用于肌營(yíng)養(yǎng)不良的診斷和治療隨訪的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及通過(guò)檢測(cè)體液中、尤其是尿液中的微RNA來(lái)進(jìn)行肌營(yíng)養(yǎng)不良的診斷、隨訪和治療效能評(píng)估。
【專利說(shuō)明】用于肌營(yíng)養(yǎng)不良的診斷和治療隨訪的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及通過(guò)檢測(cè)體液中、尤其是尿液中的微RNA來(lái)進(jìn)行肌營(yíng)養(yǎng)不良的診斷、 隨訪和治療效能評(píng)估。

【背景技術(shù)】
[0002] Duchenne型肌營(yíng)養(yǎng)不良（DMD)和Becker型肌營(yíng)養(yǎng)不良（BMD)由編碼肌養(yǎng)蛋白的 基因的突變或缺失造成（Munt〇ni，T〇relli等，2003)。在表型最為嚴(yán)重的第一種情形中，肌 養(yǎng)蛋白完全不存在。允許細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白微絲附著于細(xì)胞外基質(zhì)（LeRumeur,Winder等） 的DAPC復(fù)合物（肌養(yǎng)蛋白結(jié)合蛋白復(fù)合物）也不存在。這種復(fù)合物通常保護(hù)經(jīng)歷收縮和 松弛的肌纖維的膜。在它不存在的情況下，纖維不再受到保護(hù)，并且我們?cè)诩∪庵杏^察到經(jīng) 歷變性的肌細(xì)胞和作為傾向于抵消這種現(xiàn)象的再生的證據(jù)的新細(xì)胞（Batchelor和Winder 2006)。最終，再生不充分，并且纖維被脂肪組織代替。
[0003] 在治療上，目前將最大的希望放在外顯子跳躍技術(shù)上（Cirak,Arechavala-Gomeza 等；Lu，Yokota等）。事實(shí)上，引起嚴(yán)重性較低的表型的BMD也是由編碼肌養(yǎng)蛋白的基因中 的一個(gè)或多個(gè)突變?cè)斐傻?，但是蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)域被保留：
[0004] -與肌動(dòng)蛋白微絲結(jié)合的N-端結(jié)構(gòu)域，
[0005] -與DAPC復(fù)合物結(jié)合的富含半胱氨酸的C-端結(jié)構(gòu)域。
[0006] 因此，對(duì)于DMD患者來(lái)說(shuō)，可以通過(guò)排除信使RNA(mRNA)內(nèi)帶有無(wú)義突變的外顯子 來(lái)獲得Becker表型，并因此恢復(fù)開(kāi)放閱讀框。這樣產(chǎn)生的較短的蛋白有部分功能。這種策 略目前正在幾項(xiàng)臨床試驗(yàn)中進(jìn)行試驗(yàn)。
[0007] 定期的多學(xué)科醫(yī)學(xué)監(jiān)測(cè)能夠評(píng)估病理進(jìn)展并提出管理方案以延長(zhǎng)患者的壽命。 它包括防止退縮、提供技術(shù)幫助、物理療法、心臟監(jiān)測(cè)、整形外科和呼吸輔助。診斷隨訪通 過(guò)例如運(yùn)動(dòng)功能評(píng)估，通過(guò)肌肉活檢或通過(guò)循環(huán)中分泌的酶，肌酸激酶的測(cè)定等來(lái)進(jìn)行 (Bushby,Finkel等）。
[0008] 肌肉活檢分析能夠觀察受損的纖維、表明肌肉再生的較小纖維以及被脂肪組織代 替的壞死區(qū)。這種方法的缺點(diǎn)在于它對(duì)患者具有非常大的侵入性。
[0009] 另一種方法由測(cè)定血液中的肌酸激酶（CK)構(gòu)成。這種酶與幾種細(xì)胞類型中存在 的能量代謝相關(guān)。它在血液中濃度的增加表明了肌纖維的降解狀態(tài)。然而，這種生物標(biāo)志 物不是完全可靠的，因?yàn)樗乃揭踩Q于應(yīng)激，例如體力活動(dòng)（Nicholson,Morgan等， 1986)。還存在其他的酶例如醛縮酶或乳酸脫氫酶，但是與CK的情況相同，它們的豐度不僅 僅依賴于病理狀態(tài)（Lott和Landesman1984)。
[0010] 因此，在Duchenne型肌營(yíng)養(yǎng)不良的情形中，似乎必需鑒定更可靠的新的生物標(biāo)志 物，可以在非侵入性樣品例如尿液樣品的基礎(chǔ)上測(cè)定的標(biāo)志物。
[0011] 微RNA(或miRNA)是有希望的生物標(biāo)志物。它們?cè)谏眢w的所有組織中，尤其是骨骼 肌中表達(dá)。還已知道，它們以"循環(huán)"狀態(tài)存在于所有生物流體中（Weber，Baxter等）。文獻(xiàn) 中的最近工作顯示，Duchenne型肌病的特有識(shí)別標(biāo)志存在于肌肉（Cacchiarelli，Martone 等；Greco,DeSimone等，2〇〇9)和血清（Cacchiarelli，Legnini等）中。
[0012] 到目前為止，沒(méi)有研究顯示出miRNA用作在尿液中肌營(yíng)養(yǎng)不良標(biāo)志物的潛在用 途。本發(fā)明人調(diào)查了在患有肌營(yíng)養(yǎng)不良的患者的尿液中miRNA的存在情況，以便鑒定這種 類型的障礙特有的識(shí)別標(biāo)志。
[0013] 此外，本發(fā)明人還調(diào)查了肌營(yíng)養(yǎng)不良的新的循環(huán)標(biāo)志物。
[0014] 發(fā)明概述
[0015] 本發(fā)明人尤其是調(diào)查了DMD患者的尿液樣品，以便確定是否可以鑒定這種障礙特 有的miRNA。這一工作顯示，存在與某些miRNA在DMD患者的尿液中比在健康供體的尿液中 更加豐富的表達(dá)相關(guān)的特異性識(shí)別標(biāo)志。
[0016] 一種或多種miRNA在患病個(gè)體中相對(duì)于健康個(gè)體中的表達(dá)的這種變化的發(fā)現(xiàn)，在 診斷領(lǐng)域中找到應(yīng)用。因此，本發(fā)明涉及將選自表1中的miRNA的至少一種miRNA應(yīng)用于 診斷肌營(yíng)養(yǎng)不良的方法。它還涉及使用一種或多種所述miRNA來(lái)評(píng)估發(fā)生或出現(xiàn)肌營(yíng)養(yǎng)不 良的風(fēng)險(xiǎn)。
[0017]表1 :
[0018]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于診斷或評(píng)估在對(duì)象中發(fā)生或出現(xiàn)肌營(yíng)養(yǎng)不良的風(fēng)險(xiǎn)的方法，所述方法包括 測(cè)量所述對(duì)象的尿液樣品中至少一種微RNA的表達(dá)水平，并將在所述尿液樣品中測(cè)量到的 所述表達(dá)水平與在健康參比樣品中獲得的水平進(jìn)行比較，所述表達(dá)水平相對(duì)于所述參比樣 品之間的差異指示了所述對(duì)象中的營(yíng)養(yǎng)不良。
2. 權(quán)利要求1中所要求的方法，其中所述至少一種微RNA選自let-7f、let-7a、 miR-548d_5p、miR-183、miR-490_3p、miR-520a_3p、miR-590_3p、miR_15a、miR-1244、 miR-328、miR-494、miR-668、miR-208、miR-521、miR-597、miR-874、miR-224、miR-182、 miR_23b、miR-492、let_7c、let_7e、miR_15b、miR_487b、miR-410、miR-139_5p、miR_216b、 miR-423_5p、miR-484、miR_23a、miR_376c、miR-412、miR-433、miR-206、miR-335、 miR_33a*、miR-193a_3p、miR-381、miR-34c_5p、miR-628_3p、miR-659、miR-505*、let_7b、 let_7d、let_7g、miR_196b、miR_26b、miR-942、miR_200b*、miR-523、miR-346、miR-155、 miR-548b-5p、miR-548c-5p、miR-518f、miR-886-3p、miR-650、miR-720、miR-593、miR-657、 miR-502_3p、miR-198、miR-214、miR-220、miR-373、miR-511、miR_517b、miR-518a_3p、 miR-518b、miR-518e、miR-520g、miR-493、miR-151-5p、miR-192*、miR-28-5p、miR-30d 和 miR-30e_3p〇
3. -種用于診斷或評(píng)估在對(duì)象中發(fā)生或出現(xiàn)肌營(yíng)養(yǎng)不良的風(fēng)險(xiǎn)的方法，所述方法包 括在所述對(duì)象的體液樣品中測(cè)量至少一種微RNA的表達(dá)水平，所述微RNA選自let-7f、 let_7a、miR-548d_5p、miR-183、miR-490_3p、miR-520a_3p、miR-590_3p、miR_15a、 miR-1244、miR-328、miR-494、miR-668、miR-208、miR-521、miR-597、miR-874、miR-224、 miR-182、miR_23b、miR-492、let_7c、let_7e、miR_15b、miR_487b、miR-410、miR-139_5p、 miR_216b、miR-423_5p、miR-484、miR_23a、miR_376c、miR-412、miR-433、miR-335、 miR_33a*、miR-193a_3p、miR-381、miR-34c_5p、miR-628_3p、miR-659、miR-505*、let_7b、 let_7d、let_7g、miR_196b、miR_26b、miR-942、miR_200b*、miR-523、miR-346、miR-155、 miR-548b_5p、miR-548c_5p、miR_518f、miR-886_3p、miR-650、miR-720、miR-593、miR-657、 miR-502_3p、miR-198、miR-214、miR-220、miR-373、miR-511、miR_517b、miR-518a_3p、 miR-518b、miR-518e、miR-520g、miR-493、miR-151-5p、miR-192*、miR-28-5p、miR-30d 和 miR-30e_3p〇
4. 一種用于監(jiān)測(cè)肌營(yíng)養(yǎng)不良的演變的方法，所述方法包括在對(duì)象的第二體液樣品中中 測(cè)量至少一種微RNA的表達(dá)水平，所述微RNA選自let-7f、let-7a、miR-548d-5p、miR-183、 miR-490_3p、miR-520a_3p、miR-590_3p、miR_15a、miR-1244、miR-328、miR-494、miR-668、 miR-208、miR-521、miR-597、miR-874、miR-224、miR-182、miR_23b、miR-492、let_7c、 let-7e、miR-15b、miR-487b、miR-410、miR-139-5p、miR-216b、miR-423-5p、miR-484、 miR_23a、miR_376c、miR-412、miR-433、miR-335、miR_33a*、miR-193a_3p、miR-381、 miR-34c-5p、miR-628-3p、miR-659、miR-505*、let_7b、let_7d、let_7g、miR-196b、miR-26b、 miR-942、miR_200b*、miR-523、miR-346、miR-155、miR-548b_5p、miR-548c_5p、miR_518f、 miR-886_3p、miR-650、miR-720、miR-593、miR-657、miR-502_3p、miR-198、miR-214、 miR-220、miR-373、miR-511、miR_517b、miR-518a_3p、miR_518b、miR_518e、miR_520g、 1^尺-493、1^1?-151-5口、1^1?-192*、1^1?-28-5口、1^1?-30(1和1^1?-3(^-3口，將所述對(duì)象的樣品中 的這一水平與第一參比樣品中所述微RNA的水平進(jìn)行比較，所述第一參比樣品對(duì)應(yīng)于之前 從同一對(duì)象獲取的樣品； 所選的一種或多種微RNA的表達(dá)水平的演變，指示了肌營(yíng)養(yǎng)不良的發(fā)展。
5. -種用于在對(duì)象中確定肌營(yíng)養(yǎng)不良的治療性治療的效能的方法，所述方法包括： a) 測(cè)量所述對(duì)象的體液中一種或多種微RNA的表達(dá)水平，由此確定參比水平；然后 b) 在施用所述治療性治療之后的給定時(shí)間，測(cè)量在從同一對(duì)象獲取的生物流體的第二 樣品中在步驟a)中選擇的所述至少一種微RNA的表達(dá)水平，由此確定試驗(yàn)水平；以及 c) 比較對(duì)照水平和試驗(yàn)水平，所選的微RNA的表達(dá)水平的演變指示了所述對(duì)象的有效 治療； 所述一種或多種 miRNA 選自 let_7f、let_7a、miR-548d_5p、miR-183、miR-490_3p、 miR-520a_3p、miR-590_3p、miR_15a、miR-1244、miR-328、miR-494、miR-668、miR-208、 miR-521、miR-597、miR-874、miR-224、miR-182、miR_23b、miR-492、let_7c、let_7e、 miR-15b、miR-487b、miR-410、miR-139-5p、miR-216b、miR-423-5p、miR-484、miR-23a、 miR_376c、miR-412、miR-433、miR-335、miR_33a*、miR-193a_3p、miR-381、miR-34c_5p、 miR-628_3p、miR-659、miR-505*、let_7b、let_7d、let_7g、miR_196b、miR_26b、miR-942、 miR_200b*、miR-523、miR-346、miR-155、miR-548b_5p、miR-548c_5p、miR_518f、 miR-886_3p、miR-650、miR-720、miR-593、miR-657、miR-502_3p、miR-198、miR-214、 miR-220、miR-373、miR-511、miR_517b、miR-518a_3p、miR_518b、miR_518e、miR_520g、 miR-493、miR-151_5p、miR-192*、miR-28_5p、miR_30d 和 miR-30e_3p。
6. 權(quán)利要求3至5任一項(xiàng)中所要求的方法，所述樣品是尿液樣品。
7. -種用于在對(duì)象中（a)監(jiān)測(cè)肌營(yíng)養(yǎng)不良的演變或（b)確定肌營(yíng)養(yǎng)不良的治療性 治療的效能的方法，所述方法包括測(cè)量所述對(duì)象的尿液樣品中至少一種微RNA的表達(dá)水 平，所述微 RNA 選自 let-7f、let-7a、miR-548d-5p、miR-183、miR-490-3p、miR-520a-3p、 miR-590-3p、miR-15a、miR-1244、miR-328、miR-494、miR-668、miR-208、miR-521、miR-597、 miR-874、miR-224、miR-182、miR_23b、miR-492、let_7c、let_7e、miR_15b、miR_487b、 miR-410、miR-139_5p、miR_216b、miR-423_5p、miR-484、miR_23a、miR_376c、miR-412、 miR-433、miR-206、miR-335、miR_33a*、miR-193a_3p、miR-381、miR-34c_5p、miR-628_3p、 miR-659、miR-505*、let_7b、let_7d、let_7g、miR_196b、miR_26b、miR-942、miR_200b*、 miR-523、miR-346、miR-155、miR-548b-5p、miR-548c-5p、miR-518f、miR-886-3p、miR-650、 miR-720、miR-593、miR-657、miR-502-3p、miR-198、miR-214、miR-220、miR-373、miR-511、 miR-517b、miR-518a-3p、miR-518b、miR-518e、miR-520g、miR-493、miR-151-5p、miR-192*、 miR-28_5p、miR_30d 和 miR-30e_3p。
8. 權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)中所要求的方法，所述一種或多種microRN選自let-7f、 let_7a、miR-548d_5p、miR-183、miR-490_3p、miR-520a_3p、miR-590_3p、miR_15a、 miR-1244、miR-328、miR-494、miR-668、miR-208、miR-521、miR-597、miR-874、miR-224、 miR-182、miR_23b、miR-492、let_7c、let_7e、miR_15b、miR_487b、miR-410、miR-139_5p、 miR-216b、miR-423-5p、miR-484、miR-23a、miR-376c、miR-412、miR-433、miR-206、miR-335、 miR_33a*、miR-193a_3p、miR-381、miR-34c_5p、miR-628_3p、miR-659、miR-505*、let_7b、 let_7d、let_7g、miR_196b、miR_26b、miR-942、miR_200b*、miR-523、miR-346、miR-155、 miR-548b-5p、miR-548c-5p、miR-518f、miR-886-3p、miR-650、miR-720、miR-593、miR-657、 miR-502_3p、miR-198、miR-214、miR-220、miR-373、miR-511、miR_517b、miR-518a_3p、 miR-518b、miR-518e、miR-520g 和 miR-493〇
9. 權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)中所要求的方法，所述一種或多種miRNA選自let-7f、 let_7a、miR-548d_5p、miR-183、miR-490_3p、miR-520a_3p、miR-590_3p、miR_15a、 miR-1244、miR-328、miR-494、miR-668、miR-208、miR-521、miR-597、miR-874、miR-224、 miR-182、miR_23b、miR-492、let_7c、let_7e、miR_15b、miR_487b、miR-410、miR-139_5p、 miR-216b、miR-423-5p、miR-484、miR-23a、miR-376c、miR-412、miR-433、miR-206、miR-335、 miR_33a*、miR-193a_3p、miR-381 和 miR-34c_5p。
10. 權(quán)利要求1至9任一項(xiàng)中所要求的方法，所述一種或多種miRNA選自let-7f、 let_7a、miR-548d_5p、miR-183、miR-490_3p、miR-520a_3p、miR-590_3p、miR_15a、 miR-1244、miR-328、miR-494、miR-668、miR-208、miR-521、miR-597 和 miR-874。
11. 權(quán)利要求1至10任一項(xiàng)中所要求的方法，所述方法包括測(cè)量列出的所有miRNA。
12. 權(quán)利要求1至11任一項(xiàng)中所要求的方法，用于Duchenne型肌營(yíng)養(yǎng)不良或Becker 型肌營(yíng)養(yǎng)不良、尤其是Ducherme型肌營(yíng)養(yǎng)不良的診斷、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、演變監(jiān)測(cè)或治療效能監(jiān) 測(cè)。
13. -種試劑盒，其包含用于微RNA的檢測(cè)或測(cè)定的用品，所述試劑盒中用于檢測(cè)或 測(cè)定的用品由用于一種或多種miRNA的檢測(cè)或測(cè)定的用品構(gòu)成，所述miRNA選自let-7f、 let_7a、miR-548d_5p、miR-183、miR-490_3p、miR-520a_3p、miR-590_3p、miR_15a、 miR-1244、miR-328、miR-494、miR-668、miR-208、miR-521、miR-597、miR-874、miR-224、 miR-182、miR_23b、miR-492、let_7c、let_7e、miR_15b、miR_487b、miR-410、miR-139_5p、 miR-216b、miR-423-5p、miR-484、miR-23a、miR-376c、miR-412、miR-433、miR-206、miR-335、 miR_33a*、miR-193a_3p、miR-381、miR-34c_5p、miR-628_3p、miR-659、miR-505*、let_7b、 let_7d、let_7g、miR_196b、miR_26b、miR-942、miR_200b*、miR-523、miR-346、miR-155、 miR-548b-5p、miR-548c-5p、miR-518f、miR-886-3p、miR-650、miR-720、miR-593、miR-657、 miR-502_3p、miR-198、miR-214、miR-220、miR-373、miR-511、miR_517b、miR-518a_3p、 miR-518b、miR-518e、miR-520g、miR-493、miR-151-5p、miR-192*、miR-28-5p、miR-30d 和 miR-30e_3p〇
14. 權(quán)利要求13中所要求的試劑盒，每個(gè)所述miRNA利用探針和/或特異性引物對(duì)來(lái) 檢測(cè)或測(cè)定。
15. -種用于PCR的多孔支持物，其包含由至少兩種miRNA的特異性引物構(gòu)成的PCR引 物對(duì)，所述 miRNA 選自 let-7f、let-7a、miR-548d-5p、miR-183、miR-490-3p、miR-520a-3p、 miR-590_3p、miR-l 5a、miR_l 244、miR-328、miR-494、miR-668、miR-208、miR-521、miR-597、 miR-874、miR-224、miR-182、miR_23b、miR-492、let_7c、let_7e、miR_15b、miR_487b、 miR-410、miR-139_5p、miR_216b、miR-423_5p、miR-484、miR_23a、miR_376c、miR-412、 miR-433、miR-206、miR-335、miR_33a*、miR-193a_3p、miR-381、miR-34c_5p、miR-628_3p、 miR-659、miR-505*、let_7b、let_7d、let_7g、miR_196b、miR_26b、miR-942、miR_200b*、 miR-523、miR-346、miR-155、miR-548b-5p、miR-548c-5p、miR-518f、miR-886-3p、miR-650、 miR-720、miR-593、miR-657、miR-502-3p、miR-198、miR-214、miR-220、miR-373、miR-511、 miR-517b、miR-518a-3p、miR-518b、miR-518e、miR-520g、miR-493、miR-151-5p、miR-192*、 miR-28-5p、miR-30d和miR-30e-3p，各個(gè)引物對(duì)被安排在所述支持物的不同孔中。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104271760SQ201280062188
【公開(kāi)日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2012年12月14日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月16日
【發(fā)明者】勞倫斯·讓松-萊爾, 大衛(wèi)·伊斯拉雷利, 法蒂瑪·阿莫爾, 托馬斯·沃伊特 申請(qǐng)人:吉尼松公司, 肌肉學(xué)研究協(xié)會(huì)