嵌合的雙鏈核酸的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了借助反義作用抑制靶基因表達的雙鏈核酸復合物，和使用該雙鏈核酸復合物的方法。一種用于減少細胞中轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物水平的方法包括使組合物與細胞接觸，所述組合物包含雙鏈核酸復合物，所述雙鏈核酸復合物包含與第二核酸鏈復性的第一核酸鏈，其中第一核酸鏈(i)包含核苷酸和任選地核苷酸類似物，并且第一核酸鏈中核苷酸和核苷酸類似物的總數(shù)是8至100，(ii)包含當?shù)谝缓怂徭溑c轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物雜交時由RNA酶H識別的至少4個連續(xù)核苷酸，并且(iii)第一核酸鏈與轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物雜交；和第二核酸鏈包含核苷酸和任選地核苷酸類似物。
【專利說明】嵌合的雙鏈核酸

【技術領域】
[0001] 本申請涉及具有借助反義作用抑制靶基因表達的活性的雙鏈核酸，并且更具體 地，涉及包含反義核酸和與所述反義核酸互補的核酸的雙鏈核酸，所述反義核酸與靶基因 的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補并含有包含4個或更多個連續(xù)堿基的區(qū)域。

【背景技術】
[0002] 近年來，寡核苷酸已經(jīng)成為正在開發(fā)的稱作核酸藥物的藥物產(chǎn)品中的目的主題， 并且特別地，從靶基因的高度選擇性和低毒性的觀點看，利用反義方法開發(fā)核酸藥物正在 活躍進行中。反義方法是通過引入與靶基因的mRNA(有義鏈）的部分序列互補的寡核苷酸 (反義寡核苷酸（AS0))至細胞中，選擇性抑制靶基因編碼的蛋白質(zhì)表達的方法。
[0003] 如圖1 (上半部分）中所示，將包含RNA的寡核苷酸作為AS0引入細胞時，AS0與 靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（mRNA)結(jié)合，并且形成部分的雙鏈。已知這種雙鏈發(fā)揮覆蓋物的作用以 防止核糖體翻譯，并且因此抑制靶基因編碼的蛋白質(zhì)的表達。
[0004] 在另一方面，將包含DNA的寡核苷酸作為AS0引入細胞時，形成部分的DNA-RNA異 雙鏈體。由于RNA酶Η識別這種結(jié)構，靶基因的mRNA因而分解，抑制靶基因編碼的蛋白質(zhì) 的表達。（圖1，下半部分）。另外，還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在許多情況下，與使用RNA時相比，基因表達 抑制效應在使用DNA作為AS0(RNA酶Η依賴性途徑）時更高。
[0005] 在利用寡核苷酸作為核酸藥物的情況下，已經(jīng)在考慮增強對靶RNA的結(jié)合親和 力、體內(nèi)穩(wěn)定性等時開發(fā)多種核酸類似物如鎖核酸（LNA)(注冊商標）、其他橋連的核酸等。
[0006] 如圖2中所示，由于天然核酸（RNA或DNA)的糖部分具有含4個碳原子和1個氧 原子的五元環(huán)，所以糖部分具有兩種構象：Ν型和S型。已知這些構象從一種形式轉(zhuǎn)變成 另一種形式，并且因而核酸的螺旋結(jié)構也采取不同形式：Α型和Β型。由于充當前述AS0 的靶的mRNA采取A型螺旋結(jié)構，糖部分主要處于N型，因此從增加對RNA的親和力的觀 點看，AS0的糖部分采取N型是重要的。已經(jīng)在這種概念下開發(fā)的產(chǎn)品是修飾的核酸，如 LNA(2' -0, 4' -C-亞甲基橋連的核酸（2'，4' -BNA))。例如，在LNA中，由于2' -位置處的氧 和4'-位置處的碳由亞甲基橋連，所以構象固定成N型，并且不存在構象之間的波動。因此， 與采用常規(guī)天然核酸合成的寡核苷酸相比，通過摻入幾個LNA單元所合成的寡核苷酸具有 針對RNA的非常高的親和力和非常高的序列特異性，并且還顯示出優(yōu)異的耐熱性和核酸酶 抗性（見PTL1)。由于其他人工核酸也具有這類特征，更多注意力投向與利用反義方法等有 關的人工核酸（見PTL1至7)。
[0007] 另外，將寡核苷酸應用至藥物時，重要的是相關寡核苷酸可以以高特異性和高效 率遞送至靶部位。此外，作為用于遞送寡核苷酸的方法，已經(jīng)開發(fā)了一種利用脂質(zhì)如膽固醇 和維生素 E的方法（NPL1和2)、一種利用受體特異性肽如RVG-9R的方法（NPL3)和一種利 用對靶部位特異的抗體的方法（NPL4)。
[0008] 引文目錄
[0009] [專利文獻]
[0010] [PTL1]JP10-304889A
[0011] [PTL2]W02005/021570
[0012] [PTL3]JP10-195098A
[0013] [PTL4]JP2002-521310ff
[0014] [PTL5]W02007/143315
[0015] [PTL6]W02008/043753
[0016] [PTL7]W02008/029619
[0017] [非專利文獻]
[0018] [NPLl]Kazutaka Nishina 等人，Molecular Therapy,第 16 卷，734-740 (2008)
[0019] [NPL2] Jurgen Soutscheck 等人，Nature,第 432 卷，173-178 (2004)
[0020] [NPL3]Kazutaka Nishina 等人，Molecular Therapy,第 l6 卷，734_74〇 (2〇〇8)
[0021] [NPL4]Dan Peer 等人，Science,第 319 卷，627-630(2008)
[0022] 發(fā)明概述
[0023] 技術問題
[0024] 在某些實施方案中，雙鏈核酸復合物包含抑制靶基因表達或更廣義地抑制RNA轉(zhuǎn) 錄產(chǎn)物水平的反義核酸。本發(fā)明的又一個目的是雙鏈核酸復合物以高特異性和高效率遞送 反義核酸鏈至靶部位。
[0025] 解決問題的方案
[0026] 出于研究怎樣增強AS0穩(wěn)定性、抑制靶基因體內(nèi)表達的活性（反義作用）和在反 義方法中遞送AS0至靶部位的特異性和效率（遞送特性）的目的，發(fā)明人制備了與脂質(zhì)（膽 固醇）直接結(jié)合的包含LNA和DNA(LNA/DNA缺口聚體）的AS0,并且通過靜脈內(nèi)施用這種 AS0至小鼠，發(fā)明人評價了遞送特性和反義作用。作為結(jié)果，發(fā)現(xiàn)當膽固醇與AS0結(jié)合時， AS0至肝臟的遞送特性增強，然而，反義作用喪失。
[0027] 因而，發(fā)明人進行了徹底研究，目的是開發(fā)在增加 AS0遞送特性的同時，具有高反 義作用的核酸，并且作為結(jié)果，發(fā)明人在一個實施方案中構思了通過使LNA/DNA缺口聚體 (gapmer)與RNA鏈復性所產(chǎn)生的新雙鏈核酸復合物，其中所述RNA鏈與缺口聚體互補，并且 首次評價反義作用。作為結(jié)果，發(fā)現(xiàn)雙鏈核酸的反義作用總體上好于單鏈LNA/DNA缺口聚 體，并且取決于所用AS0的鏈長度，大大增強。發(fā)明人還產(chǎn)生了其中生育酚與包含RNA的互 補鏈結(jié)合的雙鏈核酸，將該雙鏈核酸靜脈內(nèi)施用至小鼠，并評價其反義作用。作為結(jié)果，發(fā) 現(xiàn)含有與生育酚結(jié)合的互補鏈的雙鏈核酸具有非常高的反義作用。此外，發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)通 過與包含PNA(肽核酸）而非RNA的互補鏈復性產(chǎn)生的LNA/DNA缺口聚體的反義作用至少 相似于或好于單鏈LNA/DNA缺口聚體，并且另外，PNA提供了使AS0與能指導遞送AS0至特 定位點的肽、蛋白質(zhì)或抗體間接結(jié)合的方式。
[0028] S卩，本申請涉及具有借助反義作用抑制靶基因表達的活性的雙鏈核酸。
[0029] 在某些實施方案中，提供了以下內(nèi)容。
[0030] (1)具有借助反義作用抑制靶基因表達的活性的雙鏈核酸，該雙鏈核酸包含以下 項（a)和b)的核酸 ：
[0031] (a)反義核酸，其與靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補并且含有包含4個或更多個連續(xù)堿基 的DNA的區(qū)域，和
[0032] (b)與（a)的核酸互補的核酸。
[0033] (2)項⑴中所述的雙鏈核酸，其中（a)的核酸還含有包含修飾核酸的區(qū)域，所述 區(qū)域在包含4個或更多個連續(xù)堿基的DNA的區(qū)域的5'末端側(cè)和3'末端側(cè)的至少任一者上 布置。
[0034] (3)項⑵中所述的雙鏈核酸，其中（a)的核酸的包含修飾核酸的區(qū)域是這樣的包 含修飾核酸的區(qū)域，所述修飾核酸在包含4個或更多個連續(xù)堿基的DNA的區(qū)域的5'末端側(cè) 和3'末端側(cè)上布置，并且修飾核酸是LNA。
[0035] (4)在項⑴至⑶的任一項中所述的雙鏈核酸，其中（b)的核酸是RNA或PNA。
[0036] (5)在項⑴至⑶的任一項中所述的雙鏈核酸，其中（b)的核酸是RNA，與（a) 的核酸的包含修飾核酸的區(qū)域互補的區(qū)域被修飾，并且該修飾具有抑制由核糖核酸酶（RNA 酶）所致分解的作用。
[0037] (6)在項（5)中所述的雙鏈核酸，其中修飾是2' -0-甲基化和/或硫代磷酸酯化。
[0038] (7)在項⑴至（6)的任一項中所述的雙鏈核酸，其中功能性部分與（b)的核酸結(jié) 合。
[0039] (8)在項⑴至（7)的任一項中所述的雙鏈核酸，其中（a)和（b)的核酸的鏈長度 是相同的。
[0040] (9)在項⑴至（7)的任一項中所述的雙鏈核酸，其中（a)和（b)的核酸的鏈長度 是不同的。
[0041] (10)在項（9)中所述的雙鏈核酸，還包括以下項（C)的核酸：
[0042] (c)與（a)和（b)的核酸之間具有較長鏈長度的核酸中相對于另一個核酸突出的 區(qū)域互補的核酸。
[0043] (11)在項（10)中所述的雙鏈核酸，其中（c)的核酸是PNA。
[0044] (12)在項（10)或（11)中所述的雙鏈核酸，其中功能性部分與（c)的核酸結(jié)合。
[0045] (13)在項（7)或（12)中所述的雙鏈核酸，其中功能性部分是具有遞送雙鏈核酸至 革巴部位的活性的分子。
[0046] (14)借助反義作用抑制靶基因表達的組合物，所述組合物含有在項（1)至（13)的 任一項中所述的雙鏈核酸作為有效成分。
[0047] (15) -種減少細胞中轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物水平的方法，包括使組合物與細胞接觸，所述組合 物包含：
[0048] (a)雙鏈核酸復合物，所述雙鏈核酸復合物包含與第二核酸鏈復性的第一核酸鏈， 其中：
[0049] 第一核酸鏈（i)包含核苷酸和任選地核苷酸類似物，并且第一核酸鏈中核苷酸和 任選地核苷酸類似物的總數(shù)是8至100,（ii)包含當?shù)谝缓怂徭溑c轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物雜交時由RNA 酶Η識別的至少4個連續(xù)核苷酸，并且（iii)第一核酸鏈與轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物雜交；和
[0050] 第二核酸鏈包含核苷酸和任選地核苷酸類似物。
[0051] (16) -種減少哺乳動物中基因表達水平的方法，包括向所述哺乳動物施用有效量 的藥物組合物的步驟，所述組合物包含：
[0052] (a)雙鏈核酸復合物，所述雙鏈核酸復合物包含與第二核酸鏈復性的第一核酸鏈， 其中：
[0053] 第一核酸鏈（i)包含核苷酸和任選地核苷酸類似物，并且第一核酸鏈中核苷酸和 任選地核苷酸類似物的總數(shù)是8至100,（ii)包含當?shù)谝缓怂徭溑c所述基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物雜 交時由RNA酶Η識別的至少4個連續(xù)核苷酸，并且（iii)第一核酸鏈與轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物雜交；和
[0054] 第二核酸鏈包含核苷酸和任選地核苷酸類似物；和（b)可藥用載體。
[0055] (17)純化的或分離的雙鏈核酸復合物，包含與第二核酸鏈復性的第一核酸鏈，其 中：
[0056] 第一核酸鏈（i)包含核苷酸和任選地核苷酸類似物，并且第一核酸鏈中核苷酸和 核苷酸類似物的總數(shù)是8至100,（ii)包含當?shù)谝缓怂徭溑c轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物雜交時由RNA酶Η識 別的至少4個連續(xù)核苷酸，（iii)包含至少一個非天然核苷酸，并且（iii)第一核酸鏈與轉(zhuǎn) 錄產(chǎn)物雜交；并且
[0057] 第二核酸鏈包含核苷酸和任選地核苷酸類似物。
[0058] (18)用于治療哺乳動物的藥物組合物，包含項（17)的雙鏈核酸復合物和可藥用 載體，其中轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是哺乳動物轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
[0059] 在本發(fā)明的其他實施方案中，提供以下項。
[0060] 〈1>純化的或分離的雙鏈核酸復合物，包含與第二核酸鏈復性的第一核酸鏈，其 中：
[0061] 第一核酸鏈包含DNA核苷酸和任選地核苷酸類似物，其中包含一個或多個抗核酸 酶的核苷酸的5'翼區(qū)位于5'末端處和/或包含一個或多個抗核酸酶的核苷酸的3'翼區(qū) 位于3'末端處，第一核酸鏈包含至少4個連續(xù)DNA核苷酸，并且第一核酸鏈中DNA核苷酸 和核苷酸類似物的總數(shù)是10至100個核苷酸；
[0062] 第一核酸鏈還包含與轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的序列的一部分互補的至少10個連續(xù)核苷酸的序 列；并且
[0063] 第二核酸鏈包含：
[0064] (i) RNA核苷酸和任選地核苷酸類似物，以及任選地DNA核苷酸；或
[0065] (ii)DNA核苷酸和/或核苷酸類似物；或
[0066] (iii)PNA 核苷酸。
[0067] 其中包含一個或多個抗核酸酶的核苷酸的5'翼區(qū)位于5'末端處和/或包含一個 或多個抗核酸酶的核苷酸的3'翼區(qū)位于3'末端處，并且其中第二核酸鏈中RNA核苷酸、 DNA核苷酸、核苷酸類似物和PNA核苷酸的總數(shù)是10至100個核苷酸。
[0068] 〈2>項〈1>的雙鏈核酸復合物，其中轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是編碼蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
[0069] 〈3>項〈1>的雙鏈核酸復合物，其中轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是不編碼蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
[0070] 〈4>項〈1>-〈3>中任一項的雙鏈核酸復合物，其中第一核酸鏈和第二核酸鏈中的 核苷酸的數(shù)目是相同的。
[0071] 〈5>項〈1>-〈3>中任一項的雙鏈核酸復合物，其中第一核酸鏈和第二核酸鏈中的 核苷酸的數(shù)目是不同的。
[0072] 〈6>項〈5>的雙鏈核酸復合物，其中第二核酸鏈中核苷酸的數(shù)目大于第一核酸鏈 中核苷酸的數(shù)目。
[0073] 〈7>項〈1>-〈6>中任一項的雙鏈核酸復合物，其中第一核酸鏈包含范圍從10至35 個核苷酸的核苷酸總數(shù)。
[0074] 〈8>項〈1>-〈7>中任一項的雙鏈核酸復合物，其中第一核酸鏈的核苷酸均是抗核 酸酶的核苷酸。
[0075] 〈9>項〈1>-〈8>中任一項的雙鏈核酸復合物，其中第一核酸鏈的5'翼區(qū)包含一個 或多個核苷酸類似物和/或第一核酸鏈的3'翼區(qū)包含位于3'末端處的一個或多個核苷酸 類似物。
[0076] 〈10>項〈1>-〈9>中任一項的雙鏈核酸復合物，其中第一鏈包含在5'末端的至少2 個連續(xù)核苷酸類似物的5'翼區(qū)和在3'末端的至少2個連續(xù)核苷酸類似物的3'翼區(qū)。
[0077] 〈11>項〈10>的雙鏈核酸復合物，其中5'翼區(qū)和3'翼區(qū)獨立地由2至10個核苷 酸類似物組成。
[0078] 〈12>項11的雙鏈核酸復合物，其中5'翼區(qū)和3'翼區(qū)獨立地由2-3個核苷酸類似 物組成。
[0079] 〈13>項〈1>-〈12>中任一項的雙鏈核酸復合物，其中第一核酸鏈包含至少一個核 苷酸類似物，所述核苷酸類似物是橋連核苷酸。
[0080] 〈14>項〈1>-〈13>中任一項的雙鏈核酸復合物，其中第一核酸鏈中所含有的核苷 酸類似物是橋連核苷酸。
[0081] 〈15>項〈14>的雙鏈核酸復合物，其中第一核酸鏈的橋連核苷酸獨立地選自LNA、 cEt-BNA、酰胺 BNA(AmNA)和 cMOE-BNA。
[0082] 〈16>項〈14>的雙鏈核酸復合物，其中第二核酸鏈的橋連核苷酸選自其中2' -位置 處的碳原子和 4' -位置處的碳原子由 4' _(CH2)p-0-2'、4' _(CH2)p-S-2'、4' _(CH2)p-0C0-2'、 4' - (CH2) n-N (R3)-0-(CH2) m-2'橋連的核糖核苷酸，其中p、m和η分別代表1至4的整數(shù)、?至 2的整數(shù)和1至3的整數(shù)，并且R 3代表氫原子、烷基、烯基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基、?；⒒酋?基、熒光標記物或化學發(fā)光標記物、具有核酸切割活性的官能團或胞內(nèi)或核內(nèi)定位信號肽。
[0083] 〈17>項〈1>-〈16>中任一項的雙鏈核酸復合物，其中第一核酸鏈中的DNA核苷酸是 硫代磷酸酯化的。
[0084] 〈18>項〈1>-〈17>中任一項的雙鏈核酸復合物，其中第一核酸鏈中所含有的核苷 酸類似物是硫代磷酸酯化的。
[0085] 〈19>項〈1>-〈18>中任一項的雙鏈核酸復合物，其中第一核酸鏈包含4-20個連續(xù) DNA核苷酸的區(qū)段。
[0086] 〈20>項〈1>-〈19>中任一項的雙鏈核酸復合物，其中第一鏈包含（i)在5'末端的 至少2個連續(xù)核苷酸類似物的5'翼區(qū)，（ii)在3'末端的至少2個連續(xù)核苷酸類似物的3' 翼區(qū)，和（iii)至少4個連續(xù)DNA核苷酸。
[0087] 〈21>項〈1>-〈19>中任一項的雙鏈核酸復合物，其中第一鏈包含（i)在5'末端的 至少2個連續(xù)核苷酸類似物的5'翼區(qū)，（ii)在3'末端的至少2個連續(xù)核苷酸類似物的3' 翼區(qū)，其中5'翼區(qū)和3'翼區(qū)中的所述核苷酸類似物是橋連核苷酸；和（iii)至少4個連續(xù) DNA核苷酸；其中所述橋連核苷酸和所述DNA核苷酸是硫代磷酸酯化的。
[0088] 〈22>項〈1>-〈21>任一項的雙鏈核酸，其中第一核酸鏈具有12-25個核苷酸長度。
[0089] 〈23>項〈1>-〈22>中任一項的雙鏈核酸復合物，其中第二核酸鏈包含RNA核苷酸和 /或核苷酸類似物，和任選地DNA核苷酸。
[0090] 〈24>項〈23>的雙鏈核酸復合物，其中第二核酸鏈的5'翼區(qū)包含至少一個核苷酸 類似物，第二核酸鏈的3'翼區(qū)包含至少一個核苷酸類似物，并且第二核酸鏈包含至少4個 連續(xù)RNA核苷酸。
[0091] 〈25>項〈23>的雙鏈核酸復合物，其中第二核酸鏈的5'翼區(qū)包含至少一個硫代磷 酸酯化核苷酸，第二核酸鏈的3'翼區(qū)包含至少一個硫代磷酸酯化核苷酸，并且第二核酸鏈 包含至少4個連續(xù)RNA核苷酸。
[0092] 〈26>項〈24>或〈25>的雙鏈核酸復合物，其中第二核酸鏈的5'翼區(qū)和3'翼區(qū)的 全部核苷酸均是硫代磷酸酯化的。
[0093] 〈27>項〈24>-〈26>任一項的雙鏈核酸復合物，其中第二核酸鏈的抗核酸酶的核苷 酸獨立地選自橋連核苷酸和2' -0-甲基RNA。
[0094] 〈28>項〈27>的雙鏈核酸復合物，其中第二核酸鏈的橋連核苷酸獨立地選自LNA、 cEt-BNA、酰胺 BNA(AmNA)和 cMOE-BNA。
[0095] 〈29>項〈27>的雙鏈核酸復合物，其中第二核酸鏈的橋連核苷酸選自其中2' -位置 處的碳原子和 4' -位置處的碳原子由 4' _(CH2)p-0-2'、4' _(CH2)p-S-2'、4' _(CH2)p-0C0-2'、 4' - (CH2) n-N (R3)-0-(CH2) m-2'橋連的核糖核苷酸，其中p、m和η分別代表1至4的整數(shù)、?至 2的整數(shù)和1至3的整數(shù)，并且R 3代表氫原子、烷基、烯基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基、?；?、磺酰 基、熒光標記物或化學發(fā)光標記物、具有核酸切割活性的官能團或胞內(nèi)或核內(nèi)定位信號肽。
[0096] 〈30>項〈24>的雙鏈核酸復合物，其中第二核酸鏈包含括（i)在5'末端的至少2 個硫代磷酸酯化、2' -0-甲基化的RNA核苷酸，（ii)在3'末端的至少2個硫代磷酸酯化、 2' -0-甲基化的RNA核苷酸，和（iii)分別任選地硫代磷酸酯化的至少4個連續(xù)天然RNA核 苷酸。
[0097] 〈31>項〈24>的雙鏈核酸復合物，其中第二核酸鏈包含括（i)在5'末端的至少2 個硫代磷酸酯化、橋連的RNA核苷酸，（ii)在3'末端的至少2個硫代磷酸酯化、橋連的RNA 核苷酸，和（iii)分別任選地硫代磷酸酯化的至少4個連續(xù)天然RNA核苷酸。
[0098] 〈32>項〈1>-〈22>任一項的雙鏈核酸復合物，其中第二核酸鏈包含PNA核苷酸。
[0099] 〈33>項〈23>-〈32>任一項的雙鏈核酸復合物，其中第二核酸鏈還包含具有功能的 功能性部分，所述功能選自標記功能、純化功能和祀向遞送功能。
[0100] 〈34>根據(jù)項〈1>至〈3>和〈5>至〈33>中任一項的雙鏈核酸復合物，其中雙鏈核酸 復合物還包含與第二核酸鏈復性的第三核酸鏈。
[0101] 〈35>根據(jù)項〈34>的雙鏈核酸，其中第三核酸鏈包含DNA核苷酸和任選地核苷酸類 似物，并且包含至少4個連續(xù)DNA核苷酸，其中核苷酸的總數(shù)是10至100個核苷酸，所述第 三核酸鏈還包括與轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的序列的一部分互補的至少10個連續(xù)核苷酸的序列。
[0102] 〈36>根據(jù)項〈35>的雙鏈核酸復合物，其中第三鏈包含（i)在5'末端的至少2個 連續(xù)核苷酸類似物的5'翼區(qū)，（ii)在3'末端的至少2個連續(xù)核苷酸類似物的3'翼區(qū)，其 中5'翼區(qū)和3'翼區(qū)中的所述核苷酸類似物是橋連核苷酸；和（iii)至少4個連續(xù)DNA核 苷酸；其中所述橋連核苷酸和所述DNA核苷酸是硫代磷酸酯化的。
[0103] 〈37>根據(jù)項〈34>的雙鏈核酸，其中第三核酸鏈包含PNA核苷酸。
[0104] 〈38>項〈34>-〈37>任一項的雙鏈核酸復合物，其中第三核酸鏈還包含具有功能的 功能性部分，所述功能選自標記功能、純化功能和祀向遞送功能。
[0105] 〈39>根據(jù)項33或38的雙鏈核酸復合物，其中所述功能性部分是選自脂質(zhì)、肽和蛋 白質(zhì)的分子。
[0106] 〈40>根據(jù)項〈39>的雙鏈核酸復合物，其中功能性部分與3'末端核苷酸或5'末端 核苷酸連接。
[0107] 〈41>根據(jù)項〈39>或〈40>的雙鏈核酸復合物，其中功能性部分是脂質(zhì)。
[0108] 〈42>根據(jù)項〈41>的雙鏈核酸復合物，其中功能性部分是選自膽固醇、脂肪酸、月旨 溶性維生素、糖脂和甘油酯的脂質(zhì)。
[0109] 〈43>根據(jù)項〈41>的雙鏈核酸復合物，其中功能性部分是選自膽固醇、生育酚和生 育三烯酚的脂質(zhì)。
[0110] 〈44>根據(jù)項〈39>或〈40>的雙鏈核酸復合物，其中功能分子是選自受體配體和抗 體的肽或蛋白質(zhì)。
[0111] 〈45>藥物組合物，包含可藥用載體和項〈1>至〈44>任一項的雙鏈核酸復合物。
[0112] 〈46>項〈1>至〈44>任一項的雙鏈核酸復合物的用途，用于制備減少哺乳動物中基 因表達的藥物。
[0113] 〈47>項〈1>至〈44>任一項的雙鏈核酸復合物的用途，用于減少哺乳動物中基因的 表達。
[0114] 〈48> -種減少哺乳動物中基因表達的方法，包括向所述哺乳動物施用有效量的藥 物組合物的步驟，所述組合物包含：
[0115] 純化或分離的雙鏈核酸復合物，包含與第二核酸鏈復性的第一核酸鏈，其中：
[0116] 第一核酸鏈包含DNA核苷酸和任選地核苷酸類似物，和包括至少4個連續(xù)DNA核 苷酸，其中第一核酸鏈中DNA核苷酸和核苷酸類似物的總數(shù)是10至100個核苷酸；
[0117] 第一核酸鏈還包含與哺乳動物轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的序列的一部分互補的至少10個連續(xù)核 苷酸的序列；并且
[0118] 第二核酸鏈包含：
[0119] (i)RNA核苷酸和任選地核苷酸類似物，以及任選地DNA核苷酸；或
[0120] (ii)DNA核苷酸和/或核苷酸類似物；或
[0121] (iii)PNA 核苷酸。
[0122] 其中第二核酸鏈中RNA核苷酸、DNA核苷酸、核苷酸類似物和PNA核苷酸的總數(shù)是 10至100個核苷酸；和
[0123] 可藥用載體。
[0124] 〈49>項〈48>的方法，其中施用途徑是腸內(nèi)途徑。
[0125] 〈50>項〈48>的方法，其中施用途徑是腸胃外途徑。
[0126] 〈51>項〈48>-〈50>任一項的方法，其中劑量是0.001mg/kg/日至50mg/kg/日的雙 鏈核酸復合物。
[0127] 〈52>項〈48>-〈51>任一項的方法，其中哺乳動物是人。
[0128] 本發(fā)明的有益效果
[0129] 根據(jù)某些實施方案，反義核酸可以在雙鏈復合物中遞送并且可以通過反義核酸選 擇性地和非常有效地抑制靶基因的表達或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的水平。在一些實施方案中，雙鏈復合 物可以通過締合遞送部分與該復合物而以高特異性和高效率遞送至靶部位。
[0130] 附圖簡述
[0131] 圖1是說明某些反義方法的一般機制的簡圖。如本圖中所示，將與靶基因的mRNA 的部分序列互補的寡核苷酸（反義寡核苷酸（AS0))(該圖中的"DNA"）引入細胞時，選擇性 地抑制由靶基因編碼的蛋白質(zhì)的表達。在劃虛線的框中，顯示其中RNA酶Η在mRNA與AS0 雜交的位置處切割該mRNA的降解機制。作為RNA酶Η切割的結(jié)果，該mRNA通常不翻譯，從 而不產(chǎn)生功能性基因表達產(chǎn)物。
[0132] 圖2是說明RNA、DNA和LNA核苷酸的結(jié)構的示意圖。
[0133] 圖3A-B是說明雙鏈核酸復合物的合適實施方案的例子的示意圖。 5'-LNA-DNA-LNA-3'鏈是與靶向的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補的反義核酸。在本圖中，"（s)"表示具有硫 代磷酸酯鍵的核酸；"（〇) "表示具有天然硫代磷酸酯鍵的核酸；并且" (m/s) "表示已經(jīng)硫 代磷酸酯化和2' -0-甲基化的RNA。另外，"X"表示功能性部分，并且可以獨立地代表脂質(zhì) (例如，膽固醇或生育酚）、糖等或蛋白質(zhì)、肽（例如，抗體）等。
[0134] 圖4A-B是說明雙鏈核酸復合物的合適實施方案的例子的示意圖，所述雙鏈核酸 復合物含有三條鏈：具有不同鏈長度的第一 AS0核酸鏈和第二互補性核酸鏈以及包含與功 能分子如肽、抗體等結(jié)合的PNA的第三核酸鏈。本圖中的符號具有與圖3中定義的那些符 號相同的意思。
[0135] 圖5A-B是說明雙鏈核酸復合物的合適實施方案的例子的示意圖，所述雙鏈核酸 復合物具備至少具有不同鏈長度的第一 AS0核酸鏈和第二互補性核酸鏈。在這些實施方 案中，（A)核酸還包含與第二核酸鏈互補的第三核酸鏈或（B)第二核酸鏈還包含通過發(fā)夾 接頭與第二核酸鏈連接的硫代磷酸酯化DNA的自身互補區(qū)。另外，在本圖中，"(m)"表示 2' -0-甲基化RNA。其他符號具有與圖3中定義的那些符號相同的意思。
[0136] 圖6A是說明具有結(jié)構5' -LNA-DNA-LNA-3'的核酸的示意圖，所述核酸在5'末端 用熒光染料Cy3標記。圖6B是說明具有結(jié)構5' -LNA-DNA-LNA-3'的核酸的示意圖，所述核 酸在5'末端用熒光染料Cy3標記并且在3'末端用膽固醇（"Choi"）標記。
[0137] "（s) "表示硫代磷酸酯化核酸。
[0138] 圖7是熒光顯微照片，其說明觀察已經(jīng)施用熒光（Cy3)標記的"LNA"（根據(jù)圖6A) 或熒光（Cy3)標記chol-LNA"（根據(jù)圖6B)的小鼠的肝臟結(jié)果。
[0139] 圖8是說明通過以下方式獲得的結(jié)果的圖：向小鼠施用"12聚 Cy3-Chol-LNA(ApoBl)"（根據(jù)圖 6B)、"20 聚 Cy3-Chol-LNA(ApoBl)" 或"29 聚 Cy3-Chol-LNA(ApoBl) "或"12 聚 Cy3-LNA(ApoBl) "（根據(jù)圖 6A)，它們均具有與 ApoBl 基因 的堿基序列互補的序列，并且通過定量PCR分析這些小鼠的肝臟中ApoBl基因的表達量。
[0140] 圖9是說明雙鏈核酸的某些實施方案的示意圖。符號具有與圖3-6中定義的那些 符號相同的意思。
[0141] 圖10是說明用來評價根據(jù)一個實施方案的雙鏈核酸復合物的反義作用的反義鏈 (AS0)和其互補鏈（cRNA(o)、cRNA(G)和cRNA(m/s)的示意圖。符號具有與圖3-6和圖9中 定義的那些符號相同的意思。
[0142] 圖11顯示說明結(jié)果的照片，所述結(jié)果通過采用電泳法分析存在或不存在圖10中 所示的反義鏈和其互補鏈的復性來獲得。小圖A表示在UV照射下拍照的結(jié)果，并且小圖B 顯示凝膠的照片。
[0143] 圖12是在UV照射下拍攝的照片，所述照片說明通過使圖10中所示的反義鏈及其 互補鏈復性、用RNA酶Η處理所述鏈并通過電泳法分析反應產(chǎn)物所獲得的結(jié)果。
[0144] 圖13是說明結(jié)果的圖，所述結(jié)果通過將圖10中所示的反義鏈或由該反義鏈和圖 10中所示的互補鏈之一組成的雙鏈核酸復合物（以〇. 4ηΜ或ΙΟηΜ的濃度）引入細胞中獲 得。通過定量PCR分析細胞中其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物由反義鏈靶向的ApoBl基因的表達量。
[0145] 圖14是說明結(jié)果的圖，所述結(jié)果通過分析其中引入圖10中所示的反義鏈或由該 反義鏈和圖10中所示的互補鏈之一組成的雙鏈核酸復合物的細胞中ApoBl基因的表達量 獲得，所述表達量針對僅引入該反義鏈的細胞中獲得的表達量歸一化。
[0146] 圖15是說明用來評價雙鏈核酸復合物的反義作用的反義鏈、互補鏈（cRNA(G))和 具有生育酚功能性部分的互補鏈（Toc-cRNA(G))的示意圖。"Toe"表示生育酚。其他符號 具有與圖3-6、圖9和圖10中定義的那些符號相同的意思。
[0147] 圖16是說明結(jié)果的圖，所述結(jié)果通過以下方式獲得：向小鼠施用圖15中所示的反 義鏈或由反義鏈和圖15中所示的互補鏈之一組成的雙鏈核酸并且分析小鼠中其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 由反義鏈靶向的ApoBl基因的表達量。
[0148] 圖17是說明結(jié)果的圖，所述結(jié)果通過評價雙鏈核酸復合物的反義作用的特異性 獲得，所述雙鏈核酸復合物由如圖15中所示的反義鏈和具有與之結(jié)合的生育酚的互補鏈 組成。
[0149] 圖18是說明結(jié)果的圖，所述結(jié)果通過評價雙鏈核酸復合物的反義作用的劑量依 存關系獲得，所述雙鏈核酸復合物由如圖15中所示的反義鏈和具有與之結(jié)合的生育酚的 互補鏈組成。
[0150] 圖19A是說明結(jié)果的圖，所述結(jié)果通過評價雙鏈核酸復合物的反義作用的可持續(xù) 性獲得，所述雙鏈核酸復合物由如圖15中所示的反義鏈和具有與之結(jié)合的生育酚的互補 鏈組成。在本圖中，"d"表示在施用相關雙鏈核酸后過去的天數(shù)。
[0151] 圖19B是說明結(jié)果的圖，所述結(jié)果通過評價雙鏈核酸復合物的反義作用的可持續(xù) 性獲得，所述雙鏈核酸復合物由如圖15中所示的反義鏈和具有與之結(jié)合的生育酚的互補 鏈組成。在本圖中，"d"表示在施用相關雙鏈核酸后過去的天數(shù)。
[0152] 圖20A是說明根據(jù)某些實施方案的反義寡核苷酸和互補鏈的示意圖。
[0153] 圖20B是比較下述結(jié)果的圖，所述結(jié)果通過評價根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的 雙鏈核酸復合物（LNA/cRNA(G)-〇M)的反義作用獲得，所述雙鏈核酸復合物具有包含全部 2' -0-甲基化的RNA的互補鏈。
[0154] 圖21是說明可以用來摻入肽、蛋白質(zhì)等作為功能性部分的雙鏈核酸的合適實施 方案的示意圖。本圖中的符號具有與圖3和圖4中定義的那些符號相同的意思。
[0155] 圖22是說明結(jié)果的圖，所述結(jié)果通過評價由以下三條鏈組成的雙鏈核酸復合物 的反義作用獲得：反義鏈、包含RNA的互補鏈和與肽等結(jié)合的PNA鏈。
[0156] 圖23是說明結(jié)果的圖，所述結(jié)果通過評價由反義鏈和包含PNA的互補鏈組成的雙 鏈核酸復合物的反義作用獲得。
[0157] 圖24是說明根據(jù)某些實施方案的反義寡核苷酸和互補鏈的示意圖。
[0158] 圖25A是說明結(jié)果的圖，所述結(jié)果對采用圖24中所示鏈制備的雙鏈核酸復合物獲 得。
[0159] 圖25B是說明結(jié)果的圖，所述結(jié)果對采用圖24中所示鏈制備的雙鏈核酸復合物獲 得。
[0160] 圖26是說明結(jié)果的圖，所述結(jié)果在使用雙鏈核酸復合物抑制表達的實施例11中 獲得。
[0161] 圖27A是說明結(jié)果的圖，所述結(jié)果在評價用不同長度的雙鏈核酸復合物抑制hTTR 表達的實施例12中獲得。
[0162] 圖27B是說明結(jié)果的圖，所述結(jié)果在評價用不同長度的雙鏈核酸復合物抑制hTTR 表達的實施例12中獲得。
[0163] 圖28是說明結(jié)果的圖，所述結(jié)果在評價處理之前和之后由雙鏈核酸復合物靶向 的蛋白質(zhì)的血清蛋白水平的實施例12中獲得。
[0164] 圖29是顯示在實施例13中獲得的結(jié)果的熒光圖像，顯示了由三條鏈組成的雙鏈 核酸復合物的定位。
[0165] 圖30是說明實施例13的結(jié)果的圖，顯示了由三條鏈組成的雙鏈核酸復合物所致 的表達抑制。
[0166] 圖31是說明實施例14的結(jié)果的圖，顯示了抑制miRNA的水平。
[0167] 圖32是說明結(jié)果的圖，所述結(jié)果在展示使用雙鏈核酸復合物抑制表達的實施例 15中獲得，所述雙鏈核酸復合物含有包含酰胺BNA(AmNA)核苷酸類似物的AS0。
[0168] 實施方案的描述
[0169] 包含反義核酸和與該反義核酸互補的核酸的雙鏈核酸復合物。
[0170] 某些實施方案包括包含與第二核酸復性的第一核酸的純化或分離的雙鏈核酸復 合物，所述雙鏈核酸復合物具有借助反義作用抑制靶基因表達或更普遍地抑制轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物水 平的活性。
[0171] 第一核酸鏈（i)包含核苷酸和任選地核苷酸類似物，并且第一核酸鏈中核苷酸和 核苷酸類似物的總數(shù)是8至100,（ii)包含當?shù)谝缓怂徭溑c轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物雜交時由RNA酶Η識 別的至少4個連續(xù)核苷酸，（iii)包含至少一個非天然核苷酸，并且（iii)第一核酸鏈與轉(zhuǎn) 錄產(chǎn)物雜交；并且
[0172] 第二核酸鏈包含核苷酸和任選地核苷酸類似物，和
[0173] 第二核酸鏈可以與第一核酸鏈復性，
[0174] 第二核酸鏈包含：
[0175] (i)RNA核苷酸和任選地核苷酸類似物，以及任選地DNA核苷酸；或
[0176] (ii)DNA核苷酸和/或核苷酸類似物；或
[0177] (iii)PNA 核苷酸。
[0178] "反義作用"意指抑制靶基因的表達或靶向的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的水平，這因靶向的轉(zhuǎn)錄產(chǎn) 物（RNA有義鏈）與例如與轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物等的部分序列互補的DNA鏈或更一般地設計成引起該 反義作用的鏈雜交而發(fā)生，其中在某些情況下，抑制翻譯或剪接功能調(diào)節(jié)作用如外顯子跳 躍（見對圖1中點線包圍的區(qū)域之外上半部分中的描述）可以因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物被雜交產(chǎn)物覆蓋 引起，和/或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的分解可以因雜交部分的識別而發(fā)生（見圖1中點線包圍的區(qū)域內(nèi) 部描述）。
[0179] 不特別地限制其表達被反義作用抑制的"靶基因"或"靶向的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物"，并且其例 子包括其表達在多種疾病中增加的基因。另外，"靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物"是從編碼靶基因的基 因組DNA轉(zhuǎn)錄的mRNA，并且還包括未經(jīng)歷堿基修飾的mRNA、尚未剪接的mRNA前體等。更一 般地，"轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物"可以是由DNA依賴性RNA聚合酶合成的任何RNA。
[0180] 如本文所用的術語"純化或分離的雙鏈核酸復合物"意指這樣的核酸復合物，它包 含自然界中不存在的至少一個核酸鏈或包含基本上不含天然存在的核酸物質(zhì)的至少一個 核酸鏈。
[0181] 如本文所用的術語"互補"意指其中所謂Watson-Crick堿基對（天然型堿基對） 或非Watson-Crick堿基對（Hoogsteen堿基對等）可以借助氫鍵形成的關系。祀向的轉(zhuǎn)錄 產(chǎn)物（例如靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物）的堿基序列和第一核酸鏈的堿基序列不必需是完美互補 的，并且如果堿基序列具有至少70 %或更高的、優(yōu)選地80 %或更高和更優(yōu)選地90 %或更高 (例如，95%、96%、97%、98%或99%或更高的）的互補性，則這是可接受的?？梢酝ㄟ^使 用BLAST程序等確定序列的互補性。當序列互補時，第一鏈可以"與第二鏈復性"。本領域 技術人員可以輕易地確定兩個鏈可以復性的條件（溫度、鹽濃度等）。另外，本領域普通技 術人員可以基于例如靶基因的堿基序列信息，容易地設計與靶向的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補的反義核 酸。
[0182] 根據(jù)某些實施方案，第一核酸鏈是與轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（如靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物）互補的反 義核酸，并且是含有下述區(qū)域的核酸，所述區(qū)域包含當?shù)谝缓怂徭溑c轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物雜交時由RNA 酶Η識別的至少4個連續(xù)核苷酸。
[0183] 如本文所用，術語"核酸"可以指單體核苷酸或核苷，或可以意指由多個單體組成 的寡核苷酸。術語"核酸鏈"在本文中還用來指寡核苷酸。核酸鏈可以通過化學合成方法 (包括使用自動化合成儀）或通過酶促過程（包括但不限于聚合酶、連接酶或限制性反應） 完全或部分地制備。
[0184] 不特別地限制第一核酸鏈的鏈長度，但是鏈長度通常是至少8個堿基、至少10個 堿基、至少12個堿基或至少13個堿基。鏈長度可以是直至20個堿基、25個堿基或35個堿 基。鏈長度可以甚至長約100個堿基。長度的范圍可以是10至35個堿基、12至25個堿基 或13至20個堿基。在某些情況下，長度的選擇通常取決于反義作用的強度與針對靶的核 酸鏈的特異性的平衡，連同其他因素如成本、合成產(chǎn)率等。
[0185] "由RNA酶Η識別的至少4個連續(xù)核苷酸"通常是包含4至20個連續(xù)堿基的區(qū)域、 包含5至16個連續(xù)堿基的區(qū)域或包含6至12個連續(xù)堿基的區(qū)域。另外，可以在這個區(qū)域 中使用的核苷酸是如天然DNA那樣當與RNA核苷酸雜交時由RNA酶Η識別的那些核苷酸， 其中RNA酶Η切割RNA鏈。合適的核苷酸，如修飾的DNA核苷酸和其他堿基是本領域已知 的。已知含有2'-羥基的核苷酸如RNA核苷酸不是合適的。本領域技術人員可以輕易地確 定用于"至少4個連續(xù)核苷酸"的這個區(qū)域中的核苷酸的適宜性。
[0186] 在某些實施方案中，第一核酸鏈包含"核苷酸和任選地核苷酸類似物"。這個術語 意指第一鏈包含DNA核苷酸、RNA核苷酸，并且任選地還可以在鏈中包含核苷酸類似物。
[0187] 如本文所用，"DNA核苷酸"意指天然存在的DNA核苷酸，或具有修飾的堿基、糖或 磷酸酯鍵亞單位的DNA核苷酸。類似地，"RNA核苷酸"意指天然存在的RNA核苷酸，或具 有修飾的堿基、糖或磷酸酯鍵亞單位的RNA核苷酸。修飾的堿基、糖或磷酸酯鍵亞單位是 其中已經(jīng)在亞單位中添加或取代單個取代基的那種，并且該亞單位總體上尚未替換為不同 的化學基團。從包含核苷酸的區(qū)域的部分或整體具有高脫氧核糖核酸酶抗性等的觀點看， DNA可以是修飾的核苷酸。這類修飾的例子包括胞嘧啶的5-甲基化、5-氟化、5-溴化、5-碘 化和N4-甲基化；胸苷的5-去甲基化、5-氟化、5-溴化和5-碘化；腺嘌呤的N6-甲基化和 8_溴化；鳥嘌呤的N2-甲基化和8-溴化；硫代磷酸酯化、甲基膦酸化、甲基硫代膦酸化、手 性甲基膦酸化、二硫代磷酸酯化、磷酰胺化、2'-0-甲基化、2'-甲氧乙基（MOE)化、2'-氨丙 基（AP)化和2'-氟化。然而，從具有優(yōu)異藥物代謝動力學的觀點看，硫代磷酸酯化是優(yōu)選 的?？梢匀绱藢嵤┻@種修飾，從而相同的DNA可以經(jīng)歷組合的多種修飾。并且如下文討論 的那樣，可以修飾RNA核苷酸以實現(xiàn)相似的效果。
[0188] 在某些情況下，修飾的DNA的數(shù)目和修飾位置可以影響如本文中公開的雙鏈核酸 提供的反義作用等。由于這些實施方案可以隨靶基因等的序列變動，它可以根據(jù)情況變動， 但是本領域普通技術人員可以通過參考與反義方法相關的文獻的描述，確定合適的實施方 案。另外，當測量由修飾后的雙鏈核酸復合物擁有的反義作用時，如果如此獲得的測量值并 未顯著低于修飾后的雙鏈核酸復合物的測量值（例如，如果修飾后獲得的測量值比修飾前 該雙鏈核酸復合物的測量值低30%或更多），可以是評價相關修飾。可以如下文實施例中 所示，通過以下方式實施反義作用的測量：將受測試的核酸化合物引入細胞等中，并且通過 適當使用已知技術如RNA印跡法、定量PCR和蛋白質(zhì)印跡法測量其中表達被受測試的核酸 化合物提供的反義作用抑制的細胞中靶基因的表達量（mRNA的量、cDNA的量、蛋白質(zhì)的量 等）。
[0189] 如本文所用，"核苷酸類似物"意指非天然存在的核苷酸，其中堿基、糖或磷酸酯 鍵亞單位在亞單位中具有多于一個添加或取代的取代基，或該亞單位整體上已經(jīng)替換為不 同的化學基團。具有多于一個取代的類似物的例子是橋連核酸，其中橋連單元已經(jīng)通過 兩個取代添加在糖環(huán)上，一般與2'和4'碳原子連接。就根據(jù)某些實施方案的第一核酸 鏈而言，從增加針對靶基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的部分序列的親和力和/或靶基因針對核酸酶的抗 性觀點看，第一核酸鏈還包含核苷酸類似物。"核苷酸類似物"可以是其中針對靶基因轉(zhuǎn) 錄產(chǎn)物的部分序列的親和力和/或核酸針對核酸酶的抗性由于修飾（橋連基團、取代基 等）而增強的任何核酸，并且其例子包括在JP10-304889A、W02005/021570、JP10-195098A、 JP2002-521310W、W02007/143315、W02008/043753、W02008/029619 和 W02008/049085 中被 公開為適用于反義方法中的核酸（下文中，這些文獻將稱作"與反義方法相關的文獻"）。 艮P，其例子包括在上文描述的文獻中公開的核酸：己糖醇核酸（HNA)、環(huán)己烷核酸（CeNA)、 肽核酸（PNA)、二醇核酸（GNA)、蘇糖核酸（TNA)、嗎啉代核酸、三環(huán)DNA(tcDNA)、2' -0-甲基 化核酸、2'-M0E(2'-0-甲氧乙基）化核酸、2'-AP(2'-0-氨丙基）化核酸、2'-氟化核酸、 2' -F-阿拉伯糖核酸（2' -F-ANA)和BNA (橋連核酸）。
[0190] 根據(jù)某些實施方案，BNA可以是其中2'碳原子和4'碳原子由兩個或更多個原子橋 連的任何核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸。橋連核酸的例子是本領域技術人員已知的?？梢?將這類 BNA 的一個亞組描述為具有由 4' _(CH2)p-0-2'、4' _(CH2)p-S-2'、4' _(CH2)p-0C0-2'、 4' _(CH2)n-N(R3)-0-(CH2) m-2'橋連的2' -位置處碳原子和4' -位置處碳原子（這里，p、m和 η分別代表1至4的整數(shù)、0至2的整數(shù)和1至3的整數(shù)；并且R3代表氫原子、烷基、烯基、 環(huán)烷基、芳基、芳烷基、酰基、磺?；?、單元取代基（熒光標記分子或化學發(fā)光標記分子）、具 有核酸切割活性的官能團、胞內(nèi)或核內(nèi)定位信號肽等）。另外，就根據(jù)某些實施方案的BNA 而言，在3' -位置處碳原子上的0R2取代基和5' -位置處碳原子上的0?取代基中，&和R2 一般是氫原子，但是可以彼此相同或不同，并且也可以是用于核酸合成的羥基的保護基、烷 基、稀基、環(huán)燒基、芳基、芳燒基、醜基、橫醜基、甲娃燒基、憐酸基、受:用于核酸合成的保護基 保護的磷酸基或-p (r4) r5 (這里，可以彼此相同或不同的r4和r5各自代表羥基、受用于核 酸合成的保護基保護的羥基、巰基、受用于核酸合成的保護基保護的巰基、氨基、具有1至5 個碳原子的烷氧基、具有1至5個碳原子的烷硫基、具有1至6個碳原子的氰基烷氧基或用 具有1至5個碳原子的烷基取代的氨基）。這種BNA的非限制性例子包括a -L-亞甲氧基 (4' -CH2-0-2'）ΒΝΑ或β -D-亞甲氧基（4' -CH2-0-2'）ΒΝΑ (又稱作LNA (鎖核酸（注冊商標）、 2'，4' -BNA)、乙烯氧基（4, -CH2) 2-0-2'）BNA (又稱作 ΕΝΑ)、β -D-硫代（4, -CH2-S-2'）BNA、 氛基氧（4, -CH2-0-N (R3) -2'）BNA、氧氛基（4, -CH2-N (R3) -0-2'）BNA (又稱作 2'，4' -BNANC)、 2'，4' -BNAC0C、3' -氨基-2'，4' -BNA、5' -甲基 BNA、（4, -CH(CH3)-0-2'）BNA(又稱作 cEt-BNA)、（4, -CH(CH20CH3)-0-2'）BNA(又稱作 cMOE-BNA、酰胺 BNA(4' -C(0)-N(R)-2'） BNA(R = H、Me)(又稱作AmNA)和本領域技術人員已知的其他BNA。
[0191] 另外，在核苷酸類似物中，根據(jù)某些實施方案，堿基部分可以被修飾。在堿基部 分處修飾的例子包括胞嘧啶的5-甲基化、5-氟化、5-溴化、5-碘化和N4-甲基化；胸苷的 5_去甲基化、5-氟化、5-溴化和5-碘化；腺嘌呤的N6-甲基化和8-溴化；鳥嘌呤的N2-甲 基化和8-溴化。另外，在修飾的核酸中，根據(jù)某些實施方案，磷酸二酯結(jié)合位點可以被修 飾。修飾磷酸二酯結(jié)合位點的例子包括硫代磷酸酯化、甲基膦酸化、甲基硫代膦酸化、手性 甲基膦酸化、二硫代磷酸酯化、和磷酰胺化。然而，從具有優(yōu)異藥物代謝動力學的觀點看，可 以使用硫代磷酸酯化。另外，可以如此實施對堿基部分的這種修飾或?qū)α姿岫ソY(jié)合位點 的修飾，從而相同核酸可以經(jīng)受組合的多種修飾。
[0192] 通常，修飾的核苷酸和修飾的核苷酸類似物不限于本文中例舉的那些。眾多修飾 的核苷酸和修飾的核苷酸類似物是現(xiàn)有技術中已知的，例如在授予Tachas等人的美國專 利號8, 299, 039中、特別是在第17 - 22欄中公開的那些，并且可以用于本申請的實施方案 中。
[0193] 本領域普通技術人員可以適當?shù)剡x擇并且使用這類修飾的核酸當中的核苷酸類 似物，同時考慮反義作用、針對靶基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的部分序列的親和力、核酸酶抗性等。然而， 在一些實施方案中，核苷酸類似物是下式（1)代表的LNA:[化學式1]
[0194]

【權利要求】
1. 減少細胞中轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物水平的方法，包括使組合物與細胞接觸，所述組合物包含雙鏈 核酸復合物，所述雙鏈核酸復合物包含與第二核酸鏈復性的第一核酸鏈，其中： 第一核酸鏈（i)包含核苷酸和任選地核苷酸類似物，并且第一核酸鏈中核苷酸和任選 地核苷酸類似物的總數(shù)是8至100,（ii)包含當?shù)谝缓怂徭溑c轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物雜交時由RNA酶Η 識別的至少4個連續(xù)核苷酸，并且（iii)第一核酸鏈與轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物雜交；和 第二核酸鏈包含核苷酸和任選地核苷酸類似物。
2. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中第二核酸鏈包含： (i) RNA核苷酸和任選地核苷酸類似物，以及任選地DNA核苷酸；或 (ii) DNA核苷酸和/或核苷酸類似物；或 (iii) PNA核苷酸。
3. 權利要求1或權利要求2所述的方法，其中轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是編碼蛋白質(zhì)的mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn) 物。
4. 權利要求1或權利要求2所述的方法，其中轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是不編碼蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
5. 權利要求1-4中任一項所述的方法，其中第一核酸鏈中核苷酸和核苷酸類似物的總 數(shù)和第二核酸鏈中RNA核苷酸、DNA核苷酸、核苷酸類似物和PNA核苷酸的總數(shù)是相同的。
6. 權利要求1-4中任一項所述的方法，其中第一核酸鏈中核苷酸和核苷酸類似物的總 數(shù)和第二核酸鏈中RNA核苷酸、DNA核苷酸、核苷酸類似物和PNA核苷酸的總數(shù)是不同的。
7. 權利要求6所述的方法，其中第二核酸鏈中RNA核苷酸、DNA核苷酸、核苷酸類似物 和PNA核苷酸的總數(shù)大于第一核酸鏈中核苷酸和核苷酸類似物的總數(shù)。
8. 權利要求1-7中任一項所述的方法，其中第一核酸鏈包含范圍為10至35個核苷酸 的核苷酸總數(shù)。
9. 權利要求1-8中任一項所述的方法，其中第一核酸鏈包含位于RNA酶Η識別的至少 4個連續(xù)核苷酸的5'和/或3'的一個或多個核苷酸類似物。
10. 權利要求1-9中任一項所述的方法，其中第一核酸鏈包含位于RNA酶Η識別的至少 4個連續(xù)核苷酸5'的一個或多個核苷酸類似物的5'翼區(qū)和/或位于RNA酶Η識別的至少 4個連續(xù)核苷酸3'的一個或多個核苷酸類似物的3'翼區(qū)。
11. 權利要求10所述的方法，其中第一核酸鏈包含5'翼區(qū)和3'翼區(qū)，并且其中5'翼 區(qū)包含至少2個核苷酸類似物和3'翼區(qū)包含至少2個核苷酸類似物。
12. 權利要求11所述的方法，其中5'翼區(qū)和3'翼區(qū)獨立地包含2至10個核苷酸類似 物。
13. 權利要求12所述的方法，其中5'翼區(qū)和3'翼區(qū)獨立地包含2至3個核苷酸類似 物。
14. 權利要求1-13中任一項所述的方法，其中第一核酸鏈包含至少一個核苷酸，所述 核苷酸包含2' -〇-CH3基團或2' -0_CH2CH20CH3(M0E)基團。
15. 權利要求1-14中任一項所述的方法，其中第一核酸鏈包含至少一個核苷酸類似 物，所述核苷酸類似物是橋連核苷酸。
16. 權利要求15所述的方法，其中第一核酸鏈包含獨立地選自LNA、cEt-BNA、酰胺 BNA(AmNA)和cMOE-BNA的橋連核苷酸。
17. 權利要求15所述的方法，其中第一核酸鏈包含橋連核苷酸，所述橋連核苷酸獨 立地選自其中2'-位置處的碳原子和4'-位置處的碳原子由4'-(CH2)p-0-2'、4'-(CH 2) p-S-2'、4' _(CH2)p-0C0-2'、4' _(CH2)n-N(R3)-0-(CH2) m-2' 橋連的核糖核苷酸，其中 p、m 和 η 分別代表1至4的整數(shù)、0至2的整數(shù)和1至3的整數(shù)，并且R3代表氫原子、烷基、烯基、環(huán) 烷基、芳基、芳烷基、?；⒒酋；晒鈽擞浳锘蚧瘜W發(fā)光標記物、具有核酸切割活性的官 能團或胞內(nèi)或核內(nèi)定位信號肽。
18. 權利要求1-17中任一項所述的方法，其中第一核酸鏈中的至少一個核苷酸是硫代 磷酸酯化的。
19. 權利要求1-18中任一項所述的方法，其中第一核酸鏈中的至少一個核苷酸類似物 是硫代磷酸酯化的。
20. 權利要求1-19中任一項所述的方法，其中第一核酸鏈包括當?shù)谝缓怂徭溑c轉(zhuǎn)錄產(chǎn) 物雜交時由RNA酶Η識別的4-20個連續(xù)核苷酸。
21. 權利要求20所述的方法，其中當?shù)谝缓怂徭溑c轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物雜交時由RNA酶Η識別的 4-20個連續(xù)核苷酸的至少一個核苷酸是DNA核苷酸。
22. 權利要求10-21中任一項所述的方法，其中第一核酸鏈包含5'翼區(qū)和3'翼區(qū)，并 且其中（i) 5'翼區(qū)的核苷酸類似物是橋連核苷酸；（ii) 3'翼區(qū)的核苷酸類似物是橋連核苷 酸；并且（iii)當?shù)谝缓怂徭溑c轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物雜交時由RNA酶Η識別的連續(xù)核苷酸是DNA核苷 酸。
23. 權利要求1-22中任一項所述的方法，其中第一核酸鏈中核苷酸和核苷酸類似物的 總數(shù)是12至25個核苷酸。
24. 權利要求2-23中任一項所述的方法，其中第二核酸鏈包含RNA核苷酸并任選地包 含核苷酸類似物，以及任選地包含DNA核苷酸。
25. 權利要求24所述的方法，其中第二核酸鏈包含當?shù)诙怂徭溑c第一核酸鏈復性時 被RNA酶Η切割的至少4個連續(xù)核苷酸。
26. 權利要求25所述的方法，其中第二核酸鏈包含位于至少4個連續(xù)核苷酸的5'和/ 或3'的一個或多個硫代磷酸酯化核苷酸。
27. 權利要求25或26所述的方法，其中第二核酸鏈包含位于至少4個連續(xù)核苷酸的 5'和/或3'的一個或多個核苷酸類似物。
28. 權利要求26或27所述的方法，其中第二核酸鏈包含位于至少4個連續(xù)核苷酸5' 的一個或多個核苷酸類似物的5'翼區(qū)和/或位于至少4個連續(xù)核苷酸3'的一個或多個核 苷酸類似物的3'翼區(qū)。
29. 權利要求28所述的方法，其中第二核酸鏈包含5'翼區(qū)和3'翼區(qū)，并且其中5'翼 區(qū)包含至少2個核苷酸類似物，并且第一鏈的3'翼區(qū)包含至少2個核苷酸類似物。
30. 權利要求29所述的方法，其中5'翼區(qū)和3'翼區(qū)獨立地包含2至10個核苷酸類似 物。
31. 權利要求30所述的方法，其中5'翼區(qū)和3'翼區(qū)獨立地包含2-3個核苷酸類似物。
32. 權利要求24-31中任一項所述的方法，其中第二核酸鏈包含至少一個RNA核苷酸， 所述RNA核苷酸包含2' -〇-CH3基團或2' -0-CH2CH20CH3 (ΜΟΕ)基團。
33. 權利要求24-32中任一項所述的方法，其中第二核酸鏈包含至少一個核苷酸，所述 核苷酸是橋連核苷酸。
34. 權利要求33所述的方法，其中第二核酸鏈包含獨立地選自LNA、cEt-BNA、酰胺 BNA(AmNA)和cMOE-BNA的橋連核苷酸。
35. 權利要求33所述的方法，其中第二核酸鏈包含橋連核苷酸，所述橋連核苷酸獨 立地選自其中2'-位置處的碳原子和4'-位置處的碳原子由4'-(CH 2)p-0-2'、4'-(CH2) p-S-2'、4' _(CH2)p-0C0-2'、4' _(CH2)n-N(R3)-0-(CH2) m-2' 橋連的核糖核苷酸，其中 p、m 和 η 分別代表1至4的整數(shù)、0至2的整數(shù)和1至3的整數(shù)，并且R3代表氫原子、烷基、烯基、環(huán) 烷基、芳基、芳烷基、?；⒒酋；?、熒光標記物或化學發(fā)光標記物、具有核酸切割活性的官 能團或胞內(nèi)或核內(nèi)定位信號肽。
36. 權利要求28-35中任一項所述的方法，其中第二核酸鏈包含5'翼區(qū)和3'翼區(qū)，并 且其中（i)5'翼區(qū)的核苷酸類似物是橋連核苷酸；（ii)3'翼區(qū)的核苷酸類似物是橋連核苷 酸；并且（iii)當?shù)诙怂徭溑c第一核酸鏈復性時被RNA酶Η切割的連續(xù)核苷酸是RNA核 苷酸。
37. 權利要求36所述的方法，其中第二核酸鏈的至少一個RNA核苷酸和/或至少一個 核苷酸類似物是硫代磷酸酯化的。
38. 權利要求2-23中任一項所述的方法，其中第二核酸鏈包含ΡΝΑ核苷酸。
39. 權利要求24-38中任一項所述的方法，其中第二核酸鏈還包含具有功能的功能性 部分，所述功能選自標記功能、純化功能和祀向遞送功能。
40. 根據(jù)權利要求1至4和6至33中任一項所述的方法，其中雙鏈核酸復合物還包含 與第二核酸鏈復性的第三核酸鏈。
41. 根據(jù)權利要求40所述的方法，其中第三核酸鏈與第一核酸鏈相同。
42. 根據(jù)權利要求40所述的方法，其中第三鏈（i)包含核苷酸和任選地核苷酸類似物， (ii) 包含當?shù)谌怂徭溑c第二轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物雜交時由RNA酶Η識別的至少4個連續(xù)核苷酸， (iii) 第三核酸鏈中核苷酸和任選地核苷酸類似物的總數(shù)是8至100,并且（iv)第三核酸 鏈與第二轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物雜交。
43. 根據(jù)權利要求40所述的方法，其中第三核酸鏈包含PNA核苷酸。
44. 根據(jù)權利要求40-43中任一項所述的方法，其中第三核酸鏈還包含具有功能的功 能性部分，所述功能選自標記功能、純化功能和祀向遞送功能。
45. 根據(jù)權利要求39或44所述的方法，其中所述功能性部分是選自脂質(zhì)、肽和蛋白質(zhì) 的分子。
46. 根據(jù)權利要求45所述的方法，其中功能性部分與核酸鏈的3'末端核苷酸或5'末 端核苷酸連接。
47. 根據(jù)權利要求法45或46所述的方法，其中功能性部分是脂質(zhì)。
48. 根據(jù)權利要求47所述的方法，其中脂質(zhì)選自膽固醇、脂肪酸、脂溶性維生素、糖脂 和甘油酯。
49. 根據(jù)權利要求47所述的方法，其中功能性部分是選自膽固醇、生育酚和生育三烯 酚的脂質(zhì)。
50. 根據(jù)權利要求45或46所述的方法，其中功能分子是選自受體配體和抗體的肽或蛋 白質(zhì)。
51. 減少哺乳動物中基因表達水平的方法，包括向所述哺乳動物施用有效量的藥物組 合物的步驟，所述組合物包含： (a) 雙鏈核酸復合物，所述雙鏈核酸復合物包含與第二核酸鏈復性的第一核酸鏈，其 中： 第一核酸鏈（i)包含核苷酸和任選地核苷酸類似物，并且第一核酸鏈中核苷酸和任選 地核苷酸類似物的總數(shù)是8至100,（ii)包含當?shù)谝缓怂徭溑c所述基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物雜交時 由RNA酶Η識別的至少4個連續(xù)核苷酸，并且（iii)第一核酸鏈與轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物雜交；和 第二核酸鏈包含核苷酸和任選地核苷酸類似物；和 (b) 可藥用載體。
52. 權利要求48所述的方法，其中施用途徑是經(jīng)腸途徑。
53. 權利要求48所述的方法，其中施用途徑是腸胃外途徑。
54. 權利要求51-53中任一項所述的方法，其中劑量是0· 001mg/kg/日至50mg/kg/日 的雙鏈核酸復合物。
55. 權利要求51-54中任一項所述的方法，其中哺乳動物是人。
56. 純化的或分離的雙鏈核酸復合物，包含與第二核酸鏈復性的第一核酸鏈，其中： 第一核酸鏈（i)包含核苷酸和任選地核苷酸類似物，并且第一核酸鏈中核苷酸和核苷 酸類似物的總數(shù)是8至100,（ii)包含當?shù)谝缓怂徭溑c轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物雜交時由RNA酶Η識別的 至少4個連續(xù)核苷酸，（iii)包含至少一個非天然核苷酸，并且（iv)第一核酸鏈與轉(zhuǎn)錄產(chǎn) 物雜交；并且 第二核酸鏈包含核苷酸和任選地核苷酸類似物。
57. 根據(jù)權利要求56所述的純化或分離的雙鏈核酸復合物，其中第二核酸鏈包含 (i) RNA核苷酸和任選地核苷酸類似物，以及任選地DNA核苷酸；或 (ii) DNA核苷酸和/或核苷酸類似物；或 (iii) PNA核苷酸。
58. 用于治療哺乳動物的藥物組合物，包含權利要求56或57所述的雙鏈核酸復合物和 可藥用載體，其中轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是哺乳動物轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
59. 權利要求56或57所述的雙鏈核酸復合物的用途，用于制備減少哺乳動物中基因表 達的藥物。
60. 權利要求56或57所述的雙鏈核酸復合物的用途，用于減少哺乳動物中基因的表 達。
【文檔編號】C12N15/11GK104126010SQ201280062110
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2012年12月17日 優(yōu)先權日:2011年12月16日
【發(fā)明者】橫田隆德, 仁科一隆, 小比賀聰, 水澤英洋 申請人:國立大學法人東京醫(yī)科齒科大學, 國立大學法人大阪大學