組合不同溫度步驟的核酸轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增方法，其中：a)使至少一種存在于生物學(xué)樣品中的靶核酸與以下化合物接觸：擴(kuò)增引物，進(jìn)行擴(kuò)增需要的所有試劑，包括參與擴(kuò)增的酶，以及至少一種用以穩(wěn)定實(shí)施擴(kuò)增所需要酶的多元醇，b)在44℃以上的溫度加熱混合物，c)在44℃以上的溫度實(shí)施靶核酸轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增。本發(fā)明還涉及檢測(cè)通過(guò)擴(kuò)增方法獲得的擴(kuò)增子的方法，對(duì)待測(cè)靶核酸進(jìn)行預(yù)處理的方法，以及體外診斷存在所述靶核酸的方法。本發(fā)明優(yōu)選應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域。
【專利說(shuō)明】組合不同溫度步驟的核酸轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增方法
[0001] 本發(fā)明涉及一種方法，其中通過(guò)轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增方法對(duì)存在于生物學(xué)樣品中的至少一種 靶核酸進(jìn)行擴(kuò)增，所述方法可組合不同溫度的步驟，即本質(zhì)上是變性和擴(kuò)增。
[0002] 現(xiàn)有技術(shù)包括一些研究多元醇對(duì)酶熱穩(wěn)定化作用的科學(xué)論文。尤其是這些例子：
[0003] -Lee 在 1981 年發(fā)表于 J.Biol.Chemistry256(14) :7193-7201，題目為"蔗糖對(duì)蛋 白的穩(wěn)定化"的論文，其描述了蔗糖對(duì)α-糜蛋白酶、糜蛋白酶原和RNA酶的熱穩(wěn)定化作用。
[0004] -Bernier 在 1988 年發(fā)表于 J. Biotechnol. 7 :293-298,題目為"多元醇對(duì) α -葡 萄糖苷酶的穩(wěn)定化"的論文，證明多元醇對(duì)α-葡萄糖苷酶的熱穩(wěn)定化作用。
[0005] -Carninci 在 1998 年發(fā)表于 Proc. Natl Acad. Sci. 95 :520-524,題目為"海藻糖 對(duì)不耐熱酶的熱穩(wěn)定化和熱活化及其用于全長(zhǎng)cDNA的合成的應(yīng)用"的論文，其提出海藻糖 對(duì)逆轉(zhuǎn)錄酶和限制性內(nèi)切酶的熱穩(wěn)定化作用。
[0006] -Spiess 在 2004 年發(fā)表于 Clinical Chemistry50(7) : 1256-1259,題目為"海藻 糖是一種有效的PCR增強(qiáng)劑：二糖海藻糖降低DNA的解鏈溫度和熱穩(wěn)定化taq聚合酶"的 論文，文中證明了海藻糖對(duì)Taq聚合酶的熱穩(wěn)定化作用。
[0007] 因此，很明顯，大約三十年來(lái)，許多研究者對(duì)多元醇對(duì)酶的熱穩(wěn)定化作用感興趣。 此外，十五年前提交的專利申請(qǐng)EP-A-0821058提供了一種用于在高溫下提高酶活性的方 法。相應(yīng)的專利要求保護(hù)多元醇用于熱穩(wěn)定化聚合酶和限制性內(nèi)切酶的用途。
[0008] 雖然科學(xué)家感興趣，但似乎沒(méi)有人嘗試在NASBA、TMA等的轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增中，采取這種 方法。此類方法施行中，都要用到多種不同酶的活性。第一個(gè)步驟包括靶在65°C下進(jìn)行2 分鐘變性，所述靶為核酸，通常為核糖核酸（RNA)。第二個(gè)步驟自身包括添加需要的酶，用于 在41°C下進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增。由于要依次使用兩個(gè)溫度，這兩個(gè)步驟使得該方法對(duì)使用者而言 存在技術(shù)上的局限性。
[0009] 此外，使用單一溫度（41°C )目前造成了各種問(wèn)題，比如，擴(kuò)增富含鳥(niǎo)嘌呤和胞嘧 啶的靶，后者具有難以擴(kuò)增二級(jí)結(jié)構(gòu)。用轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增技術(shù)使這些二級(jí)結(jié)構(gòu)易于擴(kuò)增的最熟知 方法是在擴(kuò)增混合物中使用第五種核苷酸，即三磷酸核糖核苷（K Nakahara et al. Nucleic Acids Res 1 Aprill998,26(7) :.1854-1856)。
[0010] 用核酸序列的擴(kuò)增（NASBA)技術(shù)，易于使用脫氧核糖核酸（DNA)靶。要實(shí)現(xiàn)這些 要做的就是，例如，預(yù)先將根據(jù)EP-B-0397269或?qū)＠暾?qǐng)W0-A-02/070735的方法應(yīng)用于已 處理的樣品，使DNA靶能夠進(jìn)行擴(kuò)增。
[0011] 雖然本領(lǐng)域技術(shù)人員用兩個(gè)具有不同溫度的步驟進(jìn)行這類DNA靶的轉(zhuǎn)錄已經(jīng)幾 十年了。但是他們還沒(méi)考慮到嘗試提高所用酶的熱穩(wěn)定性來(lái)減少此類轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增方法的局限 性。
[0012] 因此本發(fā)明描述了轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增方法的簡(jiǎn)化，由于同時(shí)加入靶核酸和擴(kuò)增試劑如緩沖 液、酶或核苷酸，并存在熱穩(wěn)定化化學(xué)添加劑，該方法可在單一的步驟中實(shí)施，所述熱穩(wěn)定 化化學(xué)添加劑使得使用更高擴(kuò)增溫度（達(dá)到所述靶核酸變性步驟所使用的溫度）成為可 能。這個(gè)效果是特別令人意想不到的且因此是令人驚訝的。
[0013] 創(chuàng)新之處在于通過(guò)使用化學(xué)添加劑，例如多元醇，使T7RNA聚合酶，RNA酶Η和 AMV-RT的活性能夠在高于41°C的溫度能夠得到保護(hù)，從而使所有的酶活性，特別是在 NASBA擴(kuò)增法中3種酶活性同時(shí)熱穩(wěn)定化，進(jìn)而使變性和擴(kuò)增的實(shí)驗(yàn)步驟能夠結(jié)合起來(lái)。
[0014] 本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增方法，其中：
[0015] a)將生物學(xué)樣品中存在的至少一種靶核酸與以下化合物相接觸：
[0016] ?擴(kuò)增引物，
[0017] ?實(shí)施擴(kuò)增所需要的所有試劑，包括參與擴(kuò)增的酶，以及
[0018] ?至少一種能穩(wěn)定擴(kuò)增所需要的酶的多元醇，
[0019] b)將混合物在41 °C以上的溫度加熱，
[0020] c)在41 °C以上的溫度實(shí)施靶核酸的轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增。
[0021] 根據(jù)所述擴(kuò)增方法的一個(gè)實(shí)施方式，擴(kuò)增在41至49°C之間的溫度進(jìn)行。
[0022] 根據(jù)所述擴(kuò)增方法的另一個(gè)實(shí)施方式，擴(kuò)增在大于或等于46°C的溫度進(jìn)行。
[0023] 所述擴(kuò)增方法的任何實(shí)施方式中，所述酶提供的酶活性為：
[0024] · RNA 聚合酶活性（T7、SP6 等），
[0025] ?逆轉(zhuǎn)錄酶活性（AMV-RT、MMLV-RT 等），
[0026] · RNA 酶 Η 活性
[0027] RNA酶Η活性可以由一個(gè)獨(dú)立的酶（"單獨(dú)的"活性）或有其它酶活性的酶（"組 合的"活性）提供。這種與RNA酶Η結(jié)合的其它活性可以由逆轉(zhuǎn)錄酶或RNA聚合酶或不同 的酶提供。
[0028] 酶的活性使實(shí)施等溫?cái)U(kuò)增成為可能，如：
[0029] -NASBA (基于核酸序列的擴(kuò)增），
[0030] -ΤΜΑ (轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增），
[0031] -3SR(自我持續(xù)序列復(fù)制），
[0032] -SMART (信號(hào)介導(dǎo)的RNA擴(kuò)增技術(shù)），
[0033] -MDA (多重置換擴(kuò)增），以及
[0034] -任何涉及上述三種活性中至少一種且用于全基因組擴(kuò)增或特定DNA或RNA序列 的擴(kuò)增的其它等溫?cái)U(kuò)增。
[0035] 所述擴(kuò)增方法的任何實(shí)施方式中，多元醇是由下列一種化合物或這些化合物的組 合構(gòu)成：
[0036] ?乳糖，
[0037] ?山梨醇，
[0038] ?蔗糖，
[0039] ·甘露醇，以及
[0040] ?海藻糖。
[0041] 所述擴(kuò)增方法的任何實(shí)施方式中，多元醇的濃度在0. 4至1. 5M之間。
[0042] 本發(fā)明還涉及一種通過(guò)如上所述的擴(kuò)增方法獲得的擴(kuò)增子的檢測(cè)方法，其特征在 于在步驟a)的過(guò)程中針對(duì)且可能存在于生物學(xué)樣品中的每種待測(cè)靶核酸的添加至少一種 檢測(cè)探針，并實(shí)施以下附加步驟：
[0043] d)通過(guò)探針與溶液中每個(gè)擴(kuò)增子的雜交檢測(cè)步驟c)中所實(shí)施的擴(kuò)增得到的擴(kuò)增 子的存在。
[0044] 本發(fā)明還涉及一種對(duì)可能存在于生物學(xué)樣品中的待測(cè)靶核酸進(jìn)行預(yù)處理的方法， 所述靶核酸用于根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的方法進(jìn)行擴(kuò)增，所述方法包括在步驟a) 前實(shí)施下列附加步驟，其中對(duì)于RNA，將所述生物學(xué)樣品置于低于或等于65°C的溫度，而對(duì) 于DNA將所述生物學(xué)樣品置于低于或等于95°C的溫度。
[0045] 本發(fā)明還涉及一種對(duì)可能存在于生物學(xué)樣品中的待測(cè)靶核酸進(jìn)行預(yù)處理的方法， 所述靶核酸用于根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的方法進(jìn)行擴(kuò)增，所述方法包括在步驟a) 前實(shí)施下列附加步驟，其中將所述生物學(xué)樣品置于為低于或等于49°C的溫度。
[0046] 本發(fā)明還涉及一種體外診斷一種或多種可能存在于生物學(xué)樣品中的待測(cè)靶核酸 的方法，包括：
[0047] a)實(shí)施預(yù)處理的方法，如上所述，
[0048] b)實(shí)施擴(kuò)增的方法，如上所述，
[0049] c)實(shí)施檢測(cè)的方法，如上所述。
[0050] 根據(jù)診斷方法的一個(gè)實(shí)施方式，整個(gè)方法是在一個(gè)單一容器內(nèi)實(shí)施的。
[0051] 根據(jù)上述方法的一個(gè)實(shí)施例變型，整個(gè)方法是在41 °C以上的單一溫度實(shí)施的。
[0052] 根據(jù)上述方法的一個(gè)實(shí)施例變型，整個(gè)方法是在46°C至49°C間的單一溫度實(shí)施 的。
[0053] 這里的附圖是作為解釋性例子給出，并且沒(méi)有限制性。它們將使更清楚地理解本 發(fā)明成為可能。
[0054] 圖1表示在7. 5cps/反應(yīng)HIV-1B轉(zhuǎn)錄本（每個(gè)篩選進(jìn)行七個(gè)重復(fù)）存在下，46°C 下進(jìn)行NASBA擴(kuò)增的過(guò)程中熱穩(wěn)定化化合物（thermostabilizing compound)的功能性篩 選。其中：
[0055] -圖1A濃度為0. 21M的乳糖，
[0056] -圖1B濃度為0. 9M的麥芽糖，
[0057] -圖1C濃度為0. 05M的棉子糖，
[0058] -圖1D濃度為1. 2M的山梨醇，
[0059] -圖1E濃度為0. 6M的蔗糖，和
[0060] -圖1F濃度為1. 09M的松二糖。
[0061] 圖2描述了在不同溫度和不同熱穩(wěn)定化化合物存在的情況下，3分鐘預(yù)溫育后， T7RNA聚合酶的殘余活性（％ )。
[0062] 圖3A描述了在不同溫度和存在或不存在0. 4M海藻糖的情況下，15分鐘預(yù)溫育后， T7RNA聚合酶的殘余活性（％ )。
[0063] 圖3B描述了在不同溫度和存在或不存在0. 4M海藻糖的情況下，25分鐘預(yù)溫育后， RNA酶Η的殘余活性（％ )。
[0064] 圖3C描述了在不同溫度和存在或不存在0. 4Μ海藻糖的情況下，25分鐘預(yù)溫育后， AMV-RT的殘余活性（％ )。
[0065] 圖4為靈敏度（％ )的測(cè)量，是在NASBA擴(kuò)增HIV-1B型的過(guò)程中存在不同熱穩(wěn)定 化化合物的情況下獲得的，所述擴(kuò)增為5cps/測(cè)試，沒(méi)有靶變性階段（Ν = 24)。應(yīng)該注意， 在46°C下，沒(méi)有受益于熱穩(wěn)定化添加劑的參比不再能得到擴(kuò)增。
[0066] 雖然糖和，更普遍地，多元醇用于使酶熱穩(wěn)定是一條可以在文獻(xiàn)中找到信息，但是 在轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增（例如NASBA)中使用高濃度糖和多元醇，以在高于41°C，特別是在高于44°C并 優(yōu)選地高于46°C，且可能在高達(dá)49°C預(yù)溫育的情況下進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增是一項(xiàng)技術(shù)進(jìn)步，使為 終端用戶從技術(shù)上簡(jiǎn)化此類擴(kuò)增成為可能。
[0067] 雖然工作溫度是在41至45°C之間，但是為了幫助結(jié)構(gòu)化的靶變性，將NASBA擴(kuò)增 溫度增加到46°C尤為必要，這樣可以提高檢測(cè)的水平。
[0068] 下面的實(shí)施例使用了 NASBA(基于核酸序列的擴(kuò)增）轉(zhuǎn)錄和等溫?cái)U(kuò)增的方法。然 而，本發(fā)明中所描述的方法也適用于其他的等溫?cái)U(kuò)增方法，如TMA(轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增）或 3SR(自我持續(xù)序列復(fù)制）例如（Gill and Ghaemi，2008，Nucleosides，Nucleotides and Nucleic Acids,27 :224-245 ;Leone et all998,NAR,26-9:2150-2155)。
[0069] NASBA技術(shù)是一種替代PCR的技術(shù)，不同于后者的是，它可以通過(guò)RNA擴(kuò)增遺傳性 檢測(cè)活的微生物（細(xì)菌，病毒等）。這種擴(kuò)增技術(shù)需要3種酶的活性來(lái)進(jìn)行，包括T7RNA聚 合酶，RNA酶Η和AMV-RT。這三種酶的活性中，T7RNA聚合酶是最熱敏感的酶。
[0070] 實(shí)施例1 :選擇與NASBA轉(zhuǎn)錄和等溫?cái)U(kuò)增法兼容的熱穩(wěn)定化化合物
[0071] 根據(jù)供應(yīng)商推薦，在 Nuclisens EasyQ? 擴(kuò)增平臺(tái)（bioM6rieux，Marcy Γ Etoile，F(xiàn)rance)上進(jìn)行的NASBA HIV-12. 0擴(kuò)增測(cè)試中，對(duì)一組具有熱穩(wěn)定化性能或 視為有此類性能的化合物進(jìn)行評(píng)估。在要評(píng)估化合物的存在或不存的情況下，將5cps到 30cps的HIV-1B型轉(zhuǎn)錄本在各反應(yīng)中用作靶，。
[0072] 在所述化合物存在的情況下于46°C進(jìn)行擴(kuò)增能夠證明該化合物對(duì)于NASBA反應(yīng) 是兼容的且有熱穩(wěn)定化作用的。
[0073] 如圖1A，1B，1C，1D，1E和1F例子所示，在46°C，存在或不存在NASBA擴(kuò)增，使選擇 熱穩(wěn)定化化合物，如蔗糖、山梨醇和乳糖（在大多數(shù)情況下擴(kuò)增都有相符合的信號(hào)（七個(gè)重 復(fù)至少有四個(gè)陽(yáng)性信號(hào)）），能很容易地進(jìn)行。由此分離的添加劑在下面會(huì)更清晰地研究。
[0074] 實(shí)施例2 :通過(guò)紫外分光光度法監(jiān)測(cè)T7RNA聚合酶熱變性來(lái)選擇熱穩(wěn)定化化合物
[0075] 本實(shí)施例中證明，與無(wú)添加劑的對(duì)照相比，T7RNA聚合酶的變性溫度（T7Tm)在一定 化學(xué)添加劑的存在下，顯著增加。T7RNA聚合酶被選為酶的模型，因?yàn)樗鼘?duì)熱變性最為敏感， 無(wú)添加劑條件下T7T m是48. 5°C。
[0076] 紫外分光光度法技術(shù)被用于測(cè)量Tm T7值。測(cè)定在λ = 280nm的蛋白質(zhì)的吸光度 變化作為溫度的函數(shù)。當(dāng)酶被加熱時(shí)，溶液變得混濁，聚集物形態(tài)相當(dāng)于變性形態(tài)。Tm對(duì)應(yīng) 具有50%的天然形態(tài)和50%的變性形態(tài)時(shí)的溫度（吸光度曲線的一階導(dǎo)數(shù)=F(溫度））。
[0077] 在聚丙烯瓶中，將 4ml300mM PBS 磷酸鹽緩沖液（Aldrich P-4417，St Quentin Fallavier，F(xiàn)rance)與 12μ 117mg/ml 的 T7RNA 聚合酶（bioM6rieux，Marcy，F(xiàn)rance)混 合，即蛋白終濃度為〇. 〇5mg/ml。500μ 10. 05mg/ml的T7RNA聚合酶和500μ 1濃縮的添 加劑溶液（Aldrich，St Quentin Fallavier，F(xiàn)rance)或作為對(duì)照的 300mM PBS，加入 到石英比色皿中進(jìn)行紫外分光光度法測(cè)定?；靹蚝?，測(cè)定在λ = 280nm下吸光度的變 化，產(chǎn)生在30至65°C之間，1°C /min的溫度函數(shù)，，以如先前所述地確定T7Tm((Cary UV spectrophotometer, Varian,Les Ulis, France)〇
[0078] 根據(jù)上述方法得到的一些有代表性的結(jié)果示于下表1中（Λ Tm的值作為該類型添 加劑的函數(shù)）。
[0079] 表1 :作為該類型添加劑函數(shù)的Λ Tm測(cè)量總結(jié)表
[0080]
【權(quán)利要求】
1. 轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增方法，其中： a) 將至少一種存在于生物學(xué)樣品中的靶核酸與以下化合物接觸： ?擴(kuò)增引物， ?實(shí)施擴(kuò)增需要的所有試劑，包括參與擴(kuò)增的酶，以及 ?至少一種能穩(wěn)定實(shí)施擴(kuò)增所需要的酶的多元醇， b) 在存在所有上述化合物的條件下，在44°C以上的溫度加熱混合物，使靶變性， c) 在44°C以上的溫度實(shí)施靶核酸轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的擴(kuò)增方法，其中實(shí)施變性和擴(kuò)增的溫度在44°C至49°C之間。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的擴(kuò)增方法，其中實(shí)施變性和擴(kuò)增的溫度大于或等于46°C。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的擴(kuò)增方法，其中所述酶所提供的酶活性是： i. RNA聚合酶活性（T7、SP6等）， ii. 逆轉(zhuǎn)錄酶活性（AMV-RT、MMLV-RT等），和 iii. RNA酶Η活性。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的擴(kuò)增方法，其中的多元醇由以下一種化合物或這 些化合物的組合組成： i. 乳糖， ii. 山梨醇， iii. 鹿糖， iv. 甘露醇，和 v. 海藻糖。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的擴(kuò)增方法，其中多元醇的濃度為0. 4至1. 5M。
7. 用于檢測(cè)通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求1至5任一所述擴(kuò)增方法獲得的擴(kuò)增子的方法，其包括 在步驟a)中針對(duì)可能存在于生物學(xué)樣品中的每種待測(cè)靶核酸添加至少一種檢測(cè)探針，以 及實(shí)施以下附加步驟： d) 通過(guò)探針與溶液中每個(gè)擴(kuò)增子的雜交檢測(cè)步驟c)中所實(shí)施的擴(kuò)增得到的擴(kuò)增子的 存在。
8. 對(duì)可能存在于生物學(xué)樣品中的待測(cè)靶核酸進(jìn)行預(yù)處理的方法，所述靶核酸用于根據(jù) 權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的方法進(jìn)行擴(kuò)增，所述方法包括在步驟a)前實(shí)施以下附加步 驟，其中對(duì)于RNA，將所述生物學(xué)樣品置于低于或等于65°C的溫度，而對(duì)于DNA，將所述生物 學(xué)樣品置于低于或等于95°C的溫度。
9. 對(duì)可能存在于生物學(xué)樣品中的待測(cè)靶核酸進(jìn)行預(yù)處理的方法，所述靶核酸用于根據(jù) 權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的方法進(jìn)行擴(kuò)增，所述方法包括在步驟a)前實(shí)施以下附加步 驟，其中將所述生物學(xué)樣品置于低于或等于49°C的溫度。
10. 體外診斷一種或多種可能存在于生物學(xué)樣品中的待測(cè)靶核酸的方法，包括： a) 實(shí)施預(yù)處理或變性的方法，并實(shí)施根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)所述的擴(kuò)增方法， b) 實(shí)施根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)方法。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所有所述方法均在單一容器內(nèi)實(shí)施。
12. 根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的方法，其特征在于，所有所述方法均在44°C以上的單 一溫度實(shí)施。
13.根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的方法，其特征在于，所有所述方法均在介于46°C至 49 °C之間的單一溫度實(shí)施。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104105796SQ201280062012
【公開(kāi)日】2014年10月15日 申請(qǐng)日期:2012年12月14日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月16日
【發(fā)明者】A·拉尤, A·洛朗, L·梅斯塔 申請(qǐng)人:生物梅里埃公司