包含內(nèi)部標記引物的核酸的測序、擴增和檢測方法
【專利摘要】本申請?zhí)峁┝擞糜诤怂釡y序或擴增和檢測的改進方法，所述方法包括下列步驟：i）提供至少一種核酸引物，其包含至少一個標記的核苷酸，ii）提供酶和試劑，其使用所述至少一種標記的核酸引物來擴增靶核酸的，iii）將反應組分在適合于靶核酸引物的擴增的條件下溫育，iv）通過標記的核苷酸檢測擴增的核酸，其中所述核酸引物包含下列序列：5’-NaXNb-3’，其中N可以是任意核苷酸，其中“a”和“b”表示核苷酸數(shù)量，并且可以在1至150的范圍內(nèi)，并且其中X是所述至少一個標記的核苷酸。此外，本文還公開了包含這樣的核酸引物的試劑盒，以及所述試劑盒或核酸引物在用于核酸測序或擴增和檢測的方法中的用途。
【專利說明】包含內(nèi)部標記引物的核酸的測序、擴增和檢測方法
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于生物學和化學領(lǐng)域，特別是分子生物學領(lǐng)域。更具體來說，本發(fā)明涉及用于核酸測序或擴增和檢測的方法和試劑盒。
[0002]發(fā)明背景
[0003]如今，分子方法在診斷學和鑒定個體，例如在法醫(yī)學領(lǐng)域或親子鑒定中發(fā)揮重要作用。靶區(qū)域的擴增是這些方法中的中心程序。此外，方法包括在大多數(shù)情況下通過凝膠電泳如毛細管電泳來分析被擴增靶區(qū)域的長度。被擴增材料的分析通過熒光標記物的檢測來進行。將標記物附連到用于擴增的位點特異性引物的5’-末端。然而，當分析擴增產(chǎn)物時，小的干擾性人為峰、即所謂的“染料污跡(dye blobs)”的出現(xiàn)，導致基線具有高的“背景噪音”，這干擾了方法的靈敏度?！叭玖衔圹E”是電泳圖中不代表特異性擴增產(chǎn)物，而是代表包含標記物的降解產(chǎn)物的峰。造成它們的分子是游離的熒光染料標記物以及與標記物相連的1-Sbp長的寡核苷酸。后者可能代表降解的引物或降解的PCR產(chǎn)物。
[0004]現(xiàn)在，本發(fā)明人出人意料地發(fā)現(xiàn)，內(nèi)部標記的寡核苷酸引物的使用減少了染料污跡的出現(xiàn)。因此，本申請?zhí)峁┝擞糜跍y序或擴增和檢測核酸的方法，所述方法包括使用內(nèi)部標記的核酸引物。使用內(nèi)部標記的引物的技術(shù)效果是提供了具有更高靈敏度的方法。
[0005]發(fā)明描述
[0006]因此，本發(fā)明解決了上面提到的問題，并提供了用于測序或擴增和檢測核酸的方法，所述方法包括下列步驟:
[0007]i)提供至少一種核酸引物`，其包含至少一個標記的核苷酸，
[0008]ii)提供酶和試劑，其使用所述至少一種標記的核酸引物來擴增靶核酸，
[0009]iii)將反應組分在適合于靶核酸引物的擴增的條件下溫育，
[0010]iv)通過標記的核苷酸來檢測擴增的核酸，
[0011]其中所述核酸引物包含下列序列:
[0012]5，-NaXNb_3，，
[0013]其中N可以是任意核苷酸或修飾的核苷酸，
[0014]其中a和b表示核苷酸數(shù)量，并可以在I至150的范圍內(nèi)；
[0015]并且其中X是所述至少一個標記的核苷酸。
[0016]在本文中，“核酸引物”是指適用于擴增的寡核苷酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員應該理解，為了適用于擴增，3’ -末端應該可以通過聚合酶進行延伸。核酸引物可以使用任何適合的方法來制備，例如磷酸三酯和磷酸二酯方法或其自動化實施方式。在一種這樣的自動化實施方式中，使用二乙基-亞磷酰胺作為起始原料，其可以如Beaucage等，TetrahedronLetters, 22:1859-1862 (1981)所述進行合成，該文獻通過引用并入本文。一種在修飾的固體支持物上合成寡核苷酸的方法描述在美國專利號4，458，006中，所述專利通過引用并入本文。還可以使用從生物樣品(例如限制性內(nèi)切酶消化物)分離的引物。核酸引物的長度可以各不相同。長度可以適應于需要。
[0017]在本發(fā)明的方法的情形中，“核酸”是指樣品中特定類型的核酸，尤其是RNA、DNA、cDNA (互補 DNA)、LNA (鎖核酸)、mRNA (信使 RNA)、mtRNA (線粒體的)、rRNA (核糖體 RNA)、tRNA (轉(zhuǎn)運 RNA)、nRNA (核 RNA)、siRNA (短干擾 RNA)、snRNA (小核 RNA)、snoRNA (小核仁RNA)、scaRNA (小卡哈爾體特異性RNA)、microRNA、dsRNA (雙鏈RNA)、核酶、核糖開關(guān)、病毒RNA、dsDNA (雙鏈 DNA)、ssDNA (單鏈 DNA)、質(zhì)粒 DNA、粘粒 DNA、染色體 DNA、病毒 DNAmtDNA(線粒體DNA)、nDNA (核DNA)、或snDNA (小核DNA)等，或可以與樣品中主體核酸區(qū)分開的任何其他類型或亞類的核酸。
[0018]本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，使用內(nèi)部標記的核酸引物導致引起染料污跡的片段減少。如果擴增產(chǎn)物在檢測之前必須按照其長度進行分離，則染料污跡是特別不想要的。因此，在本發(fā)明方法的一種實施方式中，步驟iv)優(yōu)選地在通過標記的核苷酸檢測擴增的核酸之前，包括按照長度分離擴增的核酸的步驟。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解按照核酸長度分離核酸的大量方法。一種常用方法是凝膠電泳。因此，在本發(fā)明的一種實施方式中，使用凝膠電泳對擴增的核酸按照其大小進行分離。凝膠電泳是使用施加于凝膠基質(zhì)的電場來分離核酸分子的技術(shù)。術(shù)語“凝膠”是指用于包含、然后分離靶分子的基質(zhì)。在大多數(shù)情況下，凝膠是交聯(lián)聚合物，其組成和孔隙度根據(jù)待分析的靶的具體重量/長度和組成來選擇。當分離小核酸(DNA、RNA或寡核苷酸)時，凝膠通常由不同濃度的丙烯酰胺和交聯(lián)劑構(gòu)成，產(chǎn)生不同網(wǎng)孔尺寸的聚丙烯酰胺網(wǎng)狀物。丙烯酰胺可以是例如丙烯酰胺、直鏈聚丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺或聚異丙基丙烯酰胺。當分離較大核酸(大于幾百堿基)時，可以選擇純化的瓊脂糖作為基質(zhì)。在兩種情形中，凝膠形成固體但有孔的基質(zhì)。瓊脂糖由沒有交聯(lián)的不帶電荷的糖類的無分支長鏈構(gòu)成，產(chǎn)生具有大孔的凝膠，允許分離大分子和大分子復合物。因此，在本發(fā)明的一種實施方式中，用于分離核酸的基質(zhì)是聚丙烯酰胺或瓊脂糖。
[0019]凝膠電泳使用在法醫(yī)學、分子生物學、遺傳學、微生物學和生物化學中。通過用成像裝置將凝膠中標記的核酸可視化，可以對結(jié)果進行定量分析，所述成像裝置通常包含激發(fā)標記物熒光的光源，例如激光。用檢測裝置記錄來自于標記物的信號，并測量條帶或斑點的強度。測量和分析大多使用專門的軟件來進行，所述軟件將檢測到的信號按照核酸的長度和被檢測核酸的量轉(zhuǎn)變成電泳圖。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，擴增的核酸的分離通過毛細管凝膠電泳來進行。
[0020]此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員了解在內(nèi)部位置標記寡核苷酸的方法。一種可能方法是將標記物附連于核堿基，例如核堿基的環(huán)外氨基(在本文中也稱為胺基)，另一種可能方法是將標記物附連于糖的2’ -碳。
[0021]“環(huán)外”是指位于環(huán)狀化學結(jié)構(gòu)的環(huán)外部的基團，例如環(huán)的一部分取代基對于環(huán)來說是環(huán)外的。當在本文中使用時，環(huán)外胺基是指作為雜環(huán)堿基的環(huán)的取代基的胺基，并包括胺基的氮直接附連于環(huán)結(jié)構(gòu)的成員的實施方式，還包括胺基的氮可以通過居間基團連接到雜環(huán)堿基的環(huán)結(jié)構(gòu)的實施方式。
[0022]此外，可以將標記物連接到2’ -修飾的核苷酸，例如，將胺基直接附連于糖的2’ -碳，或者胺基的氮可以通過居間基團連接到糖的2’ -碳。
[0023]在本發(fā)明的一種實施方式中，將標記物通過環(huán)外胺基連接到所述被標記核苷酸(X)或連接到所述被標記核苷酸(X)的修飾的2’ -位置。在優(yōu)選實施方式中，將標記物連接到被標記核苷酸(X)的環(huán)外氨基。在優(yōu)選實施方式中，將標記物連接到胸腺嘧啶的環(huán)外胺基。[0024]標記寡核苷酸的可能方法對于專業(yè)技術(shù)人員來說是已知的，包括但不限于氨基-修飾物-C6’-dT CEP (例如5-[N-(三氟乙?；被夯?-3-丙烯酰亞胺基]，也稱為5- [E-2- [N- [6- (二氟乙酰胺基)己基]甲酰胺基]乙烯基])、氨基-修飾物-C2-dT CEP、5-氨基烯丙基-dU CEP、氨基-修飾物-C6-dA CEP、氨基-修飾物-C6_dGCEP (例如3’-0-[( 二異丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦基]_5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-N2-[( 二甲基氨基)亞甲基]-N8-[6-(三氟乙?；被?己基]-2’-脫氧鳥苷)、氨基-修飾物-15-dT CEP (例如3’-0-[( 二異丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦基]-5’ -0-(4, 4? - 二甲氧基三苯甲基)-5-[E-2’ _[N-[15-(三氟乙酰胺基)-7-氮雜-10，13-二氧雜-8-氧基十五烷基]甲酸胺基]乙烯基]-2’-脫氧尿苷、2’ -0-氨基連接物-U CEP (例如3’-0-[( 二異丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦基]-5’-0-(4，4’-二甲氧基二苯甲基)-2’ -0-2- [2- ( 二氟乙酸胺基)乙氧基]乙基尿苷)和2’ -氨基-D-尿苷。[0025]標記的核苷酸(X)在核酸引物中的位置可以變化。然而，由于本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)內(nèi)部標記的核酸引物減少電泳圖中染料污跡的出現(xiàn)，因此本發(fā)明的核酸引物被內(nèi)部標記，即標記的核苷酸不是在核酸引物的5’ -或3’ -位置處的核苷酸。因此，在本發(fā)明的核酸引物中，“a”和“b”至少為I?！癮”和“b”的值取決于標記的核苷酸的內(nèi)部位置和核酸引物的總長度。在優(yōu)選實施方式中，“a”和/或“b”在I至150之間，優(yōu)選地在2至50之間，甚至更優(yōu)選地在3至25之間，更優(yōu)選地在4至17之間。在其他實施方式中，“a”在I至150之間，優(yōu)選地在2至50之間，甚至更優(yōu)選地在3至25之間，更優(yōu)選地在4至17之間。在其他實施方式中，“b”在I至150之間，優(yōu)選地在2至50之間，甚至更優(yōu)選地在3至25之間，更優(yōu)選地在4至17之間。本發(fā)明人出人意料地發(fā)現(xiàn)，標記的核苷酸越處于引物的中央位置中，減少染料污跡的效果越強。因此，在一種實施方式中，“a”和“b”相差15或更小，優(yōu)選地相差10或更小，更優(yōu)選地相差5或更小。在其他優(yōu)選實施方式中，“a”和“b”具有相同的值。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當“a”和“b”為10時，減少染料污跡的效果達到最高。因此，在本發(fā)明的一種實施方式中，“a”和“b”為10。然而，專業(yè)技術(shù)人員可以根據(jù)引物的長度和序列改變標記物的確切位置。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將會理解，在整個分子中，核苷酸或修飾的核苷酸(N)不必是相同的，例如，如果“a”和“b”為5，這不意味著在得到的序列NNNNNXNNNNN中所有的“N”都是相同核苷酸。此外，專業(yè)技術(shù)人員將根據(jù)待擴增的靶核酸來選擇核酸引物的核苷酸或修飾的核苷酸，即他將選擇與靶核酸的一部分互補的序列。
[0026]可以根據(jù)需要并根據(jù)所需的特異性來改變核酸引物的長度，例如，較長引物具有較高特異性程度。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，核酸引物具有約3至300nt之間，更優(yōu)選地約5至IOOnt之間，甚至更優(yōu)選地約6至50nt之間的總長度。在其他優(yōu)選實施方式中，核酸引物具有15至34nt之間的總長度。
[0027]通過本發(fā)明的方法實現(xiàn)的技術(shù)效果，可以在大量不同標記物上觀察到。因此，它原則上可以使用適合于標記核酸的任何標記物來進行。然而，在本發(fā)明的一種實施方式中，標記物選自由熒光團、生色團、放射性同位素、化學發(fā)光物和酶構(gòu)成的標記物組。在優(yōu)選實施方式中，標記物是熒光團，其優(yōu)選地選自包含下列熒光團的熒光團組:5_或6-羧基熒光素(FAM?), VIC?, NED?,熒光素，熒光素異硫氰酸酯(FITC)，IRD-700/800，花青染料例如CY3?,CY5?, CY3.5?, CY5.5?, Cy7?，氧雜蒽，6-羧基-2’，4，，7，，4，7-六氯熒光素(HEX)，6-羧基 _1，4- 二氣 _2’ , 7’ - 二氣 _ 突光素(TET? )，6-竣基-4’ , 5’ - 二氣 _2’，7’ - _.甲氧基熒光素(JOE?)，N，N，N’，N’ -四甲基-6-羧基羅丹明(TAMRA?)，6-羧基-X-羅丹明(R0X)，5-羧基羅丹明-6G (R6G5)，6-羧基羅丹明-6G (RG6)，羅丹明，羅丹明綠，羅丹明紅，羅丹明110，羅丹明6G?，BODIPY染料例如BODIPY TMR，俄勒岡綠，香豆素類例如傘形
酮，苯甲酰亞胺類例如Hoechst33258，菲啶類例如德克薩斯紅?，加利福尼亞紅?,
雅吉瓦黃，Alexa Fluor? 350, Alexa Fluor? 105, Alexa Fluor? 430, Alexa Fluor?
488，Alexa Fluor? 500, Alexa Fluor? 514, Alexa Fluor?^Alexa Fluor? 546,
Alexa Fluor? 555, Alexa Fluor? 568, Alexa Fluor? o94, Alexa Fluor? 610,
Alexa Fluor? 633, Alexa Fluor? 647, Alexa Fluor? 660, Alexa Fluor? 680,
Alexa Fluor? 700，Alexa Fluor? 750，PET?,溴化乙錠，吖啶染料，咔唑染料，吩噁嗪染料，卟啉染料，聚甲炔染料，Atto390, Atto425, Atto465, Atto488, Atto495, Atto520,Atto532,Atto550,Atto565,Atto590,Atto594,Atto620,Atto633,Atto647N,Atto655,AttoRhoG6, Atto RholI，Atto Rhol2, Atto RholOl，BMN?-5, BMN?-6, CEQ8000D2, CEQ8000D3,CEQ8000D4, DY-480XL，DY-485XL，DY-495, DY-505, DY-510XL，DY-521XL，DY-521XL，DY-530,DY-547，DY-550，DY-555,DY-610,DY-615，DY-630，DY-631，DY-633,DY-635,DY-647，DY-651,DY-675,DY-676,DY-680,DY-681,DY-700,DY-701,DY-730, DY-731, DY-732, DY-750, DY-751，DY-776，DY-780，DY-781，DY-782,6-羧 基-4，，5，- 二氯-2，，7，- 二甲氧基熒光素(JOE),TET?, CAL Fluor? Gold540，CAL Fluor RED590，CAL Fluor Red610，CAL Fluor Red635,
IRDye? 700Dx, IRDye? 800CW, Marina Blue?, Pacific Blue?，雅吉瓦黃?,
6-(4，7- 二氯-2’，7’ - 二苯基-3’，6’ - 二特戊酰熒光素_6_甲酰胺基)-己基-1_0_ (2-氰基乙基)-(N, N- 二異丙基)-亞磷酰胺(SIMA)，CAL Fluor? Gold540, CAL Fluor?0range560, CAL Fluor Red635, Quasar570, Quasar670, LIZ,桑尼維爾紅，LC Red? 610,LC Red? 640，LCRed?67(WPLCRed? 705。在本發(fā)明的其他優(yōu)選實施方式中，標記物選自由下列構(gòu)成的熒光團組:Atto465，DY-485XL，F(xiàn)AM?，Alexa Fluor? 488, DY-495, Atto495,DY-510XL, JOE, TET?, CAL Fluor? Gold540, DY-521XL,羅丹明 6G?，雅吉瓦黃?，Atto532,Alexa Fluor?532, HEX, SIMA,Atto RhoG6, VIC,CAL Fluor 0range560,DY-530,TAMRA?, Quasar570, Cy3?, NED?, DY-550, Atto550, Alexa Fluor? 555， PET?，CALFluor RED590, ROX,德克薩斯紅?, CAL Fluor Red610, CAL Fluor Red635, Atto633,Alexa Fluor? 633，DY-630, DY-633, DY-631, LIZ, Quasar670, DY-635 和 Cy5?。在其他優(yōu)選實施方式中，標記物選自由下列構(gòu)成的熒光團組:FAM?，DY-510XL, DY-530和Atto550。
[0028]在一種實施方式中，本發(fā)明的核酸引物包含修飾的核苷酸。修飾的核苷酸涵蓋:作為標記的核苷酸的核苷酸，其選自包含上文中列出的標記物的核苷酸；修飾的核苷酸；脫堿基位點；和淬滅劑 。專業(yè)技術(shù)人員能夠根據(jù)需要從大量不同核苷酸類型中選出適合的核苷酸。在優(yōu)選實施方式中，每個N獨立地選自胸苷、腺苷、鳥苷、胞苷、尿苷和次黃苷。還涵蓋核苷酸堿基，其中所述核苷酸堿基是例如次黃嘌呤、黃嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、黃嘌呤核苷(xanthinosine)、7-甲基鳥苷、5，6-二氫尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、假尿苷、二氫尿苷、5-甲基胞苷。因此，在一種實施方式中，一個或多個“N”是修飾的核苷酸。
[0029]在本文中，“修飾的核苷酸”是指非天然核苷酸。“修飾的核苷酸”為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。然而，在本發(fā)明的一種實施方式中，修飾的核苷酸選自鎖核酸(LNA)或肽核酸(PNA )、如上文中所列出的標記的核苷酸、連接到淬滅劑的核苷酸、和脫堿基位點。
[0030]“淬滅”是指降低給定物質(zhì)的熒光強度的任何過程。在本發(fā)明的情形中，“淬滅劑”是指適合于淬滅例如標記物的基本熒光而不激活的殘基。各種不同過程可以導致淬滅，例如激發(fā)態(tài)反應、能量轉(zhuǎn)移、復合物形成和碰撞引起的淬滅。因此，淬滅通常嚴重依賴于壓力和溫度。分子氧和碘離子是常見的化學淬滅劑。淬滅為非即時光譜測定法例如激光誘導的熒光提出了問題。淬滅是熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)測定法的基礎(chǔ)。與特異性分子生物學靶相互作用后的淬滅和解淬滅，是用于分子成像的可激活光學造影劑的基礎(chǔ)。存在幾種不同的能量轉(zhuǎn)移機制:兩種染料即供體和受體之間的非輻射性機制(沒有光子吸收或發(fā)射)，
Forster共振能量轉(zhuǎn)移，Dexter能量轉(zhuǎn)移，激發(fā)復合體(激發(fā)態(tài)復合物)形成和靜態(tài)淬滅(也稱為接觸淬滅)。專業(yè)技術(shù)人員能夠根據(jù)需要選擇淬滅劑。
[0031]在本發(fā)明的情形中，“脫堿基位點”(也稱為AP位點(脫嘌呤/脫嘧啶位點))是核酸/寡核苷酸中既沒有嘌呤也沒有嘧啶堿基的位置。脫堿基位點已在“用于提高雜交和引發(fā)特異性的組合物和方法”(Compositions and Methods for Enhancing Hybridizationand Priming Specificity) (US-B16, 361，940)和“用于雜交DNA祀的無標記物檢測的方法，，(Method for Label-free Detection of Hybridized DNA Target) (US-B16, 579, 680)以及“使用含有脫堿基位點的DNA鏈在水中進行核堿基識別”(Use of AbasicSite-Containing DNA Strands for Nucleobase Recognition in Water, Yoshimoto 等，JACS Communications,網(wǎng)絡(luò)版,07/04/2003)中提到。
[0032]此外，專業(yè)技術(shù)人員將會認識到，本發(fā)明的核酸引物可以由不同類型的核酸或修飾的核酸構(gòu)成。因此，在優(yōu)選實施方`式中，核酸引物由DNA、RNA、PNA或LNA構(gòu)成。
[0033]本發(fā)明人出人意料地發(fā)現(xiàn)，如果通過連接物將標記物附連于核酸引物內(nèi)的核苷酸，可以進一步增強本發(fā)明的方法的技術(shù)效果。因此，在一種實施方式中，通過連接物將標記物附連于核苷酸。適合的連接物可以包括從現(xiàn)有技術(shù)已知的間隔物。例如，根據(jù)本發(fā)明，可以在標記物與核苷酸之間使用包含2至18個碳原子的連接物例如C5-連接物或C6-連接物。優(yōu)選地，間隔物是支鏈或直鏈氨基連接物。在其他優(yōu)選實施方式中，間隔物選自C2-至C18-連接物或氨基連接物，優(yōu)選地，間隔物選自C3-至C12-連接物或氨基連接物。連接物或氨基連接物優(yōu)選地是直鏈烷基。在非常特殊的實施方式中，間隔物是C5-間隔物或C6-間隔物?？梢允褂冒被B接物將伯氨基并到寡核苷酸的5’-末端、3’-末端、環(huán)外氨基或修飾的2’ -位置上。可以使用活性氨基，用標記試劑來標記寡核苷酸，例如采取N-羥基琥珀酰亞胺酯的形式。
[0034]本發(fā)明的方法包括核酸的擴增。擴增可以通過各種已知擴增方法來進行。因此，在本發(fā)明的一種實施方式中，擴增通過選自下列的方法來進行:聚合酶鏈反應(PCR)，等溫擴增(例如在Walker等，“鏈置換擴增一一種等溫體外DNA擴增技術(shù)”(Strand displacementamplification—an isothermal, in vitro DNA amplification technique), NucleicAcids Res.20 (7):1691-6 (1992)中)，連接酶鏈反應(LCR ;例如在 Landegren 等，“連接酶介導的基因檢測技術(shù)”(ALigase-Mediated Gene Detection Technique),Science241:1077-1080, 1988 或 Wiedmann 等，“連接酶鏈反應(LCR) 一概述和應用”(Ligase Chain Reaction (LCR)—Overview and Applications),《PCR 方法和應用》(PCRMethods and Applications) (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor Laboratory, NY, 1994) pp.S51-S64.)中),基于轉(zhuǎn)錄的擴增系統(tǒng)(TAS),基于核酸序列的擴增(NASBA ;Kievits 等，(1991) J Virol Methods35:273-286)，滾環(huán)擴增(RCA ;例如在Liu等，“滾環(huán)DNA合成:小的環(huán)狀寡核苷酸作為DNA聚合酶的有效模板”(Rollingcircle DNA synthesis:Small circular oligonucleotides as efficient templatesfor DNA polymerases), J.Am.Chem.Soc.118:1587-1594 (1996)中),轉(zhuǎn)錄介導的擴增(TMA ；Vuorinen 等，(1995) J Clin Microbiol33:1856-1859),自持序列復制(3SR)，擴增，鏈置換擴增(SDA) (Walker 等，(1992) Nucleic Acids Res20 (7): 1691-6)，多重置換擴增(MDA) (Dean 等，(2OO2)Proc Natl Acad Sci USA" (8):5261_5266)，限制性酶輔助的 RCA(Wang 等，(2004) Genome Resl4:2357 - 2366)，單引物等溫擴增(SPIA ；Dafforn 等，(2004)Biotechniques37 (5):854-7),環(huán)介導的等溫擴增(LAMP ；Notomi 等，(2000)Nucleic AcidsRes28 (12):e63)，轉(zhuǎn)錄介導的擴增(TMA)，解旋酶依賴性擴增(HDA)，熱穩(wěn)定HDA (tHDA) (An等，(2005)J Biol Chem280 (32):28952_28958)，smart 擴增方法(SMAP ;Mitani 等，(2007)Nat Methods4 (3):257-62))，定量實時 PCR (qPCR)，反轉(zhuǎn)錄酶 PCR (RT-PCR), Sanger 測序。
[0035]本發(fā)明還涉及用于測序或擴增和檢測核酸的試劑盒，所述試劑盒包含:
[0036]-包含至少一個標記的核苷酸的核酸引物，
[0037]其中所述核酸引物包含下列序列:
[0038]5，-NaXNb_3，，
[0039]其中N可以是任意核苷酸或修飾`的核苷酸，
[0040]其中a和b表示核苷酸數(shù)量并且可以在I至150的范圍內(nèi)，并且其中X是所述至少一個標記的核苷酸。
[0041]如上所概述的用于本發(fā)明方法的核酸引物的實施方式，也適用于本發(fā)明試劑盒的核酸引物。
[0042]如上所概述的，擴增方法可以選自不同方法。取決于模板核酸和擴增方法，可以將不同酶或試劑合并到本發(fā)明的試劑盒中。在其他實施方式中，除了核酸引物之外，試劑盒還包含緩沖劑、dNTP和/或NTP和/或酶。
[0043]在本發(fā)明的一種實施方式中，試劑盒還包含聚合酶。聚合酶可以作為獨立的反應試劑存在于試劑盒中，或者可以以合并的測定混合物例如主混合物的形式與其他試劑盒組分預先混合在一起。DNA聚合酶優(yōu)選地是“熱穩(wěn)定的”，意味著它在用于變性DNA鏈的高溫下一般是穩(wěn)定的。更具體來說，熱穩(wěn)定DNA聚合酶在PCR中使用的高溫下不顯著失活。這樣的溫度隨著大量反應條件，包括pH、鹽濃度和本領(lǐng)域已知的其他條件而變。在本發(fā)明的情形中，優(yōu)選的實施方式包含可能具有5’ -3’外切酶活性的熱穩(wěn)定DNA聚合酶或具有降低的或不具有5’ -3’外切酶活性的熱穩(wěn)定DNA聚合酶。在另一種實施方式中，熱穩(wěn)定DNA聚合酶可能另外具有3’ -5’外切酶(校正讀碼)活性。在本領(lǐng)域中已報道了大量熱穩(wěn)定DNA聚合酶。特別有用的聚合酶是從各種棲熱菌屬(Thermus)細菌物種例如水生棲熱菌(Thermus aquaticus)、Thermus filiformis、黃棲熱菌(Thermus flavus)或嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)獲得的聚合酶。其他有用的熱穩(wěn)定聚合酶從各種其他微生物來源包括Thermococcus literal is、強烈熾熱球菌(Pyrococcus furiosus)、熱袍菌屬菌種(Thermotoga sp.)以及在TO-A-89/06691 (1989年7月27日出版)中描述的微生物獲得。這樣的聚合酶包括但不限于嗜熱棲熱菌(Tth) DNA聚合酶、水生棲熱菌(Taq) DNA聚合酶、Thermotoga neopalitana (Tne) DNA 聚合酶、海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)(Tma) DNA 聚合酶、Thermococcus litoralis (Tli 或 VENT.(TM) ?) DNA 聚合酶、Thermuseggertssonii (Teg) DNA聚合酶、強烈熾熱球菌(Pfu) DNA聚合酶、DEEPVENT.DNA聚合酶、Pyrococcus woosii (Pwo)DNA 聚合酶、Pyrococcus sp KDD2 (KOD)DNA 聚合酶、嗜熱脂肪芽抱桿菌(Bacillus sterothermophiIus) (Bst) DNA 聚合酶、Bacillus caldophilus (Bea)DNA聚合酶、嗜熱硫化葉菌(Sulfolobus acidocaldarius) (Sac) DNA聚合酶、嗜酸熱原體(Thermoplasma acidophilum) (Tac)DNA 聚合酶、Thermus flavus (Tfl/Tub)DNA 聚合酶、紅色棲熱菌(Thermus ruber) (Tru) DNA 聚合酶、Thermus brockianus (DYNAZYME) DNA 聚合酶、Methanobacterium thermoautotrophicum (Mth) DNA 聚合酶、分枝桿菌 DNA 聚合酶(Mtb，Ml印)，及其突變體、變體和衍生物，包括在室溫下無活性并且通過在高溫下溫育可以快速重新獲得全部活性的熱啟動聚合酶。
[0044]當在本文中使用時，術(shù)語“dNTP”是指脫氧核糖核苷三磷酸。這樣的dNTP的非限制性實例是dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP，其也可以以標記的衍生物的形式存在，例如包含熒光標記物、放射活性標記物、生物素標記物。還涵蓋具有修飾的核苷酸堿基的dNTP，其中所述核苷酸堿基是例如次黃嘌呤、黃嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、次黃苷、黃嘌呤核苷、7-甲基鳥苷、5，6-二氫尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、假尿苷、二氫尿苷、5-甲基胞苷。此外，上述分子的ddNTP也涵蓋在本發(fā)明中。
[0045]當在本文中使用前，術(shù)語“NTP”是指核糖核苷三磷酸。這樣的NTP的非限制性實例是ATP、GTP、CTP、TTP、UTP,其也可以以標記的衍生物的形式存在，例如包含熒光標記物、放射活性標記物、生物素標 記物。
[0046]本發(fā)明還涉及本發(fā)明的試劑盒或核酸引物在測序或擴增和檢測核酸的方法中的使用。上文中描述的核酸引物的實施方式，也適用于所使用的核酸引物的實施方式。
實施例
[0047]實施例1
[0048]在這些實施例中的PCR如下進行:
[0049]使用0.2 ii I Multi Taq2DNA 聚合酶(QIAGEN, Hilden, Germany)作為熱啟動 DNA聚合酶。使用 2.5 u I Reaction MixB (QIAGEN, Hilden, Germany)作為 PCR 緩沖溶液。使用 0.4 u M 內(nèi)部標記的正向引物 D16-P-1ntern (5，-gggggtctaagagcXtgtaaaaag-3’ ；SEQID N0.1 ;其中X表示連接到胸苷核苷酸的環(huán)外氨基的ATT0550)或0.4 ii M標記的正向引物D16-P-ATT0550 (5，-ATT0550-gggggtctaagagcttgtaaaaag_3，；SEQ ID N0.2)與 0.4u M 未標記的 D16_rev 反向引物(5，-gtttgtgtgtgcatctgtaagcatgtatc-3’ ；SEQ ID N0.3)的組合進行 PCR,所有引物由 Biomers.net (Ulm, Germany)生產(chǎn)。
[0050]表1:
[0051]
【權(quán)利要求】
1.一種用于核酸測序或擴增和檢測的方法，所述方法包括下列步驟: i)提供至少一種核酸引物，其包含至少一個標記的核苷酸， ii)提供酶和試劑，使用所述至少一種標記的核酸引物來擴增靶核酸， iii)將反應組分在適合于靶核酸引物擴增的條件下溫育， iv)通過標記的核苷酸來檢測擴增的核酸， 其中所述核酸引物包含下列序列:
5，-NaXNb-3，， 其中N可以是任意核苷酸， 其中“a”和“b”表示核苷酸的數(shù)量并且可以在I至150的范圍內(nèi)，并且其中X是所述至少一個標記的核苷酸。
2.權(quán)利要求1的方法，其中步驟iv)包括按照大小分離所述擴增的核酸的步驟。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中標記物通過核苷酸的環(huán)外氨基或2’-氨基連接到所述核苷酸。
4.權(quán)利要求1至3任一項的方法，其中“a”在3至25之間。
5.權(quán)利要求1至4任一項的方法，其中“b”在3至25之間。
6.權(quán)利要求1至5任一項的方法，其中所述核酸引物具有10至300nt的長度。
7.權(quán)利要求1至6任一項的方法，其中標記物選自由熒光團、生色團、放射性同位素和化學發(fā)光物構(gòu)成的標記物組，并且所述熒光團組包含5-或6-羧基熒光素(FAM?)、VIC?、NED?、熒光素、熒光素異硫氰酸酯(FITC)、IRD-700/800、花青染料例如CY3?、CY5?、CY3.5?、CY5.5?、Cy7?、氧雜蒽、6-羧基-2’，4，，7，，4，7-六氯熒光素(HEX)、6_ 羧基-1，4-二氯-2’，7’ - 二氯-熒光素(TET?)、6-羧基-4’，5’ - 二氯-2’，7’ - 二甲氧基熒光素(JOE?)、N，N，N’，N’ -四甲基-6-羧基羅丹明(TAMRA?)、6-羧基-X-羅丹明(ROX)、5-羧基羅丹明-6G (R6G5)、6-羧基羅丹明-6G (RG6)、羅丹明、羅丹明綠、羅丹明紅、羅丹明110、羅丹明6G^、BODIPY染料例如BODIPY TMR、俄勒岡綠、香豆素類例如傘形酮、苯甲酰亞胺類例如Hoechst33258、菲啶類例如德克薩斯紅?、加利福尼亞紅?、雅吉瓦黃、A:k'xa Fluor? 350、Alexa Fluor?.405、Alexa Fluor? 430、Alexa Fluor?488、Alexa Fluor? i5()0、Alexa Fluor? 514、Alexa Fluor?532、Alexa Fluor?546、Alexa Fluor? W、Alexa Fluor? 568> Alexa Fluor? 594、Alexa Fluor? 610>Alexa Fluor? 633、Alexa Fluor? 647、Alexa Fluor? 660、Alexa Fluor? 680、Alexa Fluor? 700、Alexa Fluor? 750、PET?、溴化乙錠、吖啶染料、咔唑染料、吩噁嗪染料、卟啉染料、聚甲炔染料、Atto390、Atto425、Atto465、Atto488、Atto495、Atto520、Atto532、Atto550、Atto565、Atto590、Atto594、Atto620、Atto633、Atto647N、Atto655、AttoRhoG6、Atto RholU Atto Rhol2、Atto RholOl、BMN?_5、BMN?_6、CEQ8000D2、CEQ8000D3、CEQ8000D4、DY-480XL、DY-485XL、DY-495、DY-505、DY-510XL、DY-521XL、DY-521XL、DY-530、DY-547、DY-550、DY-555、DY-610、DY-615、DY-630、DY-631、DY-633、DY-635、DY-647、DY-651、DY-675、DY-676、DY-680、DY-681、DY-700、DY-701、DY-730、DY-731、DY-732、DY-750、DY-751、DY-776、DY-780、DY-781、DY-782、6-羧基-4，，5，- 二氯-2，，7，- 二甲氧基熒光素(JOE),TET?、CAL Fluor? Gold540、CAL Fluor RED590、CAL Fluor Red610、CAL Fluor Red635、IRDye? 700Dx、IRDye? 800CW、Marina Blue?、Pacific Blue?、雅吉瓦黃?、6- (4，7- 二氯-2’，7’ - 二苯基-3’，6’ - 二特戊酰熒光素_6_甲酰胺基)-己基-1_0_ (2-氰基乙基)_(N, N-二異丙基)-亞磷酰胺(SIMA)、CAL Fluor? Gold540、CAL Fluor? 0range560、CAL Fluor Red635、Quasar570、Quasar670、LIZ、桑尼維爾紅、LC Red? 610,LC Red? 640、LC Red?670 和 LC Red? 705。
8.權(quán)利要求1至7任一項的方法，其中所述擴增方法選自聚合酶鏈反應(PCR)、連接酶鏈反應(LCR)、基于轉(zhuǎn)錄的擴增系統(tǒng)(TAS)、基于核酸序列的擴增(NASBA)、滾環(huán)擴增(RCA)、轉(zhuǎn)錄介導的擴增(TMA)、自持序列復制(3310和00擴增鏈置換擴增(SDA)、多重置換擴增(MDA)、環(huán)介導的等溫擴增(LAMP)、解旋酶依賴性擴增(HDA)、smart擴增方法(SMAP)、定量實時 PCR (qPCR)、反轉(zhuǎn)錄酶 PCR (RT-PCR)、Sanger 測序。
9.一種用于核酸測序或擴增和檢測的試劑盒，所述試劑盒包含: 核酸引物，其包含至少一個標記的核苷酸， 其中所述核酸引物包含下列序列:
5，_NaXNb-3，， 其中N可以是任意核苷酸或修飾的核苷酸， 其中a和b表示核苷酸的數(shù)量并且可以在I至150的范圍內(nèi)，其中X是所述至少一個標記的核苷酸。
10.權(quán)利要求9的試劑盒，其還包含用于擴增核酸的酶和試`劑。
11.權(quán)利要求9或10的試劑盒或包含至少一個標記的核苷酸的核酸引物在核酸測序或擴增和檢測方法中的用途，其中所述核酸引物具有下列序列: ` 5，-NaXNb-3，， 其中N可以是任意核苷酸， 其中“a”和“b”表示核苷酸的數(shù)量并且可以在I至150的范圍內(nèi)，其中X是所述至少一個標記的核苷酸。
【文檔編號】C12Q1/68GK103502475SQ201280022096
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2012年5月4日 優(yōu)先權(quán)日:2011年5月6日
【發(fā)明者】弗蘭切斯卡·迪帕斯奎爾, 丹尼爾·米勒 申請人:凱杰有限公司