的抑制劑。例如，在相同路徑中，鳥嘌呤交換因子(GEF)是Rho激酶的上游。GEF活化Rho激酶。因此，代替使用rho激酶抑制劑，本發(fā)明想象使用GEF抑制劑。由于當結合至GDP時，rho激酶處于失活狀態(tài)，可以使用增加存在于細胞如RAD、GEM、和RhoE以及其他中的GDP的量的任何試劑代替rho激酶抑制劑以幫助干細胞生長、存活和連接至它們所在位置處的表面(Riento K, Guasch RM, Garg R, Jin B, Ridley AJ (2003)(RhoE 結合至 ROCKI 并抑制下游信號)RhoE binds to ROCKI and inhibits downstreamsignaling.Mol Cell Biol 23:4219-4229 ；Komander D, Garg R, Wan PT, Ridley AJ, BarfordD (2008)來自ROCK-1:RhoE復合物結構的多位憐酸化機理(Mechanism of mult1-sitephosphorylation from a ROCK-1:RhoE complex structure).EMBO J27:3175-3185 ；ffardY, Yap SF, Ravichandran V, Matsumura F, Ito M, Spinelli B, Kelly K(2002)GTP 結合蛋白Gem 和 Rad 是 Rho-Rho 激酶路徑的隱性調節(jié)(The GTP binding proteins Gem and Rad arenegative regulators of the Rho-Rho kinase pathway).J Cell Biol 157:291-302)。肌球蛋白也處于與Rho激酶一樣的路徑中。肌球蛋白間接地由Rho激酶活化并且因此在相同路徑中作為Rho激酶的下游。因此，根據(jù)本發(fā)明的方法，也可以使用肌球蛋白抑制劑代替rho激酶抑制劑以幫助干細胞存活和/或幫助干細胞連接至表面。Blebbistatin是肌球蛋白抑制劑并且可以用于代替根據(jù)本發(fā)明的方法使用的任何rho激酶抑制劑(Ohgushi M, MatsumuraM, Eiraku M, Murakami K, Aramaki T, Nishiyama A, et al.負責人類多能性干細胞中的離解-誘導凋亡的分子路徑和細胞狀態(tài)(Molecular pathway and cell state responsiblefor dissociation-1nduced apoptosis in human pluripotent stem cells).Cell StemCell2010 ；7:225-39 ；Ohata H, Ishiguro T, Aihara Y, et al.通過 Rho 激酶抑制劑引入干細胞樣細胞調節(jié)劑⑶44有助于維持結腸癌癥起始細胞(Induction of the Stem-like CellRegulator CD44by Rho Kinase Inhibition Contributes to the Maintenance of ColonCancer-1nitiating Cells).Cancer Res.2012 ；72 (19): 5101-10)。
[0092]在此處和其他地方，Rho激酶抑制劑簡稱為ROCi或ROCKi。具體的rho激酶抑制劑的使用旨在示例性的并且可以 替換為任何其他的rho激酶抑制劑。
[0093]序列表自由文本(sequence listing free text)
[0094]關于除a、g、c、t的核苷酸符號的使用，它們遵循WIPO標準ST.25，附錄2，表1中列出的規(guī)則，其中，k代表t或g ;n代表a、C、t、或g ；m代表a或c ;r代表a或g ;s代表c或g 代表a或t,并且Y代表c或t。
[0095]MTPGTQSPFF LLLLLTVLTV VTGSGHASST PGGEKETSATQRSSVPSSTE KNAVSMTSSVLSSHSPGSGS STTQGQDVTLAPATEPASGS AATffGQDVTS VPVTRPALGS TTPPAHDVTSAPDNKPAPGSTAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTS APDNRPALGS TAPPVHNVTSASGSASGSAS TLVHNGTSAR ATTTPASKSTPFSIPSHHSDTPTTLASHST KTDASSTHHS SVPPLTSSNH STSPQLSTGV SFFFLSFHISNLQFNSSLEDPSTDYYQELQ RDISEMFLQI YKQGGFLGLSNIKFRPGSVV VQLTLAFREG TINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVS VSDVPFPFSA QSGAGVPGffG IALLVLVCVLVALAIVYLIA LAVCQCRRKNYGQLDIFPAR DTYHPMSEYPTYHTHGRYVP PSSTDRSPYE KVSAGNGGSS LSYTNPAVAA
[0096]ASANL(SEQ ID NO:1)描述了全長MUCl受體(粘蛋白I前體，Genbank登錄號:P15941)。
[0097]MTPGTQSPFFLLLLLTVLT(SEQ ID NO:2)
[0098]MTPGTQSPFFLLLLLTVLT VVTA (SEQ ID NO: 3)
[0099]MTPGTQSPFFLLLLLTVLT VVTG (SEQ ID NO: 4) [0100]SEQ ID NOS:2、3和4描述了用于將MUCl受體和截短的同種型指向細胞膜表面的N-端MUC-1信號序列。在由SEQ ID NOS:2、3和4中的變體指明的C-端可以缺失多達3個
氨基酸殘基。
[0101]GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAGVPGWGIALLVLVCVLVALAIVYLIALAVCQCRRKNYGQLDIFPARDTYHPMSEYPTYHTHGRYVPPSSTDRSRYEKVSAGNGGSSLSYTNPAVAAASANL(SEQ ID NO: 5)描述了在其N-端具有nat-PSMGFR并且包括跨膜和全長MUCl受體的細胞質序列的截短MUCl受體同種型。
[0102]GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO:6)描述了 MUCl生長因子受體(nat-PSMGFR- “PSMGFR”的實例)的天然一級序列(primary sequence)。
[0103]TINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO:7)描述了 MUCl 生長因子受體(nat-PSMGFR- “PSMGFR”的實例)的天然一級序列，在SEQ ID NO:6的N-端具
有單一的氨基酸缺失。
[0104]GTINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO:8)描述了具有增強的穩(wěn)定性的MUCl生長因子受體(var-PSMGFR- “PSMGFR”的實例)的天然一級序列的“SPY”功能變體。
[0105]TINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO:9)描述了具有增強的穩(wěn)定性的MUCl生長因子受體(var-PSMGFR- “PSMGFR”的實例)的天然一級序列的“SPY”功能變體，在SEQ ID NO: 8的C-端具有單一的氨基酸缺失。
[0106]tgtcagtgccgccgaaagaactacgggcagctggacatctttccagcccgggatacctaccatcctatgagcgagtaccccacctaccacacccatgggcgctatgtgccccctagcagtaccgatcgtagcccctatgagaaggtttctgcaggtaacggtggcagcagcctctcttacacaaacccagcagtggcagccgcttctgccaacttg(SEQ IDNO: 10)描述了 MUCl細胞質結構域核苷酸序列。
[0107]CQCRRKNYGQLDIFPARDTYHPMSEYPTYHTHGRYVPPSSTDRSPYEKVSAGNGGSSLSYTNPAVAAASANL(SEQ ID NO: 11)描述了 MUCl 細胞質結構域氨基酸序列。
[0108]Gagatcctgagacaatgaatcatagtgaaagattcgttttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcacttcttcgacgttatgagcttttattttacccaggggatggatctgttgaaatgcatgatgtaaagaatcatcgcacctttttaaagcggaccaaatatgataacctgcacttggaagatttatttataggcaacaaagtgaatgtcttttctcgacaactggtattaattgactatggggatcaatatacagctcgccagctgggcagtaggaaagaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggtatgttgaatacactatattcagtacattttgttaataggagagcaatgtttattttcttgatgtactttatgtatagaaaataa(SEQ ID NO: 12)描述了 NME7 核苷酸序列(NME7:GENBANKACCESSIONAB209049)。
[0109]DPETMNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYP⑶GSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGMLNTLYSVHFVNRRAMFIFLMYFMYRK(SEQ ID NO: 13)描述了 NME7 核苷酸序列(NME7:GENBANK ACCESSION AB209049)。
[0110]atggtgctactgtctactttagggatcgtctttcaaggcgaggggcctcctatctcaagctgtgatacaggaaccatggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtcca ttctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaaccctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcagtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaatga(SEQ ID NO: 14)描述了 NM23-H1 核苷酸序列(NM23-H1:GENBANK ACCESSION AF487339)。
[0111]MVLLSTLGIVFQGEGPPISSCDTGTMANCERTFIAlKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVESAEKEIGLffFHPEEL VDYTSCAQNWIYE(SEQ ID NO: 15)NM23-H1 描述了氨基酸序列(NM23-H1:GENBANK ACCESSION AF487339)。
[0112]atggtgctactgtctactttagggatcgtctttcaaggcgaggggcctcctatctcaagctgtgatacaggaaccatggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaaccctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcggtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaatga(SEQ ID NO: 16)描述了 NM23-H1 S120G突變體核苷酸序列(NM23-H1:GENBANK ACCESSIONAF487339)。
[0113]MVLLSTLGIVFQGEGPPISSCDTGTMANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHG⑶SVESAEKEIGLWFHPEEL VDYTSCAQNWIYE (SEQ ID NO: 17)描述了 NM23-H1 S120G 突變體氨基酸序列(NM23-H1:GENBANK ACCESSION AF487339)。
[0114]atggccaacctggagcgcaccttcatcgccatcaagccggacggcgtgcagcgcggcctggtgggcgagatcatcaagcgcttcgagcagaagggattccgcctcgtggccatgaagttcctccgggcctctgaagaacacctgaagcagcactacattgacctgaaagaccgaccattcttccctgggctggtgaagtacatgaactcagggccggttgtggccatggtctgggaggggctgaacgtggtgaagacaggccgagtgatgcttggggagaccaatccagcagattcaaagccaggcaccattcgtggggacttctgcattcaggttggcaggaacatcattcatggcagtgattcagtaaaaagtgctgaaaaagaaatcagcctatggtttaagcctgaagaactggttgactacaagtcttgtgctcatgactgggtctatgaataa(SEQ ID NO: 18)描述了 NM23-H2核苷酸序列(NM23-H2:GENBANK ACCESSIONAK313448)。
[0115]MANLERTFIAIKPDGVQRGLVGE11KRFEQKGFRLVAMKFLRASEEHLKQHYIDLKDRPFFPGLVKYMNSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVKSAEKEISLWFKPEELVDYKSCAHDffVYE(SEQ ID NO: 19)描述了 NM23-H2 氨基酸序列(NM23-H2:GENBANK ACCESSIONAK313448)。
[0116]最佳用于大腸桿菌表達的人匪23-H7-2序列。
[0117](DNA)
[0118]atgcatgacgttaaaaatcaccgtacctttctgaaacgcacgaaatatgataatctgcatctggaagacctgtttattggcaacaaagtcaatgtgttctctcgtcagctggtgctgatcgattatggcgaccagtacaccgcgcgtcaactgggtagtcgcaaagaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttcaaaattctggataattga(SEQ ID NO:20)
[0119](氨基酸)
[0120]MHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEffKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAlRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN-(SEQ ID NO:21)
[0121]人NME7-A:
[0122](DNA)
[0123]Atggaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgtttttttga(SEQ ID NO:22)
[0124](氨基酸)
[0125]MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIΑΜΕ ILRDDAI CEffKRLLGPANSGVARTDASES IRALFGTDGIR NAAHGPDSFASAAREMELFF- (SEQ ID NO:23)
[0126]人NME7-A1:
[0127](DNA)
[0128]atggaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttacttga(SEQ IDNO:24)
[0129](氨基酸)
[0130]MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEffKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIR N A AHGPD SFAS A AREMELFFPS S GGCGPANTAKFT-(SEQ ID NO:25)
[0131]人NME7-A2:
[0132](DNA)
[0133]atgaatcatagtgaaagattcgttttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcacttcttcgacgttatgagcttttattttacccaggggatggatctgttgaaatgcatgatgtaaagaatcatcgcacctttttaaagcggaccaaatatgataacctgcacttggaagatttatttataggcaacaaagtgaatgtcttttctcgacaactggtattaattgactatggggatcaatatacagctcgccagctgggcagtaggaaagaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattct tttgcttctgcggccagagaaatggagttgtttttttga(SEQ ID NO: 26)
[0134](氨基酸)
[0135]MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYP⑶GSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFF-(SEQ ID NO:27)
[0136]人NME7-A3:
[0137](DNA)
[0138] atgaatcatagtgaaagattcgttttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcacttcttcgacgt
【權利要求】
1.一種用于細胞生長、維持和誘導回復至較不成熟狀態(tài)的細胞培養(yǎng)基，包含MUC1*激活配體。
2.根據(jù)權利要求1所述的細胞培養(yǎng)基，其中，所述細胞是干細胞或祖細胞。
3.根據(jù)權利要求1所述的細胞培養(yǎng)基，其中，所述細胞是成熟細胞、體細胞或祖細胞。
4.根據(jù)權利要求1所述的細胞培養(yǎng)基，其中，所述細胞是人細胞。
5.根據(jù)權利要求1所述的細胞培養(yǎng)基，其中，所述培養(yǎng)基不含bFGF、TGF-β、或兩者。
6.根據(jù)權利要求1所述的細胞培養(yǎng)基，其中，所述培養(yǎng)基不含血清。
7.根據(jù)權利要求1所述的細胞培養(yǎng)基，其中，所述培養(yǎng)基進一步包含胰島素、硒、轉鐵蛋白、1-抗壞血酸、或非必需氨基酸。
8.根據(jù)權利要求1所述的細胞培養(yǎng)基，其中，所述MUC1*配體是NME家族蛋白。
9.根據(jù)權利要求8所述的細胞培養(yǎng)基，其中，所述NME家族蛋白是NMEl。
10.根據(jù)權利要求1所述的細胞培養(yǎng)基，其中，NMEl以二聚化或設計為具有兩個亞基的單鏈的兩種單體存在。
11.根據(jù)權利要求8所述的細胞培養(yǎng)基，其中，所述NME家族蛋白是ΝΜΕ7。
12.根據(jù)權利要求11所述的細胞培養(yǎng)基，其中，所述ΝΜΕ7具有約25kDa或約30kDa的分子量。
13.根據(jù)權利要求8所述的細胞培養(yǎng)基，其中，所述NME家族蛋白是NME7-AB。
14.根據(jù)權利要求8所述的細胞培養(yǎng)基，其中，所述NME家族蛋白是NME6。
15.根據(jù)權利要求1所述的細胞培養(yǎng)基，進一步包含rho相關激酶抑制劑。
16.根據(jù)權利要求1所述的細胞培養(yǎng)基，進一步包含在PI3K或RAC通路中并且不存在rho激酶抑制劑下的信號蛋白激活劑。
17.根據(jù)權利要求1所述的細胞培養(yǎng)基，進一步包含抑制NMEl或NME2表達的核酸。
18.根據(jù)權利要求1所述的細胞培養(yǎng)基，進一步包含其他生長因子。
19.根據(jù)權利要求18所述的細胞培養(yǎng)基，其中，所述其他生長因子是FGF-2和/或TGF- β。
20.一種包括使細胞與含有NME家族蛋白的細胞培養(yǎng)基接觸以刺激干細胞或祖細胞生長或誘導細胞回復至較不成熟狀態(tài)的方法。
21.根據(jù)權利要求20所述的方法，其中，所述細胞是干細胞或祖細胞。
22.根據(jù)權利要求20所述的方法，其中，所述細胞是體細胞。
23.根據(jù)權利要求20所述的方法，其中，所述細胞是人細胞。
24.根據(jù)權利要求20所述的方法，其中，所述培養(yǎng)基不含bFGF、TGF-β、或兩者。
25.根據(jù)權利要求20所述的方法，其中，所述培養(yǎng)基不含血清。
26.根據(jù)權利要求20所述的方法，其中，所述培養(yǎng)基進一步包含胰島素、硒、轉鐵蛋白、1-抗壞血酸、或非必需氨基酸。
27.根據(jù)權利要求20所述的方法，其中，所述NME家族蛋白是NMEl。
28.根據(jù)權利要求27所述的方法，其中，NMEl以二聚化或設計為具有兩個亞基的單鏈的兩種單體存在。
29.根據(jù)權利要求20所述的方法，其中，所述NME家族蛋白是ΝΜΕ7。
30.根據(jù)權利要求29所述的方法，其中，所述ΝΜΕ7具有約25kDa或約30 kDa的分子量。
31.根據(jù)權利要求20所述的方法，其中，所述NME家族蛋白是NME7-AB。
32.根據(jù)權利要求20所述的方法，其中，所述NME家族蛋白是NME6。
33.根據(jù)權利要求20所述的方法，進一步包括胰島素、硒、轉鐵蛋白、1-抗壞血酸，使用NaHCO3 調節(jié) pH。
34.根據(jù)權利要求20所述的方法，其中，所述培養(yǎng)基進一步包含rho激酶抑制劑。
35.根據(jù)權利要求20所述的方法，其中，所述培養(yǎng)基進一步包含在PI3K或RAC通路中并且不存在rho激酶抑制劑下的信號蛋白激活劑。
36.根據(jù)權利要求20所述的方法，其中，所述培養(yǎng)基進一步包含抑制NMEl或NME2表達的核酸。
37.根據(jù)權利要求20所述的方法，其中，所述培養(yǎng)基進一步包含鳥嘌呤交換因子抑制劑。
38.根據(jù)權利要求29所述的方法，其中，所述鳥嘌呤交換因子抑制劑是六聚體形式的NMEl0
39.根據(jù)權利要求29所述的方法，其中，所述鳥嘌呤交換因子抑制劑是獲得自NMEl的肽。
40.根據(jù)權利要求20所述的方法，其中，所述培養(yǎng)基進一步包含其他生長因子。
41.根據(jù)權利要求40所述的方法，其中，所述其他生長因子是FGF-2和/或TGF-β。
42.一種細胞培養(yǎng)基，基本上由NME家族蛋白，加上用于生長或維持干細胞的基礎培養(yǎng)基和非必需氨基酸組成。
43.一種包括使細胞與基本上由NME家族蛋白組成的細胞培養(yǎng)基接觸以刺激干細胞或祖細胞生長或誘導細胞回復至較不成熟狀態(tài)的方法。
44.一種包含干細胞群的組合物，其中，所述組合物進一步包含含有NME家族蛋白的無血清培養(yǎng)基。
45.一種在其上是結合至祖細胞或干細胞的配體的表面上增殖干細胞或祖細胞的方法，包括使所述細胞與包括NME家族蛋白的培養(yǎng)基接觸。
46.一種制造原始干細胞的純?nèi)后w的方法，包括: (i)使細胞與包含NME家族蛋白的細胞培養(yǎng)基接觸以獲得原始干細胞的單集落； (?)分離原始干細胞的所述單集落；以及 (iii)使所述集落與包含NME家族蛋白的細胞培養(yǎng)基接觸以獲得原始干細胞的純?nèi)后w。
47.根據(jù)權利要求46所述的方法，其中，在步驟⑴中，獲得約25%至60%的原始狀態(tài)的細胞。
48.根據(jù)權利要求47所述的方法，其中，獲得約30%至50%的所述原始狀態(tài)的細胞。
49.根據(jù)權利要求46所述的方法，其中，在步驟(iii)中，所述原始干細胞群體的純度為至少約80%。
50.根據(jù)權利要求49所述的方法，其中，所述原始干細胞群體的純度為至少約90%。
51.根據(jù)權利要求50所述的方法，其中，所述原始干細胞群體的純度為至少約95%。
52.根據(jù)權利要求51所述的方法，其中，所述原始干細胞群體的純度為至少約99%。
53.一種由誘導的多能性干細胞制造原始干細胞的純?nèi)后w的方法，包括: (i)使成熟細胞或祖細胞與包含NME家族蛋白的細胞培養(yǎng)基接觸以獲得原始干細胞的單集落； (?)分離原始干細胞的所述單集落；以及 (iii)使所述集落與包含NME家族蛋白的細胞培養(yǎng)基接觸以獲得原始干細胞的純?nèi)后w。
54.根據(jù)權利要求53所述的方法，其中，步驟(i)中，所述成熟細胞用多能性基因轉染。
55.根據(jù)權利要求53所述的方法，其中，所述成熟細胞或祖細胞是體細胞、成真皮細胞、或成纖維細胞。
56.根據(jù)權利要求53所述的方法，其中，在步驟(i)中，獲得約25%至60%的原始狀態(tài)的細胞。
57.根據(jù)權利要求56所述的方法，其中，獲得約30%至50%的所述原始狀態(tài)的細胞。
58.根據(jù)權利要求53所述的方法，其中，在步驟(iii)中，所述原始干細胞的群體的純度為至少約80%。
59.根據(jù)權利要求58所述的方法，其中，所述原始干細胞的群體的純度為至少約90%。
60.根據(jù)權利要求59所述的方法，其中，所述原始干細胞的群體的純度為至少約95%。
61.根據(jù)權利要求60所述的方法，其中，所述原始干細胞的群體的純度為至少約99%。
62.一種生成人胚胎干細胞系的方法，包括: (i)使獲得自胚泡的細胞與包含NME家族蛋白的細胞培養(yǎng)基接觸； (?)分離具有干細胞樣形態(tài)的長出物； (iii)使所述分離的長出物與包含NME家族蛋白的細胞培養(yǎng)基接觸；以及 (iv)并且分離具有期望的核型以及表明所述細胞是多能性的多能性基因和原始基因的表達水平的克隆。
63.根據(jù)權利要求62所述的方法，其中，所述NME家族成員是NME7。
64.根據(jù)權利要求63所述的方法，其中，所述NME7是NME7-AB。
65.根據(jù)權利要求62所述的方法，其中，包含所述NME家族成員的所述培養(yǎng)基不包含F(xiàn)GF。
66.根據(jù)權利要求62所述的方法，包括抑制所述細胞中的NMEl和NME2。
67.一種生成人誘導多能性干細胞系的方法，包括: (i)使獲得自供體或患者的細胞與包含NME家族蛋白的細胞培養(yǎng)基接觸； (ii)使所述細胞與誘導多能性基因0CT4、SOX2、NANOG、KLF4、c-Myc或LIN28表達的試劑接觸； (iii)分離具有干細胞樣形態(tài)的細胞； (iv)使所述分離的細胞與包含NME家族蛋白的細胞培養(yǎng)基接觸； (v)分離具有期望的核型以及表明所述細胞是多能性的多能性基因的表達水平的克??；以及 (vi)并且在包含NME家族成員的培養(yǎng)基中繁殖克隆。
68.根據(jù)權利要求67所述的方法，其中，所述NME家族成員是NME7。
69.根據(jù)權利要求68所述的方法，其中，所述NME7是NME7-AB。
70.根據(jù)權利要求67所述的方法，其中，包含所述NME家族成員的所述培養(yǎng)基不包含F(xiàn)GF。
71.根據(jù)權利要 求67所述的方法，包括抑制所述細胞中的NMEl和NME2。
【文檔編號】C12N5/00GK103998598SQ201280062509
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2012年10月17日 優(yōu)先權日:2011年10月17日
【發(fā)明者】辛西婭·巴姆達德, 貝努瓦·J·斯馬格 申請人:米納瓦生物技術公司