具有受限制的免疫球蛋白重鏈的小鼠的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了具有受限制的免疫球蛋白重鏈基因座的小鼠，其中所述基因座的特征為具有單一多態(tài)性人源VH基因區(qū)段、多個(gè)人源DH基因區(qū)段和多個(gè)JH基因區(qū)段。本發(fā)明提供了制備與抗原(例如病毒抗原)結(jié)合的抗體序列的方法，包括使用所關(guān)注的抗原免疫小鼠，其中所述小鼠在內(nèi)源性免疫球蛋白重鏈基因座包含單一人源VH基因區(qū)段、多個(gè)人源DH基因區(qū)段和多個(gè)JH基因區(qū)段。
【專(zhuān)利說(shuō)明】具有受限制的免疫球蛋白重鏈的小鼠
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]基因修飾免疫球蛋白重鏈可變(V)區(qū)基因座(或在轉(zhuǎn)基因中)以從受限數(shù)量的免疫球蛋白重鏈可變(Vh)區(qū)段(或單一 Vh區(qū)段)和/或其變體中制備抗體的非人動(dòng)物。具有來(lái)源于單一免疫球蛋白重鏈可變基因區(qū)段例如人源免疫球蛋白Vh1_69基因區(qū)段或人源Vh1_2基因區(qū)段的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的非人動(dòng)物。在非人動(dòng)物中制備用于與病原體包括人病原體結(jié)合的抗體序列的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]非人動(dòng)物例如小鼠己經(jīng)被基因修飾為制備抗體序列方法中的有用工具，其中抗體序列用于抗體依賴的人體治療。具有人源化可變區(qū)基因座(例如VinD1^P Jh基因以及'和叉基因)的小鼠可以用于生成在抗體治療中使用的同源重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域?？梢垣@得其他小鼠用于生成具有同源重鏈和輕鏈的全人源抗體。
[0003]人體抗體治療是基于針對(duì)某些預(yù)定抗原的所需特性設(shè)計(jì)的。使用預(yù)定抗原免疫人源化小鼠，并且使用經(jīng)免疫的小鼠生成抗體群以便從中鑒定具有所需結(jié)合特性的高親和性同源重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。一些人源化小鼠，例如僅在內(nèi)源性小鼠基因座的可變區(qū)人源化的小鼠，產(chǎn)生在特征和數(shù)量上與野生型小鼠B細(xì)胞群類(lèi)似的B細(xì)胞群。結(jié)果，在這些用于篩選抗體的小鼠中獲得了極為大量和多樣性的B細(xì)胞群。這些B細(xì)胞群反映出大量不同免疫球蛋白的重排，并可以從中鑒定具有最為需要特性的重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。 [0004]但并不是所有抗原激發(fā)的免疫應(yīng)答均顯示出來(lái)自各種可變(V)區(qū)段的非常大量的重排。也就是說(shuō)，人體對(duì)某些抗原的體液免疫應(yīng)答明顯受到了限制。這種限制反映為對(duì)B細(xì)胞的克隆選擇，即選擇那些僅表達(dá)某些對(duì)特定抗體具有非常高的親和性和特異性結(jié)合的V區(qū)段的B細(xì)胞。這種抗原中的一些具有臨床意義，即大量公知的人類(lèi)病原體。有一種假設(shè)，在人免疫應(yīng)答中表達(dá)的V區(qū)段是這樣一種V區(qū)段，當(dāng)其與人源D和人源J區(qū)段結(jié)合，較之在針對(duì)該抗原的人源抗體應(yīng)答中未觀察到的隨機(jī)選擇的V區(qū)段，更有可能生成有用的高親和性抗體。
[0005]根據(jù)一種假說(shuō)，幾千年以來(lái)的自然選擇己經(jīng)選擇出了最有效的基礎(chǔ)，根據(jù)其可以設(shè)計(jì)出用于中和人類(lèi)病原體最有效的武器——克隆選定的V區(qū)段。本領(lǐng)域中需要更多和更優(yōu)越的用于結(jié)合和/或中和抗原(如上文所述的病原體)的抗體。需要更加迅速地由所選定的V區(qū)段生成有用的序列，選定的V區(qū)段包括多態(tài)性和/或體細(xì)胞突變選定的V區(qū)段，以及更加迅速地生成有用的B細(xì)胞群，其具有帶多種D和J區(qū)段的V區(qū)段的重排，包括該重排的體細(xì)胞突變版本，并且特別是具有獨(dú)特的和有用的CDR3的重排。需要一種生物系統(tǒng)例如非人動(dòng)物(例如小鼠、大鼠、家兔等)，其能夠從預(yù)定的V區(qū)段生成與例如現(xiàn)有經(jīng)修飾的動(dòng)物所能達(dá)到的相比更大數(shù)量和種類(lèi)的具有治療用途的抗體可變區(qū)序列。需要一種改造過(guò)的生物系統(tǒng)，其針對(duì)來(lái)源于受限制的、預(yù)定V區(qū)段的克隆選擇抗體的可變序列具有定型的體液免疫系統(tǒng)，所述預(yù)定的V區(qū)段包括但不限于同源的人源重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述系統(tǒng)可用于生產(chǎn)針對(duì)所選抗原(包括某些人類(lèi)病原體)的人源抗體依賴的治療劑。[0006]在本領(lǐng)域中需要一種能夠中和病毒抗原例如HIV和HCV的治療性抗體，包括抗原特異性抗體，其含有來(lái)源于單一人源可變區(qū)段的重鏈，以及由所選定的治療性抗體序列生產(chǎn)多樣性來(lái)源抗體的系統(tǒng)。還需要用于制備有用抗體的進(jìn)一步的方法和非人動(dòng)物，所述抗體包括來(lái)源于單一人源Vh區(qū)段并且具有多樣性CDR序列集合的重鏈庫(kù)，并且包括表達(dá)同源的人源輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的這種重鏈。還需要用于選擇基于免疫球蛋白的結(jié)合蛋白的CDR的方法，該結(jié)合蛋白提供更多的供選擇的結(jié)合蛋白的多樣性，以及更多的免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的多樣性，其包括用于生成體細(xì)胞突變并克隆選擇的免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的組合物和方法，這些免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域可以在例如制備人用治療劑中使用。
[0007]發(fā)明概沭
[0008]本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N基因修飾的免疫球蛋白基因座，所述基因座包含具有有限數(shù)量的不同重鏈可變 區(qū)基因區(qū)段(即V基因、Vh基因、Vh基因區(qū)段或V基因區(qū)段)，例如不超過(guò)一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)不同的V基因；或者不超過(guò)一個(gè)V基因區(qū)段家族成員以例如單一拷貝或多個(gè)拷貝中和/或包含一種或多種多態(tài)性存在。
[0009]本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N基因座，所述基因座能夠重排并且形成編碼重鏈可變結(jié)構(gòu)域的基因，所述基因來(lái)源于受限制的(例如是單一 Vh基因區(qū)段或選自多個(gè)單一 Vh基因區(qū)段的多態(tài)性變體)Vh基因庫(kù)。本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N經(jīng)修飾的免疫球蛋白基因座，其包括了包含人源免疫球蛋白序列的基因座，例如可操作地與人源或者(或人源/非人源嵌合)非人源免疫球蛋白恒定序列(并且與例如D和/或J區(qū)段可操作地連接)連接的人源V區(qū)段。本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N經(jīng)修飾的基因座，所述基因座包括單一 Vh基因區(qū)段的多個(gè)拷貝，其中一個(gè)或多個(gè)拷貝可以包含多態(tài)性的變體。提供了一種經(jīng)修飾的基因座，所述基因座包括單一 Vh區(qū)段的多個(gè)拷貝，其可操作地與一個(gè)或多個(gè)D區(qū)段以及一個(gè)或多個(gè)J區(qū)段連接，其可操作地與非人源免疫球蛋白恒定序列例如小鼠或大鼠序列連接。本申請(qǐng)還提供了一種包含這種人源化基因座的非人動(dòng)物。
[0010]本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N非人動(dòng)物，所述動(dòng)物具有降低的免疫球蛋白重鏈可變基因區(qū)段復(fù)雜性(即具有有限數(shù)量的重鏈可變基因區(qū)段，或具有受限制的重鏈可變基因庫(kù))，其中所述降低的免疫球蛋白重鏈可變基因區(qū)段復(fù)雜性表征為存在不超過(guò)一個(gè)或者不超過(guò)兩個(gè)重鏈可變基因區(qū)段，并且其中所存在的重鏈可變基因可操作地與人源或非人源恒定區(qū)序列連接。
[0011]本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N非人動(dòng)物，所述動(dòng)物具有降低的免疫球蛋白重鏈可變基因區(qū)段復(fù)雜性(例如單一 Vh基因區(qū)段，或者具有作為單一 Vh基因區(qū)段多態(tài)性變體的有限數(shù)量的Vh基因區(qū)段)，其中所述降低的免疫球蛋白重鏈可變基因區(qū)段復(fù)雜性表征為存在單一 Vh基因區(qū)段或者多個(gè)作為單一 Vh基因區(qū)段多態(tài)性形式的Vh基因區(qū)段(例如在人體內(nèi)與高拷貝數(shù)和/或多態(tài)性相關(guān)的Vh基因區(qū)段)，并且其中所存在的重鏈可變基因可操作地與人源或非人源恒定區(qū)序列連接。在多種實(shí)施方式中，所述存在的重鏈可變基因可操作地與非人動(dòng)物種系中的一個(gè)或多個(gè)D和/或一個(gè)或多個(gè)J基因區(qū)段連接。
[0012]本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N非人動(dòng)物，所述動(dòng)物包含免疫球蛋白重鏈可變基因座(例如在內(nèi)源性非人動(dòng)物重鏈可變基因座的轉(zhuǎn)基因上或作為其插入或取代)，其中免疫球蛋白重鏈可變基因座包括可操作地與D和/或J基因區(qū)段連接的單一 Vh區(qū)段。在多種實(shí)施方式中，在所述非人動(dòng)物的內(nèi)源性免疫球蛋白重鏈可變基因基因座上，所述單一 ％基因區(qū)段可操作地與一個(gè)或多個(gè)D和/或一個(gè)或多個(gè)J基因區(qū)段連接。
[0013]本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N非人動(dòng)物，所述動(dòng)物在其免疫球蛋白重鏈可變區(qū)基因座被修飾以缺失全部或基本上全部(例如全部功能性區(qū)段，或幾乎全部功能性區(qū)段)內(nèi)源性免疫球蛋白Vh區(qū)段并且在所述非人動(dòng)物的內(nèi)源性免疫球蛋白重鏈可變區(qū)基因座上包含可操作地與D和J區(qū)段或者J區(qū)段連接的人源Vh1-69區(qū)段(或者人源Vh1-2區(qū)段)。
[0014]本申請(qǐng)還提供了一種非人動(dòng)物，所述動(dòng)物在其免疫球蛋白重鏈可變區(qū)基因座被修飾以使其內(nèi)源性可變區(qū)基因組不能重排形成包含內(nèi)源性可變區(qū)基因區(qū)段的功能性重鏈；其中在所述非人動(dòng)物的內(nèi)源性免疫球蛋白重鏈可變區(qū)基因座包含可操作地與D和J區(qū)段或者J區(qū)段連接的單一人源可變基因區(qū)段(人源Vh1-2或人源Vh1-69基因區(qū)段)。
[0015]本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N非人動(dòng)物，所述動(dòng)物包含與人源或非人源恒定區(qū)序列可操作地連接的具有有限數(shù)量的(例如不超過(guò)一個(gè)或不超過(guò)兩個(gè))重鏈基因區(qū)段。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述與恒定區(qū)序列連接的不超過(guò)一個(gè)或不超過(guò)兩個(gè)重鏈基因區(qū)段在轉(zhuǎn)基因上，例如在不同于內(nèi)源性重鏈基因座的位置上。
[0016]本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N在非人動(dòng)物中制備人源免疫球蛋白序列的方法。在多種實(shí)施方式中，所述人源免疫球蛋白序列來(lái)源于免疫球蛋白V序列庫(kù)，其基本上由單一人源V區(qū)段例如νΗ1-69或νΗ1-2以及一個(gè)或多個(gè)D和J區(qū)段或者一個(gè)或多個(gè)J區(qū)段組成。本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N在非人動(dòng)物、組織和細(xì)胞中制備人源免疫球蛋白序列的方法，其中所述人源免疫球蛋白序列與病原體結(jié)合。
[0017]本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N制備特征為具有受限制的免疫球蛋白重鏈基因座的小鼠的方法，其中所述限制針對(duì)免疫球蛋白Vh基因區(qū)段的數(shù)量。在多種方面，所述限制是指一個(gè)或不超過(guò)兩個(gè)，或者單一 Vh基因家族成員(例如一個(gè)或多個(gè)Vh等位基因、其變體或其多態(tài)性變體)。在多種方面，所述重鏈基因座進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)Dh基因區(qū)段和一個(gè)或多個(gè)Jh基因區(qū)段。在多種方面，所述VinD1^P Jh基因區(qū)段是人源的。在多種方面，所述VinD1^P Jh基因區(qū)段可操作地與非人源恒定區(qū)(例如IgM和/或IgG)連接。在多種方面，所述恒定區(qū)是小鼠或大鼠恒定區(qū)。
[0018]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N制備具有受限制的免疫球蛋白重鏈基因座的小鼠的方法，包括將如本申請(qǐng)所述的核酸構(gòu)建體引入小鼠胚胎干(ES)細(xì)胞，并且分離或鑒定包含所述核酸構(gòu)建體的小鼠ES細(xì)胞。
[0019]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述核酸構(gòu)建體包含單一人源Vh基因區(qū)段、一個(gè)或多個(gè)人源Dh基因區(qū)段以及一個(gè)或多個(gè)人源Jh基因區(qū)段。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述核酸構(gòu)建體包含一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)(例如1xP或Frt位點(diǎn))。
[0020]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N使用如本申請(qǐng)所述的靶向載體、核酸序列或細(xì)胞制備的小鼠。在不同實(shí)施方式中，所述靶向載體、核酸序列或細(xì)胞包含含有與非人源恒定基因可操作地連接的單一人源Vh基因區(qū)段(或其多態(tài)性變體)、一個(gè)或多個(gè)人源Dh基因區(qū)段以及一個(gè)或多個(gè)人源Jh基因區(qū)段的DNA序列。
[0021]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N制備包含受限制的免疫球蛋白重鏈基因座的小鼠的方法，包括使用人基因組序列取代小鼠免疫球蛋白重鏈基因座，所述人基因組序列包含單一人源Vh基因區(qū)段(或其多態(tài)性變體)、一個(gè)或多個(gè)人源Dh基因區(qū)段以及一個(gè)或多個(gè)人源JH基因區(qū)段，其中所述人源Vh、Dh和Jh基因區(qū)段能夠重排形成含有可操作地與非人源恒定區(qū)連接的人源可變結(jié)構(gòu)域的嵌合重鏈。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述非人源恒定區(qū)是小鼠或大鼠恒定區(qū)。
[0022]在多種方面，所述非人動(dòng)物是嚙齒動(dòng)物。在不同的方面，所述嚙齒動(dòng)物是小鼠和/或大鼠。
[0023]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N經(jīng)修飾的免疫球蛋白重鏈基因座，所述基因座包含重鏈V區(qū)段庫(kù)，該庫(kù)針對(duì)V區(qū)段的一致性是受限制的，并且所述基因座包含一個(gè)或多個(gè)D區(qū)段和一個(gè)或多個(gè)J區(qū)段，或者一個(gè)或多個(gè)J區(qū)段。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述重鏈V區(qū)段是人源區(qū)段。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述一個(gè)或多個(gè)D區(qū)段是人源D區(qū)段。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述一個(gè)或多個(gè)J區(qū)段是人源J區(qū)段。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述一個(gè)或多個(gè)D區(qū)段和一個(gè)或多個(gè)J區(qū)段是人源D和人源J區(qū)段。
[0024]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述經(jīng)修飾的基因座是非人源基因座。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述非人源基因座具有至少一個(gè)人源免疫球蛋白序列被修飾的。
[0025]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述限制是針對(duì)一種V區(qū)段家族成員的。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述一種V區(qū)段家族成員存在于兩個(gè)或多個(gè)拷貝中。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述一種V區(qū)段家族成員以兩種或多種變體形式存在(例如V區(qū)段家族成員的兩種或多種多態(tài)性形式)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述一種V區(qū)段是一個(gè)人源V區(qū)段家族成員。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述一種V區(qū)段家族成員存在于在針對(duì)該變體的人群中所觀察到的多種變體中。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述V區(qū)段家族成員選自表1。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述V區(qū)段家族成員存在于所示的多種變體中，對(duì)于各V區(qū)段而言，其存在于在由I個(gè)等位基因至表1的右欄所顯示的等位基因數(shù)量的多個(gè)等位基 因中。
[0026]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述限制是針對(duì)人源VH1_69基因區(qū)段的。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述人源Vh1-69基因區(qū)段存在于兩個(gè)或多個(gè)拷貝中。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述人源Vh1-69基因區(qū)段以兩種或多種變體形式存在(例如人源Vh1-69基因的兩種或多種多態(tài)性形式)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述人源Vh1-69基因區(qū)段存在于在具有人源Vh1-69基因區(qū)段的人群中所觀察到的多種變體中。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述人源VHl-69基因區(qū)段選自表2。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述人源VHl-69基因區(qū)段存在于所示的多種變體中，對(duì)于各￥111-69基因區(qū)段而言，在由一個(gè)等位基因至表2所示等位基因數(shù)量的多個(gè)等位基因中。
[0027]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述限制針對(duì)人源Vh1_2基因區(qū)段。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述人源Vh1-2基因區(qū)段存在于兩個(gè)或多個(gè)拷貝中。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述人源Vh1-2基因區(qū)段以兩種或多種變體形式存在(例如人源Vh1-2基因的兩種或多種多態(tài)性形式)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述人源VH1_2基因區(qū)段存在于在具有人源VHl-2基因區(qū)段的人群中所觀察到的多種變體中。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述人源VHl-2基因區(qū)段選自表3。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述人源％1-2基因區(qū)段存在于所示的多種變體中，對(duì)于各VHl-2基因區(qū)段而言，在由一個(gè)等位基因至表2所示等位基因數(shù)量的多個(gè)等位基因中。
[0028]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N重鏈免疫球蛋白基因座，其包含單一功能性人源V區(qū)段。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述單一功能性人源V區(qū)段選自Vh1-2、Vh1-3、Vh1-8、νΗ1-18、Vh1-24、Vh1-45、Vh1-46、Vh1-58、Vh1-69、Vh2-5、Vh2-26、Vh2-70、Vh3-7、Vh3-9、Vh3-11、Vh3-13、Vh3-15、VH3-16、Vh3-20、VH3_21、VH3_23、VH3_30、VH3_30_3、VH3_30_5、VH3_33、VH3_35、VH3_38、Vh3-43、Vh3-48、Vh3_49、Vh3_53、Vh3_64、Vh3_66、Vh3_72、Vh3_73、Vh3_74、Vh4_4、Vh4_28、Vh4-30-1、Vh4-30-2、VH4_30_4、VH4_31、VH4_34、VH4_39、VH4_59、VH4_61、VH5_51、VH6_ 1、VH7_4_ I和Vh7-81區(qū)段。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述單一功能性人源V區(qū)段是Vh1-69區(qū)段；在一個(gè)特定實(shí)施方式中，在人群中發(fā)現(xiàn)的所述單一功能性人源V區(qū)段存在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、
11、12或13中多態(tài)性形式。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述單一功能性人源V區(qū)段是Vh1-2區(qū)段；在一個(gè)特定實(shí)施方式中，在人群中發(fā)現(xiàn)的所述單一功能性人源V區(qū)段存在1、2、3、4或5種多態(tài)性形式。
[0029]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述重鏈免疫球蛋白基因座是非人動(dòng)物的一個(gè)經(jīng)修飾的基因座。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述經(jīng)修飾的非人源免疫球蛋白重鏈基因座在非人動(dòng)物中存在于野生型非人動(dòng)物基因組中相應(yīng)的未經(jīng)修飾的非人源基因座的位置。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述經(jīng)修飾的非人源免疫球蛋白重鏈基因座存在于非人動(dòng)物的轉(zhuǎn)基因上。
[0030]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述單一功能性人源V基因區(qū)段是Vh1_69基因區(qū)段。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述VHl-69基因區(qū)段包含SEQ ID NO:340在一個(gè)實(shí)施方式中，所述VH1_69基因區(qū)段來(lái)源于SEQ ID NO:34。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述VH1_69基因區(qū)段與SEQ ID NO:34具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%的一致性。
[0031]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述單一功能性人源V基因區(qū)段由SEQ ID NO:34所述的核苷酸序列編碼。
[0032]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述單一功能性人源V基因區(qū)段是VH1_2基因區(qū)段。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述VHl-2基因區(qū)段包含SEQ ID NO:60o在一個(gè)實(shí)施方式中，所述VH1_2基因區(qū)段來(lái)源于SEQ ID NO:60o在一個(gè)實(shí)施方式中，所述VH1_2基因區(qū)段與SEQ ID NO:60具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%的一致性。
[0033]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述單一功能性人源V基因區(qū)段由SEQ ID NO:60所述的核苷酸序列編碼。
[0034] 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述單一功能性人源V區(qū)段可操作地與一個(gè)或多個(gè)D區(qū)段及一個(gè)或多個(gè)J區(qū)段，或者一個(gè)或多個(gè)J區(qū)段連接。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述V區(qū)段與一個(gè)或多個(gè)D和/或J區(qū)段可操作地與免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)序列連接。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)序列選自CH1、鉸鏈、CH2、CH3序列及其組合。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述CH1、鉸鏈、Ch2、Ch3或其組合均是非人源內(nèi)源性恒定序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述CH1、鉸鏈、Ch2、Ch3或其組合中的至少一個(gè)是人源序列。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述ChI和/或鉸鏈?zhǔn)侨嗽葱蛄小?br> [0035]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N經(jīng)修飾的內(nèi)源性非人源免疫球蛋白重鏈基因座，所述基因座包含用單一人源V基因區(qū)段(或者以多種多態(tài)性形式或拷貝數(shù)存在的單一人源V基因區(qū)段)取代全部功能性V基因區(qū)段，其中所述非人源免疫球蛋白重鏈基因座不能重排形成來(lái)源于單一人源V基因區(qū)段(或者多態(tài)性形式或拷貝中的一種)以外的V基因區(qū)段的重鏈可變基因。
[0036]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述單一人源V基因區(qū)段是Vh1_69。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述單一人源V基因區(qū)段是νΗ1-2。
[0037]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述基因組包含至少一個(gè)人源或非人源Dh基因區(qū)段，以及一個(gè)人源或非人源Jh基因區(qū)段。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述基因座包含人源Dh基因區(qū)段和人源Jh基因區(qū)段。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述基因座包含人源Jh基因區(qū)段。在另一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述基因座包含人源％1-69基因區(qū)段(以單一拷貝或不同多態(tài)性形式的多重拷貝形式存在)、全部功能性人源Dh基因區(qū)段以及全部功能性人源Jh基因區(qū)段。在另一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述基因座包含人源％1-2基因區(qū)段(以單一拷貝或不同多態(tài)性形式的多重拷貝形式存在)、全部功能性人源Dh基因區(qū)段以及全部功能性人源Jh基因區(qū)段。在一個(gè)實(shí)施方式中，在內(nèi)源性小鼠重鏈基因座位置所述人源V、D和J基因區(qū)段(或者V和J基因區(qū)段)可操作地與小鼠恒定區(qū)基因連接。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述小鼠重鏈基因座包含野生型小鼠免疫球蛋白恒定區(qū)序列庫(kù)。
[0038]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N基因修飾的非人動(dòng)物，其中所述非人動(dòng)物單一功能性免疫球蛋白重鏈V基因區(qū)段選自人源Vh1_2、Vh1_3、Vh1-8、Vh1-18、Vh1_24、Vh1_45、Vh1-46、Vh1-58、Vh1-69、Vh2-5、Vh2-26、Vh2-70、Vh3-7、Vh3-9、Vh3-11、Vh3-13、Vh3-15、Vh3-16、Vh3-20、Vh3-2 1、VH3-23、VH3_30、VH3_30_3、VH3_30_5、VH3_33、VH3_35、VH3_38、VH3_43、VH3_48、Vh3-49、Vh3-53、Vh3-64、Vh3_66、Vh3_72、Vh3_73、Vh3_74、Vh4_4、Vh4_28、Vh4_30_1、Vh4_30_2、Vh4-30-4、Vh4-31、Vh4-34、Vh4_39、Vh4_59、Vh4_61、Vh5_51、Vh6_1、Vh7_4_1 和 VH7_81 基因區(qū)段。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述重鏈V基因區(qū)段是人源％1-69基因區(qū)段。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述重鏈V基因區(qū)段是人源Vh1-2基因區(qū)段。
[0039]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N基因修飾的非人動(dòng)物，其中所述非人動(dòng)物包含單一功能性人源Vh基因區(qū)段(以單一拷貝或不同多態(tài)性形式的多重拷貝形式存在)，并且其中所述非人動(dòng)物基本上不能形成缺乏單一功能性人源Vh基因區(qū)段(或者多態(tài)性形式或拷貝中的一種)的重排的免疫球蛋白重鏈可變結(jié)構(gòu)域基因。
[0040]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N基因修飾的非人動(dòng)物，其中僅在非人動(dòng)物中表達(dá)的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)來(lái)源于選自人源Vh1-2、Vh1-3、Vh1-8、Vh1-18、Vh1_24、Vh1_45、Vh1-46、Vh1-58、Vh1-69、Vh2-5、Vh2-26、Vh2-70、Vh3-7、Vh3-9、Vh3-11、Vh3-13、Vh3-15、Vh3-16、Vh3-20、Vh3-2 1、VH3-23、VH3_30、VH3_30_3、VH3_30_5、VH3_33、VH3_35、VH3_38、VH3_43、VH3_48、Vh3-49、Vh3-53、Vh3-64、Vh3_66、Vh3_72、Vh3_73、Vh3_74、Vh4_4、Vh4_28、Vh4_30_1、Vh4_30_2、Vh4-30-4、Vh4-31、Vh4-34、Vh4_39、Vh4_59、Vh4_61、Vh5_51、Vh6_1、Vh7_4_1 和 VH7_81 基因區(qū)段的人源區(qū)段之一。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述人源區(qū)段是Vh1-69區(qū)段。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述人源區(qū)段是Vh1-2區(qū)段。在一個(gè)實(shí)施方式中，由小鼠表達(dá)的唯一的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)來(lái)源于單一 V區(qū)段家族成員，并且在一個(gè)實(shí)施方式中，所述唯一的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)來(lái)源于單一 V區(qū)段家族成員的多態(tài)性變體。
[0041]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N包含受限制的免疫球蛋白重鏈V基因區(qū)段庫(kù)的非人動(dòng)物，其中所述非人動(dòng)物進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)人源免疫球蛋白K輕鏈可變區(qū)段(Vk)0在一個(gè)實(shí)施方式中，所述一個(gè)或多個(gè)V K區(qū)段可操作地與一個(gè)或多個(gè)人源J區(qū)段連接。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述J區(qū)段是人源J K區(qū)段。在另一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物不表達(dá)免疫球蛋白λ輕鏈。在另一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物不包含功能性人源或功能性內(nèi)源性免疫球蛋白λ輕鏈可變基因座。
[0042]在一個(gè)實(shí)施方式中,所述非人動(dòng)物是哨齒動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述哨齒動(dòng)物是小鼠。
[0043]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物包含用一個(gè)或多個(gè)功能性人源V K區(qū)段取代內(nèi)源性非人源免疫球蛋白Vk基因座的全部或基本上全部功能性內(nèi)源性VK區(qū)段。在進(jìn)一步的特定實(shí)施方式中，所述取代使用全部或基本上全部功能性人源免疫球蛋白Vk區(qū)段。
[0044]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物包含在內(nèi)源性非人免疫球蛋白Vk基因座用選白 Vk 4-1、Vk 5-2, Vk 7-3, Vk 2-4, Vk 1-5、Vk 1-6、Vk 3-7, Vk 1-8、Vk 1-9、Vk 2-10,Vk 3-11、Vk 1-12、Vk 1-13、Vk 2-14, Vk 3-15, Vk 卜16、Vk 1-17、Vk 2-18, Vk 2-19,Vk 3-20、Vk 6-21、Vk 1-22, Vk 1-23, Vk 2-24、Vk 3-25、Vk 2-26、Vk 1-27, Vk 2-28、Vk 2-29、Vk 2-30、Vk 3-31、Vk 1-32, Vk 1-33, Vk 3-34、Vk 卜35、Vk 2-36、Vk 1-37,Vk 2-38,V K 1_39、V κ 2_40及其組合的人源V κ基因區(qū)段取代全部或基本上全部的功能性內(nèi)源性V K基因區(qū)段。
[0045]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物包含在內(nèi)源性非人源免疫球蛋白Jk基因座用一個(gè)或多個(gè)功能性人源免疫球蛋白Jk區(qū)段取代全部或基本上全部的功能性內(nèi)源性非人源免疫球蛋白Jk區(qū)段。在進(jìn)一步的特定實(shí)施方式中，所述取代是使用全部或基本上全部功能性人源免疫球蛋白Jk區(qū)段。
[0046]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物包含在內(nèi)源性非人源免疫球蛋白Jk基因座用選自Jk 1、J K 2、Jk 3、Jk 4、Jk 5及其組合的人源Jk基因區(qū)段取代全部或基本上全部的功能性內(nèi)源性非人源免疫球蛋白Jk基因區(qū)段。
[0047]在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)基因座，其包含基本上由單一 V區(qū)段和/或其多態(tài)性變體組成的V區(qū)段庫(kù)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述單一免疫球蛋白重鏈V區(qū)段是人源νΗ1-69區(qū)段，并且所述非人動(dòng)物進(jìn)一步包含用全部功能性人源Dh區(qū)段取代全部功能性非人源Dh區(qū)段，并且進(jìn)一步包含用全部功能性人源Jh區(qū)段取代全部功能性非人源Jh區(qū)段，并且其中所述免疫球蛋白重鏈可變區(qū)基因座可操作地與人源或非人源恒定區(qū)基因序列連接。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述恒定區(qū)基因序列是內(nèi)源性非人源恒定區(qū)基因序列。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物在非人免疫球蛋白重鏈基因座重排區(qū)段以形成編碼包含人源Vh1-69序列、人源Dh序列、人源Jh序列和小鼠恒定區(qū)序列的重鏈可變區(qū)的基因。
[0048]在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)基因座，其包含基本上由單一 V區(qū)段和/或其多態(tài)性變體組成的V區(qū)段庫(kù)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述單一免疫球蛋白重鏈V區(qū)段是人源νΗ1-2區(qū)段，并且所述非人動(dòng)物進(jìn)一步包含用全部功能性人源Dh區(qū)段取代全部功能性非人源Dh區(qū)段，并且進(jìn)一步包含用全部功能性人源Jh區(qū)段取代全部功能性非人源Jh區(qū)段，并且其中所述免疫球蛋白重鏈可變區(qū)基因座可操作地與人源或非人源恒定區(qū)基因序列連接。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述恒定區(qū)基因序列是內(nèi)源性非人源恒定區(qū)基因序列。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物在非人免疫球蛋白重鏈基因座重排區(qū)段以形成編碼包含人源Vh1-2序列、人源Dh序列、人源Jh序列和小鼠恒定區(qū)序列的重鏈可變區(qū)的基因。
[0049]在一個(gè)實(shí)施方式中，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N包含所述重排的基因的B細(xì)胞。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述B細(xì)胞來(lái)源于用所關(guān)注的抗原免疫的所述小鼠，并且所述B細(xì)胞編碼與所關(guān)注的抗原特異性結(jié)合的抗體。在一個(gè)實(shí)施方式中，所關(guān)注的抗原是病原體。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述病原體選自流感病毒、肝炎病毒(例如乙型肝炎或丙型肝炎病毒)和人免疫缺陷病毒。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述B細(xì)胞編碼體細(xì)胞突變的、高親和性(例如約KT9Kd或更低)抗體，所述抗體包含與所關(guān)注抗原特異性結(jié)合的人源輕鏈可變區(qū)(例如人源K輕鏈可變區(qū))。
[0050]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N包含受限制的免疫球蛋白重鏈V區(qū)段庫(kù)的非人動(dòng)物，其中所述非人動(dòng)物包含一個(gè)或多個(gè)人源化λ輕鏈可變(V λ)區(qū)段。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述一個(gè)或多個(gè)人源Vλ區(qū)段可操作地與一個(gè)或多個(gè)人源J區(qū)段連接。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述J區(qū)段是人源JX區(qū)段。在另一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物不表達(dá)K輕鏈。在另一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物不包含功能性人源或非人源K輕鏈可變基因座。
[0051]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物包含用一個(gè)或多個(gè)功能性人源免疫球蛋白V λ區(qū)段取代全部或基本上全部的功能性非人源免疫球蛋白V λ區(qū)段。在進(jìn)一步的特定實(shí)施方式中，所述取代使用全部或基本上全部的功能性人源免疫球蛋白νλ區(qū)段。
[0052]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物包含用人源λ輕鏈基因座簇A的片段取代全部或基本上全部功能性非人源Vλ區(qū)段。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述人源λ輕鏈基因座簇A的片段包含人源V λ基因區(qū)段V λ 3-27至V λ 3-1。
[0053]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物包含用人源λ輕鏈基因座簇B的片段取代全部或基本上全部功能性非人源Vλ區(qū)段。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述人源λ輕鏈基因座簇B的片段包含人源V λ基因區(qū)段νλ 5-52至νλ 1-40。
[0054]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物包含用人源λ輕鏈基因座簇A的片段和簇B的片段取代全部或基本上全部功能性非人源Vλ區(qū)段，其中所述取代所得的產(chǎn)物包含人源νλ基因區(qū)段νλ5-52至νλ3-1。 [0055]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物包含用至少12個(gè)人源V λ基因區(qū)段、至少28個(gè)人源V λ基因區(qū)段或至少40個(gè)人源V λ基因區(qū)段取代全部或基本上全部功能性非人源V λ區(qū)段。
[0056]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物包含用一個(gè)或多個(gè)功能性人源免疫球蛋白JA基因區(qū)段取代全部或基本上全部功能性非人源免疫球蛋白JX基因區(qū)段。在進(jìn)一步的特定實(shí)施方式中，所述取代使用全部或基本上全部功能性人源免疫球蛋白JX基因區(qū)段。在不同實(shí)施方式中，所述功能性人源JA基因區(qū)段包括JA 1、JA2、JA3和JA7。
[0057]在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物包含包括單一 Vh區(qū)段的免疫球蛋白重鏈可變(Vh)區(qū)的基因座，其中所述單+Vh區(qū)段是人源Vh1-69區(qū)段或人源Vh1-2區(qū)段，并且其進(jìn)一步包含用全部功能性人源Dh區(qū)段取代全部功能性非人源Dh區(qū)段，以及進(jìn)一步包含用全部功能性人源Jh區(qū)段取代全部功能性非人源Jh區(qū)段，并且其中所述Vh區(qū)基因座可操作地與人源或非人源恒定區(qū)基因序列連接。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述恒定區(qū)基因序列是非人源恒定區(qū)基因序列，例如內(nèi)源性非人源恒定基因序列。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物在非人源免疫球蛋白重鏈基因座重排區(qū)段以形成編碼包含Vh1-69序列(或人源Vh1-2序列)、人源Dh序列、人源Jh序列和內(nèi)源性非人源恒定區(qū)序列的人源免疫球蛋白重鏈可變區(qū)的基因。
[0058]在一個(gè)實(shí)施方式中，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N包含所述重排基因的B細(xì)胞。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述B細(xì)胞來(lái)源于己使用所關(guān)注的抗原免疫的所述非人動(dòng)物，并且所述B細(xì)胞編碼與所關(guān)注的抗原特異性結(jié)合的抗體。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述抗原是選自配體、細(xì)胞表面受體和胞內(nèi)蛋白的人源蛋白。在一個(gè)實(shí)施方式中，所關(guān)注的抗原是病原體。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述病原體選自流感病毒、肝炎病毒(例如乙型肝炎或丙型肝炎病毒)和人免疫缺陷病毒。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述B細(xì)胞編碼體細(xì)胞突變的、高親和性(例如約KT9Kd或更低)抗體，所述抗體包含與所關(guān)注抗原特異性結(jié)合的人源輕鏈可變區(qū)(例如人源λ輕鏈可變區(qū))。
[0059]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N包含受限制的免疫球蛋白Vh區(qū)段庫(kù)的非人動(dòng)物，其中所述非人動(dòng)物在轉(zhuǎn)基 因上包含人源Vh1-69區(qū)段(或人源Vh1-2區(qū)段)，其中所述人源Vh1-69區(qū)段可操作地在轉(zhuǎn)基因上與人源或非人源Dh區(qū)段和/或人源或非人源J區(qū)段連接，并且所述轉(zhuǎn)基因進(jìn)一步包含人源或非人源恒定區(qū)基因，或者人源/非人源嵌合恒定區(qū)(例如CH1、鉸鏈、Ch2、Ch3或其組合，其中至少一個(gè)序列是非人源的，例如選自鉸鏈、Ch2和Ch3和/或鉸鏈)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物是小鼠或大鼠并且所述非人源D、J和/或恒定區(qū)基因是小鼠或大鼠基因或者嵌合的人源/小鼠或大鼠基因。
[0060]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物包含轉(zhuǎn)基因，所述轉(zhuǎn)基因包含免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)基因座，其包含一個(gè)或多個(gè)人源免疫球蛋白νλ基因區(qū)段和基因區(qū)段，或者一個(gè)或多個(gè)人源免疫球蛋白V K基因區(qū)段和J K基因區(qū)段，以及人源免疫球蛋白K或λ輕鏈恒定區(qū)，以使得所述轉(zhuǎn)基因在非人動(dòng)物中重排形成重排的免疫球蛋白K或λ輕鏈基因。在多種實(shí)施方式中，所述人源V K和】!^基因區(qū)段是此處所描述的那些。在多種實(shí)施方式中，所述人源V λ和基因區(qū)段是此處所描述的那些。
[0061]在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物包含具有免疫球蛋白重鏈可變基因座的轉(zhuǎn)基因，所述免疫球蛋白重鏈可變基因座包含單一 V區(qū)段，其為人源νΗ1-69區(qū)段(或人源Vh1-2區(qū)段)、一個(gè)或多個(gè)人源D區(qū)段、一個(gè)或多個(gè)人源J區(qū)段，并且人源恒定基因可操作地與所述重鏈可變基因座連接，以使得所述小鼠由轉(zhuǎn)基因表達(dá)來(lái)源于Vh1-69區(qū)段(或Vh1-2區(qū)段)的全人源抗體。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物不包含功能性內(nèi)源免疫球蛋白重鏈可變區(qū)基因座。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物包含非功能性內(nèi)源免疫球蛋白重鏈可變區(qū)基因座，所述基因座包含內(nèi)源性非人源D1^P /或內(nèi)源性非人源Jh區(qū)段缺失，以使得所述非人動(dòng)物不能重排內(nèi)源性免疫球蛋白重鏈可變區(qū)基因座以形成重排的非人源抗體基因。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物包含可操作地與內(nèi)源性小鼠重鏈恒定區(qū)連接的開(kāi)關(guān)序列的缺失。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述開(kāi)關(guān)序列是非人源(例如小鼠)μ開(kāi)關(guān)序列。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物進(jìn)一步包含功能性內(nèi)源輕鏈可變基因座的缺失，所述功能性內(nèi)源輕鏈可變基因座選自免疫球蛋白K基因座和免疫球蛋白λ基因座。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物包含J K和/或JX序列缺失，以使得所述非人動(dòng)物不能重排內(nèi)源性非人源免疫球蛋白K輕鏈和/或內(nèi)源性非人源免疫球蛋白λ輕鏈可變區(qū)以形成重排的內(nèi)源性非人源免疫球蛋白K輕鏈和/或重排的內(nèi)源性非人源免疫球蛋白λ輕鏈基因。
[0062]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物包含內(nèi)源性非人源免疫球蛋白K輕鏈序列的缺失，其導(dǎo)致內(nèi)源性非人源免疫球蛋白K輕鏈的功能性敲除。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物包含內(nèi)源性非人源免疫球蛋白λ輕鏈序列的缺失，其導(dǎo)致內(nèi)源性非人源免疫球蛋白λ輕鏈的功能性敲除。
[0063]在一個(gè)方面，所述非人動(dòng)物包含被功能性沉默的內(nèi)源免疫球蛋白重鏈可變基因基因座，并且包含受限制的人源重鏈可變基因區(qū)段庫(kù)(例如不超過(guò)一個(gè)或者不超過(guò)兩個(gè))。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述功能性沉默包含內(nèi)源性非人源重鏈可變基因基因座的修飾，所述修飾選自缺失、插入、反轉(zhuǎn)及其組合。
[0064]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N嚙齒動(dòng)物，所述嚙齒動(dòng)物包含免疫球蛋白Vh庫(kù)，其來(lái)源于不超過(guò)一個(gè)人源Vh區(qū)段或其一個(gè)或多個(gè)多態(tài)性變體，和來(lái)源于選自一個(gè)或多個(gè)D區(qū)段庫(kù)的D區(qū)段以及來(lái)源于來(lái)自一個(gè)或多個(gè)J區(qū)段庫(kù)的J區(qū)段。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述嚙齒動(dòng)物重排所述人源Vh區(qū)段、人源D區(qū)段和人源J區(qū)段并且形成與人源或嚙齒動(dòng)物恒定區(qū)序列可操作地連接的重排的人源重鏈序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述人源和/或嚙齒動(dòng)物恒定區(qū)序列選自CH1、鉸鏈、Ch2、Ch3及其組合。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述嚙齒動(dòng)物表達(dá)包含人源可變結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白輕鏈，其中所述輕鏈與來(lái)源于重排的人源重鏈序列的人源重鏈結(jié)構(gòu)域是同源的。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述嚙齒動(dòng)物不表達(dá)選自非人源重鏈可變結(jié)構(gòu)域、非人源輕鏈可變結(jié)構(gòu)域及其組合的多肽序列。
[0065]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述人源Vh 區(qū)段以 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、
16、17、18或19或者更多種多態(tài)性變體形式存在，其中各多態(tài)性變體可操作地與D和/或J區(qū)段連接以使得各多態(tài)性變體能夠重排和形成具有任意一個(gè)或多個(gè)D區(qū)段和任意一個(gè)或多個(gè)J區(qū)段的重排的重鏈可變結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述嚙齒動(dòng)物是小鼠或大鼠。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述D區(qū)段庫(kù)包含兩個(gè)或多個(gè)D區(qū)段。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述J區(qū)段庫(kù)包含兩個(gè)或多個(gè)J區(qū)段。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述D和/或J區(qū)段是人源區(qū)段。
[0066]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N核酸構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含編碼單一人源免疫球蛋白Vh區(qū)段和/或其多態(tài)性變體的序列以及一個(gè)或多個(gè)Dh和一個(gè)或多個(gè)J序列，其中所述構(gòu)建體包含至少一個(gè)與非人源免疫球蛋白重鏈可變基因座同源的同源臂，或重組酶識(shí)別位點(diǎn)(例如1x位點(diǎn))。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述V區(qū)段是VHl-69區(qū)段或VHl-2區(qū)段。
[0067] 在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N核酸構(gòu)建體；所述構(gòu)建體包含編碼單一人源免疫球蛋白重鏈V區(qū)段的核酸序列，其中所述單一VH區(qū)段是νΗ1-69(*νΗ1-2)區(qū)段。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述構(gòu)建體包含位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別位點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述構(gòu)建體包
區(qū)段上游的第一小鼠同源臂區(qū)段下游的第二小鼠同源臂，并且其中所述第一小鼠同源臂與小鼠染色體上小鼠免疫球蛋白重鏈可變區(qū)上游緊鄰的區(qū)域具有同源性但不包括功能性小鼠免疫球蛋白重鏈可變區(qū)段。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述構(gòu)建體包含SEQ ID NO:3。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述構(gòu)建體包含SEQ ID NO:70。
[0068]在一個(gè)方面，所述受限制的單一 Vh區(qū)段在非人動(dòng)物中，或者所述受限制的Vh區(qū)段在非人源免疫球蛋白重鏈基因座(例如在原位或在轉(zhuǎn)基因中)，并且所述非人動(dòng)物或非人源免疫球蛋白重鏈基因座選自小鼠、大鼠、家兔、豬、牛(例如母牛、公牛、水牛)、鹿、綿羊、山羊、雞、貓、犬、雪貂、靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物(例如絨猴、獼猴)基因座或動(dòng)物。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物或基因座是小鼠或大鼠基因座。
[0069]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N細(xì)胞或組織，其中所述細(xì)胞或組織來(lái)源于如本申請(qǐng)所述的非人動(dòng)物，并且包含受限制的Vh區(qū)段庫(kù)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述Vh區(qū)段庫(kù)被限制為單一 Vh區(qū)段家族成員和/或其多態(tài)性變體。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述單一 Vh區(qū)段是人源Vh1-69區(qū)段或人源Vh1-2區(qū)段。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞或組織來(lái)源于非人動(dòng)物的脾臟、淋巴結(jié)或骨髓。
[0070]在一個(gè)實(shí)施方式中,所述細(xì)胞是ES細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中,所述細(xì)胞是B細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是生殖細(xì)胞。
[0071]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述組織選自結(jié)締、肌肉、神經(jīng)和上皮組織。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述組織是生殖組織。
[0072]在一個(gè)實(shí)施方式中，分離來(lái)源于如本申請(qǐng)所述小鼠的所述細(xì)胞和/或組織用于一項(xiàng)或多項(xiàng)體外檢測(cè)。在多種實(shí)施方式中，所述一項(xiàng)或多項(xiàng)體外檢測(cè)包括物理、熱、電、機(jī)械或光學(xué)性質(zhì)檢測(cè)，外科手術(shù)，不同組織類(lèi)型相互作用檢測(cè)，影像技術(shù)顯影或其組合。
[0073]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物是小鼠。
[0074]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N非人動(dòng)物胚胎，所述胚胎包括如本申請(qǐng)所述的受限制的重鏈Vh區(qū)段。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述胚胎包含包括受限制Vh區(qū)段的ES供體細(xì)胞，以及宿主胚胎細(xì)胞。
[0075]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物是小鼠。
[0076]在一個(gè)方面，所述非人細(xì)胞包含如本申請(qǐng)所述的非人動(dòng)物的染色體或其片段。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述非人細(xì)胞包含如本申請(qǐng)所述的非人動(dòng)物的細(xì)胞核。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物細(xì)胞 包含核轉(zhuǎn)移得到的染色體或其片段。
[0077]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N來(lái)源于如本申請(qǐng)所述的來(lái)源于非人動(dòng)物的細(xì)胞核。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞核來(lái)自非B細(xì)胞的二倍體細(xì)胞。
[0078]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N來(lái)源于如本申請(qǐng)所述的非人動(dòng)物的多能性、誘導(dǎo)多能性或全能性細(xì)胞。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是小鼠胚胎干(ES)細(xì)胞。
[0079]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N包含受限制的Vh區(qū)段庫(kù)的非人源的誘導(dǎo)多能性細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述誘導(dǎo)多能性細(xì)胞來(lái)源于如本申請(qǐng)所述的非人動(dòng)物。
[0080]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N來(lái)源于如本申請(qǐng)所述的非人動(dòng)物細(xì)胞的雜交瘤或四價(jià)體瘤。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物是小鼠或大鼠。
[0081]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝巳绫旧暾?qǐng)所述的非人動(dòng)物的淋巴細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述淋巴細(xì)胞是B細(xì)胞。
[0082]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N小鼠細(xì)胞和小鼠胚胎，其包括但不限于包含如本申請(qǐng)所述的基因修飾的ES細(xì)胞、多能行細(xì)胞以及誘導(dǎo)多能性細(xì)胞。本申請(qǐng)?zhí)峁┝?XX細(xì)胞和XY細(xì)胞。本申請(qǐng)還提供了包含具有如本申請(qǐng)所述的修飾的細(xì)胞核的細(xì)胞,例如通過(guò)前核顯微注射將修飾引入細(xì)胞。
[0083]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝嗽谌绫旧暾?qǐng)所述的非人動(dòng)物中制備的抗體可變結(jié)構(gòu)域序列。
[0084]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N人用治療劑，所述治療劑包括包含來(lái)源于如本申請(qǐng)所述的非人動(dòng)物序列的抗體可變結(jié)構(gòu)域。
[0085]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N從非人動(dòng)物中獲得抗體可變區(qū)序列的方法，其中所述抗體可變區(qū)序列來(lái)源于人源Vh1-69區(qū)段或Vh1-2區(qū)段，其中所述方法包括(a)使用所關(guān)注的抗原免疫非人動(dòng)物，其中所述非人動(dòng)物包含用單一人源可變區(qū)段在內(nèi)源性免疫球蛋白重鏈基因座取代全部或基本上全部的非人源可變區(qū)段，其中所述單一人源可變區(qū)段是Vh1-69區(qū)段或Vh1-2區(qū)段，并且其中所述非人動(dòng)物基本上不能形成非來(lái)源于人源Vh1-69區(qū)段或Vh1-2區(qū)段的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)序列；(b)使所述非人動(dòng)物發(fā)生針對(duì)所關(guān)注抗原的免疫應(yīng)答；以及(c)鑒定或分離所述非人動(dòng)物的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)序列，其中所述抗體與所關(guān)注抗原結(jié)合。
[0086]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述單一人源可變區(qū)段是Vh1_69區(qū)段。
[0087]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述抗體可變區(qū)序列來(lái)源于SEQ ID NO:34。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述抗體可變區(qū)序列有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%與SEQ IDNO:34相同。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述抗體可變區(qū)序列包含SEQ IDNO:34。
[0088]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述單一人源可變區(qū)段是Vh1_2區(qū)段。
[0089]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述抗體可變區(qū)序列來(lái)源于SEQ ID NO:60。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述抗體可變區(qū)序列有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%與SEQ IDNO:60的相同。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述抗體可變區(qū)序列包含SEQ IDNO:60。
[0090]在一個(gè)實(shí)施方式中，針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的特征為在ELISA檢測(cè)中測(cè)定的抗體的滴度比本底的兩倍高約6xW4至約5x10s倍。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，根據(jù)在ELISA檢測(cè)中測(cè)定的結(jié)果抗體的滴度比本底的兩倍高約1.5xl05倍。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述抗原是人細(xì)胞表面受體。
[0091]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N在非人動(dòng)物中生成人源抗體可變區(qū)庫(kù)的方法，其中所述人源重鏈可變區(qū)庫(kù)來(lái)源于同一 Vh基因家族成員和多個(gè)Dh區(qū)段之一和多個(gè)Jh區(qū)段之一，其中所述庫(kù)的特征為具有來(lái)自單一 Vh基因家族成員的重鏈免疫球蛋白FRl (框架I)、⑶Rl、FR2、⑶R2和FR3序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述庫(kù)進(jìn)一步的特征為具有多個(gè)不同的CDR3+FR4 序列。
[0092]在一個(gè)實(shí)施方式 中，所述單一 Vh基因家族選自Vh家族1、2、3、4、5、6和7。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述單一 Vh基因家族是Vh家族I。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述單一 Vh基因家族成員選自Vh1-2、Vh1-69、Vh2-26、Vh2_70和VH3_23。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述單一Vh基因家族成員是Vh1-69。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述單一 Vh基因家族成員是Vh1-2。
[0093]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述庫(kù)包含來(lái)源于Vh1_69區(qū)段的重鏈FRUCDR1、FR2、CDR2和FR3序列。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述庫(kù)包含來(lái)源于SEQ ID NO:35的重鏈FR1、CDR1、FR2、⑶R2和FR3序列。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述庫(kù)包含SEQ ID NO:35的重鏈FR1、⑶R1、FR2、CDR2 和 FR3 序列。
[0094]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述庫(kù)包含來(lái)源于Vh1_2區(qū)段的重鏈FRl、CDRl、FR2、CDR2和FR3序列。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述庫(kù)包含來(lái)源于SEQ IDNO:61的重鏈FR1、CDR1、FR2、⑶R2和FR3序列。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述庫(kù)包含SEQ ID NO:61的重鏈FR1、⑶R1、FR2、CDR2 和 FR3 序列。
[0095]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N用于生成多種不同人源CDR3序列的生物(即體內(nèi))系統(tǒng)，所述序列反映了單一人源Vh基因區(qū)段與多種人源D和J區(qū)段的多種重排，其中該系統(tǒng)生成的人源重鏈可變結(jié)構(gòu)域的特征為具有與人源FRl-⑶R1-FR2-⑶R2-FR3 —致但具有體細(xì)胞高突變的序列，其中所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域的特征為具有特異性高突變并且來(lái)源于單一人源Vh基因區(qū)段和多個(gè)人源D和J區(qū)段；其中所述系統(tǒng)包含如本申請(qǐng)所述的基因修飾的非人動(dòng)物(例如嚙齒動(dòng)物，例如小鼠或大鼠)。
[0096]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述單一人源Vh基因區(qū)段選自Vh1_2、Vh1_69、Vh2_26、Vh2_70和\^3-23。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述單一人源Vh基因區(qū)段是Vh1-69。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述單一人源Vh基因區(qū)段是Vh1-2。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述單一人源Vh基因區(qū)段列于表I中。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述單一人源Vh基因區(qū)段列于表2中。在一個(gè)實(shí)施方式中,所述單一人源Vh基因區(qū)段列于表3中。
[0097]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N用于在體內(nèi)產(chǎn)生多種重鏈CDR序列的方法，所述序列來(lái)源于單一人源Vh基因區(qū)段與多個(gè)人源D和J區(qū)段的重排，其中所述方法產(chǎn)生的人源重鏈可變結(jié)構(gòu)域的特征為具有與人源FRl-⑶R1-FR2-⑶R2-FR3 —致但具有體細(xì)胞高突變的序列，其中所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域的特征為具有體細(xì)胞突變并且來(lái)源于單一人源Vh基因區(qū)段和多個(gè)人源D和J區(qū)段；其中所述系統(tǒng)包含如本申請(qǐng)所述的基因修飾的非人動(dòng)物(例如嚙齒動(dòng)物，例如小鼠或大鼠)。
[0098]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法包括將如本申請(qǐng)所述的非人動(dòng)物與所關(guān)注的抗原接觸，使得所述非人動(dòng)物產(chǎn)生針對(duì)所述抗原的免疫應(yīng)答，其中所述免疫應(yīng)答生成多個(gè)來(lái)源于單一人源Vh基因區(qū)段與人源D區(qū)段之一和人源J區(qū)段之一重排的重鏈CDR序列，以及鑒定一系列與所述抗原結(jié)合的重鏈CDR。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法包括從所述動(dòng)物的核酸序列中分離編碼包含重鏈CDR的人源Vh結(jié)構(gòu)域。
[0099]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述重鏈⑶R序列來(lái)源于人源Vh1_69基因區(qū)段的重排。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述重鏈CDR序列來(lái)源于人源Vh1-2基因區(qū)段的重排。
[0100]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N在非人動(dòng)物中產(chǎn)生多個(gè)不同的CDR3和FR4序列的方法，所述方法包括將非人動(dòng)物與所關(guān)注的抗原接觸，所述非人動(dòng)物包含具有限定為單一Vh區(qū)段家族成員的Vh區(qū)段庫(kù)的免疫球蛋白重鏈可變基因基因座，使得所述非人動(dòng)物產(chǎn)生針對(duì)所述抗原的免疫應(yīng)答，其中所述免疫應(yīng)答生成重鏈可變結(jié)構(gòu)域均來(lái)源于單一 Vh區(qū)段家族成員且包含多種不同的⑶R3和FR4序列的B細(xì)胞庫(kù)。
[0101]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述單一 VHg段家族成員是人源的。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物選自小鼠、大鼠和家兔。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述所關(guān)注的抗原選自配體、受體、細(xì)胞內(nèi)蛋白和分泌蛋白。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述所關(guān)注的抗原是如本申請(qǐng)所述的人病原體。
[0102]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述單一人源Vh基因家族成員選自Vh1_2、Vh1_69、Vh2_26、￥112-70和￥113-23。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述單一人源Vh基因家族成員是VH1_69。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述單一人源Vh基因家族成員是Vh1-2。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述單一人源Vh基因家族成員列于表1中。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述單一人源Vh基因家族成員列于表2中。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述單一人源Vh基因家族成員列于表3中。
[0103]本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N在如本申請(qǐng)所述的非人動(dòng)物中制備的編碼免疫球蛋白可變區(qū)的核苷酸序列。
[0104]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N在如本申請(qǐng)所述的非人動(dòng)物中制備的抗體的免疫球蛋白重鏈或免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)氨基酸序列。
[0105]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N在如本申請(qǐng)所述的非人動(dòng)物中制備的免疫球蛋白重鏈或免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)核苷酸序列編碼的抗體的可變區(qū)。
[0106]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N在如本申請(qǐng)所述的非人動(dòng)物中制備的抗體或其抗原結(jié)合片段(例如Fab、F (ab) 2、scFv)。
[0107]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N具有受限制的免疫球蛋白重鏈基因座的小鼠，其特征為存在單一人源Vh基因區(qū)段、一個(gè)或多個(gè)人源Dh基因區(qū)段以及一個(gè)或多個(gè)人源Jh基因區(qū)段，其中所述單一人源Vh基因區(qū)段在內(nèi)源性小鼠基因座并且所述Vh基因區(qū)段可操作地與一個(gè)或多個(gè)人源011基因區(qū)段、一個(gè)或多個(gè)人源Jh基因區(qū)段以及內(nèi)源性免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)連接。
[0108]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠進(jìn)一步包含人源化的免疫球蛋白輕鏈基因座，所述基因座包含一個(gè)或多個(gè)人源\基因區(qū)段以及一個(gè)或多個(gè)人源I基因區(qū)段，其中所述人源'基因區(qū)段和人源I基因區(qū)段可操作地與非人動(dòng)物免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)基因連接。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述人源\和I基因區(qū)段在內(nèi)源性小鼠輕鏈基因座，并且其中所述非人源免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)基因是小鼠基因。
[0109]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述人源化免疫球蛋白輕鏈基因座在轉(zhuǎn)基因上，并且所述恒定區(qū)基因選自小鼠、大鼠和人。
[0110]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述人源'和叉基因區(qū)段是VK和】!^基因區(qū)段。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述人源'和叉基因區(qū)段是νλ和基因區(qū)段。
[0111]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N非人動(dòng)物，其中所述非人動(dòng)物具有B細(xì)胞庫(kù)，其表達(dá)來(lái)源于單一V區(qū)段家族成員的免疫球蛋白重鏈可變結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方式中，在B細(xì)胞庫(kù)中表達(dá)的非人動(dòng)物免疫球蛋白重鏈可變結(jié)構(gòu)域B細(xì)胞庫(kù)的至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90或至少95%來(lái)源于同一 V區(qū)段家族成員。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述B細(xì)胞庫(kù)基本上由外周(血液)Β細(xì)胞組成。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述B細(xì)胞庫(kù)基本上由脾臟B細(xì)胞組成。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述B細(xì)胞庫(kù)基本上由骨髓B細(xì)胞組成。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述B細(xì)胞庫(kù)基本上由外周B細(xì)胞、脾臟B細(xì)胞和骨髓B細(xì)胞組成。
[0112]在一個(gè)方 面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N基因修飾的非人動(dòng)物，其中表達(dá)重鏈免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的非人動(dòng)物不超過(guò)10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或高于90%的B細(xì)胞表達(dá)來(lái)源于單一 Vh基因區(qū)段家族成員的重鏈免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方式中,表達(dá)重鏈免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的非人動(dòng)物至少75%的B細(xì)胞表達(dá)來(lái)源于單一Vh基因區(qū)段家族成員的重鏈免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述百分率為至少90%。在一個(gè)實(shí)施方式中，全部表達(dá)重鏈結(jié)構(gòu)域的B細(xì)胞均來(lái)源于單一 Vh基因家族成員。
[0113]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N基因修飾的小鼠，其制備對(duì)所關(guān)注抗原的免疫產(chǎn)生應(yīng)答的抗原特異性B細(xì)胞群，其中所述抗原特異性B細(xì)胞群的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或高于90%表達(dá)來(lái)源于同一￥11基因區(qū)段的免疫球蛋白重鏈。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述至少75%的抗原特異性B細(xì)胞群表達(dá)來(lái)源于同一乂11基因區(qū)段的免疫球蛋白重鏈。在一個(gè)實(shí)施方式中，全部抗原特異性B細(xì)胞表達(dá)的重鏈均來(lái)源于同一 Vh基因區(qū)段。
[0114]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N包含受限制的Vh基因區(qū)段庫(kù)的非人動(dòng)物，其中所述限制針對(duì)人源％1-69基因區(qū)段或與Vh1-69*01基因區(qū)段具有至少約75.5%、76.5%、86.7%,87.8%,94.9%、96.9%、98%或99%同一性的VH1_69基因區(qū)段。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述受限制的庫(kù)選自圖15中的一個(gè)或多個(gè)Vh1-69變體。
[0115]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N包含受限制的Vh基因區(qū)段庫(kù)的非人動(dòng)物，其中所述限制針對(duì)人源Vh1-2基因區(qū)段或與Vh1-2基因區(qū)段具有至少約94.9%、95.9%、96.9%,98%或99%同一性的￥111-2基因區(qū)段。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述受限制的庫(kù)選自圖18中的一個(gè)或多個(gè)Vh1-2變體。
[0116]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物是小鼠。
[0117]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠表現(xiàn)出具有與野生型小鼠相比更高的成熟B細(xì)胞與未成熟B細(xì)胞比率特征的免疫表型。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述比率根據(jù)從脾臟中收集的B細(xì)胞計(jì)算。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠表現(xiàn)出的成熟B細(xì)胞群為約lxlO7。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠表現(xiàn)出的未成熟B細(xì)胞群為約0.5xl07。在一個(gè)實(shí)施方式中,所述小鼠表現(xiàn)出在小鼠脾臟中的成熟B細(xì)胞與未成熟B細(xì)胞的比率比野生型小鼠顯示出的比率高約
1.5倍至約2倍。
[0118]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述比率根據(jù)從骨髓中收集的B細(xì)胞計(jì)算。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述小鼠表現(xiàn)出的成熟B細(xì)胞群為約3xl05。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠表現(xiàn)出的未成熟B細(xì)胞群為約7xl05。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠表現(xiàn)出在小鼠骨髓中的成熟B細(xì)胞與未成熟B細(xì)胞的比率比野生型小鼠顯示出的比率高約3倍或約3.3倍。
[0119]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠表現(xiàn)出具有與野生型小鼠相比骨髓中更高原B細(xì)胞數(shù)量的特征的免疫表型。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述小鼠表現(xiàn)出的小鼠骨髓中的原B細(xì)胞群與野生型小鼠骨髓中表現(xiàn)出的相比高約2.5倍至約3倍。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述小鼠表現(xiàn)出的小鼠骨髓中的原B細(xì)胞群與野生型小鼠骨髓中表現(xiàn)出的相比高約2.75倍。
[0120]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠表現(xiàn)出具有選自下組特征的免疫表型:約80%野生型B細(xì)胞的CD19+脾臟B細(xì)胞群、與野生型小鼠大致相同的CD3+脾臟T細(xì)胞群及其組合。 [0121]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠包含淋巴細(xì)胞群，其脾臟中⑶19+B細(xì)胞百分比大致與野生型小鼠相同。在一個(gè)實(shí)施方式中，每只小鼠脾臟中CD19+B細(xì)胞的數(shù)量為野生型小鼠脾臟中⑶19+B細(xì)胞數(shù)量的至少約50%。
[0122]在一個(gè)實(shí)施方式中，與野生型小鼠相比所述非人動(dòng)物在骨髓中包含至少約75%至約80%的CD19+B細(xì)胞。
[0123]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠股骨中CD19+骨髓細(xì)胞的總數(shù)不超過(guò)野生型小鼠中CD19+骨髓細(xì)胞總數(shù)的約30%、40%、50%、60%或75%。
[0124]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠表達(dá)的IgD和IgM與在野生型小鼠中觀察到的具有大致相同的水平。
[0125]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N包含受限制的人源Vh區(qū)段庫(kù)的小鼠，所述小鼠進(jìn)一步包含人源化的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)段基因座，其中在所述小鼠中表達(dá)的λ與K輕鏈的比率與在野生型小鼠中大致相同。
[0126]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N小鼠，所述小鼠包含受限制的免疫球蛋白重鏈基因座，其特征為存在單一 ％基因區(qū)段、一個(gè)或多個(gè)Dh基因區(qū)段以及一個(gè)或多個(gè)Jh基因區(qū)段，其中所述單一 Vh基因區(qū)段是多態(tài)性Vh基因區(qū)段。
[0127]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述多態(tài)性Vh基因區(qū)段是在人群中與較高拷貝數(shù)相關(guān)的人源Vh基因區(qū)段。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述人源Vh基因區(qū)段選自Vh1-2、Vh1-69、Vh2-26、Vh2-70、Vh3-23或其多態(tài)性變體。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述人源Vh基因區(qū)段是VHl-69基因區(qū)段。在另一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述人源Vh基因區(qū)段是VHl-2基因區(qū)段。
[0128]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述單一 Vh基因區(qū)段可操作地與人源、小鼠或人源/小鼠嵌合免疫球蛋白恒定區(qū)基因連接。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述免疫球蛋白恒定區(qū)基因是小鼠恒定區(qū)基因。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述免疫球蛋白恒定基因包含選自人源Ch1、人源鉸鏈、人源CH2、人源Ch3及其組合的人源序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠恒定基因位于內(nèi)源性免疫球蛋白重鏈基因座。
[0129]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠進(jìn)一步包含可操作地與J基因區(qū)段和輕鏈恒定基因連接的人源免疫球蛋白\基因區(qū)段。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述\基因區(qū)段和/或J基因區(qū)段選自人源K基因區(qū)段和人源λ基因區(qū)段。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述'和/或J基因區(qū)段是人源K基因區(qū)段。
[0130]在多種實(shí)施方式中，所述小鼠包含全部或基本上全部?jī)?nèi)源性Vh基因區(qū)段的缺失。
[0131]在多種實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物包含滅活的內(nèi)源性重鏈可變基因基因座。在多種實(shí)施方式中，所述滅活的內(nèi)源性重鏈可變基因基因座未可操作地與內(nèi)源性重鏈恒定區(qū)基因連接。
[0132]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N小鼠，其中所述小鼠的特征為表達(dá)血清免疫球蛋白，其中80%以上的血清免疫球蛋白包含人源重鏈可變結(jié)構(gòu)域和同源的人源輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，其中所述人源重鏈可變結(jié)構(gòu)域來(lái)源于基本上由單一人源Vh基因區(qū)段和/或其多態(tài)性變體組成的Vh基因區(qū)段庫(kù)。
[0133]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述單一人源￥11基因區(qū)段是人源￥111_69基因區(qū)段和/或其多態(tài)性變體。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述單一人源Vh基因區(qū)段是人源Vh1-2基因區(qū)段和/或其多態(tài)性變體。
[0134] 在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N小鼠，所述小鼠在其種系中包含用單一人源Vh基因區(qū)段和/或其多態(tài)性變體區(qū)段取代內(nèi)源性免疫球蛋白重鏈基因座的全部或基本上全部?jī)?nèi)源性Vh基因區(qū)段。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述單一人源Vh基因區(qū)段是人源Vh1-69基因區(qū)段和/或其多態(tài)性變體。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述單一人源Vh基因區(qū)段是人源Vh1-2基因區(qū)段和/或其多態(tài)性變體。
[0135]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠進(jìn)一步包含用一個(gè)或多個(gè)人源'基因區(qū)段取代內(nèi)源性免疫球蛋白輕鏈基因座的全部或基本上全部?jī)?nèi)源性'基因區(qū)段。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述小鼠進(jìn)一步包含可操作地與人源性\區(qū)段連接的一個(gè)或多個(gè)人源I基因區(qū)段。
[0136]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝巳绫旧暾?qǐng)所述的小鼠用于制備免疫球蛋白可變區(qū)核苷酸序列的用途。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述序列包含重排的VHl-69基因區(qū)段。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述序列包含重排的Vh1-2基因區(qū)段。
[0137]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述免疫球蛋白可變區(qū)核苷酸序列有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%與人源Vh1-69基因區(qū)段相同。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述免疫球蛋白可變區(qū)核苷酸序列有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%與SEQ IDNO:34相同。在不同實(shí)施方式中，所述人源VH1_69基因區(qū)段列于表2中。
[0138]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述免疫球蛋白可變區(qū)核苷酸序列編碼的氨基酸序列有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%與SEQ IDNO:35相同。
[0139]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述免疫球蛋白可變區(qū)核苷酸序列有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%與人源Vh1-2基因區(qū)段相同。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述免疫球蛋白可變區(qū)核苷酸序列有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%與SEQ IDNO:60相同。在不同實(shí)施方式中，所述人源VH1_2基因區(qū)段列于表3中。[0140]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述免疫球蛋白可變區(qū)核苷酸序列編碼的氨基酸序列有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%與SEQ ID NO:61相同。
[0141]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N如本申請(qǐng)所述的小鼠在制備全人Fab或全人F (ab) 2中的用途。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述全人Fab或全人F (ab) 2包含包括重排的人源Vh1-69基因區(qū)段的重鏈可變區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述全人Fab或全人F (ab) 2包含包括重排的人源Vh1-2基因區(qū)段的重鏈可變區(qū)。
[0142]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝耸褂萌绫旧暾?qǐng)所述的小鼠制備永生化細(xì)胞系的用途。
[0143]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝耸褂萌绫旧暾?qǐng)所述的小鼠制備雜交瘤或四價(jià)體瘤的用途。
[0144]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝耸褂萌绫旧?請(qǐng)所述的小鼠制備含有人源重鏈可變區(qū)和人源輕鏈可變區(qū)的噬菌體文庫(kù)的用途。
[0145]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述人源重鏈可變區(qū)來(lái)源于人源VH1_69基因區(qū)段，其包含選自下述的序列:SEQ ID NO:34,SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42,SEQID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ IDNO:56 和 SEQ ID NO:58。
[0146]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述人源重鏈可變區(qū)來(lái)源于人源VH1_69基因區(qū)段，其包含選自下述的序歹Ij:SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:39,SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43,SEQID NO:45, SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ IDNO:57 和 SEQ ID NO:59。
[0147]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述人源重鏈可變區(qū)均來(lái)源于人源￥111_2基因區(qū)段，其包含選自下述的序列:SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66 和 SEQ ID NO:68。
[0148]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述人源重鏈可變區(qū)來(lái)源于人源Vh1_2基因區(qū)段，其包含選自下述的序列:SEQ ID NO:6U SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67 和 SEQ ID NO:69。
[0149]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝巳绫旧暾?qǐng)所述的小鼠生成用于制備人源抗體的可變區(qū)序列的用途，包括(a)使用所關(guān)注的抗原免疫如本申請(qǐng)所述的小鼠，(b)從經(jīng)免疫的(a)中的小鼠分離淋巴細(xì)胞，(C)將淋巴細(xì)胞與一種或多種標(biāo)記抗體接觸，(d)鑒定能夠與所關(guān)注的抗原結(jié)合的淋巴細(xì)胞，以及(e)擴(kuò)增一個(gè)或多個(gè)來(lái)自于淋巴細(xì)胞的可變區(qū)核酸序列以產(chǎn)生可變區(qū)序列。
[0150]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述淋巴細(xì)胞來(lái)源于或分離自小鼠的脾臟。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述淋巴細(xì)胞來(lái)源于或分離自小鼠的淋巴結(jié)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述淋巴細(xì)胞來(lái)源于或分離自小鼠的骨髓。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述淋巴細(xì)胞來(lái)源于或分離自小鼠的血液。
[0151]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述標(biāo)記抗體是熒光團(tuán)偶聯(lián)的抗體。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述一種或多種熒光團(tuán)偶聯(lián)的抗體選自IgM、IgG和/或其組合。
[0152]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述淋巴細(xì)胞是B細(xì)胞。
[0153]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述一個(gè)或多個(gè)可變區(qū)核酸序列包含重鏈可變區(qū)序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述一個(gè)或多個(gè)可變區(qū)核酸序列包含輕鏈可變區(qū)序列。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述輕鏈可變區(qū)序列是免疫球蛋白K輕鏈可變區(qū)序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述一個(gè)或多個(gè)可變區(qū)核酸序列包含重鏈和K輕鏈可變區(qū)序列。
[0154]在一個(gè)實(shí)施方式中，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N如本申請(qǐng)所述的小鼠生成用于制備人源抗體的重鏈和K輕鏈可變區(qū)序列的用途，包括(a)使用所關(guān)注的抗原免疫如本申請(qǐng)所述的小鼠，(b)從經(jīng)免疫的(a)中的小鼠分離脾臟，(C)將來(lái)自于脾臟的B淋巴細(xì)胞與一種或多種標(biāo)記的抗體接觸，(d)鑒定(C)中能夠與所關(guān)注的抗原結(jié)合的B淋巴細(xì)胞，以及(e)從B淋巴細(xì)胞中擴(kuò)增重鏈可變區(qū)核酸序列和K輕鏈可變區(qū)核酸序列以產(chǎn)生重鏈和K輕鏈可變區(qū)序列。
[0155]在一個(gè)實(shí)施方式中，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N如本申請(qǐng)所述的小鼠生成用于制備人源抗體的重鏈和K輕鏈可變區(qū)序列的用途，包括(a)使用所關(guān)注的抗原免疫如本申請(qǐng)所述的小鼠，(b)從經(jīng)免疫的(a)中的小鼠分離一個(gè)或多個(gè)淋巴結(jié)，將來(lái)自于B淋巴細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)淋巴結(jié)與一種或多種標(biāo)記的抗體接觸，鑒定(C)中能夠與所關(guān)注的抗原結(jié)合的B淋巴細(xì)胞，以及(e)從B淋巴細(xì)胞中擴(kuò)增重鏈可變區(qū)核酸序列和K輕鏈可變區(qū)核酸序列以產(chǎn)生重鏈和K輕鏈可變區(qū)序列。
[0156]在一個(gè)實(shí)施方式中，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N如本申請(qǐng)所述的小鼠生成用于制備人源抗體的重鏈和K輕鏈可變區(qū)序列的用途，包括(a)使用所關(guān)注的抗原免疫如本申請(qǐng)所述的小鼠，(b)從經(jīng)免疫的(a)中的小鼠分離骨髓，(C)將來(lái)自于骨髓的B淋巴細(xì)胞與一種或多種標(biāo)記的抗體接觸，(d)鑒定(C)中能夠與所關(guān)注的抗原結(jié)合的B淋巴細(xì)胞，以及(e)從B淋巴細(xì)胞中擴(kuò)增重鏈可變區(qū)核酸序列和K輕鏈可變區(qū)核酸序列以產(chǎn)生重鏈和K輕鏈可變區(qū)序列。在不同實(shí)施方式中，所述一種或多種標(biāo)記的抗體選自IgM、IgG和/或其組合。
[0157]在多種實(shí)施方式中，所關(guān)注的抗原是危害人主體的病原體包括例如病毒抗原。示例性病毒病原體包括例如主要是腺病毒、細(xì)菌小核糖核酸病毒、皰疹病毒、肝脫氧核糖核酸病毒、黃病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、正粘病毒、副粘病毒、乳多空病毒、多瘤病毒、彈狀病毒和披膜病毒家族的病原體。這些示例性病毒通常的長(zhǎng)度范圍為20-300納米。在多種實(shí)施方式中，所關(guān)注的抗原是選自肝炎 病毒(例如HCV、HBV等)、人免疫缺陷病毒(HIV)或流感病毒(例如H1N1)的病毒抗原。
[0158]在多種實(shí)施方式中，本申請(qǐng)?zhí)峁┝巳绫旧暾?qǐng)所述的小鼠生成用于人源抗體的重鏈和K輕鏈可變區(qū)序列的用途，其進(jìn)一步包括將經(jīng)擴(kuò)增的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列與人源重鏈和輕鏈恒定區(qū)序列融合，在細(xì)胞中表達(dá)融合的重鏈和輕鏈序列，并且回收所表達(dá)的重鏈和輕鏈序列以生成人源抗體。
[0159]在多種實(shí)施方式中，所述人源重鏈恒定區(qū)選自IgM、IgD、IgA、IgE和IgG。在多種的特定實(shí)施方式中，所述IgG選自IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。在多種實(shí)施方式中，所述人源重鏈恒定區(qū)包含CH1、鉸鏈、Ch2、Ch3、Ch4或其組合。在多種實(shí)施方式中，所述重鏈恒定區(qū)是免疫球蛋白K恒定區(qū)。在多種實(shí)施方式中，所述細(xì)胞選自HeLa細(xì)胞、DU145細(xì)胞、Lncap細(xì)胞、MCF-7 細(xì)胞、MDA-MB-438 細(xì)胞、PC3 細(xì)胞、T47D 細(xì)胞、THP-1 細(xì)胞、U87 細(xì)胞、SHSY5Y (人神經(jīng)母細(xì)胞瘤)細(xì)胞、Saos-2細(xì)胞、Vero細(xì)胞、CHO細(xì)胞、GH3細(xì)胞、PC12細(xì)胞、人視網(wǎng)膜細(xì)胞(例如PER.C6?細(xì)胞)和MC3T3細(xì)胞。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是CHO細(xì)胞。
[0160]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N生成特異性針對(duì)所關(guān)注抗原的反向嵌合嚙齒動(dòng)物-人源抗體的方法，所述方法包括步驟:使用所述抗原免疫如本申請(qǐng)所述的小鼠，從針對(duì)所關(guān)注抗原生成特異性反向嵌合小鼠-人源抗體的小鼠中分離至少一個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)針對(duì)所關(guān)注抗原生成特異性反向嵌合小鼠-人源抗體的至少一個(gè)細(xì)胞，以及獲得所述抗體。
[0161]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述反向-嵌合小鼠-人源抗體包含與小鼠或大鼠重鏈恒定基因融合的人源重鏈可變結(jié)構(gòu)域，以及與小鼠或大鼠或人源輕鏈恒定基因融合的人源輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述人源重鏈可變結(jié)構(gòu)域含有重排的人源Vh1-69或人源VHl-2基因區(qū)段。
[0162]在一個(gè)實(shí)施方式中，對(duì)至少一個(gè)針對(duì)所關(guān)注抗原生成特異性反向嵌合哨齒動(dòng)物-人源抗體的細(xì)胞的培養(yǎng)是針對(duì)從小鼠分離的至少一個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生的至少一個(gè)雜交瘤細(xì)胞上進(jìn)行。
[0163]在一個(gè)實(shí)施方式中，所關(guān)注的抗原是如本申請(qǐng)所述的危害人主體的病原體。
[0164]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N用于產(chǎn)生特異性針對(duì)所關(guān)注抗原的全人源抗體的方法，所述方法包括步驟:使用所述抗原免疫如本申請(qǐng)所述的小鼠，從產(chǎn)生特異性針對(duì)所述抗原的反向嵌合嚙齒動(dòng)物-人源抗體的小鼠中分離至少一個(gè)細(xì)胞，產(chǎn)生至少一個(gè)生產(chǎn)來(lái)源于特異性針對(duì)所述抗原的反向-嵌合嚙齒動(dòng)物-人源抗體的全人源抗體的細(xì)胞，并且培養(yǎng)至少一個(gè)生產(chǎn)所述全人源抗體的細(xì)胞，以及獲得所述全人源抗體。
[0165]在多種實(shí)施方式中，分離自針對(duì)所述抗原生成特異性反向-嵌合嚙齒動(dòng)物-人源抗體的小鼠的至少一個(gè)細(xì)胞是脾細(xì)胞或B細(xì)胞。
[0166]在多種實(shí)施方式中，所述抗體是單克隆抗體。
[0167]在多種實(shí)施方式中，所述抗體包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域，其含有重排的人源Vh1_69或人源VHl-2基因區(qū)段。
[0168]在多種實(shí)施方式中，針對(duì)所關(guān)注抗原實(shí)施的免疫是使用蛋白、DNA、DNA和蛋白的組合或者表達(dá)所述抗原的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，所關(guān)注的抗原是如本申請(qǐng)所述的危害人主體的病原體。
[0169]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N如本申請(qǐng)所述的小鼠用于制備編碼免疫球蛋白可變區(qū)或其片段的核酸序列的用途。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述核酸序列用于制備人源抗體或其抗原結(jié)合片段。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠用于制備選自下述的抗原結(jié)合蛋白:抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、scFv、雙特異性scFv、二體、三體、四體、V-NAR、Vhh、'、F(ab)、F(ab)2、DVD(即雙可變結(jié)構(gòu)域抗原結(jié)合蛋白)、SVD(即單可變結(jié)構(gòu)域抗原結(jié)合蛋白)或者雙特異性T細(xì)胞卡合體(BiTE)。
[0170]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N制備人源抗原-結(jié)合蛋白的方法，所述方法包括將如本申請(qǐng)所述的基因修飾的非人動(dòng)物與所關(guān)注的抗原接觸，使得所述基因修飾的非人動(dòng)物對(duì)所述抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答，從所述基因修飾的非人動(dòng)物獲得編碼與所關(guān)注的抗原特異性結(jié)合的人源重鏈可變結(jié)構(gòu)域的重鏈可變結(jié)構(gòu)域核酸序列，將所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域核酸序列克隆至人源恒定區(qū)序列，并且在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)包含人源重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列和人源恒定區(qū)序列的抗體。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞是CHO細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述基因修飾的非人動(dòng)物包含人源Vh基因區(qū)段庫(kù)，其基本上由單一人源Vh基因區(qū)段組成，其任選地以其兩種或多種多態(tài)性變體形式存在，其可操作地與一個(gè)或多個(gè)人源D和/或J區(qū)段連接。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述人源Vh基因區(qū)段庫(kù)在內(nèi)源性非人源Vh區(qū)段基因座。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述人源Vh基因區(qū)段庫(kù)在不是內(nèi)源性VHg段基因座的基因座。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述人源Vh基因區(qū)段與人源D區(qū)段和人源J區(qū)段重排以形成可操作地與恒定區(qū)序列連接的重排的人源VDJ基因，其中所述恒定區(qū)序列選自人源序列和嚙齒動(dòng)物序列(例如小鼠或大鼠或倉(cāng)鼠序列)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述恒定區(qū)序列包含選自CH1、鉸鏈、Ch2、CH3及其組合的序列；在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述恒定區(qū)序列包含(^1、鉸鏈、(^和^。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述人源可變結(jié)構(gòu)域和所述恒定序列在具有同源人源輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的來(lái)自同一小鼠的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)(例如來(lái)自與人源可變結(jié)構(gòu)域序列相同的B細(xì)胞的序列)；在一個(gè)實(shí)施方式中，然后將從小鼠中獲得的編碼人源輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的序列與編碼人源輕鏈恒定序列的序列融合，并且在所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)所述輕鏈序列和所述重鏈序列。
[0171]在一個(gè)實(shí)施方式中，所關(guān)注的抗原是如本申請(qǐng)所述的危害人主體的病原體。
[0172]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N用于制備與所關(guān)注的抗原結(jié)合的抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域的方法，所述方法包括在單一細(xì)胞中表達(dá)(a)經(jīng)過(guò)免疫的如本申請(qǐng)所述的非人動(dòng)物的第一 Vh序列，其中所述第一 Vh序列與Ch基因序列融合；以及(b)經(jīng)過(guò)免疫的如本申請(qǐng)所述的非人動(dòng)物的'基因序列，其中所述'基因序列與人源Q基因序列融合；將所述細(xì)胞維持在足以表達(dá)抗體的條件下；并且分離所述抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述Vl基因與所述第一 Vh序列是同源的。
[0173]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞包含經(jīng)過(guò)免疫的如本申請(qǐng)所述的非人動(dòng)物的第二 Vh基因序列，其中所述第二 Vh基因序列與Ch基因序列融合，其中所述第一 Vh基因序列編碼特異性結(jié)合第一表位的Vh結(jié)構(gòu)域，以及所述第二 Vh基因序列編碼特異性結(jié)合第二表位的Vh結(jié)構(gòu)域，其中所述第一表位和所述第二表位是不同的。
[0174]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述恒定區(qū)序列均是人源恒定區(qū)序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，所關(guān)注的抗原是如本申請(qǐng)所述的危害人主體的病原體。
[0175]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N制備人源雙特異性抗體的方法，包括使用如本申請(qǐng)所述非人動(dòng)物B細(xì)胞的 人源可變區(qū)基因序列制備所述雙特異性抗體。
[0176]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法包括(a)鑒定所述非人動(dòng)物克隆選定的淋巴細(xì)胞，其中所述非人動(dòng)物己經(jīng)與所關(guān)注的抗原接觸并且己出現(xiàn)針對(duì)所關(guān)注抗原的免疫應(yīng)答，并且其中所述淋巴細(xì)胞表達(dá)與所關(guān)注抗原特異性結(jié)合的抗體，(b)從所述淋巴細(xì)胞或抗體獲得編碼與所關(guān)注抗原特異性結(jié)合的人源重鏈可變區(qū)的核苷酸序列，以及(C)在制備雙特異性抗體中引入編碼與所關(guān)注抗原特異性結(jié)合的人源重鏈可變區(qū)的核苷酸序列。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述人源重鏈可變區(qū)包含重排的Vh1-2或Vh1-69基因區(qū)段。
[0177]在一個(gè)實(shí)施方式中，步驟(a)至(C)在第一時(shí)間用于第一所關(guān)注抗原以生成第一人源重鏈可變區(qū)序列，和步驟(a)至(C)在第二時(shí)間用于第二所關(guān)注抗原以生成第二人源重鏈可變區(qū)序列，并且其中所述第一重鏈可變區(qū)序列與第一人源重鏈恒定區(qū)融合表達(dá)以形成第一人源重鏈，所述第二人源重鏈可變區(qū)序列與第二人源重鏈恒定區(qū)融合表達(dá)以形成第二人源重鏈，其中所述第一和第二人源重鏈在由重排的人源Vk 1-39或人源Vk 3-20基因區(qū)段表達(dá)的單一人源輕鏈存在時(shí)表達(dá)。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述單一人源輕鏈包含種系序列。
[0178]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法包括(a)從己經(jīng)與所關(guān)注的第一抗原接觸的如本申請(qǐng)所述的非人動(dòng)物，以及從己經(jīng)與所關(guān)注的第二抗原接觸的同一非人動(dòng)物或者基因相同的不同非人動(dòng)物的B細(xì)胞中克隆重鏈可變區(qū)；以及(b)在細(xì)胞中表達(dá)具有相同重鏈恒定區(qū)的(a)的重鏈可變區(qū)以及相同的輕鏈以制備雙特異性抗體。
[0179]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝巳绫旧暾?qǐng)所述的非人動(dòng)物用于獲得編碼人源重鏈可變結(jié)構(gòu)域的核酸序列的用途。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含選自VHl-2和Vh1-69的重排的人源Vh基因區(qū)段。
[0180]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝巳绫旧暾?qǐng)所述的非人動(dòng)物用于獲得編碼人源重鏈可變結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞的用途。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含選自￥111-2和￥111-69的重排的人源Vh基因區(qū)段。
[0181]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝巳绫旧暾?qǐng)所述的非人動(dòng)物用于制備人源抗體可變結(jié)構(gòu)域的用途。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述可變結(jié)構(gòu)域包含選自Vh1-2和Vh1-69的重排的人源Vh基因區(qū)段。
[0182]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝巳绫旧暾?qǐng)所述的非人動(dòng)物用于制備人源抗體的用途，包括使用如本申請(qǐng)所述的非人動(dòng)物B細(xì)胞中的人源可變區(qū)基因序列制備所述抗體。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述人源抗體是人源雙特異性抗體。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述雙特異性抗體包含來(lái)源于重排的人源Vh1-2或Vh1-69基因區(qū)段的一個(gè)重鏈可變結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述人源可變區(qū)基因序列包含重排的人源VHl-2或VHl-69基因區(qū)段。
[0183]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝巳绫旧暾?qǐng)所述的非人動(dòng)物用于選擇人源免疫球蛋白重鏈可變結(jié)構(gòu)域的用途。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含選自￥111-2和￥111-69的重排的人源Vh基因區(qū)段。 [0184]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝巳绫旧暾?qǐng)所述的小鼠用于制備治療人類(lèi)疾病或病變的藥物(例如抗原結(jié)合蛋白)或用于制備編碼藥物(例如抗原結(jié)合蛋白)可變序列的序列的用途。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述藥物的可變序列包含多態(tài)性人源Vh基因區(qū)段。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述藥物的可變序列包含人源VHl-69基因區(qū)段。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述藥物的可變序列包含人源Vh1-2基因區(qū)段。
[0185]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝司幋a在如本申請(qǐng)所述的小鼠中制備的免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的核酸構(gòu)建體。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述可變結(jié)構(gòu)域是重鏈可變結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含選自Vh1-2、Vh1-69、Vh2-26、Vh2-70 *Vh3-23的重排的人源％基因區(qū)段。在另一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含重排的人源Vh1-2基因區(qū)段。在另一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含重排的人源Vh1-69基因區(qū)段。
[0186]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述可變結(jié)構(gòu)域是輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述可變結(jié)構(gòu)域是K輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，其與包含重排的人源￥111-69基因區(qū)段的人源重鏈可變結(jié)構(gòu)域具有同源性。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述可變結(jié)構(gòu)域是K輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，其與包含重排的人源Vh1-2基因區(qū)段的人源重鏈可變結(jié)構(gòu)域具有同源性。
[0187]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝巳绫旧暾?qǐng)所述的小鼠用于制備編碼人源免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的核酸構(gòu)建體的用途。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述可變結(jié)構(gòu)域是輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述可變結(jié)構(gòu)域是K輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，其包含選自下述的重排的人源Vk 基因區(qū)段:V K 4-1、V K 5-2, Vk 7-3, Vk 2-4, Vk 1-5, Vk 1-6, Vk 3-7, Vk 1-8, Vk 1-9、Vk 2-10、Vk 3-11, Vk 1-12、Vk 卜13、Vk 2-14, Vk 3-15, Vk 1-16、Vk 卜 17、Vk 2-18,Vk 2-19、Vk 3-20、Vk 6-21、Vk 卜22、Vk 卜23、Vk 2-24、Vk 3-25、Vk 2-26、Vk 卜27、Vk 2-28、Vk 2-29、Vk 2-30、Vk 3-31、Vk 卜32、Vk 卜33、Vk 3-34、Vk 1-35, Vk 2-36、
VK 1-37、V K 2-38、V κ 1-39 和 V κ 2-40 ?[0188]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述可變結(jié)構(gòu)域是重鏈可變結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含選自Vh1-2、Vh1-69, Vh2-26、Vh2_70或VH3_23的重排的人源Vh基因區(qū)段。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含重排的人源Vh1-69基因區(qū)段。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含重排的人源Vh1-2基因區(qū)段。
[0189]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝巳绫旧暾?qǐng)所述的小鼠用于制備人源免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的用途。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述可變結(jié)構(gòu)域是輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述可變結(jié)構(gòu)域是κ輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，其包含選自下述的重排的人源Vk基因區(qū)段:V κ 4-1、Vk 5-2、Vk 7-3, Vk 2-4, Vk 1-5、Vk 1-6、Vk 3-7, Vk 1-8、Vk 1-9、Vk 2-10,Vk 3-11、Vk 卜12、Vk 1-13、Vk 2-14, Vk 3-15, Vk 1-16、Vk 卜 17、Vk 2-18, Vk 2-19,Vk 3-20、Vk 6-21、Vk 1-22, Vk 卜23、Vk 2-24、Vk 3-25、Vk 2-26、Vk 卜27、Vk 2-28、Vk 2-29、Vk 2-30、Vk 3-31、Vk 1-32, Vk 卜33、Vk 3-34、Vk 1-35, Vk 2-36、Vk 卜37、
Vκ 2-38、V κ 1-39 和 V κ 2-40 ?
[0190]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述可變結(jié)構(gòu)域是重鏈可變結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含選自Vh1-2、Vh1-69, Vh2-26、Vh2_70或VH3_23的重排的人源Vh基因區(qū)段。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含重排的人源Vh1-69基因區(qū)段。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含重排的人源Vh1-2基因區(qū)段。
[0191]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝耸褂萌绫旧暾?qǐng)所述的非人動(dòng)物制備編碼人源重鏈可變結(jié)構(gòu)域的核酸序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述人源重鏈可變結(jié)構(gòu)域的特征為具有來(lái)源于多態(tài)性人源Vh基因區(qū)段的人源FRl-⑶R1-FR2-⑶R2-FR3序列。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述人源Vh基因區(qū)段選自人源 Vh1-2、Vh1-69、Vh2-26、Vh2_70或VH3_23基因區(qū)段。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述人源Vh基因區(qū)段是人源Vh1-69基因區(qū)段。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述人源Vh基因區(qū)段是VH1_2基因區(qū)段。
[0192]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N制備編碼人源Vh結(jié)構(gòu)域的核酸序列的方法，所述方法包括使用所關(guān)注的抗原免疫如本申請(qǐng)所述的非人動(dòng)物，使所述非人動(dòng)物對(duì)所關(guān)注的抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答，并且從中獲得編碼與所關(guān)注抗原結(jié)合的人源Vh結(jié)構(gòu)域的核酸序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括制備與人源Vh結(jié)構(gòu)域具有同源性的編碼人源\結(jié)構(gòu)域的核酸序列，包括分離編碼人源Vh結(jié)構(gòu)域和人源\結(jié)構(gòu)域的B細(xì)胞，并且從中獲得重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的序列。在不同實(shí)施方式中，所述人源Vh結(jié)構(gòu)域來(lái)源于重排的人源Vh1-69或人源Vh1-2基因區(qū)段。在不同實(shí)施方式中，所述人源八結(jié)構(gòu)域選自人源Vk或人源νλ結(jié)構(gòu)域。
[0193]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝巳绫旧暾?qǐng)所述的非人動(dòng)物用于制備人用治療劑的用途，包括使用所關(guān)注的抗原免疫非人動(dòng)物，使所述非人動(dòng)物產(chǎn)生免疫應(yīng)答，從所述動(dòng)物中獲得編碼與所關(guān)注的抗原結(jié)合的免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的核酸序列，以及將所述免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域引入人用治療劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述可變結(jié)構(gòu)域是重鏈可變結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域來(lái)源于重排的人源Vh1-69或人源Vh1-2基因區(qū)段。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述可變結(jié)構(gòu)域是輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述輕鏈可變結(jié)構(gòu)域來(lái)源于重排的人源Vκ或人源Vλ基因區(qū)段。
[0194]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N制備人用治療劑的方法，包括使用所關(guān)注的抗原免疫如本申請(qǐng)所述的非人動(dòng)物，使所述非人動(dòng)物產(chǎn)生免疫應(yīng)答，從所述動(dòng)物獲得編碼與所關(guān)注抗原結(jié)合的免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的核酸序列，以及將所述免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域引入人用治療劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述可變結(jié)構(gòu)域是重鏈可變結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域來(lái)源于重排的人源νΗ1-69或人源νΗ1-2基因區(qū)段。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述可變結(jié)構(gòu)域是輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述輕鏈可變結(jié)構(gòu)域來(lái)源于重排的人源Vκ或人源Vλ基因區(qū)段。
[0195]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N制備人源抗原結(jié)合蛋白的方法，所述方法包括使用所關(guān)注的抗原免疫如本申請(qǐng)所述的非人動(dòng)物，使所述動(dòng)物產(chǎn)生免疫應(yīng)答，獲得編碼與所關(guān)注抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的小鼠核酸序列，在適于表達(dá)所述核酸的載體中克隆所述核酸序列，其中將所述核酸序列克隆至具有編碼人源免疫球蛋白恒定區(qū)或其功能性片段的核酸序列的框架中，將所述載體引入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，并且將細(xì)胞維持在適于表達(dá)包含免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域和免疫球蛋白恒定區(qū)或其功能性片段的抗原結(jié)合蛋白的條件下。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述抗原結(jié)合蛋白是人源抗體。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述抗體包含來(lái)源于如本申請(qǐng)所述小鼠的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述抗體包含來(lái)源于如本申請(qǐng)所述小鼠的重鏈可變結(jié)構(gòu)域。在不同實(shí)施方式中，所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域來(lái)源于重排的人源Vh1-69或人源Vh1-2基因區(qū)段。
[0196]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝嗽谌绫旧暾?qǐng)所述的非人動(dòng)物中制備的編碼人源抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核酸序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述核酸序列編碼人源免疫球蛋白Vh結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述核酸序列編碼人源免疫球蛋白Vh結(jié)構(gòu)域以及同源的人源\結(jié)構(gòu)域。在不同實(shí)施方式中，所述人源Vh結(jié)構(gòu)域來(lái)源于重排的人源Vh1-69或人源Vh1-2基因區(qū)段。
[0197] 在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N制備人源抗體的方法，所述方法包括使用所關(guān)注的抗原免疫如本申請(qǐng)所述的非人動(dòng)物，使所述非人動(dòng)物產(chǎn)生免疫應(yīng)答，從免疫的動(dòng)物中收集淋巴細(xì)胞(例如B細(xì)胞)，將所述淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合以形成雜交瘤細(xì)胞，從雜交瘤細(xì)胞中獲得編碼人源Vh結(jié)構(gòu)域和人源\結(jié)構(gòu)域的核酸序列，將所述核酸序列克隆至具有人源恒定區(qū)序列的框架中(即在可操作的鍵中)以形成免疫球蛋白重鏈和免疫球蛋白輕鏈，并且在能夠表達(dá)全人抗體的細(xì)胞中表達(dá)所述重鏈和輕鏈。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是CHO細(xì)胞。在不同實(shí)施方式中，所述人源Vh結(jié)構(gòu)域來(lái)源于重排的人源Vh1-69基因區(qū)段或人源VHl-2基因區(qū)段。
[0198]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N制備人源抗體的方法，所述方法包括使用所關(guān)注的抗原免疫如本申請(qǐng)所述的非人動(dòng)物，使所述非人動(dòng)物產(chǎn)生免疫應(yīng)答，從免疫的動(dòng)物中收集淋巴細(xì)胞(例如B細(xì)胞)，從淋巴細(xì)胞獲得編碼人源Vh結(jié)構(gòu)域和人源\結(jié)構(gòu)域的核酸序列，將所述核酸序列克隆至具有人源恒定區(qū)序列的框架中(即在可操作的鍵中)以形成免疫球蛋白重鏈和免疫球蛋白輕鏈，并且在能夠表達(dá)全人抗體的細(xì)胞中表達(dá)所述重鏈和輕鏈。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述淋巴細(xì)胞來(lái)源于所述非人動(dòng)物的脾臟。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是CHO細(xì)胞。在不同實(shí)施方式中，所述人源Vh結(jié)構(gòu)域來(lái)源于重排的人源Vh1-69基因區(qū)段或人源VH1_2基因區(qū)段。
[0199]在不同的方面，所關(guān)注的抗原是如本申請(qǐng)所述的危害人主體的病原體。在不同的方面，所關(guān)注的抗原是能夠感染人的病毒。能夠在本申請(qǐng)所述的方法和用途中使用的示例性抗原包括微生物如病毒、細(xì)菌、朊病毒或真菌或者在人體內(nèi)導(dǎo)致疾病的任意其他病原體。本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀了本公開(kāi)后將知曉將適用于本申請(qǐng)所述的方法和用途的那些人病原體。除非明確指出或者上下文明確禁止一同使用，否則能夠?qū)⒉煌姆矫婧蛯?shí)施方式一同使用。
[0200]附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明
[0201]圖1為構(gòu)建具有經(jīng)修飾的重鏈基因座的靶向載體的靶向和分子改造的一系列步驟的未按照比例的通用圖示，，所述經(jīng)修飾的重鏈基因座在內(nèi)源性免疫球蛋白重鏈基因座含有單一人源Vh1-69基因區(qū)段、27個(gè)人源Dh和6個(gè)人源Jh基因區(qū)段。
[0202]圖2為構(gòu)建具有經(jīng)修飾的重鏈基因座的靶向載體的靶向和分子改造步驟的未按照比例的通用圖示，所述經(jīng)修飾的重鏈基因座在內(nèi)源性免疫球蛋白重鏈基因座含有單一人源Vh1-2基因區(qū)段、27個(gè)人源Dh和6個(gè)人源Jh基因區(qū)段。
[0203]圖3顯示了對(duì)來(lái)自野生型小鼠(WT)和針對(duì)在內(nèi)源性免疫球蛋白重鏈基因座的單一人源Vh基因區(qū)段、27個(gè)人源D1^Pe個(gè)人源Jh基因區(qū)段為純合子的小鼠(IhV11HO)的脾細(xì)胞門(mén)控單一淋巴細(xì)胞以及CD19 (B細(xì)胞)和CD3(T細(xì)胞)染色的等值線圖。
[0204]圖4A中的左圖顯示了從野生型小鼠(WT)和針對(duì)在內(nèi)源性免疫球蛋白重鏈基因座的單一人源Vh基因區(qū)段、27個(gè)人源D1^Pe個(gè)人源Jh基因區(qū)段為純合子的小鼠(IhV11HO)的脾臟中收集的CD19+B細(xì)胞的百分率。右圖顯示了野生型小鼠(WT)和針對(duì)在內(nèi)源性免疫球蛋白重鏈基因座的單一人源Vh基因區(qū)段、27個(gè)人源Dh和6個(gè)人源Jh基因區(qū)段為純合子的小鼠(lhVH HO)的各脾臟的CD19+B細(xì)胞數(shù)量。
[0205]圖4B中的左圖顯示了從野生型小鼠(WT)和針對(duì)在內(nèi)源性免疫球蛋白重鏈基因座的單一人源Vh基因區(qū) 段、27個(gè)人源D1^Pe個(gè)人源Jh基因區(qū)段為純合子的小鼠(IhV11HO)的骨髓中收集的CD19+B細(xì)胞的百分率。右圖顯示了野生型小鼠(WT)和針對(duì)在內(nèi)源性免疫球蛋白重鏈基因座的單一人源Vh基因區(qū)段、27個(gè)人源Dh和6個(gè)人源Jh基因區(qū)段為純合子的小鼠(lhVH HO)各股骨的CD19+B細(xì)胞數(shù)量。
[0206]圖5顯示了對(duì)來(lái)自野生型小鼠(WT)和針對(duì)在內(nèi)源性免疫球蛋白重鏈基因座的單一人源Vh基因區(qū)段、27個(gè)人源D1^Pe個(gè)人源Jh基因區(qū)段為純合子的小鼠(IhV11HO)的脾細(xì)胞門(mén)控⑶19+B細(xì)胞以及針對(duì)Ig λ +和Ig κ +表達(dá)染色的等值線圖。
[0207]圖6顯示了對(duì)來(lái)自野生型小鼠(WT)和針對(duì)在內(nèi)源性免疫球蛋白重鏈基因座的單一人源Vh基因區(qū)段、27個(gè)人源D1^Pe個(gè)人源Jh基因區(qū)段為純合子的小鼠(IhV11HO)的脾細(xì)胞門(mén)控CD19+B細(xì)胞以及針對(duì)免疫球蛋白D(IgD)和免疫球蛋白M(IgM)染色的等值線圖。
[0208]圖7顯示了從野生型小鼠(WT)和針對(duì)在內(nèi)源性免疫球蛋白重鏈基因座(的單一人源Vh基因區(qū)段、27個(gè)人源Dh和6個(gè)人源Jh基因區(qū)段為純合子的小鼠IhV11 HO)的脾臟中收集的過(guò)渡性B細(xì)胞(CD19+IgMhiIgDint)、成熟B細(xì)胞(CD19+IgMintIgDhi)的總數(shù)，以及成熟與未成熟B細(xì)胞的比率。
[0209]圖8顯示了對(duì)來(lái)自野生型小鼠(WT)和針對(duì)在內(nèi)源性免疫球蛋白重鏈基因座的單一人源Vh基因區(qū)段、27個(gè)人源D1^Pe個(gè)人源Jh基因區(qū)段為純合子的小鼠(IhV11HO)的免疫球蛋白M(IgM)和B220染色的骨髓門(mén)控單峰的等值線圖。
[0210]圖9顯示了從野生型小鼠(WT)和針對(duì)在內(nèi)源性免疫球蛋白重鏈基因座的單一人源％基因區(qū)段、27個(gè)人源D1^pe個(gè)人源Jh基因區(qū)段為純合子的小鼠(IhV11HO)的股骨分離的骨髓中未成熟(B220intIgM+)和成熟(B220hiIgM+)B細(xì)胞的總數(shù)。[0211]圖10顯示了對(duì)來(lái)自野生型小鼠(WT)和針對(duì)在內(nèi)源性免疫球蛋白重鏈基因座的單一人源Vh基因區(qū)段、27個(gè)人源D1^Pe個(gè)人源Jh基因區(qū)段為純合子的小鼠(IhV11HO)的骨髓門(mén)控⑶19+B細(xì)胞以及ckit+和⑶43+染色的等值線圖。
[0212]圖1lA顯示了在從野生型小鼠(WT)和針對(duì)在內(nèi)源性免疫球蛋白重鏈基因座的單一人源Vh基因區(qū)段、27個(gè)人源D1^Pe個(gè)人源Jh基因區(qū)段為純合子的小鼠(IhV11HO)收集的骨髓中原B(CD19+CD43+ckit+)和前B (CD19+CD43-ckit_)細(xì)胞群中CD19+細(xì)胞的百分率。
[0213]圖1lB顯示了在從野生型小鼠(WT)和針對(duì)在內(nèi)源性免疫球蛋白重鏈基因座(lhVHHO)的單一人源Vh基因區(qū)段、27個(gè)人源D1^P 6個(gè)人源Jh基因區(qū)段為純合子的小鼠收集的骨髓中原B(CD19+CD43 +ckit+)和前B (CD19+CD43-ckit_)細(xì)胞群中各股骨的絕對(duì)細(xì)胞數(shù)。
[0214]圖12顯示了在使用人源Vh、Dh、Jh、Vk和Jk基因區(qū)段(HO取代內(nèi)源性重鏈VH、DH、Jh和區(qū)段內(nèi)源性輕鏈V κ和Jk基因區(qū)段為純合子的小鼠，野生型小鼠(WT)，在內(nèi)源性免疫球蛋白重鏈基因座針對(duì)單一人源Vh基因區(qū)段、27個(gè)人源Dh和6個(gè)人源Jh基因區(qū)段的小鼠雜合子(IhV11HET)以及在內(nèi)源性免疫球蛋白重鏈基因座針對(duì)單一人源Vh基因區(qū)段、27個(gè)人源Dh和6個(gè)人源Jh基因區(qū)段為純合子的小鼠(IhV11HO)中使用特異性針對(duì)人源Vh1-69基因區(qū)段的探針在定量PCR檢測(cè)中測(cè)定的經(jīng)純化的脾臟B細(xì)胞的來(lái)源于Vh1-69的重鏈相對(duì)mRNA的表達(dá)情況(y-軸)。將信號(hào)歸一化至小鼠C κ的表達(dá)情況。
[0215]圖13顯示了人源VH1_69基因中13個(gè)己報(bào)道的等位基因各第二外顯子的核苷酸比對(duì)情況。小與喊基表不在等位基因之間的種系核昔酸差異。序列中的框表不互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)。虛線表示針對(duì)正確序列比對(duì)的人工缺口。VH1-69*01 (SEQ IDNO:34) ;VH1_69*02 (SEQID NO:36) ;Vh1-69*03(SEQ ID NO:38) ;VH1_69*04(SEQ ID NO:40) ;VH1_69*05(SEQ IDNO:42) ;Vh1-69*06(SEQ ID NO:44) ;VH1_69*07(SEQ ID NO:46) ;VH1_69*08(SEQ ID NO:48) ;Vh1-69*09(SEQ ID NO:50) ;VH1_69*10 (SEQ ID NO:52) ;VH1_69*11 (SEQ ID NO:54)；Vh1-69*12 (SEQ ID NO:56) ;VH1_69*13 (SEQ ID NO:58)。
[0216]圖14顯示了人源VH1_69基因中13個(gè)己報(bào)道的等位基因各成熟重鏈可變基因序列的蛋白比對(duì)情況。小寫(xiě)氨基酸表示在等位基因之間的種系差異。序列中的框表示互補(bǔ)性決定區(qū)(⑶R)。虛線表示針對(duì)正確序列比對(duì)的人工缺口。Vh1-69*01(SEQID NO:35) ;Vh1-69*02(SEQ ID NO:37) ;VH1_69*03 (SEQ ID NO:39) ;VH1_69*04 (SEQ IDNO:41) ;Vh1-69*05(SEQ ID NO:43) ;VH1_69*06(SEQ ID NO:45) ;VH1_69*07(SEQ ID NO:47) ;Vh1-69*08(SEQ ID NO:49) ;VH1_69*09(SEQ ID NO:51) ;VH1_69*10(SEQ ID NO:53)；Vh1-69*11(SEQ ID NO:55) ;VH1_69*12 (SEQ ID NO:57) ;VH1_69*13 (SEQ ID NO:59)。
[0217]圖15顯示了人源VH1_69基因中13個(gè)己報(bào)道的等位基因各成熟可變基因經(jīng)比對(duì)蛋白序列的同一性百分率/相似性百分率矩陣。VHl-69等位基因的同一性百分率以陰影框以上的方框表示和相似性百分率以陰影框以下的方框表示。同一性百分率和相似性百分率評(píng)分由使用 MacVector 軟件(MacVector, Inc.,North Carolina)的 ClustalW(vl.83)比對(duì)工具獲得。
[0218]圖16顯示了人源Vh1_2基因中5個(gè)己報(bào)道的等位基因各第二外顯子的核苷酸比對(duì)情況。小與喊基表不在等位基因之間的種系核昔酸差異。序列中的框表不互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)。虛線表示針對(duì)正確序列比對(duì)的人工缺口。Vh1-2*01(SEQ ID NO:60) ;VH1_2*02 (SEQID NO:62):Vh1-2*03 (SEQ ID NO:64) ;VH1_2*04 (SEQ ID NO:66) ;VH1_2*05 (SEQ ID NO:68)。[0219]圖17顯示了人源VH1_2基因中5個(gè)己報(bào)道的等位基因各成熟重鏈可變基因序列的蛋白比對(duì)情況。小與氣基酸表不在等位基因之間的種系差異。序列中的框表不互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)。虛線表示針對(duì)正確序列比對(duì)的人工缺口。VH1-2*01 (SEQ IDNO:61) ;VH1_2*02 (SEQID NO:63) ;Vh1-2*03 (SEQ ID NO:65) ;VH1_2*04 (SEQ ID NO:67) ;VH1_2*05 (SEQ ID NO:69)。
[0220]圖18顯示了人源VH1_2基因中5個(gè)己報(bào)道的等位基因各成熟可變基因經(jīng)比對(duì)蛋白序列的同一性百分率/相似性百分率矩陣。VHl-2等位基因的同一性百分率以陰影框以上的方框表示和相似性百分率以陰影框以下的方框表示。同一性百分率和相似性百分率評(píng)分由使用 MacVector 軟件(MacVector, Inc.,North Carolina)的 Clustalff (vl.83)比對(duì)工具獲得。
[0221]圖19顯示了使用人細(xì)胞表面受體(抗原A)免疫的針對(duì)人源重鏈和人源κ輕鏈可變基因基因座為純合子的小鼠(Ηκ ；n = 4)和在內(nèi)源性免疫球蛋白重鏈基因座針對(duì)單一人源Vh1-69基因區(qū)段、27個(gè)人源D1^P 6個(gè)人源Jh基因區(qū)段為純合子的小鼠(IhV11HO ；n =10)的抗體滴度。
[0222]圖20顯示了使用兩種不同的流感疫苗免疫的針對(duì)人源重鏈和人源κ輕鏈可變基因基因座為純合子的小鼠(Ηκ ；n = 5)和在內(nèi)源性免疫球蛋白重鏈基因座針對(duì)單一人源Vh1-69基因區(qū)段、27個(gè)人源Dh和6個(gè)人源Jh基因區(qū)段為純合子的小鼠(IhV11HO ；n = 5)的抗體滴度。
[0223]圖21顯示了使用人細(xì)胞表面受體(抗原A)免疫的在內(nèi)源性免疫球蛋白重鏈基因座針對(duì)單一人源Vh1-69基因區(qū)段、27個(gè)人源Dh和6個(gè)人源Jh基因區(qū)段為純合子的小鼠和針對(duì)使用人源κ輕鏈可變基因座取代內(nèi)源性κ輕鏈可變基因座的純合子的VHCDR3區(qū)(X-軸)具有特定氨基酸長(zhǎng)度的IgM激發(fā)的重鏈百分率(y_軸)。 [0224]圖22顯示了用人細(xì)胞表面受體(抗原A)免疫的在內(nèi)源性免疫球蛋白重鏈基因座針對(duì)單一人源VHl-69基因區(qū)段、27個(gè)人源D1^Pe個(gè)人源Jh基因區(qū)段為純合子的小鼠和針對(duì)使用人源κ輕鏈可變基因座取代內(nèi)源性κ輕鏈可變基因座的純合子的VHCDR3區(qū)(X-軸)具有特定氨基酸長(zhǎng)度的IgG激發(fā)的重鏈百分率(y_軸)。
[0225]發(fā)明詳沭
[0226]本發(fā)明不限于所描述的特定方法以及實(shí)驗(yàn)條件，因?yàn)檫@些方法和條件可以改變。還將理解的是本發(fā)明的范圍是由權(quán)利要求所定義的，因此本申請(qǐng)所使用的術(shù)語(yǔ)僅用于描述特定實(shí)施方式的目的，其并不旨在限定。
[0227]除非另有定義，否則本申請(qǐng)使用的所有術(shù)語(yǔ)和短語(yǔ)包括所述術(shù)語(yǔ)和短語(yǔ)在本領(lǐng)域中所具有的含義，除非有相反的明確說(shuō)明或根據(jù)使用所述術(shù)語(yǔ)或短語(yǔ)的上下文是顯而易見(jiàn)的。盡管在實(shí)施或檢驗(yàn)本發(fā)明中可以使用與本申請(qǐng)所描述的那些相似或等效的任意方法和材料，但是在本申請(qǐng)中僅描述了特定的方法和材料。所提及的全部出版物均通過(guò)引用并入本申請(qǐng)。
[0228]當(dāng)使用是短語(yǔ)“基本上的”或“基本上地”指基因區(qū)段的數(shù)量(例如“基本上全部的” V基因區(qū)段)包括功能性和非功能性基因區(qū)段并且包括，在不同實(shí)施方式中，例如全部基因區(qū)段的80%或以上、85%或以上、90%或以上、95%或以上、96%或以上、97%或以上、98%或以上或者99%或以上；在不同實(shí)施方式中，“基本上全部的”基因區(qū)段包括例如至少95%、96%、97%、98%或99%的功能性(即非假基因)基因區(qū)段。[0229]術(shù)語(yǔ)“取代”包括其中DNA序列以這樣一種方式放置于細(xì)胞的基因組中，即使在基因組用異源性序列(例如在小鼠中的人源序列)取代基因組中的序列。這樣放置的DNA序列可以包括一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列，其為所述被放置的序列的來(lái)源DNA的一部分(例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、5’-或3’-非翻譯區(qū)、適宜的重組信號(hào)序列等)。例如，在多種實(shí)施方式中，所述取代是異源性序列對(duì)內(nèi)源性序列的取代以生成這樣放置的DNA序列(包含異源性序列)的基因產(chǎn)物，但是不表達(dá)內(nèi)源性序列；所述取代是具有編碼與編碼內(nèi)源性基因組序列(例如編碼免疫球蛋白基因或結(jié)構(gòu)域的內(nèi)源性基因組序列，以及編碼一個(gè)或多個(gè)人源免疫球蛋白基因或結(jié)構(gòu)域的DNA片段)的蛋白具有相似功能的蛋白的DNA序列的內(nèi)源性基因組序列。在多種實(shí)施方式中，使用相應(yīng)的人源基因或其片段取代內(nèi)源性基因或其片段。相應(yīng)的人源基因或其片段是被取代的內(nèi)源性基因或其片段的直系同源物、同源物或與其在結(jié)構(gòu)和/或功能上基本相等或相同的人源基因或其片段。
[0230]使用受限制的人源免疫球蛋白重鏈基因座精確地在原位取代小鼠重鏈免疫球蛋白基因座(Vh-Dh-Jh)可變區(qū)的6百萬(wàn)個(gè)堿基，但是在雜合基因座中保留翼側(cè)小鼠序列的完整和功能，包括全部小鼠的恒定鏈基因和基因座轉(zhuǎn)錄對(duì)照區(qū)(圖1和圖2)。特別地，使用VELOCIGENE⑩基因工程技術(shù)通過(guò)嵌合BAC靶向載體將單一人源VH、27DH和6個(gè)Jh基因區(qū)段引入小鼠ES細(xì)胞(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，586，251和ValenzueIa等，2003，High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolutionexpression analysis, Nat Biotechnol21:652-659)。
[0231]具有受限制的免疫球蛋白Vh基因區(qū)段的非人動(dòng)物
[0232]本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N包含免疫球蛋白基因座的非人動(dòng)物，所述基因座包含受限制的數(shù)量的Vh基因以及一個(gè)或多個(gè)D基因和一個(gè)或多個(gè)J基因，以及制備和使用其的方法。當(dāng)使用所關(guān)注的抗原免疫時(shí)，所述非人動(dòng)物產(chǎn)生具有僅來(lái)源于受限制的預(yù)先選定的Vh基因或Vh基因集合(例如預(yù)先選定的Vh基因及其變體)的抗體可變區(qū)的B細(xì)胞群。在不同實(shí)施方式中，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N產(chǎn)生表達(dá)人源抗體可變結(jié)構(gòu)域的B細(xì)胞群的非人動(dòng)物，所述人源抗體可變結(jié)構(gòu)域是人源重鏈可變結(jié)構(gòu)域以及同源的人源輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。在不同實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物在經(jīng)修飾的內(nèi)源性小鼠免疫球蛋白基因座重排人源重鏈可變基因區(qū)段和人源輕鏈可變基因區(qū)段，所述基因座包含用人源未經(jīng)重排的可變區(qū)序列取代或插入非人源未經(jīng)重排的可變區(qū)序列。
[0233]對(duì)免疫球蛋白基因的組織、結(jié)構(gòu)和功能的早期工作部分在具有缺陷的內(nèi)源性基因座并且工程化改造為具有部分人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因基因座(隨機(jī)設(shè)置)的小鼠中進(jìn)行，例如在存在或不存在人源輕鏈轉(zhuǎn)基因的情況下，將部分人源重鏈基因庫(kù)與人源恒定基因連接，隨機(jī)插入基因座。盡管這些小鼠用于制備有用的高親和性抗體不是十分理想，但是其有助于對(duì)免疫球蛋白基因座進(jìn)行某些功能性分析。這些小鼠中的一些具有少至兩種或三種，或者甚至單一的重鏈可變基因。
[0234]己報(bào)道了表達(dá)來(lái)源于在隨機(jī)插入的轉(zhuǎn)基因上的單一人源VH5_51基因以及10個(gè)人源Dh基因和6個(gè)人源Jh基因，且具有人源μ和Y I恒定基因的全人免疫球蛋白重鏈(并且具有存在缺陷的內(nèi)源性免疫球蛋白基因座)的小鼠(Xu和avis，2000，Diversity in theCDR3Region of Vh Is Sufficient for Most Antibody Specificities, Immunityl3:37-45)。這些小鼠的全人源免疫球蛋白重鏈主要僅表達(dá)來(lái)源于內(nèi)源性小鼠λ輕鏈基因座的兩種全小鼠λ輕鏈之一(僅V λ 1-J λ I或V λ 2-J λ 2)，并且能夠不表達(dá)K輕鏈(所述小鼠是IgK +的)。這些小鼠在B細(xì)胞發(fā)育和抗體表達(dá)方面顯示出嚴(yán)重異常的功能障礙。據(jù)報(bào)道其B細(xì)胞數(shù)為野生型的5-10%、IgM水平為野生型的5-10%以及IgGl水平僅為野生型的0.1-1%。所觀察到的IgM庫(kù)顯示出高度受限制的連接多樣性。所述全人源重鏈針對(duì)所有抗原展示出基本相同的CDR3長(zhǎng)度，相同的Jh(Jh2)使用情況以及起始連接Q殘基，因此反映了一定程度的⑶R3多樣性缺失。全小鼠λ輕鏈在J λ I幾乎均具有W96L取代作為起始連接殘基。據(jù)報(bào)道所述小鼠不能產(chǎn)生針對(duì)細(xì)菌多糖的任何抗體。由于人源可變結(jié)構(gòu)域與小鼠輕鏈偶聯(lián)，因此所述人源可變區(qū)的利用受到了極大的限制。
[0235]僅具有單一人源乂113_23基因、人源DdP Jh基因以及小鼠輕鏈基因的其他小鼠己被報(bào)導(dǎo)，但是部分由于在人源Vh與小鼠'結(jié)構(gòu)域之間存在錯(cuò)配的可能，所述小鼠顯示出受限的多樣性(因此使用情況受限)(參見(jiàn)例如Mageed等,2001, Rearrangement of thehuman heavy chain variable region gene V3_23in transgenic mice generates antibodiesreactive with a range of antigens on the basis of VHCDR3and residues intrinsic tothe heavy chain Variable region, Clin.Exp.Tmmunol.123: 1-5)。類(lèi)似地，在含有人源 μ恒定基因的轉(zhuǎn)基因中攜帶兩個(gè)Vh基因(3-23和6-1)以及人源D1^P Jh基因(Bruggemann等，1991, Human antibody production in transgenic mice:expression fromlOOkb of thehuman IgH locus, Eur.J.1mmmuno1.21:1323-1326)并且在具有小鼠輕鏈的人 IgM 鏈中表達(dá)該轉(zhuǎn)基因的小鼠通過(guò)錯(cuò)配可以顯示出受限制的庫(kù)(Mackworth-Young等,2003, The roleof antigen in the selection of the human V3-23immunoglobulin heavy chain Variableregion gene, Clin.Exp.Tmmunol.134:420-425)。 [0236]表達(dá)來(lái)自隨機(jī)插入基因組中的人轉(zhuǎn)基因的Vh-受限制的全人源重鏈，具有來(lái)自全人源隨機(jī)插入轉(zhuǎn)基因的受限制的人源λ庫(kù)的小鼠亦己被報(bào)導(dǎo)(參見(jiàn)例如Taylor等，1992，Αtransgenic mouse that expresses a diversity of human sequence heavy and light chainimmunoglobulins, Nucleic Acids Res.20(23):6287-6295 ；ffagner 等，1994, Antibodiesgenerated form human immunoglobulin miniloci in transgenic mice, Nucleic AcidsRes.22(8):1389-1393)。然而，表達(dá)來(lái)自隨機(jī)插入小鼠基因座的轉(zhuǎn)基因的全人源抗體并且包含受損的內(nèi)源性基因座的小鼠己知與野生型小鼠相比顯示出免疫應(yīng)答上的巨大差異，這些差異影響了從這種小鼠獲得的抗體的可變結(jié)構(gòu)域多樣性。
[0237]能夠產(chǎn)生表達(dá)來(lái)自受限制的Vh基因庫(kù)以及一個(gè)或多個(gè)D基因和一個(gè)或多個(gè)J基因的人源抗體可變結(jié)構(gòu)域的多樣性B細(xì)胞群的有用的非人動(dòng)物可產(chǎn)生，優(yōu)選地在一些實(shí)施方式中，具有足夠多樣性的重排的可變區(qū)基因庫(kù)。在不同實(shí)施方式中，多樣性包括連接多樣性、體細(xì)胞高突變和在Vh基因序列中的多態(tài)性多樣性(對(duì)于Vh基因以多態(tài)性形成存在的實(shí)施方式而言)。組合多樣性發(fā)生在所述Vh基因與多種同源的人源輕鏈可變結(jié)構(gòu)域之一的配對(duì)中(其在不同實(shí)施方式中包括結(jié)合多樣性和/或體細(xì)胞高突變)。
[0238]包含受限制的人源Vh基因庫(kù)和完全或基本上完全人源的Vh基因庫(kù)的非人動(dòng)物將在不同實(shí)施方式中產(chǎn)生反映多種多樣性來(lái)源的B細(xì)胞群，如連接多樣性(例如VDJ、VJ連接、P附加、N附加)、組合多樣性(例如同源的Vh-受限制的人源重鏈，人源輕鏈)和體細(xì)胞高突變。在包含將Vh庫(kù)限制為一種人源Vh基因的實(shí)施方式中，所述的一種人源Vh基因能夠以兩種或多種變體形式存在。在不同實(shí)施方式中，Vh基因兩種或更多多態(tài)性形式的存在將豐富B細(xì)胞群可變結(jié)構(gòu)域的多樣性。
[0239]在種系序列基因區(qū)段(例如V基因)中的變體有助于在人中抗體應(yīng)答的多樣性。其對(duì)多樣性的相對(duì)貢獻(xiàn)是由于V基因序列在V基因之間的差異導(dǎo)致的。在不同基因家族之間多態(tài)性的程度不同，并且根據(jù)所觀察到的在人群中相關(guān)和不相關(guān)個(gè)體之間Vh單倍體存在的差異，其反映了多種單倍體(具有共遺傳多態(tài)性的序列的延伸)產(chǎn)生更多多樣性的能力(參見(jiàn)例如 Souroujon 等,1989, Polymorphisms in Human H Chain V Region Genes fromthe VhIII Gene Family, J.1mmunol.143(2):706-711)。依據(jù)從特定多態(tài)性人源 Vh 基因家族中得到的數(shù)據(jù)，一些人提出在種系中單倍體的多樣性是Vh基因在人群中呈現(xiàn)異質(zhì)性的主要因素，這反映在人群中不同的種系Vh基因具有較大的多樣性(參見(jiàn)Sasso等，1990，Prevalence and Polymorphism of Human VH3Genes, J.Tmmunol.145(8):2751-2757)。
[0240]盡管由于普遍存在的多態(tài)性人群中對(duì)于Vh基因庫(kù)顯示出了較大的單倍體多樣性，但是某些多態(tài)性反映在在人群中觀察到的普遍(即保守的)的等位基因上(Sasso等，1990)。可將Vh的多態(tài)性描述為兩種主要形式。第一種變體由與相同基因區(qū)段的等位基因之間核苷酸序列的差異相關(guān)的等位基因變體產(chǎn)生。第二種由發(fā)生在免疫球蛋白重鏈基因座的眾多的復(fù)制、插入和/或缺失產(chǎn)生。這就造成了獨(dú)特的情況，其中從相同基因經(jīng)復(fù)制得到的Vh基因與其各自的等位基因相比有一個(gè)或多個(gè)核苷酸取代的差異。這也直接影響了在重鏈基因座Vh基因的拷貝數(shù)。
[0241]人源免疫球蛋白重鏈可變基因區(qū)段(Vh基因)的多態(tài)性等位基因基本上是基因區(qū)段的插入/缺失以及編碼區(qū)內(nèi)單核苷酸的差異導(dǎo)致的，其均對(duì)免疫球蛋白分子具有潛在的功能性后果。表1顯示了根據(jù)人源Vh基因家族和在人源免疫球蛋白重鏈基因座中各Vh基因經(jīng)鑒定的等位基因數(shù)列出的功能性Vh基因。一些發(fā)現(xiàn)提示多態(tài)性的Vh基因與對(duì)某些疾病的易感性相關(guān)例如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，而在其他情況下Vh與疾病之間的聯(lián)系一直不太清楚。這種不確定性己被歸因于在不同人群中不同等位基因的拷貝數(shù)和存在情況不同。事實(shí)上，己證實(shí)若干人源Vh基因的拷貝數(shù)存在差異(例如Vh1-2、Vh1-69、Vh2-26、Vh2-70和VH3_23)。在不同實(shí)施方式中，具有受限制的Vh庫(kù)的如本申請(qǐng)所述的人源化小鼠包含單個(gè)￥11家族成員的多個(gè)多態(tài)性變體(例如Vh1-2、Vh1-69, Vh2-26、Vh2_70和VH3_23的兩個(gè)或多個(gè)多態(tài)性變體，其在內(nèi)源性小鼠基因座取代全部或基本上全部的功能性小鼠Vh區(qū)段)。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，本申請(qǐng)所述小鼠的兩個(gè)或多個(gè)多態(tài)性變體的數(shù)量可達(dá)到和包括表1中對(duì)應(yīng)的Vh家族成員所示的數(shù)量(例如針對(duì)Vh1-69，13個(gè)變體；針對(duì)Vh1-2，5個(gè)變體等)。
[0242]通常所見(jiàn)的特定人源乂11基因的變體是本領(lǐng)域所公知的。例如在乂11基因座中最復(fù)雜的多態(tài)性之一是VH1_69基因。所述人源VH1_69基因具有13個(gè)己報(bào)道的等位基因(Sasso等，1993, A fetally expressed immunoglobulin VaIgene belongs to a complex set of alleles,Journal of Clinical Investigation91:2358-2367 ；Sasso 等，1996, Expression of theimmunoglobulin Vh gene51plis proportional to its germline gene copy number, Journalof Clinical Investigation97 (9):2074-2080)并且存在至少三個(gè)攜帶VH1_69基因副本的單倍體，使得在給定基因座存在Vh基因的多重拷貝。這些多態(tài)性等位基因在互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)存在差異，這可能會(huì)顯著影響抗原的特異性。表2中列出了己報(bào)道的人源乂111-69的等位基因以及成熟重鏈可變區(qū)的DNA和蛋白序列的SEQ ID NO。表3中列出了己報(bào)道的人源Vh1_2的等 位基因以及成熟重鏈可變區(qū)的DNA和蛋白序列的SEQ ID NO。[0243]Vh1-69基因典型的基因組DNA和全長(zhǎng)蛋白序列分別如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。圖13和圖14分別顯示了 13個(gè)己報(bào)道的VHl-69等位基因的DNA和蛋白比對(duì)情況。VHl-2基因典型的DNA和蛋白序列分別如SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:61所示。圖16和圖17分別顯示了 5個(gè)己報(bào)道的VHl-2等位基因的DNA和蛋白比對(duì)情況。圖15和圖18分別顯示了與13個(gè)己報(bào)道的人源Vh1-69等位基因和5個(gè)己報(bào)道的人源Vh1-2等位基因?qū)?yīng)的經(jīng)比對(duì)的蛋白序列的同一性/相似性百分率矩陣。在不同實(shí)施方式中，本發(fā)明經(jīng)修飾的基因座包含選自表1的Vh基因，其存在兩個(gè)或更多的拷貝數(shù)，其中所述拷貝數(shù)包括高達(dá)和包括表1所示的等位基因數(shù)。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明經(jīng)修飾的基因座包含選自表2的Vh1-69基因，其存在兩個(gè)或更多的拷貝數(shù)，其中所述拷貝數(shù)包括高達(dá)和包括表1所示的等位基因數(shù)。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明經(jīng)修飾的基因座包含選自表3的Vh1-2基因，其存在兩個(gè)或更多的拷貝數(shù)，其中所述拷貝數(shù)包括高達(dá)和包括表1所示的等位基因數(shù)。
[0244]盡管對(duì)涉及小鼠中受限制的人源Vh庫(kù)的實(shí)施方式進(jìn)行了廣泛的討論，但是本申請(qǐng)還提供了表達(dá)受限制的人源Vh庫(kù)的其他非人動(dòng)物。這種非人動(dòng)物包括能夠被基因修飾以表達(dá)如本申請(qǐng)所述的受限制的人源Vh庫(kù)的任意動(dòng)物，包括例如小鼠、大鼠、家兔、豬、牛(例如母牛、公牛、水牛)、鹿、綿羊、山羊、雞、貓、狗、雪貂、靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物(例如狨猴、獼猴)等。例如，對(duì)于適宜的基因修飾的ES細(xì)胞不易于獲得的非人動(dòng)物而言，可以使用其他方法制備包含基因修飾的非人動(dòng)物。這種方法包括例如修飾非ES細(xì)胞基因組(例如成纖維細(xì)胞或誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞)以及引入核轉(zhuǎn)移以便將經(jīng)修飾的基因組轉(zhuǎn)移至適宜細(xì)胞例如卵母細(xì)胞，并且在適宜條件下在非人動(dòng)物中使經(jīng)修飾的細(xì)胞(例如經(jīng)修飾的卵細(xì)胞)妊娠以形成胚胎。修飾非人動(dòng)物基因組(例如豬、母牛、嚙齒動(dòng)物、雞等的基因組)的方法包括例如引入鋅指核酸酶(ZFN)或轉(zhuǎn)錄活化 因子樣效應(yīng)物核酸酶(TALEN)以修飾基因組使其包括受限制的人源乂11庫(kù)。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N編輯非人動(dòng)物基因組使其包括受限制的人源Vh庫(kù)的方法，所述方法包括編輯引入了 ZFN或TALEN的基因組以使其包括不超過(guò)一個(gè)或者不超過(guò)兩個(gè)人源Vh基因區(qū)段(或其多態(tài)性變體)的步驟，其中所述不超過(guò)一個(gè)或不超過(guò)兩個(gè)人源Vh基因區(qū)段可操作地與免疫球蛋白恒定基因序列連接。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述恒定基因序列選自人源重鏈恒定序列和非人源重鏈恒定序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述恒定序列是非人源的并且所述不超過(guò)一個(gè)或不超過(guò)兩個(gè)人源Vh基因區(qū)段在內(nèi)源性非人源免疫球蛋白基因座可操作地與非人源恒定基因序列連接。
[0245]在一個(gè)方面，所述非人動(dòng)物是小型哺乳動(dòng)物，例如跳鼠科或鼠科超家族。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述基因修飾的動(dòng)物是嚙齒動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述嚙齒動(dòng)物選自小鼠、大鼠和倉(cāng)鼠。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述哨齒動(dòng)物選自鼠科超家族。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述基因修飾的動(dòng)物來(lái)自選自麗倉(cāng)鼠科(例如小鼠樣倉(cāng)鼠)、倉(cāng)鼠科(例如倉(cāng)鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠科(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、馬島鼠科(登山小鼠、巖小鼠、有尾大鼠、馬達(dá)加斯加大鼠和小鼠)、刺山鼠科(例如多刺睡鼠)和廳形鼠科(例如摩爾大鼠、竹大鼠和鼢鼠)家族。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述基因修飾的嚙齒動(dòng)物選自真小鼠或大鼠(鼠科)、沙鼠、刺毛鼠和黃冠鼠。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述基因修飾的小鼠是鼠科家族成員。
[0246]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物是哨齒動(dòng)物，其是C57BL品系的小鼠。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述 C57BL 品系選自 C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr 和C57BL/01a。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠是129品系。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述129品系選自下組:129P1、129P2、129P3、129X1、129S1 (例如 129S1/SV、129Sl/Svlm)、129S2、129S4、129S5、129S9/SvEvH、129S6(129/SvEvTac)、129S7、129S8、129T1、129T2(參見(jiàn)例如 Festing 等(1999)Revised nomenclature for strainl29mice, Mammalian GenomelO:836,亦參見(jiàn) Auerbach 等(2000)Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv-andC57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述基因修飾的小鼠是前述129品系和前述C57BL品系的混合物(例如C57BL/6品系)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠是前述129品系的混合物，或者前述C57BL/6品系的混合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述129品系的混合物是129S6(129/SvEvTac)品系。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠是129/SvEv-和C57BL/6-來(lái)源品系的混合物。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述小鼠是Auerbach et al.2000B1Techniques29:1024-1032 描述的 129/SvEv-和 C57BL/6-來(lái)源品系的混合物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠是BALB品系例如BALB/c品系。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠是BALB品系(例如BALB/c品系)和另一種如述品系的混合物。
[0247]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物是大鼠。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述大鼠選自Wistar 大鼠、LEA 品系、Sprague Dawley 品系、Fischer 品系、F344、F6和Dark Agouti。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述大鼠品系是兩種或多種選自下組的品系的混合物:Wistar、LEA、SpragueDawley> Fischer> F344、F6 和 Dark Agouti。
[0248]表1
[0249]
【權(quán)利要求】
1.一種具有受限制的免疫球蛋白重鏈基因座的小鼠，其特征在于，所述受限制的免疫球蛋白重鏈基因座存在單一人源％基因區(qū)段、一個(gè)或多個(gè)人源Dh基因區(qū)段和一個(gè)或多個(gè)人源Jh基因區(qū)段，其中所述單一人源Vh基因區(qū)段是多態(tài)性的Vh基因區(qū)段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小鼠，其中所述小鼠包含全部或基本上全部?jī)?nèi)源性VinD1^PJh基因區(qū)段的缺失。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小鼠，其中所述單一人源Vh基因區(qū)段選自Vh1-2、Vh1-69、Vh2-26、Vh2-70 和 Vh3-23。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的小鼠，其中所述單一人源Vh基因區(qū)段是Vh1-69。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的小鼠，其中所述單一人源Vh基因區(qū)段是Vh1-2。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小鼠，其中所述單一人源Vh基因區(qū)段可操作地與人源或非人源免疫球蛋白恒定區(qū)基因連接。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的小鼠，其中所述免疫球蛋白恒定區(qū)基因是小鼠、大鼠或人恒定區(qū)基因。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小鼠，其進(jìn)一步包含與一個(gè)或多個(gè)人源Jh基因片段可操作地連接的一個(gè)或多個(gè)人源免疫球蛋白\基因區(qū)段。
9.根據(jù)權(quán)利要求 8所述的小鼠，其中所述一個(gè)或多個(gè)人源\基因區(qū)段和/或所述一個(gè)或多個(gè)人源I基因區(qū)段選自人K和人λ基因區(qū)段。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的小鼠，其中所述一個(gè)或多個(gè)人源免疫球蛋白\基因區(qū)段和一個(gè)或多個(gè)人源I基因區(qū)段可操作地與非人源輕鏈恒定基因連接。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的小鼠，其中所述非人源輕鏈恒定基因選自小鼠或大鼠K或λ恒定區(qū)基因。
12.一種小鼠，其特征在于，所述小鼠在其種系的內(nèi)源性免疫球蛋白重鏈基因座中包含用單一人源Vh基因區(qū)段和/或其多態(tài)性變體、一個(gè)或多個(gè)人源Dh基因區(qū)段和一個(gè)或多個(gè)人源Jh基因區(qū)段取代全部或基本上全部的內(nèi)源性VH、Dh和Jh基因區(qū)段。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的小鼠，其進(jìn)一步包括在內(nèi)源性免疫球蛋白輕鏈基因座用一個(gè)或多個(gè)人源\和一個(gè)或多個(gè)人源I基因區(qū)段取代全部或基本上全部的內(nèi)源性\和叉基因區(qū)段。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的小鼠，其中所述單一人源Vh基因區(qū)段選自AVHl-69和人VH1_2基因區(qū)段。
15.一種來(lái)源于權(quán)利要求1或12所述的小鼠的細(xì)胞或組織。
16.—種制備編碼人Vh結(jié)構(gòu)域的核酸序列的方法，所述方法包括: (a)使用抗原免疫權(quán)利要求1或12所述的小鼠； (b)使得所述小鼠產(chǎn)生針對(duì)所述抗原的免疫應(yīng)答；以及， (c)從所述小鼠中獲得編碼人Vh結(jié)構(gòu)域的核酸序列。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述免疫球蛋白Vh區(qū)序列與SEQID NO:34,SEQID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ IDNO:48,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:52,SEQ ID NO:54,SEQ ID NO:56 或 SEQ ID NO:58 具有至少75%的同一性。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述免疫球蛋白Vh區(qū)序列包含SEQID NO:34、SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40,SEQ ID NO:42,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:46,SEQID NO:48, SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58,或其多態(tài)性變體。
19.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，所述免疫球蛋白Vh區(qū)序列編碼的蛋白與SEQID NO:.35,SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:39,SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45,SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49,SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:55,SEQ ID NO:57 或 SEQ ID NO:59 具有至少75%的同一性。
20.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述免疫球蛋白Vh區(qū)序列與SEQID NO:60,SEQID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66 或 SEQ ID NO:68 具有至少 95% 的同一性。
21.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述免疫球蛋白Vh區(qū)序列包含SEQID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68，或其多態(tài)性變體。
22.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中免疫球蛋白Vh區(qū)序列編碼的蛋白與SEQID NO:61，、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67 或 SEQ ID NO:69 具有至少 95% 的同一性。
23.根據(jù)權(quán)利要求1或12所述的小鼠用于制備編碼人重鏈可變結(jié)構(gòu)域的核酸序列的用途。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的用途，其中所述人重鏈可變結(jié)構(gòu)域的特征為具有來(lái)源于多態(tài)性人Vh基因區(qū)段的人FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3序列。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的用途，其中所述人Vh基因區(qū)段選自AVh1-2、Vh1-69、Vh2-26、Vh2-70 或 Vh3-23 基因區(qū)段。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的用途，其中所述人Vh基因片區(qū)段是Vh1-2。
27.根據(jù)權(quán)利要求25所述的用途，其中所述人Vh基因區(qū)段是Vh1-69。
28.根據(jù)權(quán)利要求1或12所述的小鼠用于制備人源抗體的用途，其中所述人源抗體包含來(lái)源于經(jīng)重排的人Vh1-2基因區(qū)段、人Vh1-69基因區(qū)段或其多態(tài)性變體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的用途，其中所述重排的人VHl-69基因區(qū)段與SEQIDNO:34、SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:38,SEQ IDNO:40,SEQ ID NO:42,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:46,SEQID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56 或 SEQ ID NO:58 具有至少75%的同一性。
30.根據(jù)權(quán)利要求28所述的用途，其中所述經(jīng)重排的AVHl-2基因區(qū)段與SEQID NO:.60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66 或 SEQ ID NO:68 具有至少 95% 的同一性。
【文檔編號(hào)】C12N15/85GK104024418SQ201280062449
【公開(kāi)日】2014年9月3日 申請(qǐng)日期:2012年10月17日 優(yōu)先權(quán)日:2011年10月17日
【發(fā)明者】L·麥克唐納, J·麥克沃克, C·古雷爾, K·A·霍西阿瓦, A·J·莫菲 申請(qǐng)人:瑞澤恩制藥公司