低巖藻糖細(xì)胞系及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種用作表達(dá)重組蛋白宿主細(xì)胞的具有零巖藻糖水平的細(xì)胞的選擇方法。該方法包括：(d)使CHO細(xì)胞接觸氨甲喋呤(MTX)從而在CHO細(xì)胞的細(xì)胞群中導(dǎo)入基因突變；(e)使含有突變細(xì)胞的CHO細(xì)胞群接觸無(wú)毒巖藻糖結(jié)合劑一定的時(shí)間量，使巖藻糖結(jié)合劑結(jié)合于該細(xì)胞群細(xì)胞膜的巖藻糖部分，其中所述一定的時(shí)間量不會(huì)導(dǎo)致殺傷細(xì)胞；和(f)清除含突變細(xì)胞的細(xì)胞群中結(jié)合該巖藻糖結(jié)合劑的細(xì)胞亞群，從而選出細(xì)胞用作表達(dá)重組蛋白的宿主細(xì)胞，所選細(xì)胞的巖藻糖含量為零。本發(fā)明還公開(kāi)了用作表達(dá)重組蛋白宿主細(xì)胞的細(xì)胞和細(xì)胞系。
【專利說(shuō)明】低巖藻糖細(xì)胞系及其應(yīng)用
[0001]發(fā)明領(lǐng)域和背景
[0002]本發(fā)明在其某些實(shí)施方式中涉及CHO細(xì)胞系，產(chǎn)生該細(xì)胞系的方法及其應(yīng)用。
[0003]重組的治療性抗體在治療各種各樣疾病中已發(fā)揮了重要作用。估計(jì)下一個(gè)十年中可能約30%新出現(xiàn)的藥物基于抗體。已批準(zhǔn)了 30種重組抗體和Fe融合物進(jìn)入市場(chǎng)，2008年銷(xiāo)售額達(dá)到350億美元。
[0004]抗體含有由重鏈和輕鏈可變區(qū)組成的靶抗原特異性區(qū)域?？贵w的這個(gè)部分可結(jié)合和中和可溶性靶抗原或膜結(jié)合的靶抗原。
[0005]Fe部分通過(guò)抗體依賴的細(xì)胞毒(ADCC)機(jī)制、補(bǔ)體依賴的復(fù)合體(OTC)和新生受體FcRn機(jī)制負(fù)責(zé)效應(yīng)器功能。通過(guò)效應(yīng)分子與鉸鏈區(qū)和Fe的CH2區(qū)的相互作用介導(dǎo)了這些效應(yīng)器功能。CH2區(qū)含有一個(gè)位于抗體297位N糖基化位點(diǎn)的寡糖，已知其在結(jié)合效應(yīng)細(xì)胞中起著重要作用。該寡糖通常由具有相當(dāng)大異質(zhì)性的雙觸角型復(fù)合體如核心戊糖與附加的可變外糖殘基一起組成。
[0006]ADCC是一種重要的抗體結(jié)合靶細(xì)胞膜配體的殺傷機(jī)制。白細(xì)胞上表達(dá)的FcyR能結(jié)合抗體的CH2區(qū)。一旦結(jié)合，與靶細(xì)胞上的抗原產(chǎn)生免疫復(fù)合體而啟動(dòng)白細(xì)胞活化。這種活化可包括吞噬和細(xì)胞介質(zhì)的釋放，這些介質(zhì)導(dǎo)致細(xì)胞通透增加和死亡。ADCC活性一方面依賴于IgG同種型，另一方面依賴于特異性的FcYR。IgGl和IgG3可誘導(dǎo)這種活性，而IgG4則不能。能結(jié)合IgG并對(duì)ADCC激活機(jī)制重要的FcyR稱為FcYRIIIa，其表達(dá)在NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上。在許多情況下通過(guò)NK細(xì)胞與靶細(xì)胞的結(jié)合所獲得的ADCC活性并不足以實(shí)施對(duì)靶細(xì)胞的殺傷。其原因是FcYRIIIa對(duì)IgGl的親和力低。
[0007]與表達(dá)FcYRIIIa-158Phe的患者相比，見(jiàn)于10-15%人群的表達(dá)高親和力同種異型FcYRIIIa-158Val的患者中 ，發(fā)現(xiàn)ADCC活性增強(qiáng)。也可通過(guò)對(duì)IgGFc操作來(lái)獲得ADCC增強(qiáng)。利用計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)算法對(duì)抗體進(jìn)行工程改造，并用高通量篩選來(lái)選擇高親和力抗體。這一工作產(chǎn)生了在體外顯示效應(yīng)器功能增強(qiáng)大于2個(gè)數(shù)量級(jí)的抗體(Lazar, Dang等；2006),雖然測(cè)得突變的IgGl (含S239D、A330L和I332E的IgGl)熱穩(wěn)定性降低。獲得ADCC增強(qiáng)的抗體的另一種方法是產(chǎn)生寡糖上297位的巖藻糖水平低的抗體。先前曾發(fā)現(xiàn)該寡糖上的巖藻糖殘基可干擾Fe與FcyRIIIa的結(jié)合(Shinkawa, Nakamura等；2003)。獲得低巖藻糖水平抗體的一種方法是采用具有這種天然能力的控制細(xì)胞，如大鼠雜交瘤YB2/0細(xì)胞(Shinkawa, Nakamura等；2003),然而這些細(xì)胞產(chǎn)生的重組蛋白的巖藻糖含量水平是可變的。幾種可能采用的其他非哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括Vivalis類的禽細(xì)胞，Biolex公司工程改造的水生植物浮萍(Cox, Sterling等;2006)和Igeneon公司的變種Physocmirtella苔蘚(Nechansky, Schuster等；2007)。此外，GlycoFi制備了具有幾種糖基化能力包括增強(qiáng)ADCC的多種畢赤酵母細(xì)胞系(Hamilton, Davidson等；2006)。也可采用幾種哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)制備具有各種通用糖基化能力特別是增強(qiáng)ADCC的抗體。Glycotope創(chuàng)造了多種糖基經(jīng)工程改造的人細(xì)胞系以產(chǎn)生糖基優(yōu)化的生物治療劑。羅氏公司通過(guò)導(dǎo)入一種能催化形成涉及抗體依賴性細(xì)胞毒(ADCC)的二等份寡糖的糖基轉(zhuǎn)移酶，β (I, 4)-N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶III(GnTIII),獲得了 Glycart，一種能產(chǎn)生巖藻糖水平降低的重組抗體的基因工程細(xì)胞系，(Umana, Jean-Mairet等；1999)。Biowa公司制備了巖藻糖轉(zhuǎn)移酶基因(Fut8)被敲除的 CHO DG44 細(xì)胞以降低巖藻糖水平(Yamane-Ohnuki, Kinoshita 等；2004)。[0008]近年研究證明在胞質(zhì)內(nèi)異源表達(dá)的原核酶，⑶P-6-脫氧-D-來(lái)蘇糖-4-已酮糖還原酶，能阻斷中間體GDP-4-酮-6-脫氧甘露糖轉(zhuǎn)變成終末產(chǎn)物，這在脊椎動(dòng)物細(xì)胞中通常不會(huì)發(fā)生。因此，用這種方法修飾的CHO細(xì)胞分泌的抗體缺乏核心巖藻糖(vonHorsten, Ogorek等；)。另一種方法是制備能在毒性巖藻糖特異性凝集素存在下存活的凝集素抗性突變體。Lecl3細(xì)胞是基于在毒碗豆巖藻糖特異性凝集素存在下培育CHO細(xì)胞所產(chǎn)生的一種CHO細(xì)胞系(Ripka和Stanley, 1986)。Lecl3細(xì)胞缺乏⑶P-甘露糖4，6-脫水酶活性，導(dǎo)致表達(dá)的人IgGl缺乏巖藻糖(Shields，Lai等；2002)。[0009]美國(guó)專利申請(qǐng)N0.2010/0081150報(bào)告了用化學(xué)方法處理和選擇顯示變體糖基化模式的細(xì)胞(包括用高劑量巖藻糖殺傷細(xì)胞以降低巖藻糖基化)所產(chǎn)生的CHO細(xì)胞突變體，以產(chǎn)生用于表達(dá)抗體的細(xì)胞。[0010]美國(guó)專利申請(qǐng)N0.2010/0304436報(bào)告了通過(guò)突變Fx蛋白和調(diào)控外源巖藻糖的利用度產(chǎn)生巖藻糖基化降低的CHO細(xì)胞系，以指導(dǎo)細(xì)胞巖藻糖基化多肽的能力。[0011]Kanda 等(Kanda, Ima1-Nishiya 等，2007)公開(kāi)了 GMD 和 FUT8 基因被敲除的宿主細(xì)胞系。該GMD敲除細(xì)胞具有與GMD外顯子5，6和7區(qū)相應(yīng)的基因組缺失。[0012]Ripka等(Ripka和Stanley, 1986)公開(kāi)了 4種凝集素抗性CHO突變細(xì)胞。通過(guò)用N-甲基-N-亞硝基胍培育產(chǎn)生這類突變。[0013]Shields等(Shields, Lai等；2002)公開(kāi)了 Lecl3 (巖藻糖缺陷的CH0)細(xì)胞系產(chǎn)生的IgGl提高了與FcyRIIIa的結(jié)合高達(dá)50倍，其ADCC也增強(qiáng)。[0014]Kanda 等(Kanda, Yamane-Ohnuki 等，2006)公開(kāi)了 Lecl3 細(xì)胞可產(chǎn)生 50-70% 巖藻糖基化的抗體，然而該已知的細(xì)胞系不能穩(wěn)定產(chǎn)生抗體。因此Lecl3細(xì)胞系不適合作為生產(chǎn)細(xì)胞系。[0015]發(fā)明概沭[0016]按照本發(fā)明某些實(shí)施方式的一個(gè)方面，提供選擇CHO細(xì)胞用作表達(dá)重組蛋白的宿主細(xì)胞的方法，該方法包括:[0017](a)使CHO細(xì)胞接觸氨甲喋呤(MTX)從而在CHO細(xì)胞的細(xì)胞群中導(dǎo)入基因突變，[0018](b)使含有突變細(xì)胞的CHO細(xì)胞群接觸無(wú)毒性的巖藻糖結(jié)合劑一定量的時(shí)間，使該巖藻糖結(jié)合劑結(jié)合于該細(xì)胞群細(xì)胞膜上的巖藻糖部分，其中所述一定量的時(shí)間不會(huì)導(dǎo)致殺傷細(xì)胞；和[0019](C)清除含突變細(xì)胞的細(xì)胞群中結(jié)合該巖藻糖結(jié)合劑的細(xì)胞亞群，從而選出細(xì)胞用作表達(dá)重組蛋白的宿主細(xì)胞，所選細(xì)胞的巖藻糖含量為零。[0020]按照本發(fā)明某些實(shí)施方式的一個(gè)方面，提供按本發(fā)明上述方法產(chǎn)生的分離的CHO細(xì)胞。[0021]按照本發(fā)明某些實(shí)施方式的一個(gè)方面，提供經(jīng)基因修飾能表達(dá)具有如SEQ ID NO:23和/或24所示氨基酸序列的突變的GDP-甘露糖4，6-脫水酶(GMD)的分離的CHO細(xì)胞。[0022]按照本發(fā)明某些實(shí)施方式的一個(gè)方面，提供含有本發(fā)明分離細(xì)胞的CHO細(xì)胞系。[0023]按照本發(fā)明某些實(shí)施方式的一個(gè)方面，提供含有本發(fā)明分離的CHO細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物和沒(méi)有異種污染物的細(xì)胞培養(yǎng)液。[0024]按照本發(fā)明某些實(shí)施方式的一個(gè)方面，提供一種產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的方法，即用含有編碼該重組蛋白的核酸序列的聚核甘酸轉(zhuǎn)染本發(fā)明分離的CHO細(xì)胞，在適合表達(dá)該重組蛋白的條件下培養(yǎng)該轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞和分離該蛋白質(zhì)。
[0025]按照本發(fā)明某些實(shí)施方式的一個(gè)方面，提供一種經(jīng)基因修飾的分離的CHO細(xì)胞，使其中所表達(dá)的蛋白質(zhì)的巖藻糖基化含量呈線性依賴于外部巖藻糖濃度。
[0026]按照本發(fā)明某些實(shí)施方式，巖藻糖結(jié)合劑對(duì)突變的CHO細(xì)胞群無(wú)毒性。
[0027]按照本發(fā)明某些實(shí)施方式，巖藻糖結(jié)合劑附著于可檢測(cè)部分或親和部分。
[0028]按照本發(fā)明某些實(shí)施方式，在CHO細(xì)胞群中導(dǎo)入基因突變是通過(guò)使細(xì)胞接觸能引起巖藻糖合成通路中GDP-甘露糖4，6-脫水酶基因突變的誘變劑而實(shí)施的。
[0029]按照本發(fā)明某些實(shí)施方式，使突變的細(xì)胞群接觸巖藻糖結(jié)合劑的時(shí)間量不長(zhǎng)于60分鐘。
[0030]按照本發(fā)明某些實(shí)施方式，當(dāng)巖藻糖結(jié)合劑附著于親和部分時(shí)，所述方法還包括使突變的CHO細(xì)胞群接觸其他物質(zhì)，該其他物質(zhì)含有與該親和部分同類的結(jié)合部分。
[0031 ] 按照本發(fā)明某些實(shí)施方式，所述親和部分包括生物素。
[0032]按照本發(fā)明某些實(shí)施方式，所述同類的結(jié)合部分附著于一可檢測(cè)部分。
[0033]按照本發(fā)明某些實(shí)施方式，所述可檢測(cè)部分包括熒光基團(tuán)或磁性基團(tuán)。
[0034]按照本發(fā)明某些 實(shí)施方式，通過(guò)FACS分揀實(shí)施所述清除。
[0035]按照本發(fā)明某些實(shí)施方式，通過(guò)磁性分離實(shí)施所述清除。
[0036]按照本發(fā)明某些實(shí)施方式，通過(guò)至少三輪順次清除實(shí)施所述清除。
[0037]按照本發(fā)明某些實(shí)施方式，所述CHO細(xì)胞選自CH0-S、CH0-K1、DUXB11、CH0/DG44和Pro-5細(xì)胞。
[0038]按照本發(fā)明某些實(shí)施方式，所述巖藻糖結(jié)合劑是橙黃網(wǎng)孢盤(pán)菌(aleuriaaurantia)凝集素(AAL)或米曲霉菌1-巖藻糖特異性凝集素(AOL)。
[0039]按照本發(fā)明某些實(shí)施方式，所述分離的CHO細(xì)胞可表達(dá)野生型巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶-8(Fut8)。
[0040]按照本發(fā)明某些實(shí)施方式，所述分離的CHO細(xì)胞可表達(dá)野生型⑶P-酮基-6-脫氧甘露糖3，5-差向異構(gòu)酶，4-還原酶(FX)。
[0041]按照本發(fā)明某些實(shí)施方式，所述突變的GMD具有SEQ ID NO:23和/或24所示的
氨基酸序列。
[0042]按照本發(fā)明某些實(shí)施方式，所述分離的CHO細(xì)胞可表達(dá)突變的⑶P-甘露糖4，6-脫水酶(GMD)。
[0043]按照本發(fā)明某些實(shí)施方式，所述分離的CHO細(xì)胞具有至少370群體倍增的穩(wěn)定巖
藻糖表型。
[0044]按照本發(fā)明某些實(shí)施方式，所述CHO細(xì)胞可表達(dá)感興趣的重組蛋白。
[0045]按照本發(fā)明某些實(shí)施方式，所述細(xì)胞培養(yǎng)液含有巖藻糖。
[0046]按照本發(fā)明某些實(shí)施方式，所述細(xì)胞培養(yǎng)液不含巖藻糖。
[0047]按照本發(fā)明某些實(shí)施方式，轉(zhuǎn)染在存在外源性巖藻糖時(shí)進(jìn)行。
[0048]按照本發(fā)明某些實(shí)施方式，所述方法還包括在轉(zhuǎn)染后用含巖藻糖的培養(yǎng)液培養(yǎng)本發(fā)明的分離的CHO細(xì)胞。[0049]按照某些實(shí)施方式，所述重組蛋白是抗體。
[0050]按照某些實(shí)施方式，所述重組蛋白是Fe融合蛋白。
[0051]按照某些實(shí)施方式，所述抗體具有增強(qiáng)的ADCC。
[0052]按照某些實(shí)施方式，所述CHO細(xì)胞經(jīng)基因修飾能表達(dá)突變的⑶P-甘露糖4，6-脫水酶(GMD)。
[0053]按照某些實(shí)施方式，GMD的至少一個(gè)等位基因攜帶了至少一個(gè)可導(dǎo)致功能缺失的突變。 [0054]按照某些實(shí)施方式，GMD的各個(gè)等位基因攜帶了至少一個(gè)可導(dǎo)致功能缺失的突變。
[0055]按照某些實(shí)施方式，當(dāng)外部巖藻糖濃度為零時(shí)，所述蛋白的巖藻糖基化量為零。
[0056]按照某些實(shí)施方式，所述分離的CHO細(xì)胞的活細(xì)胞積分濃度(IVCC)比非突變的CHO細(xì)胞高20%。
[0057]除非另有說(shuō)明，本說(shuō)明書(shū)所用的所有技術(shù)和/或科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所涉及領(lǐng)域普通技術(shù)人員共同理解的相同含義。雖然在實(shí)施或測(cè)試本發(fā)明實(shí)施方式時(shí)可采用與本說(shuō)明書(shū)所述相似或等價(jià)的方法和材料，但是以下描述的是示范性的方法和/或材料。當(dāng)發(fā)生沖突的情況下，本專利說(shuō)明書(shū)，包括定義，將會(huì)予以控制。此外，所述材料、方法和實(shí)施例只是說(shuō)明性的，并不意味著是必需的限制。
[0058]附圖的簡(jiǎn)要i兌明
[0059]這里僅通過(guò)實(shí)施例并參見(jiàn)附圖和圖像，描述本發(fā)明的某些實(shí)施方式?，F(xiàn)在具體參見(jiàn)附圖細(xì)節(jié)，要強(qiáng)調(diào)的是通過(guò)實(shí)施例來(lái)顯示詳情，目的是說(shuō)明性地討論本發(fā)明的實(shí)施方式。在這方面，通過(guò)附圖進(jìn)行的描述可使得本領(lǐng)域技術(shù)人員明白本發(fā)明的實(shí)施方式可如何進(jìn)行實(shí)施。
[0060]在附圖中:
[0061]圖1是用于獲得表達(dá)零水平或低水平巖藻糖多肽的細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)方法流程圖。
[0062]圖2是完整的和單體抗-EGFR mAb純化過(guò)程的流程圖。
[0063]圖3是通過(guò)Octet作動(dòng)力學(xué)分析的示范性概況。
[0064]圖4是分離低巖藻糖ITL-LFl細(xì)胞(沒(méi)有外源性巖藻糖時(shí)其巖藻糖含量為零)示范性方法的說(shuō)明圖。將CHO-S細(xì)胞與誘變劑氨甲喋呤(MTX) —起培育，然后用生物素化巖藻糖特異性凝集素(生物素化AAL)標(biāo)記細(xì)胞，分離除去不結(jié)合鏈霉親和素包被磁珠的細(xì)胞，對(duì)低巖藻糖細(xì)胞作二輪選擇。此步驟后是又一輪選擇，其中用生物素化巖藻糖特異性凝集素(生物素化AAL)和熒光鏈霉親和素標(biāo)記細(xì)胞，用FACS選擇低熒光細(xì)胞。
[0065]圖5是分離低巖藻糖ITL-LFl細(xì)胞的示范性方法的說(shuō)明圖。將CHO-S細(xì)胞與誘變劑MTX —起培育，然后進(jìn)行4輪用生物素化巖藻糖特異性凝集素(生物素化AAL)和熒光鏈霉親和素標(biāo)記細(xì)胞，再用FACS分揀低熒光細(xì)胞。
[0066]圖6是用磁珠分離后用FACS分析經(jīng)MTX處理和未處理CHO細(xì)胞的巖藻糖水平的說(shuō)明圖。用生物素化AAL標(biāo)記與MTX —起培育或未一起培育的CHO-S細(xì)胞，與鏈霉親和素包被磁珠混合。用磁鐵分離細(xì)胞，使不附著磁鐵的細(xì)胞進(jìn)一步增殖。用生物素化AAL標(biāo)記細(xì)胞，然后用熒光鏈霉親和素染色進(jìn)行FACS分析。未標(biāo)記的MTX處理的CHO-S細(xì)胞(□)，與MTX培育標(biāo)記了 AAL的CHO-S細(xì)胞(〇)，與MTX —起培育用珠分揀的低巖藻糖CHO-S細(xì)胞(Λ)，用珠分揀的CHO-S細(xì)胞(O)。[0067]圖7A是用磁珠分離的ITL-LFl細(xì)胞上巖藻糖水平FACS分析的說(shuō)明圖。將與MTX培育的CHO-S細(xì)胞用生物素化AAL標(biāo)記，與鏈霉親和素包被磁珠混合。用磁鐵分離細(xì)胞，使不附著磁鐵的細(xì)胞進(jìn)一步增殖。重復(fù)此步驟二次，然后用生物素化AAL和熒光鏈霉親和素標(biāo)記細(xì)胞，使FACS分揀的低熒光細(xì)胞進(jìn)一步增殖。通過(guò)用生物素化AAL和熒光鏈霉親和素標(biāo)記細(xì)胞進(jìn)行FACS分析。未標(biāo)記的MTX處理的CHO-S細(xì)胞(□)，經(jīng)MTX處理的CHO-S細(xì)胞(〇)，經(jīng)MTX處理然后一輪珠分離的CHO-S細(xì)胞(Λ)，經(jīng)MTX處理然后二輪珠分離的CHO-S細(xì)胞(O)A^MTX處理然后二輪珠分離及一輪FACS分揀的CHO-S細(xì)胞(V)。
[0068]圖7B是對(duì)用米曲霉菌1-巖藻糖特異性凝集素(AOL)所選細(xì)胞的巖藻糖水平作FACS分析的說(shuō)明圖。未標(biāo)記的CHO-S細(xì)胞(DXCHO-S細(xì)胞(〇)，經(jīng)MTX處理和一輪珠分離的CHO-S細(xì)胞(Λ)，經(jīng)MTX處理和二輪珠分離的CHO-S細(xì)胞(?)，經(jīng)MTX處理然后二輪珠分離及一輪FACS分揀的CHO-S細(xì)胞(V)。
[0069]圖8A是不同培養(yǎng)液培養(yǎng)的ITL-LFl細(xì)胞巖藻糖水平FACS分析的說(shuō)明圖。在ProCH05和C6614中培養(yǎng)增殖ITL-LFl細(xì)胞，然后在用生物素化AAL和熒光鏈霉親和素標(biāo)記細(xì)胞后作FACS分析。未標(biāo)記的經(jīng)MTX處理的CHO-S細(xì)胞(□)，ProCH05培養(yǎng)增殖的CHO-S細(xì)胞(〇)，ProCH05培養(yǎng)增殖的ITL-LFl細(xì)胞(Λ)，C6614培養(yǎng)增殖的ITL-LFl細(xì)胞(O)。
[0070]圖8B是經(jīng)MTX處理后用磁珠和FACS分離的CHO-S細(xì)胞的巖藻糖水平FACS分析說(shuō)明圖。將與MTX培育的CHO-S細(xì)胞用生物素化AOL標(biāo)記，與鏈霉親和素包被磁珠混合。用磁鐵分離細(xì)胞，使不附著磁鐵的細(xì)胞進(jìn)一步增殖。重復(fù)此步驟二次，然后用生物素化AOL和熒光鏈霉親和素標(biāo)記細(xì)胞，用FACS分揀低熒光細(xì)胞并進(jìn)一步增殖。用生物素化AOL和熒光鏈霉親和素標(biāo)記細(xì)胞進(jìn)行FACS分析。未標(biāo)記的CHO-S細(xì)胞(DXCHO-S細(xì)胞(〇)，經(jīng)MTX處理然后一輪珠分離的CHO-S細(xì)胞(Λ)，經(jīng)MTX處理然后二輪珠分離的CHO-S細(xì)胞(?)，經(jīng)MTX處理然后二輪珠分 離及一輪FACS分揀的CHO-S細(xì)胞(V)。
[0071]圖9是不同培養(yǎng)液培養(yǎng)的ITL-LFl細(xì)胞唾液酸水平FACS分析的說(shuō)明圖。分析了用ProCH05和C6614培養(yǎng)液培養(yǎng)的ITL-LFl細(xì)胞中的唾液酸水平。用偶聯(lián)FITC的唾液酸結(jié)合特異性凝集素(MAA)標(biāo)記細(xì)胞作FACS分析。未標(biāo)記的CHO-S細(xì)胞(□)，MAA-FITC標(biāo)記的CHO-S細(xì)胞(〇)，經(jīng)ProCH05培養(yǎng)用MAA-FITC標(biāo)記的ITL-LFl細(xì)胞(Λ)，經(jīng)C6614培養(yǎng)用MAA-FITC標(biāo)記的ITL-LFl細(xì)胞(O)。
[0072]圖10是評(píng)價(jià)ITL-LFl細(xì)胞巖藻糖穩(wěn)定性的說(shuō)明圖。對(duì)完成分離步驟后不同時(shí)間點(diǎn)ITL-LFl細(xì)胞表面的巖藻糖水平作FACS分析，以評(píng)價(jià)低巖藻糖表達(dá)的穩(wěn)定性。為了分析，用生物素化ALL和熒光鏈霉親和素標(biāo)記該細(xì)胞。
[0073]圖11是評(píng)價(jià)ITL-LFl細(xì)胞生長(zhǎng)速率的說(shuō)明圖。使ITL-LFl細(xì)胞按363群體倍增水平(roL)增殖，測(cè)定每次傳代后的生長(zhǎng)速率。
[0074]圖12是用連續(xù)FACS分揀分離得到的ITL-LF2細(xì)胞FACS分析的說(shuō)明圖。用生物素化AAL和熒光鏈霉親和素標(biāo)記經(jīng)MTX培育的CHO-S細(xì)胞。用FACS分揀低熒光細(xì)胞并使其進(jìn)一步增殖。重復(fù)此步4次。用生物素化AAL和突光鏈霉親和素標(biāo)記細(xì)胞進(jìn)行FACS分析。未標(biāo)記的MTX處理CHO-S細(xì)胞(□)，經(jīng)MTX處理的CHO-S細(xì)胞(〇)，第一次分揀后經(jīng)MTX處理的CHO-S細(xì)胞(Λ)，第二次分揀后經(jīng)MTX處理的CHO-S細(xì)胞(?)，第三次分揀后經(jīng)MTX處理的CHO-S細(xì)胞(▼)，第四次分揀后經(jīng)MTX處理的CHO-S細(xì)胞(實(shí)心)。
[0075]圖13是不同培養(yǎng)液培養(yǎng)的ITL-LF2細(xì)胞巖藻糖水平FACS分析的說(shuō)明圖。在ProCH05和C6614培養(yǎng)液中培養(yǎng)增殖ITL-LF2細(xì)胞，用生物素化AAL和熒光鏈霉親和素標(biāo)記后作FACS分析。未標(biāo)記的CHO-S細(xì)胞(□)，用ProCH05培養(yǎng)的CHO-S細(xì)胞(〇)，用ProCH05培養(yǎng)的ITL-LF2細(xì)胞(Λ)，用C6614培養(yǎng)的ITL-LF2細(xì)胞(?)?
[0076]圖14是ITL-LF2細(xì)胞唾液酸水平FACS分析的說(shuō)明圖。分析了用ProCH05培養(yǎng)的ITL-LF細(xì)胞的唾液酸水平。用偶聯(lián)FITC的唾液酸結(jié)合凝素(MAA)標(biāo)記細(xì)胞，作FACS分析。未標(biāo)記的CHO-S細(xì)胞(□ )，MAA-FITC標(biāo)記的CHO-S細(xì)胞(〇)，經(jīng)ProCH05培養(yǎng)用MAA-FITC標(biāo)記的ITL-LF2細(xì)胞(Λ)。
[0077]圖15是分離步驟完成后不同時(shí)間點(diǎn)ITL-LF2細(xì)胞表面巖藻糖水平FACS分析的說(shuō)明圖，用以評(píng)價(jià)低巖藻糖表達(dá)的穩(wěn)定性。為了分析，用生物素化AAL和熒光鏈霉親和素標(biāo)記細(xì)胞。
[0078]圖16是ITL-LF2細(xì)胞生長(zhǎng)速率的說(shuō)明圖。使ITL-LF2細(xì)胞按363群體倍增水平(PDL)增殖，測(cè)定每次傳代后的生長(zhǎng)速率。
[0079]圖17是評(píng)價(jià)ProCH05培養(yǎng)的ILA-LF2細(xì)胞最高細(xì)胞濃度的說(shuō)明圖。在一個(gè)批處理中接種0.2xl06個(gè)細(xì)胞，每二天測(cè)定一次細(xì)胞數(shù)。CHO-S細(xì)胞(〇)和ITL-LF2細(xì)胞(Λ)。
[0080]圖18是外源性巖藻糖對(duì)ITL-LF2細(xì)胞巖藻糖基化水平影響的說(shuō)明圖。在ProCH05培養(yǎng)液中以0.2xl06細(xì)胞/ml濃度接種ITL-LF2細(xì)胞，其中加入不同濃度的L-巖藻糖，在含CO2的溫箱中37°C、320rpm振搖培養(yǎng)。
[0081]圖19A是在一個(gè)批處理中培養(yǎng)的ITL-LF2和CHO-S細(xì)胞活力的說(shuō)明圖。在一個(gè)批處理中以0.2xl06細(xì)胞/ml濃度在含添加劑的ProCH05培養(yǎng)液中接種細(xì)胞，分析該過(guò)程中的細(xì)胞活力。CHO-S細(xì)胞(〇)和ITL-LF2細(xì)胞(Λ)。
[0082]圖19B是在一個(gè)批處理·中培養(yǎng)的ITL-LF2和CHO-S活細(xì)胞濃度的說(shuō)明圖。在ProCH05培養(yǎng)液和添加劑中在一個(gè)批處理中以0.2xl06細(xì)胞/ml濃度接種細(xì)胞，分析該過(guò)程中的細(xì)胞數(shù)。CHO-S細(xì)胞(〇)和ITL-LF2細(xì)胞(Λ)。
[0083]圖19C是在一個(gè)批處理中培養(yǎng)的ITL-LF2和CH0-S活細(xì)胞積分濃度(IVCC)說(shuō)明圖。在一個(gè)批處理中以0.2xl06細(xì)胞/ml濃度在含添加劑的ProCH05培養(yǎng)液中接種細(xì)胞，檢測(cè)該過(guò)程中的活細(xì)胞濃度。根據(jù)測(cè)得的細(xì)胞濃度計(jì)算出IVCC。CHO-S細(xì)胞(〇)和ITL-LF2細(xì)胞(Λ)。注意CHO-S與ITL-LF2細(xì)胞系二者相一致，但CHO-S細(xì)胞達(dá)到此濃度只需9天而ITL-LF2細(xì)胞需12天才達(dá)到。
[0084]圖19D是在一個(gè)批處理中培養(yǎng)的ITL-LF2和CHO-S細(xì)胞的乳酸濃度說(shuō)明圖。
[0085]圖20是蛋白質(zhì)巖藻糖基化通路和潛在酶(用方塊標(biāo)出)mRNA分析的說(shuō)明圖。
[0086]圖21是說(shuō)明巖藻糖基化通路基因RT-PCR分析的照片。分離得到CHO-S(C)和ITL-LF2 (LF)細(xì)胞的總RNA，采用polydT然后是基因特異性引物，對(duì)其進(jìn)行RT-PCR。取所得產(chǎn)物作瓊脂糖凝膠電泳，紫外光檢測(cè)后用SyberSafe?染色。預(yù)計(jì)大小:Fut8 — 1.7kb;GMD—1.lkb; FX-1.2kb; GFPP — 1.7kb;M— DNA 標(biāo)記物。
[0087]圖22A-B是全長(zhǎng)GMD與剪接變體之間的蛋白質(zhì)序列比較。將從CHO-S和ITL-LF2細(xì)胞提取的RNA經(jīng)RT-PCR制成cDNA，作凝膠電泳，分離并測(cè)序。用CloneMagager?軟件將該DNA序列翻譯成蛋白質(zhì)序列。將剪接變體I (SV1;圖22A;SEQ ID N0:23)和剪接變體2(SV2;圖22B;SEQ ID NO: 24)的蛋白質(zhì)序列與GMD基因的全長(zhǎng)(SEQ ID NO: 25)作比較。虛線表示缺失區(qū)域。文本表明各剪接變體中所缺失的外顯子。[0088]圖23A-B說(shuō)明這兩種GMD剪接變體的限制性酶切分析。圖23A — GMD剪接變體中獨(dú)特限制性酶位點(diǎn)的位置。圖23B—瓊脂糖凝膠顯示限制性酶切后的條帶。以下實(shí)施例章節(jié)的表7詳述了它們的大小和解釋。
[0089]圖24是ITL-LF2細(xì)胞與CHO-S細(xì)胞的巖藻糖基化通路基因表達(dá)水平Q-PCR分析的說(shuō)明圖。制備ITL-LF2和CHO-S (對(duì)照)細(xì)胞RNA的cDNA，采用位于外顯子5_6 (存在于全長(zhǎng)GMD mRNA和兩種剪接變體中)上的基因特異性引物和探針對(duì)其作Q-PCR分析。從4個(gè)不同日期接種細(xì)胞的4種不同RNA提取物獲得各個(gè)基因的結(jié)果。從每個(gè)提取日期制備的cDNA用Q-PCR檢測(cè)所有基因。所有樣品一式三份進(jìn)行操作，并按內(nèi)部對(duì)照β -肌動(dòng)蛋白基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。上面的短棒數(shù)字表示用配對(duì)T檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析計(jì)算出的各基因的P-值。P-值〈0.05表明有顯著性(差異)。
[0090]RQ—與對(duì)照相比，表達(dá)變化的倍數(shù)。
[0091]圖25是載體MB-129(pCMV-P-GMD)的概況圖。將野生型CHO-S細(xì)胞的全長(zhǎng)GMDcDNA克隆到載體p-CMV-P、pCMVpr-人CMV啟動(dòng)子中。IVS=hCMV IE基因的內(nèi)含子A。PAC=嘌呤霉素抗性基因。
[0092]圖26是用野生型GMD cDNA轉(zhuǎn)染后ITL-LF2細(xì)胞重獲巖藻糖基化的說(shuō)明圖。用含巖藻糖的C6614培養(yǎng)液培養(yǎng)以含GMD cDNA (pCMV-P-GMD)載體轉(zhuǎn)染的ITL-LF2細(xì)胞。細(xì)胞用生物素化AAL和熒光鏈霉親和素標(biāo)記后作FACS分析。未標(biāo)記的CHO-S細(xì)胞(□)，CHO-S細(xì)胞(〇)，ITL-LF2細(xì)胞(Δ)，GMD轉(zhuǎn)染的ITL-LF2細(xì)胞(?)。
[0093]圖27是含質(zhì)粒-PGL3抗EGFR mAb-EMCV-PAC1-DHFR串聯(lián)序列的抗EGFR mAb的說(shuō)明圖。用含抗EGFR mAb的LC和HC區(qū)的線性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO-S和ITL-LF2細(xì)胞。mCMV=鼠巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子，EMCV=腦心肌炎病毒，IRES=內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)，PAC =嘌呤霉素N-乙酰轉(zhuǎn)移酶，DHFR= 二氫葉酸還原酶，HC=重鏈，LC=輕鏈，SV40=猿病毒40，PA=聚腺苷酸化。
[0094]圖28是ITL-LF2和CHO-S細(xì)胞池穩(wěn)定表達(dá)抗EGFR mAb的說(shuō)明圖。用含抗EGFRmAb的載體(PGL3抗-EGFRmAb EMCV-PAC1-DHFR串聯(lián))轉(zhuǎn)染ITL-LF2和CH0-S細(xì)胞?；厥蘸笤u(píng)價(jià)細(xì)胞池的產(chǎn)率。
[0095]圖29是抗EGFRmAb轉(zhuǎn)染的ITL-LF2細(xì)胞巖藻糖水平的FACS分析說(shuō)明圖。分析去除巖藻糖前后在C6614中增殖的抗EGFRmAb轉(zhuǎn)染細(xì)胞細(xì)胞膜的巖藻糖水平。未標(biāo)記的CHO-S細(xì)胞(DXProCHOS培養(yǎng)增殖的CHO-S細(xì)胞(〇)，C6614培養(yǎng)增殖的ITL-LFl細(xì)胞(?)，含巖藻糖C6614培養(yǎng)的抗EGFRmAb轉(zhuǎn)染的ITL-LF2細(xì)胞(▼)，無(wú)巖藻糖C6614培養(yǎng)的抗EGFRmAb轉(zhuǎn)染的ITL-LF2細(xì)胞(Δ)。
[0096]圖30是抗EGFRmAb轉(zhuǎn)染ITL-LF2細(xì)胞唾液酸水平的FACS分析說(shuō)明圖。分析在ProCH05中增殖的抗EGFRmAb轉(zhuǎn)染細(xì)胞細(xì)胞膜的唾液酸水平。用偶聯(lián)FITC的唾液酸結(jié)合凝集素(MAA)標(biāo)記細(xì)胞，并作FACS分析。未標(biāo)記的CHO-S細(xì)胞(DXCHO-S細(xì)胞(〇)，ITL-LF2細(xì)胞(?)，抗EGFRmAb轉(zhuǎn)染的CHO-S細(xì)胞(▼)，抗EGFRmAb轉(zhuǎn)染的ITL-LF2細(xì)胞(Δ)。
[0097]圖31A-B說(shuō)明瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到ITL-LF2中的載體結(jié)構(gòu)。以載體pTT5為骨架構(gòu)建了載體Mb-127 和 ΜΒ-128?？?EGFRmAb-LC=EGFRmAb 的輕鏈；抗 EGFRmAbANTI EGFR mAb-HC=EGFRmAb的重鏈。
[0098]圖32是說(shuō)明ITL-LF2和CHO-S細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)抗EGFRmAb的條形圖。在ProCH05培養(yǎng)液中用含抗EGFRmAb的pTT5載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染ITL-LF2和CHO-S細(xì)胞。轉(zhuǎn)染條件為細(xì)胞類型特異性條件。轉(zhuǎn)染后ITL-LF2細(xì)胞添加VPA并移到31°C，CHO-S細(xì)胞添加VPA后培養(yǎng)細(xì)胞增殖24小時(shí)。
[0099]圖33描述用FACS分析抗體的糖殘基水平。取粗制收獲物或純化抗體樣品與G蛋白包被的磁珠混合，然后結(jié)合熒光標(biāo)記的凝集素。用FACS根據(jù)熒光測(cè)定巖藻糖水平。
[0100]圖34是對(duì)ITL-LF2和CHO-S細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)的抗EGFRmAb作巖藻糖水平FACS分析的說(shuō)明圖。取粗制收獲物樣品與G蛋白包被磁珠混合，然后結(jié)合生物素化AAL和熒光鏈霉親和素混合物。用FACS根據(jù)熒光水平測(cè)定巖藻糖水平。磁珠(DXCHO-S轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)生的抗EGFR (〇)，ITL-LF2轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)生的抗EGFR (Δ)。 [0101]圖35是對(duì)培養(yǎng)的ITL-LF2和CHO-S細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)的抗EGFRmAb粗制收獲物作巖藻糖水平FACS分析的說(shuō)明圖。取粗制收獲物樣品與G蛋白磁珠混合，然后結(jié)合生物素化AAL和熒光鏈霉親和素混合物。用FACS根據(jù)熒光水平測(cè)定巖藻糖水平。磁珠(DXCHO-S轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)生的抗EGFRmAb (〇)，ITL-LF2轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)生的抗EGFRmAb (Δ)。
[0102]圖36是對(duì)培養(yǎng)的ITL-LF2和CHO-S細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)的抗EGFRmAb粗制收獲物作唾液酸水平FACS分析的說(shuō)明圖。取粗制收獲物樣品與G蛋白磁珠混合，然后結(jié)合偶聯(lián)FITC的MAA。用FACS根據(jù)熒光水平測(cè)定唾液酸水平。磁珠(□)，從CHO-S轉(zhuǎn)染細(xì)胞得到的粗制收獲物(〇)，從ITL-LF2轉(zhuǎn)染細(xì)胞得到的粗制收獲物(Λ)。
[0103]圖37是對(duì)ITL-LF2和CHO-S細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)的抗EGFRmAb作巖藻糖水平FACS分析的說(shuō)明圖。取純化的抗體樣品與G蛋白磁珠混合，然后結(jié)合生物素化AAL和熒光鏈霉親和素混合物。用FACS根據(jù)熒光水平測(cè)定巖藻糖水平。磁珠(DXCHO-S轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)生的抗EGFRmAb (〇)，ITL-LF2 轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)生的抗 EGFRmAb (Λ)。
[0104]圖38是對(duì)ITL-LF2和CHO-S細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)的抗EGFRmAb作唾液酸水平FACS分析的說(shuō)明圖。取純化的抗體樣品與G蛋白磁珠混合，然后結(jié)合偶聯(lián)FITC的MAA。用FACS根據(jù)熒光水平測(cè)定唾液酸水平。磁珠(OXCHO-S轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)生的抗EGFR (〇)，ITL-LF2轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)生的抗EGFR (Λ)。
[0105]圖39是對(duì)純化的完整抗EGFRmAb作巖藻糖水平Octet分析的讀出。使CH0-S和ITL-LF2細(xì)胞的抗EGFRmAb純化產(chǎn)品(0D280測(cè)定的濃度為225 μ g/ml)與事先已附著預(yù)包被鏈霉親和素生物傳感器的生物素化AAL(2 μ g/ml)相結(jié)合。此圖提供了用Octet QK系統(tǒng)作動(dòng)力學(xué)分析的有關(guān)步驟，每條曲線代表用箭頭指出的一個(gè)具體樣品。
[0106]圖40是對(duì)純化的完整抗EGFRmAb作唾液酸水平Octet分析的讀出。使CH0-S和ITL-LF2細(xì)胞的抗EGFRmAb純化產(chǎn)品(0D280測(cè)定的濃度為115 μ g/ml)與事先已附著預(yù)包被鏈霉親和素生物傳感器的生物素化ΜΑΑ(10 μ g/ml)相結(jié)合。此圖提供了用Octet QK系統(tǒng)作動(dòng)力學(xué)分析的有關(guān)步驟，每條曲線代表用箭頭指出的一個(gè)具體樣品。
[0107]圖41是對(duì)純化的抗EGFR Fe單體巖藻糖水平的Octet分析圖。使CHO-S和ITL-LF2細(xì)胞產(chǎn)生的抗EGFRmAb的Fe部分(0D280測(cè)定的濃度為40 μ g/ml)與事先已附著預(yù)包被鏈霉親和素生物傳感器的生物素化AAL(I μ g/ml)相結(jié)合。此圖提供了用Octet QK系統(tǒng)作動(dòng)力學(xué)分析的有關(guān)步驟，每條曲線代表用箭頭指出的一個(gè)具體樣品。
[0108]圖42是純化的抗EGFR Fe單體唾液酸水平的Octet分析圖。使CH0-S和ITL-LF2細(xì)胞產(chǎn)生的抗EGFRmAb的Fe部分與事先已附著預(yù)包被鏈霉親和素生物傳感器的生物素化AAL(1 μ g/ml)相結(jié)合。此圖提供了用Octet QK系統(tǒng)作動(dòng)力學(xué)分析的有關(guān)步驟，每條曲線代表用箭頭指出的一個(gè)具體樣品。
[0109]圖43顯示抗EGFRmAb純化產(chǎn)品帶電模式的iCE280分析結(jié)果。用iCE280分析CHO-S細(xì)胞()和ITL-LF2細(xì)胞(▲)產(chǎn)生的抗EGFRmAb純化產(chǎn)品(0D280測(cè)定的濃度為0.4 μ g/ml)。點(diǎn)線代表iCE280模式中同種型抗體的峰面積％(注意圖中的線條并不代表連續(xù)函數(shù)，加入它只是為了更容易追尋同一產(chǎn)品的同種型)。
[0110]圖44是提供抗EGFR Fe部分聚糖模式的表格。
[0111]圖45是外源性巖藻糖對(duì)EGFRmAb轉(zhuǎn)染的ITL-LF2細(xì)胞巖藻糖水平影響的說(shuō)明圖。取抗EGFRmAb轉(zhuǎn)染的ITL-LF2細(xì)胞以0.2xl06細(xì)胞/ml的濃度接種在含不同濃度L-巖藻糖的ProCH05培養(yǎng)液中，在含CO2的37°C培養(yǎng)箱中320rpm搖動(dòng)培養(yǎng)。
[0112]圖46是外源性巖藻糖對(duì)EGFRmAb巖藻糖基化水平影響的說(shuō)明圖。
[0113]圖47是依據(jù)外源性巖藻糖(量)的EGFRmAb巖藻糖基化水平的校準(zhǔn)曲線。
[0114]圖48A-B是用Octet檢測(cè)純化的抗EGFR Fe單體巖藻糖水平的校準(zhǔn)曲線。將CH0-S和ITL-LF2細(xì)胞產(chǎn)生的抗EGFRmAb Fe單體部分混合制成樣品，0D280測(cè)定濃度為40 μ g/ml。使該樣品結(jié)合于事先已附著預(yù)包被鏈霉親和素生物傳感器的生物素化AAL(1 μ g/ml)。此圖提供了用Octet QK系統(tǒng)作動(dòng)力學(xué)分析的有關(guān)步驟，每條曲線對(duì)應(yīng)于樣品(A)中的巖藻糖具體％。線狀曲線代表(B)。
[0115]圖49是部分巖藻糖基化抗EGFR Fe單體部分的Octet分析。使CH0-S細(xì)胞和ITL-LF2細(xì)胞的抗EGFRmAb Fe單體部分結(jié)合于事先已附著預(yù)包被鏈霉親和素生物傳感器的生物素化AAL(1 μ g/ml)。此圖提供了用Octet QK系統(tǒng)作動(dòng)力學(xué)分析的有關(guān)步驟，每條曲線對(duì)應(yīng)于一個(gè)具體樣品。
[0116]本發(fā)明【具體實(shí)施方式】的描述
[0117]本發(fā)明在其某些實(shí)施方式中涉及巖藻糖含量為零的CHO細(xì)胞和細(xì)胞系，產(chǎn)生該細(xì)胞和細(xì)胞系的方法及其應(yīng)用。
[0118]在詳述本發(fā)明至少一種實(shí)施方式之前，必需理解不是要將本發(fā)明的申請(qǐng)范圍限制于本說(shuō)明書(shū)的以下詳述或?qū)嵤├信e的細(xì)節(jié)，本發(fā)明可以有其他實(shí)施方式或以各種不同方式進(jìn)行實(shí)施。
[0119]為了降低重組蛋白質(zhì)如抗體的巖藻糖水平以得到增強(qiáng)的ADCC功能，本發(fā)明人開(kāi)發(fā)了經(jīng)修飾能在其細(xì)胞表面表達(dá)變體糖基化模式的CHO-S細(xì)胞衍生的細(xì)胞系。這是通過(guò)在存在MTX時(shí)培育細(xì)胞然后有效地選出細(xì)胞膜巖藻糖水平最低的細(xì)胞而實(shí)現(xiàn)的。
[0120]采用對(duì)抗體Fe糖基化位點(diǎn)上aFucl-6GlcNA殘基具有高親和力的巖藻糖特異性凝集素(如橙黃網(wǎng)孢盤(pán)菌(aleuria aurantia)凝集素,AAL)或米曲霉菌1_巖藻糖特異性凝集素(AOL)，通過(guò)磁珠分離和FACS分揀(圖7A-B)或單獨(dú)FACS分揀(圖12)進(jìn)行這種選擇。
[0121]雖然可根據(jù)細(xì)胞膜的巖藻糖水平選擇零表達(dá)巖藻糖的細(xì)胞，但用各種方法分析發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞表達(dá)的重組抗體(抗EGFR mAb)的巖藻糖水平仍相同(圖33-41)。
[0122]通過(guò)用含巖藻糖的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，本發(fā)明人證明其中所表達(dá)的重組蛋白的巖藻糖水平是可調(diào)控的。此種結(jié)果顯示有可復(fù)制性(圖49)。
[0123]此外，還發(fā)現(xiàn)本發(fā)明細(xì)胞表型的370PDL測(cè)試穩(wěn)定(圖15)。因此當(dāng)需要高于100PDL時(shí)這類細(xì)胞本身可用作重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)細(xì)胞。
[0124]在巖藻糖穩(wěn)定性試驗(yàn)中測(cè)定巖藻糖零表達(dá)細(xì)胞(命名為ITL-LF2細(xì)胞)的生長(zhǎng)速率，發(fā)現(xiàn)該生長(zhǎng)速率導(dǎo)致群體倍增時(shí)間O3DT)為約15-20小時(shí)(圖11)，與衍生該ITL-LF2細(xì)胞的CHO-S細(xì)胞相似。
[0125]對(duì)已知參與巖藻糖基化的關(guān)鍵蛋白質(zhì)的分析揭示，在本發(fā)明所選細(xì)胞中GDP-甘露糖4，6-脫水酶(GMD)的mRNA大小短于其對(duì)應(yīng)的野生型細(xì)胞(圖20)，測(cè)序揭示它有兩種剪接變體。從該細(xì)胞提取的mRNA分子缺乏第三和第四外顯子，或缺乏第八和第九外顯子(圖 2IA-B 和圖 22A-B)。
[0126]本發(fā)明人提議，本說(shuō)明書(shū)描述的用于產(chǎn)生和鑒定特定類型細(xì)胞的方法可用來(lái)選擇其他有用的細(xì)胞類型。
[0127]因此，按照本發(fā)明的一個(gè)方面，提供選擇用作表達(dá)重組蛋白宿主細(xì)胞的CHO細(xì)胞的方法，該方法包括:
[0128](a)使CHO細(xì)胞接觸氨甲喋呤(MTX)從而在CHO細(xì)胞群中導(dǎo)入基因突變，
[0129](b)使含有突變細(xì)胞的CHO細(xì)胞群接觸巖藻糖結(jié)合劑一定的時(shí)間量，使該巖藻糖結(jié)合劑結(jié)合于細(xì)胞群細(xì)胞膜的巖藻糖部分，其中所述接觸的時(shí)間量不會(huì)導(dǎo)致殺傷細(xì)胞；和
[0130](C)消除該細(xì)胞群中結(jié)合該巖藻糖結(jié)合劑的細(xì)胞亞群，從而選出細(xì)胞用作表達(dá)重組蛋白的宿主細(xì)胞，所選細(xì)胞的巖藻糖含量為零。
[0131]適合本發(fā)明的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢組織衍生的CHO細(xì)胞或細(xì)胞系可以是從中國(guó)倉(cāng)鼠(Cricetulus griseus)卵巢組織建立的細(xì)胞系中的任何細(xì)胞。例子包括以下文獻(xiàn)中所述的 CHO細(xì)胞，如 Journal of Experimental Medicine, 108, 945 (1958) ；Proc.Nat Acad.Sc1.USA,60, 1275(1968) ；Genetics,55,513(196 8) ；Chromosoma, 41, 129(1973) !Methods inCell Science, 18, 115(1996) ；Radiation Research, 148, 260 (1997) ;Proc.Nat Acad.Sc1.USA, 77, 4216(1980) ；Proc.Nat Acad.Sc1.，60，1275 (1968) ；Cell,6, 121 (1957) ；MolecularCell genetics, Appendix I, II (883-900頁(yè))，等等。此外，本發(fā)明也可采用在ATCC (美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)中注冊(cè)保藏的CH0-K1 (ATCC CCL-61)、DUXB11(ATCC CCL-9096)和Pro-5 (ATCC CCL-1781)細(xì)胞系以及 CH0-S (Life Technologies 公司，Cat#l 1619)或使這些細(xì)胞系適應(yīng)各種培養(yǎng)液而獲得的亞細(xì)胞系。
[0132]在某些實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞是010-^5、010-3、010/1)644、010-3?或010-2，6克隆細(xì)胞。
[0133]誘變劑MTX可引起巖藻糖合成通路中所涉及的基因或多肽發(fā)生突變。
[0134]如上所述，可通過(guò)使突變的CHO細(xì)胞群接觸巖藻糖結(jié)合劑使之結(jié)合于突變細(xì)胞的細(xì)胞膜而實(shí)現(xiàn)本發(fā)明一個(gè)方面所述的方法。
[0135]本說(shuō)明書(shū)所用的短語(yǔ)“巖藻糖結(jié)合劑”指能以至少lxlO_5Kd結(jié)合細(xì)胞表面巖藻糖部分的任何物質(zhì)(如凝集素)。按照一種實(shí)施方式，該巖藻糖結(jié)合劑以至少lxlO_3Kd(Matsumura, Higashida 等；2009),例如至少 IxlCT4Kd,至少 IxlCT5Kd,至少 IxlCT6Kd 或至少lxl(T7Kd，結(jié)合于 a Fucl-6GlcNA 殘基。
[0136]按照一種實(shí)施方式，該巖藻糖結(jié)合劑是多肽，如凝集素。
[0137]本發(fā)明考慮的示范性凝集素包括但不限于:橙黃網(wǎng)孢盤(pán)菌凝集素(AAL)或米曲霉菌1-巖藻糖特異性凝集素(AOL)和荊豆凝集素(UEA)及(Oda，Senaha等，2003 ;Tateno, Nakamura-Tsuruta等；2009，它們的內(nèi)容納入本說(shuō)明書(shū)作為參考)中披露的那些凝集素。[0138]如上所述，在能使巖藻糖結(jié)合劑與細(xì)胞膜的巖藻糖結(jié)合的條件下進(jìn)行所述接觸。按照一種實(shí)施方式，在凝集素不會(huì)導(dǎo)致其結(jié)合細(xì)胞死亡(即消除細(xì)胞)的條件下進(jìn)行所述結(jié)合。
[0139]按照一種【具體實(shí)施方式】，在凝集素不會(huì)導(dǎo)致其結(jié)合細(xì)胞的50%以上死亡的條件下進(jìn)行所述結(jié)合。
[0140]按照一種【具體實(shí)施方式】，在凝集素不會(huì)導(dǎo)致其結(jié)合的40%以上細(xì)胞死亡的條件下進(jìn)行所述結(jié)合。
[0141]按照一種【具體實(shí)施方式】，在凝集素不會(huì)導(dǎo)致其結(jié)合的30%以上細(xì)胞死亡的條件下進(jìn)行所述結(jié)合。
[0142]按照一種【具體實(shí)施方式】，在凝集素不會(huì)導(dǎo)致其結(jié)合的20%以上細(xì)胞死亡的條件下進(jìn)行所述結(jié)合。
[0143]按照一種實(shí)施方式，進(jìn)行所述結(jié)合不超過(guò)3小時(shí)，優(yōu)選不超過(guò)2小時(shí)，甚至更優(yōu)選不超過(guò)I小時(shí)。
[0144]按照一種實(shí)施方式，本發(fā)明此方面的巖藻糖結(jié)合劑附著于能使該物質(zhì)結(jié)合的細(xì)胞群(直接或間接)消除的功能部分。
[0145]因此，該巖藻糖結(jié)合劑可附著于可檢測(cè)部分，包括但不限于熒光部分或磁性部分。
[0146]示范性的熒光部分包括熒光黃或其衍生物，例如，異硫氰酸熒光黃(FITC)、俄勒岡綠、東京綠、SNAFL、羧基萘熒光素(CFSE)、羧基熒光素二乙酸琥珀酰亞胺酯(CFDA-SE)、DyLight488、Alexa熒光素488、綠熒光蛋白(GFP)、藻紅蛋白(PE)、多甲藻素葉綠素I蛋白(PerCP)、PE-Alexa 熒光素 700、PE-Cy5 (TR1-COLOR)、PE-Cy5.5、PE-Alexa 熒光素 750、PE-Cy7、別藻蘭素(APC)、APC_Cy7，及其衍生物。
[0147]或者，巖藻糖結(jié)合劑可附著于親和部分。
[0148]本說(shuō)明書(shū)所用的術(shù)語(yǔ)“親和部分”指能與關(guān)聯(lián)分子的結(jié)合部分選擇性相互作用的分子，例如生物素/親和素，配體/受體等。
[0149]使巖藻糖結(jié)合劑附著于親和部分或可檢測(cè)部分的詳細(xì)方法可在以下實(shí)施例章節(jié)中找到。
[0150]應(yīng)明白如果巖藻糖結(jié)合劑附著于熒光部分(直接或間接通過(guò)相應(yīng)的結(jié)合分子)，就可采用已知的細(xì)胞分揀方法，如采用熒光激活細(xì)胞分揀儀(FACS)來(lái)消除突變細(xì)胞群中不想要的細(xì)胞。
[0151]可商品化購(gòu)得多種流式細(xì)胞儀，包括，例如Becton Dickinson FACScan和FACScalibe (BD Biosciences, Mountain View, CA)?？捎糜?FACS 分析的抗體在 SchlossmanS BoumeII L等(白細(xì)胞分型V，紐約:牛津大學(xué)出版社，1995)中有所描述，并可商品化廣泛購(gòu)得。
[0152]如果巖藻糖結(jié)合劑附著于磁性部分(直接或間接通過(guò)相應(yīng)的結(jié)合分子)，就可利用磁性激活細(xì)胞分離法來(lái)消除突變細(xì)胞群中不想要的細(xì)胞。
[0153]如果巖藻糖結(jié)合劑附著于親和部分，就可通過(guò)采用相應(yīng)結(jié)合分子的親和純化方法來(lái)消除突變細(xì)胞群中不想要的細(xì)胞。因此，例如，如果巖藻糖結(jié)合劑附著于生物素，可采用鏈霉親和素珠或柱純化來(lái)消除突變細(xì)胞群中不想要的細(xì)胞。例如，如果巖藻糖結(jié)合劑附著于抗體或抗體的Fe部分，可用A蛋白珠或柱來(lái)消除突變細(xì)胞群中不想要的細(xì)胞。[0154]如本說(shuō)明書(shū)以上所述，可使相應(yīng)的結(jié)合分子本身附著于可檢測(cè)部分，加入該相應(yīng)的結(jié)合分子后通過(guò)FACS或MACS進(jìn)行所述消除。
[0155]應(yīng)明白可通過(guò)數(shù)輪(如2、3或更多輪)順次消除來(lái)進(jìn)行不想要細(xì)胞群的消除。此外，消除步驟可包括用同一方法(如只用FACS珠分離法)的數(shù)輪順次消除，或可聯(lián)用不同方法(如磁珠分離，然后熒光分離)。
[0156]按照一種實(shí)施方式，選擇的消除輪數(shù)和具體方法能使巖藻糖結(jié)合劑結(jié)合的細(xì)胞基本上被去除。
[0157]術(shù)語(yǔ)“基本上被去除”意味著至少約50%或更高的特定類型細(xì)胞，如至少約75%、約80%、約90%、約95%或約97%，包括至少99%、99.5%,99.9%或更多的特定類型細(xì)胞被去除。
[0158]按照一【具體實(shí)施方式】，基本上去除了巖藻糖結(jié)合劑結(jié)合的細(xì)胞，只保留了其細(xì)胞膜巖藻糖為零的細(xì)胞。
[0159]如果在上述去除后加入外源性巖藻糖，可獲得含一定量巖藻糖的不同細(xì)胞，這取決于加入的巖藻糖量。
[0160]因此按照另一種實(shí)施方式，可獲得與野生型細(xì)胞(即氨甲喋呤處理前)相比其細(xì)胞膜巖藻糖低于50%的CHO細(xì)胞。
[0161]按照另一種實(shí)施方式，可獲得與野生型細(xì)胞(即氨甲喋呤處理前)相比其細(xì)胞膜巖藻糖低于40%的CHO細(xì)胞。
[0162]按照另一種實(shí)施方式，可獲得與野生型細(xì)胞(即氨甲喋呤處理前)相比其細(xì)胞膜巖藻糖低于30%的CHO細(xì)胞。
[0163]按照另一種實(shí)施 方式，可獲得與野生型細(xì)胞(即氨甲喋呤處理前)相比其細(xì)胞膜巖藻糖低于20%的CHO細(xì)胞。
[0164]按照另一種實(shí)施方式，可獲得與野生型細(xì)胞(即氨甲喋呤處理前)相比其細(xì)胞膜巖藻糖低于10%的CHO細(xì)胞。
[0165]本發(fā)明的細(xì)胞群經(jīng)分離后，可在任何用于培養(yǎng)生長(zhǎng)的裝置(包括發(fā)酵罐或生物反應(yīng)器)中培養(yǎng)生長(zhǎng)。細(xì)胞可生長(zhǎng)成單層或貼附于表面。或者，分離的細(xì)胞群可懸浮生長(zhǎng)。
[0166]可用無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞。該培養(yǎng)液可以是商品化購(gòu)得的培養(yǎng)液，例如但不限于:ProCH05(Lonza, Catalogue#BE12-766Q)、CHO DHFR-粉狀培養(yǎng)基(SAFCBioscinces, Catalogue C6614)或 Opt1-CHO(Invitrogen, Cat aloguel2681),其中添加了谷氨酰胺，如8mM L-谷氨酰胺。
[0167]按照一種實(shí)施方式，該培養(yǎng)液無(wú)異源污染物，即無(wú)動(dòng)物衍生組分。
[0168]按照一種實(shí)施方式，在允許無(wú)限增殖的條件(如培養(yǎng)液和空間)下，培養(yǎng)細(xì)胞成為細(xì)胞培養(yǎng)物，即增殖成細(xì)胞系。
[0169]該分離的CHO細(xì)胞在大量傳代培養(yǎng)中可維持其變種糖基化模式(即巖藻糖低表達(dá))，即具有高度穩(wěn)定性。按照一種實(shí)施方式，發(fā)現(xiàn)經(jīng)修飾的CHO宿主細(xì)胞甚至在370代后仍能維持其變種糖基化模式。
[0170]本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，按照本說(shuō)明書(shū)所述方法選出的CHO細(xì)胞具有特定的表型，如可表達(dá)負(fù)責(zé)細(xì)胞膜低巖藻糖基化的突變的GDP-甘露糖4，6-脫水酶(GMD)。
[0171]誘變后的細(xì)胞可包含至少一個(gè)可導(dǎo)致功能缺失的突變的GMD等位基因。
[0172]本說(shuō)明書(shū)所用術(shù)語(yǔ)“等位基因”指一個(gè)基因座的任何一種或多種替代形式，所有的等位基因都與性狀或特征相關(guān)。在二倍體細(xì)胞或生物中，一給定基因的兩個(gè)等位基因占據(jù)了一對(duì)同源染色體上的相應(yīng)基因座。
[0173]“導(dǎo)致功能缺失的突變”是基因序列中可導(dǎo)致基因產(chǎn)物(通常為蛋白質(zhì))的功能降低或完全缺失的突變。例如，由于移碼或無(wú)義突變而產(chǎn)生的截短基因產(chǎn)物可導(dǎo)致功能缺失的突變。與含有導(dǎo)致功能缺失突變的等位基因相關(guān)的表型通常是隱性的，但也可以是顯性的。
[0174]應(yīng)明白本發(fā)明也考慮了其中兩個(gè)GMD等位基因都攜帶有導(dǎo)致功能缺失的突變的細(xì)胞。在這樣的情況下，GMD可以是純合子形式或雜合子形式。按照此種實(shí)施方式，純合子的情況是GMD基因座兩個(gè)等位基因以核苷酸序列相同為特征。雜合子指GMD基因座的基因情況不同。
[0175]具體說(shuō)，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)經(jīng)本發(fā)明的誘變和選擇步驟后的CHO細(xì)胞可表達(dá)SEQ IDNO:23和24所示的兩種變體形式的GMD，分別對(duì)應(yīng)于缺失外顯子3和4、缺失外顯子8和9的GMD基因。
[0176]因此，按照本發(fā)明的另一方面，提供經(jīng)基因修飾能表達(dá)具有SEQ ID NO:23和/或24所示氨基酸序列的突變GDP-甘露糖4，6-脫水酶(GMD)的分離的CHO細(xì)胞。
[0177]發(fā)現(xiàn)本發(fā)明此方面的細(xì)胞能表達(dá)功能性巖藻糖轉(zhuǎn)移酶-8(Fut_8)。該功能性FutS可以是具有SEQ ID NO:29所示多肽序列的野生型Fut8。
[0178]此外，本發(fā)明的細(xì)胞可表達(dá)功能性⑶P-酮基-6脫氧甘露糖3，5-差向異構(gòu)酶，4-還原酶(FX)。該功能性FX可以是具有SEQ ID NO: 30所示多肽序列的野生型FX。
[0179]本發(fā)明人證明了按照本說(shuō)明書(shū)所述方法產(chǎn)生的CHO細(xì)胞可用于生產(chǎn)糖蛋白，如可收獲或收集抗體或Fe融合蛋白?？煞置诘倪@種糖蛋白顯示變體巖藻糖基化模式，和/或如本說(shuō)明書(shū)進(jìn)一步所述具有·治療用途。這種糖蛋白可以是抗體，例如，如本說(shuō)明書(shū)進(jìn)一步所述，與未修飾的親代宿主細(xì)胞產(chǎn)生的相應(yīng)抗體相比其ADCC活性增強(qiáng)的抗體。
[0180]本說(shuō)明書(shū)所用的術(shù)語(yǔ)“抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒”(ADCC)指表達(dá)FcR的效應(yīng)細(xì)胞(如自然殺傷細(xì)胞(NK)、中性白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)識(shí)別靶細(xì)胞上結(jié)合的抗體隨后導(dǎo)致該靶細(xì)胞溶解的細(xì)胞介導(dǎo)反應(yīng)。介導(dǎo)ADCC的主要細(xì)胞包括NK細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。NK細(xì)胞通常主要表達(dá)Fe Y RIII，而單核細(xì)胞表達(dá)Fe Y R1、Fe Y RII和Fe Y RIII。在Ravetch和Kinrt的Annu Rev Immunol, 9:457-92 (1991)中小結(jié)了造血細(xì)胞上的FcR表達(dá)。
[0181]“效應(yīng)細(xì)胞”是表達(dá)一種或多種FcR并執(zhí)行效應(yīng)器功能的白細(xì)胞。優(yōu)選地是，這種細(xì)胞至少表達(dá)Fe Y RIII并執(zhí)行ADCC效應(yīng)器功能。能介導(dǎo)ADCC的人白細(xì)胞的例子包括外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)、自然殺傷細(xì)胞(NK)、單核細(xì)胞、細(xì)胞毒T細(xì)胞和中性白細(xì)胞，優(yōu)選PBMC和NK細(xì)胞。效應(yīng)細(xì)胞可從天然來(lái)源(如血液，或本說(shuō)明書(shū)所述的PBMC)分離得到或采用本領(lǐng)域的已知方法進(jìn)行體外增殖。
[0182]在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明CHO細(xì)胞系產(chǎn)生的抗體與親代宿主細(xì)胞產(chǎn)生的相應(yīng)抗體相比，在存在人效應(yīng)細(xì)胞和當(dāng)所述抗體應(yīng)用的量相當(dāng)時(shí)，能更有效地介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒(ADCC)。一般而言，采用本說(shuō)明書(shū)所述方法可確定ADCC活性，但也考慮測(cè)定ADCC活性的其他試驗(yàn)或方法，例如在動(dòng)物模型上，等等。納入本說(shuō)明書(shū)作參考的美國(guó)專利公開(kāi)公報(bào)N0.2010/0081150中進(jìn)一步描述了在體內(nèi)或體外測(cè)試系統(tǒng)中，從本發(fā)明的CHO細(xì)胞系得到的抗體比親代抗體在介導(dǎo)ADCC上更有效。[0183]因此，對(duì)本發(fā)明公開(kāi)的經(jīng)修飾能產(chǎn)生變種巖藻糖基化模式的分離的細(xì)胞群或細(xì)胞系，可作進(jìn)一步修飾以使之包含異源聚核苷酸序列。這類序列包括:基因或基因片段的編碼或非編碼區(qū)、信使RNA(mRNA)、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA、核糖體RNA、核酶等。該異源序列可編碼蛋白類分子，即蛋白質(zhì)、多肽、肽、氨基酸序列，包括任何長(zhǎng)度的氨基酸聚合物。該異源聚核苷酸序列通常操作性連接于啟動(dòng)子(即連接到表達(dá)載體中)而能表達(dá)重組蛋白質(zhì)。
[0184]按照一種實(shí)施方式，在存在外源性巖藻糖時(shí)進(jìn)行本發(fā)明的CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)染?？紤]的巖藻糖濃度包括1-20 μ g/ml,例如10 μ g/ml。
[0185]如圖45和48所示，可通過(guò)在巖藻糖存在時(shí)培育轉(zhuǎn)染細(xì)胞來(lái)控制重組多肽的巖藻糖含量?？紤]的巖藻糖濃度包括1-10 μ g/ml，例如2.5-5 μ g/ml至例如3.5 μ g/ml。
[0186]因此，提供細(xì)胞膜上無(wú)巖藻糖和能表達(dá)不同程度巖藻糖基化蛋白質(zhì)的CHO細(xì)胞，巖藻糖基化量取決于細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)和轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)液中的巖藻糖含量。這種重組多肽的巖藻糖基化量范圍為0-100%。
[0187]該插入的編碼序列除包含轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的元件外，所采用的表達(dá)構(gòu)建物還可包含經(jīng)工程改造能提高所表達(dá)多肽的穩(wěn)定性、產(chǎn)生、純化、產(chǎn)量或毒性的序列。例如，可工程改造表達(dá)包含本發(fā)明某些實(shí)施方式的蛋白質(zhì)和異源蛋白質(zhì)的融合蛋白或可切割的融合蛋白?？稍O(shè)計(jì)這類融合蛋白使之易用親和層析分離，如通過(guò)固定于對(duì)該異源蛋白特異性的層析柱。經(jīng)工程改造可在蛋白質(zhì)與可切割融合蛋白之間產(chǎn)生一個(gè)切割位點(diǎn)，用能破壞該切割位點(diǎn)的相應(yīng)酶或物質(zhì)處理，使該可切割融合蛋白從層析柱上釋放出來(lái)(例如，參見(jiàn)Booth等(1988)Immunol Lett.19: 65-70;和 Gardella 等(1990)J Biol Chem.265:15845-15859)。
[0188]按照一個(gè)實(shí)施方式，在不存在外源性巖藻糖時(shí)進(jìn)行純化。
[0189]可用各種常規(guī)重組技術(shù)和合成方法制備核酸。本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA和分子克隆技術(shù)在以下文獻(xiàn)中有描述:Sambrook J., Fritsch E.F.和Maniatis T.的“分子克隆:實(shí)驗(yàn)手冊(cè)”冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港(1989) (Maniatis) ;T.J.Sihavy, M.L.Bennan和L.W.Enquist的“基因融合實(shí)驗(yàn)”，泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港(1984);和Ausubel，F(xiàn).Μ.等的“分子生物學(xué)當(dāng)前方案”，Greene聯(lián)合出版社和Wiley-1nterscience (1987)。簡(jiǎn)言之,可制備的主題核酸有基因組DNA片段、cDNA和RNA，均可直接從細(xì)胞抽提獲得或用各種擴(kuò)增方法(包括但不限于PCR和RT-PCR)重組產(chǎn)生。
[0190]如上所述，本發(fā)明的CHO細(xì)胞可用作宿主細(xì)胞以產(chǎn)生抗體。所述抗體可以是單克隆或多克隆抗體。
[0191]在某些實(shí)施方式中，所述抗體是抑制性抗體。抑制性抗體可抑制與其結(jié)合的抗原的一種或多種生物學(xué)活性。例如，抑制性抗體通過(guò)抑制抗原的活性或其表達(dá)，可下調(diào)相應(yīng)抗原的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在某些實(shí)施方式中，所述抗體是中和抗體。中和抗體可降低或破壞可溶性抗原或活生物體(如感染劑)的某些生物學(xué)活性。中和抗體可與天然的配體或受體競(jìng)爭(zhēng)其抗原。在某些實(shí)施方式中，所述抗體是刺激性或激活性抗體。刺激性或激活性抗體可以是激動(dòng)性抗體，它結(jié)合抗原時(shí)可激活相應(yīng)抗原的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)從而活化或上調(diào)該抗原的活性，或上調(diào)所述抗體結(jié)合的抗原的表達(dá)。
[0192]本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“抗體”包括完整的分子及其功能片段，如Fe融合蛋白，其定義如下:經(jīng)遺傳工程改造的含有直接或通過(guò)合適的多肽接頭與另一多肽或蛋白質(zhì)相連接的(抗體)重鏈恒定區(qū)的分子。[0193]非人(例如，鼠)抗體的人源化形式，是含有最少非人免疫球蛋白衍生序列的人免疫球蛋白、免疫球蛋白各鏈或片段的嵌合分子。人源化抗體包括具有所需特異性、親和力與結(jié)合能力的人免疫球蛋白(受者抗體)，其中受者的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)殘基被非人動(dòng)物(如小鼠、大鼠或家兔)免疫球蛋白(供者抗體)的CDR殘基所取代。在某些例子中，人免疫球蛋白的Fv框架殘基被相應(yīng)的非人殘基所取代。人源化抗體也可包含受者抗體或輸入的CDR或框架序列中均沒(méi)有的殘基。一般而言，所有的人源化抗體基本上包含至少一個(gè)，通常兩個(gè)可變區(qū)，其中所有的或基本上所有的⑶R區(qū)與非人免疫球蛋白的這些區(qū)相當(dāng)，而所有的或基本上所有的FR區(qū)是人免疫球蛋白的共有序列。優(yōu)化的人源化抗體也至少包含免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)的一部分，通常是人免疫球蛋白恒定區(qū)的一部分[Jones 等,Nature, 321:522-525(1986) ；Riechmann 等,Nature, 332:323-329(1988)和Presta, Curr.0p.Struct.Biol., 2:593-596(1992)]。
[0194]在一實(shí)施方式中，可將輕鏈和重鏈(基因)分別轉(zhuǎn)化入經(jīng)修飾的同種或不同種分離宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中。在另一種替代實(shí)施方式中，可用含輕鏈和重鏈(基因)的不同質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染一種經(jīng)修飾的培養(yǎng)的宿主細(xì)胞。在另一實(shí)施方式中，可用含有輕鏈和重鏈兩種基因并能表達(dá)該兩種基因的一種表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入一種經(jīng)修飾的培養(yǎng)的宿主細(xì)胞中。
[0195]當(dāng)重鏈和輕鏈在同一宿主中共表達(dá)時(shí)，設(shè)計(jì)的分離方法應(yīng)能回收重構(gòu)建的抗體。這可通過(guò)常規(guī)的抗體純化方法，例如A蛋白-瓊脂糖凝膠層析、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析而實(shí)現(xiàn)。
[0196]可用本發(fā)明細(xì)胞產(chǎn)生的這種重組抗體具有變體巖藻糖基化模式從而增強(qiáng)了該抗體的效應(yīng)器功能。優(yōu)選本發(fā)明重組抗體的Fe單體上與ADCC相關(guān)的巖藻糖殘基含量低，從而該抗體的抗體依賴性細(xì)胞毒(ADCC)活性增強(qiáng)。
[0197]按照一 實(shí)施方式，所產(chǎn)生的抗體是IgGl或IgG3類抗體。
[0198]具有變種巖藻糖基化模式和/或由本說(shuō)明書(shū)所述經(jīng)修飾的CHO宿主細(xì)胞所產(chǎn)生的抗體可結(jié)合任何抗原，如癌抗原。所述癌抗原可選自:HER2、免疫球蛋白eFc受體I1、Alk-1、CD20、EGF 受體、VEGF 受體、FGF 受體、NGF 受體、PDGF 受體、EpCam, CD3、CD4、CDl la、CD19、CD22、CD30、CD33、CD38、CD40、CD51、CD55、CD80、CD95、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CTLA-4、粘蛋白1、粘蛋白16、內(nèi)皮因子、間皮素受體、Nogo受體、葉酸受體、CXCR4、胰島素樣生長(zhǎng)因子受體、神經(jīng)節(jié)苷脂⑶3、α和β整合素。
[0199]本發(fā)明細(xì)胞所產(chǎn)生的示范性抗體包括但不限于:阿達(dá)木單抗(Humirara)^a侖珠單抗(Campath?)、巴利昔單抗(Simulect?1)、貝伐單抗(Avastin?)、西妥昔單抗(Erbitux?)、達(dá)珠單抗(Zenapax?1)、dacetuzumab、依法珠單抗(Raptiva?)、依帕珠單抗、替伊真單抗(Zevalinra)、替伊莫單抗、如英昔單抗(Remicade?)、莫羅莫那_CD3 (0KT3)、奧馬佐單抗(Xolairra)、帕利珠單抗(Synagis?)、奧戈伏單抗(OvaRexra)、利妥昔單抗(Rituxan?)、曲妥珠單抗(HerceptinR?)、ocrelizumab、帕妥珠單抗、huM195Mab、抗-淀粉樣蛋白、抗-0)4、抗-氧化LDL、曲妥珠單抗-DMl、apomab、rhuMAb、GAlOl、抗-0X40L、伊匹單抗(ipilimumab)、優(yōu)特克諾單抗、戈利木單抗、木單抗、zalutumumab、莫維珠單抗、依美昔單抗、MDXlOl、4B5、TNX-901、IDRC-114和能誘導(dǎo)ADCC的抗原特異性Fe抗體任何片段。
[0200]本說(shuō)明書(shū)所用的術(shù)語(yǔ)“約”指±10%。
[0201]術(shù)語(yǔ)“包含”、“包括”、“含有”、“具有”及他們的結(jié)合意指“包括但不限于”。[0202]本申請(qǐng)書(shū)通篇中，本發(fā)明的各種實(shí)施方式可以一種范圍格式呈現(xiàn)。應(yīng)理解這種范圍格式的描述只是為了方便和簡(jiǎn)短，不應(yīng)被解釋為對(duì)本發(fā)明范圍的僵化限制。因此，一個(gè)范圍的描述應(yīng)被視為具體公開(kāi)了所有可能的子范圍以及該范圍內(nèi)的各個(gè)數(shù)值。例如，描述的范圍是1-6應(yīng)被視為具體公開(kāi)了子范圍如1-3、1-4、1-5、2-4、2-6、3-6等以及該范圍內(nèi)的各個(gè)數(shù)值。
[0203]每當(dāng)本說(shuō)明書(shū)示出一個(gè)數(shù)值范圍，就意味著包括該示出范圍內(nèi)的任何引用數(shù)值(分?jǐn)?shù)或整數(shù))。短語(yǔ)第一個(gè)字指出的數(shù)字到第二個(gè)字指出的數(shù)字“之間的范圍”，與“范圍”為從第一個(gè)字指出的數(shù)字到第二個(gè)字指出的數(shù)字，在本說(shuō)明書(shū)中可互換使用，意味著包括第一個(gè)和第二個(gè)指出的數(shù)字及它們之間的所有分?jǐn)?shù)和整數(shù)數(shù)字。
[0204]本說(shuō)明書(shū)所用的術(shù)語(yǔ)“方法”指可用于完成某給定任務(wù)的方式、方法、技術(shù)和程序，包括但不限于化學(xué)、藥理學(xué)、生物學(xué)、生物化學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域從業(yè)者已知的那些方式、方法、技術(shù)和程序，或易于從已知的方式、方法、技術(shù)和程序開(kāi)發(fā)的方式、方法、技術(shù)和程序。
[0205]應(yīng)理解，為清晰起見(jiàn)，在上下文不同的實(shí)施方式中描述的本發(fā)明某些特征也可被組合在一個(gè)單一實(shí)施方式中提供。相反，為簡(jiǎn)短起見(jiàn)，在上下文單一實(shí)施方式中描述的本發(fā)明各種特征也可單獨(dú)或以任何適當(dāng)?shù)淖咏M合、或在任何其他描述本發(fā)明實(shí)施方式中提供。上下文各種實(shí)施方式中描述的各種特征不應(yīng)認(rèn)為是這些實(shí)施方式的必要特征，除非沒(méi)有這些元素該實(shí)施方式不起作用。
[0206]本說(shuō)明書(shū)上面描述的和權(quán)利要求中要求保護(hù)的本發(fā)明各種實(shí)施方式和各方面內(nèi)容可在以下實(shí)施例中找到實(shí)驗(yàn)支持。 實(shí)施例
[0207]現(xiàn)在參見(jiàn)以下實(shí)施例，與上面的描述一起以非限制方式說(shuō)明本發(fā)明的某些實(shí)施方式。
[0208]一般而言，本說(shuō)明書(shū)所用的命名法和本發(fā)明所用的實(shí)驗(yàn)方法包括分子、生物化學(xué)、微生物學(xué)和重組DNA技術(shù)。文獻(xiàn)中有這些技術(shù)的充分說(shuō)明。例如，可參見(jiàn)Sambrook等的“分子克隆:實(shí)驗(yàn)手冊(cè)”(1989);AUSUbel，R.M.主編的“分子生物學(xué)當(dāng)前方案”第1-1II卷(1994) ；Ausubel等的“分子生物學(xué)當(dāng)前方案”，John Wiley和Sons出版社，巴爾的摩，馬里蘭州(1989) ；Perbal的“分子克隆實(shí)踐指南”，John Wiley和Sons出版社，紐約(1988) ;Watson 等的“重組 DNA”，科學(xué)美國(guó)人叢書(shū)(Scientific American Books),紐約；Birren等主編的“基因組分析，實(shí)驗(yàn)手冊(cè)叢書(shū)”，1-4版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約(1988);美國(guó)專利 4，666，828; 4, 683，202; 4, 801，531; 5, 192，659 和 5，272，057 中所闡述的方法；J.E.等主編的“細(xì)胞生物學(xué)，實(shí)驗(yàn)手冊(cè)”1-111卷，Cellis出版社(1994)；Freshney, Wikey-Liss，N.Y.的“動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)一基礎(chǔ)技術(shù)手冊(cè)”，第3版，紐約(1994);Coligan.J主編的“免疫學(xué)當(dāng)前方案” 1-1II卷(1994) ；Stites等主編的“基礎(chǔ)和臨床免疫學(xué)”，第 8 版，Appleton&Lange, Norwak, CT (1994) ；Mishell 和 Shiigi 主編的“細(xì)胞免疫學(xué)的選擇方法”，W.H.Freeman公司，紐約，(1980);以及專利和科學(xué)文獻(xiàn)中廣泛描述的現(xiàn)有免疫試驗(yàn)，參見(jiàn)，例如美國(guó)專利 N0.3，791，932; 3, 839，153; 3，850，752; 3, 850，578; 3, 853，987; 3,867，517; 3，879，262; 3, 901，645; 3, 935，074; 3, 984，533 ; 3, 996，345; 4, 034，074; 4, 098，876;4，879，219; 5，011，771 和 5，281，521 ；Gait, M.J.主編的“寡核苷酸合成”(1984)；Hames, B.D.和 Higgins, S.J.主編的“核酸雜交” (1985) ；Hames, B.D.和 Higgins, S.J.主編的“轉(zhuǎn)錄和翻譯” (1984) ；Freshney,R.1.主編的“動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)”(1986)固定的細(xì)胞和酶”，LRL出版社(1986) ;Perbal，B.的“分子克隆實(shí)踐指南”(1984)和“酶學(xué)方法” 1-317卷，Academic出版社；“PCR方法,方法指南和應(yīng)用”，Academic出版社，San Diego, CA (1990)；Marshak等的“蛋白純化和特征分析的策略一實(shí)驗(yàn)室課程手冊(cè)”，CSHL出版社(1996);以上所有文獻(xiàn)均納入本說(shuō)明書(shū)作參考。相信上述方法為本領(lǐng)域所熟知并為方便讀者而提供。文獻(xiàn)中包含的所有信息納入本說(shuō)明書(shū)作參考。
[0209]通用材料
[0210]細(xì)胞:
[0211]建立了適應(yīng)于Sigma C6614 培養(yǎng)液的 CH0-S 細(xì)胞(GibcoBRL, Cat.#11619)； [0212]含200nM MTX 的 C6614 培養(yǎng)的 CH0-S 細(xì)胞；
[0213]C6614 培養(yǎng)的 CHO-Dukx 細(xì)胞；
[0214]ProCH0-5 培養(yǎng)的 CHO-Sl 細(xì)胞。
[0215]質(zhì)粒:PGL3抗-EGFRmAb EMCV-PAC1-DHFR 串聯(lián)-872 ；pTT5 載體；pCMV_P。
[0216]試劑
[0217]AccuPrime Pfx Invitrogen 的 DNA 聚合酶 Cat.N0.12344-024;
[0218]分子生物學(xué)認(rèn)證的瓊脂糖:IBI瓊脂糖Cat.#1B70042;
[0219]牛血清白蛋白組分溶液(BSA)，7.5%, Sigma, Cat.#A8412;
[0220]橙黃網(wǎng)孢盤(pán)菌凝集素AAL; lmg/ml, Cat.L-1390, Vector;
[0221]米曲霉菌1-巖藻糖特異性凝集素A0L, 5mg/ml, Cat.L0169, ΕΥ;
[0222]氨節(jié)青霉素一Sigma Cat.#A9518;
[0223]ELISA 用抗體:包被抗體:山羊抗人 IgG (H+L), Jackson Tmmuno ResearchCat.#109-005-088 (USA);檢測(cè)抗體:山羊抗人 IgG Fe (Fab2) Jackson Tmmuno ResearchCat.#109-036-098(USA)；
[0224]β肌動(dòng)蛋白試驗(yàn)需要的Q-PCR探針和引物，ABI Cat.#RN00667869_ml ；
[0225]生物素(EZ-Link'K'NHS-PEG4-生物素，No-Weigh? Format, Cat.21329，ThermoCat.#21329;
[0226]生物素化AAL，Img 活性偶聯(lián)物，Vector, Cat.#B_1395 ；
[0227]生物素化MAL, lmg, EY, Cat.#ΒΑ-7801_2;
[0228]牛血清白蛋白(BSA)，Bovostar.Bovogen Cat.#BSAS.01;
[0229]細(xì)胞增強(qiáng)劑，HyClone,Cat.#SH30866.01;
[0230]CHO CD 有效飼料 ? A, Invitrogen, Cat.#A10234_01;
[0231]CHO CD 有效飼料 ? B, Invitrogen, Cat.#A10240_01;
[0232]檸檬酸，Sigma,Cat.#C_1909;
[0233]硫酸葡萄糖鈉鹽，Sigma,Cat.#D4911;
[0234]DH5 α 感受態(tài)細(xì)菌-Life-Technologies, Cat.#18263-012;
[0235]DMS0, Merck, Cat.#1.02931.1000;
[0236]DNA 階梯:lkb 的 DNA 階梯一Biolabs, Cat.#3232L;
[0237]DNA 階梯:100bp 的 DNA 階梯一Biolabs, Cat.#3231L;[0238]DTTj Cat:D9779，Sigma;
[0239]EDTA, Sigma, Cat.#E7889;
[0240]乙醇，Merck, Cat.#00983.1000;
[0241]EZ-Link? NHS-PEG4-生物素，No-Weigh? Format, Cat:21329, Thermo FisherScientific Inc.USA;
[0242]FACS Accudrop 珠，Becton Dickinson, Cat.#MAB345249;
[0243]巖藻糖，Sigma,Cat.#F2252 ；
[0244]葡萄糖，Sigma,Cat.#G7021 ；
[0245]谷氨酉先胺，BiologicalIndustries, Cat.#03_020_1Α;
[0246]谷氨酰胺，Sigma,Cat.#G5972 ；
[0247]甘氨酸，Merck,Cat.#4201;
[0248]鹽酸胍，Cat.#G3272，Sigma;
[0249]HepeslM，Invitrogen, Cat.#15630-056;
[0250]高能cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，Applied Biosystems, Cat.#4368814;
[0251]HTX50，Biological Industries, Cat.#03-085-lC;
[0252]鹽酸，Merck,Cat.冊(cè)N-17891.00317.2500 ；
[0253]iCE280 甲基纖維素 1%，Cat.#102220 和 101876，ConvergentBiosciences, (Canada);
[0254]iCE280 兩性載體 3-10，Cat.#10-0456-01，GE Healthcare(Germany)；
[0255]iCE280pI 標(biāo)記 6.14 和 9.5，Cat.# 分別為 102220 和 101996，ConvergentBiosciences, (Canada);
[0256]iCE280 系統(tǒng)適用性試劑盒，Cat.#102093_j，Convergent Biosciences, (Canada);
[0257]iCE280IEF 試劑盒，Convergent Biosciences;
[0258]IMag 緩沖液，Becton Dickinson, Cat.#552362 ；
[0259]IMag SA 顆粒加 _DM，Becton Dickinson, Cat.#557812;
[0260]碘乙酰胺，Cat.#11149，Sigma ；
[0261]ITSX100, Invitrogen, Cat.#51500-056;
[0262]LB+ 氨節(jié)青霉素板-Hy-Labs Cat.#PD178;
[0263]L-半胱氨酸，Cat.#C7352, Sigma;
[0264]脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺，Invitrogen,Cat.#50470;
[0265]懷槐凝集素lmg/ml，Cat.#L8025，批號(hào):036k4075，Sigma;
[0266]MAA-FITCj 2mg/2ml 緩沖液，EYj Cat.#F_7801_2;
[0267]馬來(lái)酰亞胺，Cat.#129585，批號(hào):S56783_278，Sigma;
[0268]Na2PO4.2H20，Merck, Cat.#6580;
[0269]NaH2PO4.H2Oj Merck, Cat.#6346;
[0270]Octet QK 系統(tǒng)，動(dòng)力學(xué)緩沖液 xlO，Cat.#18-5032，F(xiàn)ortebi0.Fortebio Inc.USA ；
[0271]木瓜酶，Cat.P3125，Sigma，以0.05M乙酸鈉(pH4.5)溶液提供，含0.05%瑞香草分;
[0272]酚紅，Sigma,Cat.#P0290;[0273]泊洛沙姆(Pluronic)F-68, Sigma, Cat.#P5556;
[0274]聚乙烯亞胺粉末，LinearMW25000, Polysciences, Cat.#23966;
[0275]蛋白酶抑制劑混合物，Sigma, Cat.#P8340;
[0276]蛋白酶抑制劑，Sigma,Cat.#P8340;
[0277]A 蛋白瓊脂糖凝膠(Sepharose)-Mab Select Xtra, Cat.#17-5269-07,批號(hào):#10011545 ；
[0278]G 蛋白磁珠，Biolabs, Cat.#S1430;
[0279]嘌呤霉素，Invitrogen,Cat.#Ant-pr5;
[0280]嘌呤霉素，Sigma,Cat.#P8833;
[0281]參比樣品:ERBlTlJX7il5mg/ml 灌注溶液，Merck, Serono,批號(hào):#7820907 ；
[0282]限制性酶購(gòu)自:新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室(New England Biolabs);
[0283]R-藻紅蛋白偶聯(lián)鏈霉親和素(SA-PE)，0.2mg/ml, Biolegend, Cat.#405203;
[0284]R-藻紅蛋白偶聯(lián)鏈霉親和素(SA-PE)，Jackson, Cat.#016-110-084;
[0285]脫脂奶粉，F(xiàn)luka,Cat.#70166;
[0286]碳酸氫鈉，M erck,Cat.#6329 ；
[0287]碳酸鈉，Merck,Cat.#6392 ；
[0288]氯化鈉，Merck,Cat.#6404 ；
[0289]氫氧化鈉顆粒，Merck,Cat.#1.06498.500 ；
[0290]SuperScriptk III 細(xì)胞直接 cDNA 合成試劑盒，Invitrogen, Cat.#18080-051;
[0291]SYBR 安全 DNA 凝膠染料，1000Ox 用 DNSO 配制，Invitrogen, Cat.#S33102;
[0292]TMB 溶液，Cat.#1928, Savyon Diagnostics ；
[0293]TransIT-PRO 試劑盒，Mirus, Cat.#Mir5700 ；
[0294]Tris-HCl, Cat.#T3038,批號(hào):037K8402, Sigma;
[0295]吐溫20, Cat.8.17072, Merck ；
[0296]丙戍酸鈉鹽，Sigma,Cat.#P4543。
[0297]溶液
[0298]生物素化AAL-SA-PE混合液:含20 μ g/ml生物素化AAL和2 μ g/ml SA-PE的PBS+0.1%泊洛沙姆酸液；
[0299]1% 漂白劑-FACS 清洗液，Becton Dickinson, Cat.#340345 ；
[0300]ELISA試驗(yàn)緩沖液:含1%脫脂奶粉的PBS;
[0301 ]ELISA 封閉緩沖液:含 l%BSA/0.05% 吐溫-20 的 PBS ；
[0302]ELISA捕獲(包被)緩沖液:用0.1M碳酸鹽緩沖液(pH9.6)將山羊抗-人IgG(H+L)按1:900稀釋至最終濃度2mcg/ml ；
[0303]ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品:用試驗(yàn)緩沖液將參比樣品Erbitux(EMD，批號(hào)-7820907，
5.0mg/ml)稀釋至100ng/ml,然后作2倍系列稀釋至1.56ng/ml,每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)濃度制備最終體積至少I(mǎi)ml的溶液；
[0304]ELISA洗滌緩沖液:含0.05%吐溫-20的PBS;
[0305]配方緩沖液:取氯化鈉11.7g (IOOmM)，檸檬酸4.2g (IOmM)，甘氨酸15g (IOOmM)，溶于WFI水,加氫氧化鈉使pH=5.8,加WFI水使體積達(dá)到2升；
[0306]iCE280電泳貯存液:取70mcll%甲基纖維素、lmcl6.14和9.5pl標(biāo)記物、8mcl兩性載體(PH3-10)，加 100ml WFI ；
[0307]木瓜酶切割緩沖液:0.1M Tris-HCl, 4mM EDTA, 5mM甘氨酸，pH7.6，甘氨酸每次應(yīng)新鮮制備，用此緩沖液按廠商說(shuō)明書(shū)稀釋木瓜酶至lmg/ml;
[0308]PBS (磷酸鹽緩沖液):10mM磷酸鈉、150mM氯化鈉，pH7.2，用IOxPBS作1:10稀釋而制得；
[0309]含0.1%泊洛沙姆的PBS;
[0310]PBS, (ITL 制劑，BR R0450V01);
[0311]PBS-0.05% 吐溫-20:0.5ml 吐溫-20 與 I 升 PBS xl 混合而成；
[0312]20mM 磷酸鹽緩沖液(pH7.5):1.8g Na2PO4.2H20 和 1.38g NaH2PO4.H2O 溶于 I 升水；
[0313]A蛋白洗脫液:20mM乙酸，ρΗ=3.2 ;
[0314]A蛋白平衡/洗滌緩沖液2:50mM乙酸鈉，pH=6.8 ；
[0315]A蛋白洗滌緩沖液1:50mM乙酸鈉+1.5M氯化鈉，pH=6.8 ；
[0316]還原緩沖液x2:8M鹽酸胍，IOOmM Tris-HCl, IOmM DTT, pH8.8 (每次新鮮制備)。
[0317]細(xì)胞培養(yǎng)液
[0318]3.5%細(xì)胞增強(qiáng)6貯存液；
[0319]CHO 克隆培養(yǎng)液，Cat.#6366, Sigma;
[0320]CHO DHFR-培養(yǎng)基粉末，SAFC Bioscinces, Cat.#C6614(ITL 制品 R0461V01);
[0321]DMEM-F/121:1X1, Invitrogen, Cat.#21331-020;
[0322]FEME 培養(yǎng)液(DMEM/F-12 (1:1) (Invitrogen, Cat.#32500_043)添加 8ml/L ITS-X (Invitrogen, Cat.#51500-056);
[0323]極限必需培養(yǎng)基Eagle，Sigma, Cat.#M2279;
[0324]ProCH05, Lonza, Cat.#BE12_766Q;
[0325]Select CD1000, Becton Dickinson, Cat.#215204;
[0326]VPA 鈉貯存液 100mM。
[0327]—次性使用器材
[0328]14ml 離心管，Greiner, Cat.#187261;
[0329]15ml 離心管，Corning, Cat.#430052;
[0330]24 孔板，Nunc, Cat.#142475;
[0331]5ml 聚苯乙烯園底試管，Becton Dickinson, Falcon, Cat.#352054;
[0332]5ml 聚苯乙烯園底試管，Becton Dickinson, Falcon, Cat.#352054;
[0333]96 孔板，Costar, Cat.#3595;
[0334]96 孔板，F(xiàn)alcon, Cat.#353072;
[0335]ABI PRISM TM 光照粘合蓋 IOOPkg, Applied Biosystems, Cat.#4311971;
[0336]冷凍管小瓶2ml, Grenier, Cat.#126-263;
[0337]針頭過(guò)濾器(Acrodiscfilter) 0.2 μ m, Gelman, Cat.#4192 ；
[0338]Amicon 超濾試管，15mll0kDa, Cat.UFC901024, Millipore;
[0339]Amicon 超濾試管，3kDa, Cat.UFC900324, Millipore;[0340]Amicon 超離心過(guò)濾單兀，Millipore, Cat.#UFC801024;
[0341]I°C冰凍容器，Nalgene, Cat.#5100-0001;
[0342]PBS 或水除菌用一次性 0.22 μ 過(guò)濾器，Nalgene, Cat.#1270020 ；
[0343]ACFM 除菌(GP 表達(dá)加膜)用一次性 0.2 μ 過(guò)濾器，Millipore，Cat.#SCGPU05RE 或SCGPUlIRE;
[0344]FACS 清洗除菌一次性 0.45 μ 過(guò)濾器，Nalgene, Cat.#4500045 ；
[0345]一次性 40 μ 細(xì)胞粗濾除菌器，Becton Dickinson, Falcon, Cat.#352340;
[0346]帶有35μ細(xì)胞粗濾杯的一次性5ml聚苯乙烯試管，BectonDickinson, Falcon, Cat.#352235;
[0347]一次性 70μ (或 35μ)除菌過(guò)濾杯 Filcon ,BectonDickinson, Falcon, Cat.#340634;
[0348]一次性 10 μ 過(guò)濾杯 Filcon, Becton Dickinson, Cat.#340732 ；
[0349]一次性 30 μ 過(guò)濾杯 Filcon, Becton Dickinson, Cat.#340625 ；
[0350]DynaMag, Dynal, Invitrogen, Cat.#123.0lD;
[0351]DynaMag, Dynal, Invitrogen, Cat.#123.21D;
[0352]ELISA 微滴板 MaxiSorp F96, Cat:NUNC;
[0353]錐形瓶100ml, Triforest, Cat.#TF FPC1000S;
[0354]錐形燒瓶125ml, Corning, Cat.撕1-431143; 250ml, Corning, Cat.撕1-431144; 500ml,Corning, Cat.撕1-431145;2L, Corning, Cat.撕1-4312-55;
[0355]FACS 試管，F(xiàn)alcon, Cat.#352235,帶藍(lán)色過(guò)濾帽；
[0356]FACS 試管，BD Falcon, Cat.#352235;
[0357]過(guò)濾試管10” 0.1 μ m, Durapore, Millipore, Cat.#Mllipak20050 ；
[0358]過(guò)濾試管50，TPP，Cat.#87050 ；
[0359]iCE280 毛細(xì)管芯柱，Cat:FC 包被(PN: 101700) ,Convergent Biosciences;
[0360]iCE280 顯微注射轉(zhuǎn)移毛細(xì)管，Cat.PN: 102019, Convergent Biosciences;
[0361]1 磁鐵，Becton Dickinson, Cat.#552311 ；
[0362]帶有網(wǎng)格的Kova 玻璃計(jì)數(shù)板(Glasstic Slide) 10, Hycor, Cat.87144;
[0363]微離心管(1.7ml) , Costa, Cat.#3207;
[0364]Octet QK 系統(tǒng)，微孔板，黑色 96 孔，Cat.655209, Greiner, bio-one,德國(guó);
[0365]96 孔光學(xué)快熱循環(huán)條形碼板 20/Pkg, Applied Biosystems, Cat.#4346906 吸管頭，Sorenson, Cat.#14200 和 14220 ；
[0366]吸管頭0-200 μ I，Costa, Cat.#4864;
[0367]載玻片-A溶解透析盒G22kDa:Cat.#87718,恒溫；
[0368]SnakeSkin 透析管 IOkDa, Cat.#68100,批號(hào) JJ127549,恒溫，HiTrap MabSelectXtralml, Cat.#28-4082-58,GE;
[0369]一次性過(guò)濾裝置 1 升過(guò)濾單元 0.1 μ m，Mi 11 ipore, Cat.#SCGPU05RE;
[0370]一次性過(guò)濾裝置 1 升過(guò)濾單元 0.2 μ m，Millipore, Cat.#SCGPU11RE;
[0371]無(wú)菌過(guò)濾器50ml 過(guò)濾單元，0.22 μ m, Millipore, Cat.#SCGP00525;
[0372]滅菌24 孔板，Nunc, Cat.#143982;[0373]滅菌6 孔板，Costar, Cat.#3506;
[0374]滅菌離心管:I5ml，Bec ton Dickinson, Falcon, Cat.#2097 和Corning, Cat.#430055 ；50ml, Corning, Cat.#430290; 250ml，Corning, Cat.#430776; 500ml，Corning, Cat.#431123;
[0375]滅菌FACS 試管，Becton Dickinson, Falcon, Cat.#352054 ；
[0376]滅菌移液管:10ml，SterillinCat.#47110; Imlj SterillinCat.#40105; 2ml，Sterillin Cat.#40102; 5ml，Corning, Cat.#4011; 50ml，Corning, Cat.#W4501;25ml，F(xiàn)alcon, Cat.#35-7525;
[0377]滅菌組織培養(yǎng)瓶:25cm2(T-25)，Nunc, Cat.#163371;
[0378]鏈霉親和素生物傳感器頭，Cat.18-5019，F(xiàn)ortebio Incj USA;
[0379]滅菌注射器，2.5ml，Med1-Plusj Cat.；
[0380]TCF175cm2，Nunc, Cat.#156502;
[0381]TCF25cm2，Nunc, Cat.#136196;
[0382]TCF80cm2，Nunc, Cat.#153732。
[0383]儀器
[0384]AKTA 探測(cè)器 100，Cat.18-1112-41，GE (德國(guó))；
[0385]Cellav ista-1nnovatisj Roche;
[0386]離心機(jī)-Cat.#5417R-Eppendorf;
[0387]離心機(jī)-型號(hào)RC3C Plus - Sorvall (USA);
[0388]循環(huán)水浴箱，F(xiàn)3/K型，Haake (芬蘭)；
[0389]電導(dǎo)儀 0R10N，150 型，ORION Research Inc.[0390]庫(kù)爾特計(jì)數(shù)器，ZI型，Coulter Electronics (英格蘭)；
[0391]IdC冰凍容器，Nalgene，Cat#N0.5100-0001 ；
[0392]ELISA 平板讀數(shù)儀，Sunrise basic, Cat.#16039400, TECAN;
[0393]ELISA 平板洗滌器，Cat.#6040834，TECAN;
[0394]ELISA 機(jī)器人，Geresis RSP150/8，Cat.#5112200，恒溫；
[0395]Eppendorf 離心管，5417R 系列，Eppendorf (德國(guó))；
[0396]FACSAria 流式細(xì)胞儀，Becton Dickinson,；
[0397]微量移液管，Cat.#4540000, Labsystems (芬蘭)；
[0398]GE Fanuc 系列 90-70 程序控制儀-General Electric Ltd.(USA);
[0399]GeneAmp》:PCR 系統(tǒng) 9700，PE Applied Biosystems (USA);
[0400]水平凝膠電泳系統(tǒng)，GIBC0-BRLHorizon58, Cat.#41060;
[0401]iCE280 成像毛細(xì)管電泳分析儀，Cat.#1241，Convergent Biosciences;
[0402]iCE280PrinCE 微量注射器，Cat.#5418074067，Convergent Biosciences;
[0403]iCE280 軟件 iCE280CFR 軟件，v.2.3.6 版，Convergent Biosciences;
[0404]成像控制器(Imaginemaster) VDS，Cat.#80_6254_80，Pharmacia(瑞典)；
[0405]搖動(dòng)培養(yǎng)盒，CE.RTOMA10]BS-T，Β.Braun Biotech International (德國(guó))；
[0406]培養(yǎng)箱，37°C 5%C02，溫度和CO2可控，TuttnaueH以色列);[0407]培養(yǎng)搖床“η” 堆疊，Hybaid, Cat.#HBM0VC5T220 (雜交爐)；
[0408]層流凈化罩(LFH) 100型，Israflow(以色列);
[0409]光學(xué)顯微鏡，TMS型 N0.301070, Nikon (日本)；
[0410]微量板培養(yǎng)箱/ 搖床，iEMS, ThermoLabsystem (芬蘭)；
[0411]微量板清洗機(jī)，Cat.#WW015，Applied Quality Services LTD (UK);
[0412]微波爐一Crystal,17 升；
[0413]Octet QK 系統(tǒng),數(shù)據(jù)獲得軟件 6.3 版，F(xiàn)ortebio Inc, USA;
[0414]Octet QK 系統(tǒng),數(shù)據(jù)分析軟件 6.3 版，F(xiàn)ortebio Inc, USA;
[0415]Octet QK 系統(tǒng)，F(xiàn)ortebio Inc, CA, USA;
[0416]定軌平臺(tái)搖床，具有25mm搖動(dòng)振幅(軌道)，New Brunswick Scientific (USA);
[0417]螺動(dòng)泵-WatsonMarlow5O3S 或 5O5U(英國(guó))；
[0418]pH 計(jì)，PHM210 系列，Radiometer (丹麥)；
[0419]平板洗滌器(SLT96PW)TECAN;
[0420]平臺(tái)振動(dòng)搖床-Hoefer“Red-Rocker，，PR5O-25OV (Pharmacia Biotech);
[0421]電源，Cat.#PS500XT, Hoefer Scientific Instruments (USA);
[0422]冷凍離心管，Multifuge3S-R,Heraeus ;
[0423]冷凍搖動(dòng)培養(yǎng)箱，Innova4230,New Brunswick Scientific (USA);
[0424]機(jī)器人樣品處理器，RSP150/8型，Genesis, TEACN(瑞士 );
[0425]搖床，Rotamax,#120 系列 Heidolph (德國(guó))；
[0426]軟件-WIZCON-PCSoft International Ltd.(以色列)；
[0427]StepOnePlus? 實(shí)時(shí)-PCR 系統(tǒng)，Applied Biosystems, Cat.#4376600;
[0428]UV 表，BTS20.MS, Uvitec, Cat.#M023641 ；
[0429]水浴箱,恒溫控制，Polyscience,9106 型。
[0430]通用方法
[0431]縮寫(xiě)
[0432]AAL-橙黃網(wǎng)孢盤(pán)菌凝集素
[0433]ACF-無(wú)動(dòng)物成分
[0434]ACFM無(wú)動(dòng)物成分培養(yǎng)液
[0435]ADCC-抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒
[0436]Anti EGFR mAb 抗 EGFR mAb
[0437]CHO-中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞
[0438]DHFR二氫葉酸還原酶
[0439]DMEM-DulbeccoJ s 改良 Eagle’ s 培養(yǎng)液
[0440]DMSO二甲基亞楓
[0441]DTT-二硫蘇糖醇
[0442]EDTA乙二胺四乙酸
[0443]EGFR表皮生長(zhǎng)因子受:體
[0444]ELISA酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)
[0445]EMCV-腦心肌炎病毒[0446]Fab-1gGl重鏈和輕鏈的CHl和Vh部分
[0447]FACS-熒光激活細(xì)胞分揀儀
[0448]Fe-1gGl 重鏈的 CH3 和 CH2 部分
[0449]F-SA-熒光鏈霉親和素
[0450]Fut8-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶8
[0451]FX⑶P-4-酮基-6-脫氧甘露糖3，5-差向異構(gòu)酶，4-還原酶
[0452]GFT-⑶P-巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白
[0453]GMD-⑶P-甘露糖4，6_脫水酶
[0454]GO1-感興趣的基因
[0455]HC-重鏈
[0456]hCMV-1E-人巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子
[0457]HRP辣根過(guò)氧化物酶
[0458]ICE成像毛細(xì)管電泳
[0459]IgGl免疫球蛋白Gl類
·[0460]IRES內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)
[0461]LC-輕鏈
[0462]MAA-懷槐(Maackia amurensis)凝集素
[0463]MCB-主細(xì)胞庫(kù)
[0464]mMCV-小鼠巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子
[0465]MFl-平均熒光強(qiáng)度
[0466]MS-質(zhì)譜
[0467]MTX-甲氨喋呤
[0468]NK-自然殺傷細(xì)胞
[0469]PA-聚腺苷酸化
[0470]PAC-嘌呤霉素N-乙酰轉(zhuǎn)移酶
[0471]PBS磷酸緩沖鹽水
[0472]P⑶-每個(gè)細(xì)胞每天微微克
[0473]PCR-聚合酶鏈反應(yīng)
[0474]PDL-群體倍增水平
[0475]PDT-群體倍增時(shí)間
[0476]PO1-感興趣的蛋白質(zhì)
[0477]PreMCB-前主細(xì)胞庫(kù)
[0478]RE-限制性酶
[0479]RT-室溫
[0480]SA-鏈霉親和素
[0481]SA-PER-藻紅蛋白偶聯(lián)的鏈霉親和素
[0482]SP-單個(gè)肽
[0483]SV40- 猿猴病毒 40
[0484]TM- 跨膜肽[0485]TMB 3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺
[0486]VPA- 丙戊酸
[0487]在存在MTX時(shí)培育CHO-S細(xì)胞:取C6614培養(yǎng)的CH0-S細(xì)胞以0.2xl06細(xì)胞/ml接種在含IOOnM MTX的培養(yǎng)液中，增殖10天直到活力超過(guò)90%。然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至200nMMTX中增殖27天，隨后在200nM MTX中凍存細(xì)胞。為分離得到巖藻糖零表達(dá)的細(xì)胞，用不含MTX的培養(yǎng)液融化細(xì)胞。
[0488]用鏈霉親和素磁珠選擇低巖藻糖細(xì)胞:將經(jīng)MTX處理的CHO細(xì)胞用生物素化AAL或AOL標(biāo)記并與連接有鏈霉親和素的磁珠混合。用磁鐵分離細(xì)胞，使懸液中不附著于磁鐵的細(xì)胞(即其表面巖藻糖水平低的細(xì)胞)進(jìn)一步增殖。執(zhí)行此步驟兩次，然后用FACS分揀細(xì)胞。
[0489]收集經(jīng)MTX處理的50xl06個(gè)CH0-S細(xì)胞，用PBS+0.1%泊洛沙姆酸(PluronicF-68，Sigma Cat.#p5556)液洗滌。然后于室溫下將細(xì)胞在含濃度20 μ g/ml生物素化AAL (Vector, Cat.B-1395, Lot#U0922)或濃度 5yg/ml 生物素化 AOL (Cat.LO169，EY)的PBS+0.1%泊洛沙姆酸液5ml中，重懸30分鐘。用PBS+0.1%泊洛沙姆酸洗滌染色后的細(xì)胞，加入250 μ I BD IMag SA顆粒和DM(BD，Cat#557812)，再室溫培育30分鐘。然后加入2.25ml的PBS+0.1%泊洛沙姆酸+0.5%BSA。將磁珠分裝在三個(gè)5ml試管中，放在BDIMagmet (BD, Cat#552311)上留置8分鐘。吸取上清液移到一個(gè)新15ml試管中，進(jìn)行此步驟兩次，合并吸取的上清液。再將上清液分裝入5ml試管置于BD IMagmet (BD, Cat#552311)上8分鐘。收集上清液、離心，接種C6614培養(yǎng)液(CHO DHFR—培養(yǎng)基粉末，SAFC BioscincesCat#C6614) (ITL制品R0461V01)。增殖細(xì)胞，然后執(zhí)行另一輪磁珠分離。
[0490]與凝集素一起培育后，與AAL培育的細(xì)胞活力為83%，與AOL培育的為89%。與PBS培育細(xì)胞的典型活力為85-95%。
[0491]用FACS分揀低巖藻糖細(xì)胞
[0492]A.磁珠分離后的分揀:對(duì)經(jīng)二輪磁珠分離的細(xì)胞用FACS分揀細(xì)胞表面巖藻糖水平低的細(xì)胞。用冷PBS+0.1%泊洛沙姆酸液洗滌40xl06細(xì)胞，離心，重懸于IOml含20 μ g/ml生物素化AAL或A0L+SA-PE的混合液中，轉(zhuǎn)移至T80瓶中于37°C、45rpm振搖培育30分鐘。將細(xì)胞離心，用PBS+0.1%泊洛沙姆酸液洗滌，離心兩次，重懸于PBS+0.1%泊洛沙姆酸液至終濃度IOxIO6細(xì)胞/ml。用FACS將熒光最低的細(xì)胞懸液部分(1.5%)分揀入每管2ml的 Sigma C6614SFM+HT(Biological Industries Cat#03-085_1C)液中，離心，重懸于每管1.5ml的Sigma C6614SFM+HT液中，接種6孔板孔，并增殖細(xì)胞。
[0493]B.低巖藻糖細(xì)胞的分揀-4輪:用冷PBS+0.1%泊洛沙姆酸液洗滌IOOxIO6細(xì)胞，離心，重懸于IOml含生物素化AAL (20 μ g/ml) +SA-PE (1:100)的PBS+0.1%泊洛沙姆酸混合液中，轉(zhuǎn)移至T80瓶中37°C、45rpm振搖培育30分鐘。將細(xì)胞離心，用冷的PBS+0.1%泊洛沙姆酸液洗滌，離心兩次，重懸于PBS+0.1%泊洛沙姆酸液，得到細(xì)胞濃度IOxlOfVml，濾入FACS試管中。用AAL培育后，細(xì)胞的活力為81%。用PBS培育后的典型細(xì)胞活力為85_95%。用FACS將細(xì)胞群中最低熒光部分(第一次分揀0.2%，第二次0.07%,第三次1%，第四次2%)分揀入每管2ml的Sigma ProCH5SFM+HT液中，離心，重懸于每管Iml (第一和第二次分揀)或3ml (第三和第四次分揀)的ProCH5SFM+HT液中，接種24孔板孔(第一和第二次分揀)或T25瓶(第三和第四次分揀)，并增殖細(xì)胞。[0494]用FACS分析細(xì)胞膜巖藻糖水平:用PBS+0.1%泊洛沙姆酸液洗滌2xl06細(xì)胞，離心，重懸于含 500 ill 生物素化 AAL (Cat.B1395, Vector)(稀釋至 20 y g/ml)或 AOL (Cat.L0169, EY)(稀釋至 5 u g/ml )+SA-PE (Cat.40250, Biolegend)(稀釋至 2 u g/ml)的 PBS+0.1%泊洛沙姆酸混合液中，轉(zhuǎn)移至24孔板37°C振搖培育30分鐘。將細(xì)胞充分重懸并轉(zhuǎn)移至15ml試管。加入IOml PBS+0.1%泊洛沙姆酸液混合細(xì)胞，離心，再洗滌。將沉淀細(xì)胞重懸于每管0.5ml的PBS+0.1%泊洛沙姆酸液中，濾入FACS試管作細(xì)胞熒光分析。
[0495]用FACS分析細(xì)胞膜的唾液酸含量:用PBS+0.1%泊洛沙姆酸液洗滌20xl06細(xì)胞兩次，離心，重懸于500 ill含MAA-FITC (稀釋至50 u g/ml)的PBS+0.1%泊洛沙姆酸液中，轉(zhuǎn)移至24孔板，25°C振搖培育30分鐘。將細(xì)胞徹底重懸并轉(zhuǎn)移至15ml試管。加入IOmlPBS+0.1%泊洛沙姆酸液，將細(xì)胞混合、離心再洗滌。沉淀細(xì)胞重懸于每管0.5ml的PBS+0.1%泊洛沙姆酸液中，濾入FACS試管作細(xì)胞熒光分析。
[0496]將外源性巖藻糖加入培養(yǎng)的ITL-LF2細(xì)胞:取用抗EGFR mAb轉(zhuǎn)染前或后的ITL-LF2細(xì)胞，以0.2xl06細(xì)胞/ml濃度接種含不同濃度L-巖藻糖(Sigma，Cat.#F2252)的ProCH05培養(yǎng)液，37°C和CO2下、320rpm振搖培育。4天后取樣作細(xì)胞熒光FACS分析(如下文所述)。此外，用FACS對(duì)收獲的抗EGFRmAb轉(zhuǎn)染細(xì)胞的粗制樣品進(jìn)行分析。
[0497]前-主細(xì)胞庫(kù)(前-MCB)的制備:在錐形瓶中擴(kuò)增培養(yǎng)細(xì)胞用于細(xì)胞凍存。離心收集所需量的細(xì)胞，重懸于凍存培養(yǎng)液中。所述凍存培養(yǎng)液的組成為:92.5%的新鮮Pix)CH5培養(yǎng)液+HT和條件培養(yǎng)液(由指數(shù)生長(zhǎng)的ITL-LF2宿主細(xì)胞產(chǎn)生)的1:1混合液；和7.5%DMS0。每個(gè)前-主細(xì)胞庫(kù)(pre-MCB)中的每個(gè)克隆細(xì)胞凍存60個(gè)小瓶，每個(gè)1.5ml小瓶有IOxlO6個(gè)細(xì)胞，在_80°C的Cryo冰凍1°C容器(NALGENE，Cat.#N0.5100-0001)中凍結(jié)，24小時(shí)后移入液氮貯藏罐中。
[0498]細(xì)胞庫(kù)測(cè)試:在制備前-MCBll天后，測(cè)試凍存安瓶中的ITL-LF2前-MCB細(xì)胞的活力。融化一個(gè)安瓶的細(xì)胞，立即測(cè)定活力。使細(xì)胞增殖三個(gè)生長(zhǎng)周期，第三周期后測(cè)定活力。
[0499]用直接轉(zhuǎn)移或沉浸技術(shù)進(jìn)行無(wú)菌試驗(yàn)。同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞有無(wú)支原體。
[0500]用FACS ACDU進(jìn)行克隆:用FACSAria細(xì)胞分揀儀的自動(dòng)化細(xì)胞沉積單元(AOTU)裝置進(jìn)行克隆，用ACDU將Pix)CH5+HT培養(yǎng)的細(xì)胞以精確的“單個(gè)細(xì)胞”模式接種96孔板，每孔含200 u I的80%C6366+20%ProCH5ACFM混合液，細(xì)胞濃度為0.4xl06細(xì)胞/ml?？寺∪?0天)和其后第8天用Cellavista給培養(yǎng)板拍照。挑選幾個(gè)克隆，增殖后轉(zhuǎn)移到裝有4ml50%Sigma C6366和50%ProCH5混合液的T25培養(yǎng)瓶中。在細(xì)胞增殖期間逐步加入ProCH5液。分析這些細(xì)胞的mRNA特征。
[0501]抽提細(xì)胞RNA:用Rneasy試劑盒(Qiagen, Cat.#74104)按廠商說(shuō)明書(shū)分離得到細(xì)胞的總RNA。
[0502]用于檢測(cè)巖藻糖通路基因的RT-PCR:用Invitrogen的SuperScript III試劑盒(Cat.#18080-051)和盒中提供的寡dT引物，從CHO-S或ITL-LF2細(xì)胞抽提的總RNA制備cDNA。然后用基因特異性引物執(zhí)行PCR。引物由Sigma Aldrich合成。引物的序列詳見(jiàn)以下表1。用瓊脂糖凝膠電泳分析產(chǎn)生的條帶，與DNA大小標(biāo)記物進(jìn)行比較。
[0503]表1
[0504]
【權(quán)利要求】
1.一種選擇用作表達(dá)重組蛋白宿主細(xì)胞的具有零巖藻糖水平的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)的方法，該方法包括: (a)使CHO細(xì)胞接觸氨甲喋呤(MTX)從而在CHO細(xì)胞的細(xì)胞群中導(dǎo)入基因突變， (b)使含有突變細(xì)胞的CHO細(xì)胞群接觸無(wú)毒巖藻糖結(jié)合劑一定的時(shí)間量，使該巖藻糖結(jié)合劑結(jié)合于該細(xì)胞群細(xì)胞膜的巖藻糖部分，其中所述一定的時(shí)間量不會(huì)導(dǎo)致殺傷細(xì)胞；和 (C)清除含突變細(xì)胞的細(xì)胞群中結(jié)合該巖藻糖結(jié)合劑的細(xì)胞亞群，從而選出細(xì)胞用作表達(dá)重組蛋白的宿主細(xì)胞，所選細(xì)胞的巖藻糖含量為零。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述CHO細(xì)胞選自CH0-K1、CH0-S、DUXB11、CH0-1E5、CH03F、CH0/DG44 和 CH0-2.6。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述重組蛋白是抗體或Fe蛋白。 3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述巖藻糖結(jié)合劑對(duì)所述包含突變細(xì)胞的細(xì)胞群無(wú)毒性。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述巖藻糖結(jié)合劑附著于可監(jiān)測(cè)部分或親和部分。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述一定的時(shí)間量不長(zhǎng)于60分鐘。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述巖藻糖結(jié)合劑附著于親和部分，所述方法進(jìn)一步包括將所述突變的細(xì)胞群與其它物質(zhì)接觸，該其它物質(zhì)含有與所述親和部分同類的結(jié)合部分。
7.如權(quán)利要求4所述的方·法，其中所述親和部分包括生物素。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述同類的結(jié)合部分附著于可檢測(cè)部分。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述可檢測(cè)部分包括熒光基團(tuán)或磁性基團(tuán)。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述清除通過(guò)FACS分揀來(lái)實(shí)施。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述清除通過(guò)磁性分離來(lái)實(shí)施。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述清除通過(guò)至少三輪順次清除來(lái)實(shí)施。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述巖藻糖結(jié)合劑是是橙黃網(wǎng)孢盤(pán)菌凝集素(AAL)或米曲霉菌1-巖藻糖特異性凝集素(A0L)。
14.按權(quán)利要求1的方法產(chǎn)生的分離的CHO細(xì)胞。
15.一種經(jīng)基因修飾可表達(dá)具有SEQ ID NO:23和/或24所示氨基酸序列的突變⑶P-甘露糖4，6-脫水酶(GMD)的分離的CHO細(xì)胞。
16.一種經(jīng)基因修飾使所表達(dá)蛋白質(zhì)的巖藻糖基化含量呈線性依賴于外部巖藻糖濃度的分離的CHO細(xì)胞。
17.如權(quán)利要求16所述的分離的CHO細(xì)胞，所述細(xì)胞經(jīng)基因修飾可表達(dá)突變的GDP-甘露糖4，6-脫水酶(GMD)。
18.如權(quán)利要求14、15或17所述的分離的CHO細(xì)胞，其中所述GMD的至少一個(gè)等位基因攜帶了至少一個(gè)可導(dǎo)致功能缺失的突變。
19.如權(quán)利要求14、15或17所述的分離的CHO細(xì)胞，其中所述GMD的各個(gè)等位基因攜帶了至少一個(gè)可導(dǎo)致功能缺失的突變。
20.如權(quán)利要求16所述的分離的CHO細(xì)胞，其中所述外部巖藻糖濃度為零時(shí)，所述蛋白的巖藻糖基化量為零。
21.如權(quán)利要求14、15或15，2所述的分離的CHO細(xì)胞，所述分離的CHO細(xì)胞的活細(xì)胞積分濃度(IVCC)比非突變的CHO細(xì)胞高20%。
22.如權(quán)利要求14或15所述的分離的CHO細(xì)胞，所述分離的CHO細(xì)胞表達(dá)野生型巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶-8 (Fut8)。
23.如權(quán)利要求14或15所述的分離的CHO細(xì)胞，所述分離的CHO細(xì)胞表達(dá)野生型⑶P-酮基-6-脫氧甘露糖3，5-差向異構(gòu)酶，4-還原酶(FX)。
24.如權(quán)利要求14所述的分離的CHO細(xì)胞，所述分離的CHO細(xì)胞可表達(dá)突變的GDP-甘露糖4，6-脫水酶(GMD)。
25.如權(quán)利要求24所述的分離的CHO細(xì)胞，其中所述突變的GMD具有如SEQID NO:23和/或24所示氨基酸序列。
26.如權(quán)利要求14或15所述的分離的CHO細(xì)胞，所述分離的CHO細(xì)胞具有與其親代CHO細(xì)胞相似的群體倍增時(shí)間。
27.如權(quán)利要求14或15所述的分離的CHO細(xì)胞，所述分離的CHO細(xì)胞具有至少370群體倍增的穩(wěn)定巖藻糖表型。
28.如權(quán)利要求14或15所述的分離的CHO細(xì)胞，所述分離的CHO細(xì)胞表達(dá)感興趣的重組抗體或Fe融合蛋白。
29.—種包含權(quán)利要求14或15所述分離細(xì)胞的CHO細(xì)胞系。
30.如權(quán)利要求29所述的CHO細(xì)胞系，所述CHO細(xì)胞系以CNCM保藏號(hào)1-4449進(jìn)行了保藏。
31.一種細(xì)胞培養(yǎng)物，所述細(xì)胞培養(yǎng)物包含權(quán)利要求14、15或28所述分離的CHO細(xì)胞及無(wú)異源污染物的細(xì)胞培養(yǎng)基。
32.如權(quán)利要求31所述的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基包含巖藻糖。
33.如權(quán)利要求31所述的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基是無(wú)巖藻糖。
34.一種生產(chǎn)重組蛋白的方法，包括:用包含編碼重組蛋白的核酸序列的多核苷酸轉(zhuǎn)染權(quán)利要求14或15所述分離的CHO細(xì)胞；在適合于表達(dá)重組蛋白的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞；及分離蛋白。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其中所述重組蛋白是抗體或Fe融合蛋白。
36.如權(quán)利要求34所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)染在外源性巖藻糖存在下進(jìn)行。
37.如權(quán)利要求34所述的方法，進(jìn)一步包括將權(quán)利要求24所述分離的CHO細(xì)胞在所述轉(zhuǎn)染后于含巖藻糖的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。
38.一種按權(quán)利要求34-37之一所述方法生產(chǎn)的具有增強(qiáng)的ADCC的抗體。
【文檔編號(hào)】C12N15/01GK103597073SQ201280021537
【公開(kāi)日】2014年2月19日 申請(qǐng)日期:2012年3月5日 優(yōu)先權(quán)日:2011年3月6日
【發(fā)明者】D·黑爾曼, M·巴爾-西蒙, M·托耶斯特-阿契杜夫 申請(qǐng)人:默克雪蘭諾有限公司