專利名稱：一種尼羅羅非魚幾丁質(zhì)酶基因及其重組蛋白的制備與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種尼羅羅非魚幾丁質(zhì)酶基因及其重組蛋白的制備與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
幾丁質(zhì)酶(EC 3. 2.1. 14)是一種糖苷水解酶，可以作用于幾丁質(zhì)使其脫去N-乙酰氨基葡萄糖。幾丁質(zhì)酶可以分為內(nèi)切酶和外切酶。內(nèi)切酶從幾丁質(zhì)內(nèi)部斷開糖苷鍵，形成低 分子量的N-乙酰氨基葡萄糖聚合物；外切酶則從幾丁質(zhì)的一端分別切下殼二糖，或者N-乙酰氨基葡萄糖的單體，進而降解幾丁質(zhì)。幾丁質(zhì)酶在自然界分布廣泛，大部分的原核生物和真核生物中均有發(fā)現(xiàn)。魚類中，最初是在海鯛的胃腸道中檢測到有幾丁質(zhì)酶活性，但由于技術(shù)限制，對于這種幾丁質(zhì)酶活性是由胃腸道內(nèi)的微生物，或者捕食的食物本身，還是由魚體本身產(chǎn)生的不能確定。隨著分子技術(shù)的發(fā)展，及斑馬魚中幾丁質(zhì)酶類似EST的發(fā)現(xiàn)，首先在日本比目魚中利用同源序列比對的方法克隆獲得了三種幾丁質(zhì)酶，接著在其他魚類中的幾丁質(zhì)酶克隆研究逐漸開展起來。目前已經(jīng)在日本比目魚，斜帶石斑魚，條文鱸，虹鱒，黑青斑河豚，白姑魚，歐式六線魚和三線雞魚中獲得了幾丁質(zhì)酶序列。幾丁質(zhì)是β- (1，4)_連接的N-乙酰氨基葡萄糖的聚合物，根據(jù)內(nèi)部分子的排列方式，存在α、β和Y三種形式。幾丁質(zhì)在自然界分布廣泛，蘊藏量僅次于纖維素，在細菌類，真菌類和硅藻類的細胞壁，節(jié)肢昆蟲類，海洋節(jié)肢動物類的外殼以及烏賊中都含有。在海洋生物中，幾丁質(zhì)的產(chǎn)量達到每年101°到IO11公噸。大多數(shù)形式的幾丁質(zhì)復(fù)合物可以抵制化學(xué)降解，但在自然界中也很少看到大面積持續(xù)存在的幾丁質(zhì)碎屑，因而在自然界中應(yīng)當存在一些可以降解幾丁質(zhì)的酶，迅速的將幾丁質(zhì)降解循環(huán)利用。另外，幾丁質(zhì)是天然糖中唯一大量存在的堿性氨基多糖，具有眾多特殊的理化性質(zhì)和生理功能，在農(nóng)業(yè)和食品等領(lǐng)域都有很高的使用價值，但幾丁質(zhì)分子量大，難溶于水，限制了幾丁質(zhì)的應(yīng)用。幾丁質(zhì)的降解產(chǎn)物殼寡糖，分子量相對較小，也可溶于水，多位學(xué)者對其研究發(fā)現(xiàn)，殼寡糖也可以在農(nóng)業(yè)和食品等領(lǐng)域擁有幾丁質(zhì)類似的應(yīng)用價值，另外在降血壓、血糖、血脂，增強免疫力、抗疾病能力以及調(diào)節(jié)腸道微生物的生態(tài)平衡有作用。還可進行加工用于污水處理和輸送藥物，此外純化加工后的硫化殼六糖對一些相關(guān)的腫瘤具有抑制作用。因而對殼寡糖的研究具有重要的意義。目前生產(chǎn)殼寡糖主要通過幾丁質(zhì)部分去乙酰化形成殼多糖，再經(jīng)過化學(xué)法，物理法或酶解法降解殼多糖進行生產(chǎn)。但化學(xué)法存在明顯的缺陷生產(chǎn)條件較為苛刻，制備過程中要使用大量的化學(xué)試劑，對環(huán)境危害較大，并且化學(xué)法生產(chǎn)的殼寡糖，因為隨機斷裂糖苷鍵，產(chǎn)生的分子大小分布較寬。物理方法生產(chǎn)殼寡糖的機制也是隨機斷裂殼聚糖的糖苷鍵，因而生產(chǎn)的產(chǎn)物也是分子大小分布較寬，不利于獲得相對較純的殼寡糖。而殼寡糖眾多的醫(yī)藥應(yīng)用價值大多都是相對單一的殼寡糖在起作用。酶解法生產(chǎn)殼寡糖具有明顯的優(yōu)勢，不僅對環(huán)境危害小，另外通過對酶解條件的調(diào)整可能獲得相對分子大小分布較窄的殼聚糖，進而方便純化及應(yīng)用。酶解法可分為專一性酶解法和非專一性酶解法。常用的非專一性酶主要由溶菌酶，脂肪酶，蛋白酶和纖維素酶。這些酶容易得到，價格低廉，因而曾在一段時間作為殼寡糖的主要生產(chǎn)方法，但專一性不高，依然得不到理想聚合度的殼寡糖。近年來隨著表達技術(shù)的發(fā)展，獲得各種原核和真核重組的幾丁質(zhì)酶，也逐漸應(yīng)用于殼寡糖的生產(chǎn)，雖然目前對幾丁質(zhì)酶的作用機制了解較少，但通過條件的摸索希望可以獲得一些相對聚合度符合的殼寡糖的降解條件。幾丁質(zhì)酶有著廣泛的功能，在昆蟲和甲殼類等含幾丁質(zhì)的物種中，幾丁質(zhì)酶可以協(xié)助蛻皮。在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)，一些幾丁質(zhì)酶諸如殼三糖酶可以作為哮喘等炎癥的指示劑。在魚類中，一些幾丁質(zhì)酶分布于免疫器官，但由于獲得具有活性的幾丁質(zhì)酶蛋白比較有困難等原因，對魚類中幾丁質(zhì)酶的功能研究受到限制。目前魚類中所獲得的幾丁質(zhì)酶的類型相對較少，來源相對單一，以上所獲得幾丁質(zhì)酶序列信息的魚類均屬于肉食性，在草食性和 雜食性的魚類中目前尚未獲得幾丁質(zhì)酶的信息，制約了魚類中是否存在其他類型的幾丁質(zhì)酶和不同食性的魚類中幾丁質(zhì)酶是否存在結(jié)構(gòu)和功能的區(qū)別的研究。羅非魚(Tilapia)俗稱非洲鯽魚，屬于鱸形目，鱸形亞目，麗魚科。與其他已獲得幾丁質(zhì)酶序列的魚類不同，羅非魚屬雜食性魚類。巴西學(xué)者曾在尼羅羅非魚的血液，腸道和胃內(nèi)檢測到幾丁質(zhì)酶活性，但由于技術(shù)限制等原因目前沒有獲得相關(guān)的基因序列信息或蛋白信息。畢赤酵母是一種真核表達系統(tǒng)，具有類似原核表達系統(tǒng)的易操作性，同時具有真核生物的翻譯后修飾功能。同時畢赤酵母具有易培養(yǎng)，安全性高，可以進行發(fā)酵和大規(guī)模培養(yǎng)等特點，易于獲得大量的外源重組蛋白。相對于其他表達系統(tǒng)，利用畢赤酵母表達系統(tǒng)進行有功能蛋白的研究比較有優(yōu)勢。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，公開了一種尼羅羅非魚幾丁質(zhì)酶基因。本發(fā)明的另一個目的是公開了一種尼羅羅非魚幾丁質(zhì)酶。本發(fā)明的另一個目的是公開了一對克隆尼羅羅非魚幾丁質(zhì)酶基因的引物。本發(fā)明的另一個目的是公開了一種載體，所述載體含有羅非魚幾丁質(zhì)酶基因。本發(fā)明的另一個目的是公開一種尼羅羅非魚幾丁質(zhì)酶重組蛋白的制備方法。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)的
一種尼羅羅非魚幾丁質(zhì)酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。一種尼羅羅非魚幾丁質(zhì)酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。一對克隆尼羅羅非魚幾丁質(zhì)酶基因的引物，引物序列如SEQ ID N0:3 4所示。一種載體，所述載體含有羅非魚幾丁質(zhì)酶基因。優(yōu)選地，所述載體為克隆載體T4_Cht，或者所述的載體為畢赤酵母表達載體pPICZa A-tchto一種重組株，是由如上所述含有羅非魚幾丁質(zhì)酶基因的載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母得到的。優(yōu)選地,重組株是由如上所述畢赤酵母表達載體pPICZa A-tcht轉(zhuǎn)入畢赤酵母X33中得到的。
一種尼羅羅非魚幾丁質(zhì)酶重組蛋白的制備方法，包括如下步驟
51.將權(quán)利要求4或5所述表達載體轉(zhuǎn)入畢赤酵母中，利用抗生素抗性基因篩選陽性轉(zhuǎn)化子；
52.將陽性轉(zhuǎn)化子接種在含甘油碳源的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜，次日更換為含甲醇碳源的培養(yǎng)基中進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，每If 24hr進行一次甲醇添加，收集上清；
S3.將上清過鎳離子柱后用5(T250mM咪唑洗滌柱子，收集洗滌液即得重組蛋白。優(yōu)選地，步驟SI所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的最優(yōu)條件為誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH值為5. 0，甲醇的誘導(dǎo)終濃度為O. 5%，誘導(dǎo)時間為48小時，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中吐溫-80的濃度為O. 4%。一種如上所述尼羅羅非魚幾丁質(zhì)酶重組蛋白在降解幾丁質(zhì)制備殼寡糖中的應(yīng)用。
進一步地，所述尼羅羅非魚幾丁質(zhì)酶重組蛋白降解幾丁質(zhì)的酶解條件為采用PH為4飛的緩沖體系，每10(Γ500份重量的殼聚糖添加f 10份重量的幾丁質(zhì)酶28°C 37°C反應(yīng)Γ3小時。所述緩沖體系可以采用檸檬酸-磷酸氫二鈉配制而成。優(yōu)選地，可利用5^50ug的幾丁質(zhì)酶，降解O. 5^2. 5mg的殼聚糖，
本發(fā)明利用同源序列比對和RACE方法進行尼羅羅非魚幾丁質(zhì)酶基因的克隆。通過將其他物種中所獲得幾丁質(zhì)酶序列進行比對，進行簡并引物的設(shè)計。利用Trizol Reagent進行中腸組織RNA的提取，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，進行RT-PCR獲得中腸組織的cDNA。接下來利用所設(shè)計簡并引物進行尼羅羅非魚幾丁質(zhì)酶中間片段的克隆并獲得中間片段序列。根據(jù)獲得的序列進行了 3'GSP和5'GSP的RACE引物的設(shè)計。3'RACE，利用3'CDS為引物進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。利用3' GSP為上游，L-UPM和S-UPM的組合為下游，進行3' RACE,從而獲得3'序列。5'RACE利用普通的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄從而獲得cDNA。利用TdT轉(zhuǎn)移酶，在5' cDNA尾端加上一段dCTP。利用5'GSP為下游引物，AAP為上游引物，進行5' RACE,從而獲得5'序列。將獲得的序列進行拼接，從而設(shè)計包含完整編碼序列的引物，進行0RF(開放閱讀框)的克隆，從而獲得完整的尼羅羅非魚幾丁質(zhì)酶序列。本發(fā)明同樣采用了畢赤酵母表達系統(tǒng)進行了尼羅羅非魚幾丁質(zhì)酶畢赤酵母表達菌株的構(gòu)建。采用了分泌型pPICZa A表達載體，野生型的X33菌株。根據(jù)尼羅羅非魚成熟肽序列，以及選取的EcoR I和Xba I酶切位點，進行了表達載體引物的設(shè)計。通過PCR技術(shù)獲得了含雙酶切位點的尼羅羅非魚幾丁質(zhì)酶成熟肽序列，通過雙酶切和連接，構(gòu)建了表達載體pPICZa A-tchto通過電擊轉(zhuǎn)化的方式轉(zhuǎn)入到畢赤酵母野生型X33酵母中，從而構(gòu)建了尼羅羅非魚幾丁質(zhì)酶畢赤酵母表達菌株。通過載體上的Zeocin+抗性進行菌株的初步篩選。通過挑選成功轉(zhuǎn)化的菌株，進行誘導(dǎo)培養(yǎng)以及western-blot檢測，進行了陽性轉(zhuǎn)化子的進一步篩選，從而獲得了成功構(gòu)建的尼羅羅非魚幾丁質(zhì)酶畢赤酵母表達菌株X-33-tCH。本發(fā)明同時對尼羅羅非魚幾丁質(zhì)酶畢赤酵母表達菌株X-33-CH的表達條件進行了篩選。利用連續(xù)誘導(dǎo)六天，并收集上清的方式，獲得了該菌株的最佳表達時間。在最佳的表達時間條件下，采用了不同的甲醇誘導(dǎo)濃度誘導(dǎo)培養(yǎng)，收集上清進行檢測，從而獲得了最佳的甲醇誘導(dǎo)濃度。在最佳的甲醇誘導(dǎo)濃度和最佳的誘導(dǎo)時間情況下，采取不同PH的培養(yǎng)基，進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，收集上清進行檢測，從而獲得了最佳的誘導(dǎo)培養(yǎng)基pH。吐溫-80作為一種去垢劑，可以增加膜的通透性，使得蛋白比較容易分泌到細胞外。采用不同濃度的吐溫添加到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，利用最佳的誘導(dǎo)時間，甲醇濃度和誘導(dǎo)培養(yǎng)基PH，從而獲得了最佳的吐溫-80的濃度。
本發(fā)明同時也提供了表達上清中目的蛋白鎳柱純化的條件。利用鎳柱純化，采取不同的咪唑洗脫濃度，進行表達上清的洗脫，將各收集液進行了 SDS-PAGE檢測，獲得最佳的咪唑洗脫濃度。利用載體上攜帶的另一個蛋白myc檢測的抗體，進行了目的蛋白的進一步的確認。尼羅羅非魚是一種比較重要的經(jīng)濟魚類，屬雜食性。而近年來發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶及其降解產(chǎn)物，在促生長和免疫中均有重要的作用。利用本發(fā)明生產(chǎn)的重組幾丁質(zhì)酶可為進一步魚類添加劑或酶解反應(yīng)等功能研究奠定基礎(chǔ)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果
1.利用畢赤酵母的真核表達系統(tǒng)進行了魚類幾丁質(zhì)酶的重組表達，畢赤酵母具有翻譯后修飾，一定程度上保證了所 表達的外源蛋白的功能；
2.利用畢赤酵母表達的重組尼羅羅非魚幾丁質(zhì)酶蛋白可以達到每毫升7ug左右的蛋白，通過增加培養(yǎng)體系從而滿足重組幾丁質(zhì)酶蛋白的應(yīng)用。3.利用表達上清所獲得的粗幾丁質(zhì)酶液和純化的幾丁質(zhì)酶蛋白分別鑒定到為有降解功能的，酶活分別為9U和18. 6U，相對于其他非專一性的酶，更有應(yīng)用于幾丁質(zhì)降解的前景。


圖1.尼羅羅非魚基因中間片段的PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果；M. marker ;1.陰性對照；2.所選的中腸組織。圖2.尼羅羅非魚幾丁質(zhì)酶基因3'RACE的電泳結(jié)果；M. marker ；1.所選的中腸組織。圖3.尼羅羅非魚幾丁質(zhì)酶基因5'RACE的電泳結(jié)果；M. marker ；1.所選的中腸組織。圖4.尼羅羅非魚幾丁質(zhì)酶基因ORF克隆的電泳結(jié)果；M. marker ；1.所選的中腸組織。圖5.尼羅羅非魚幾丁質(zhì)酶成熟肽雙酶切的結(jié)果；M. marker ；1.雙酶切后的尼羅羅非魚幾丁質(zhì)酶成熟肽。圖6.空載的雙酶切的結(jié)果；M. marker ;Vec. pPICZaA的雙酶切。圖7.構(gòu)建的pPICZa A-tcht載體雙酶切驗證的結(jié)果；M. marker ;T_cht.構(gòu)建好的尼羅羅非魚表達載體pPICZa A-tcht。圖8. pPICZa A-tcht載體線性化的結(jié)果；M. marker ;T_cht.構(gòu)建好的尼羅羅非魚表達載體pPICZa A-tchto圖9. pPICZa A-tcht轉(zhuǎn)化畢赤酵母的模式圖。圖10.陽性轉(zhuǎn)化子的篩選結(jié)果；1，2，3，4，5，6，7，8和9分別為9個不同的單克??；
NC.轉(zhuǎn)化空載的對照。圖11.最佳誘導(dǎo)時間的篩選；1，2，3，4，5和6分別代表誘導(dǎo)的天數(shù)。圖12.最佳誘導(dǎo)甲醇濃度的篩選；I，2，3，4和5分別代表甲醇濃度為0.5%，1.0%，1. 5%, 2. 0% 和 2. 5%ο圖13.最佳誘導(dǎo)pH的篩選；1，2，3，4和5分別代表誘導(dǎo)培養(yǎng)基的？!1為3，4，5，6和 。圖14.最佳吐溫-80濃度的篩選；NC.未添加吐溫_80 ;1，2，3和4分別代表吐溫-80 的濃度為 O. 2%, O. 4%, O. 6% 和 O. 8%ο圖15和16是不同咪唑洗脫濃度的的篩選；M. marker ；P.表達上清；B. BindingBuffer流出液；W. Washing Buffer流出液；1，2，3和4分別對應(yīng)收集的管數(shù)；50mM，IOOmM,150mM, 200mM和250mM對應(yīng)咪唑洗脫的濃度。圖17.咪唑洗脫蛋白的western-blot檢測；1，2，3和4對應(yīng)200mM咪唑洗脫的管數(shù)。圖18.牛血清白蛋白溶液標準曲線。
圖19.重組幾丁質(zhì)酶降解功能檢測結(jié)果；1.未進行降解的殼聚糖；2.利用粗酶液進行降解的殼聚糖產(chǎn)物；3.重組純化的幾丁質(zhì)酶進行降解的殼聚糖產(chǎn)物。圖20. N-乙酰氨基葡萄糖標準曲線。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和實例對本發(fā)明作進一步的說明，但實施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。實施例中未注明具體條件的實驗方法，可參照本領(lǐng)域常規(guī)方法條件，如J.薩姆布魯克(Sambrook)等編寫的《分子克隆實驗指南》中所述的方法和條件，或按照制造產(chǎn)品廠商所建議的條件進行。實施例1
尼羅羅非魚幾丁質(zhì)酶基因的克隆 S1.引物設(shè)計
根據(jù)斜帶石斑魚(FJ169895.1),比目魚(AB642677.1)，虹鱒(NMJ)Ol 160474. 1)，三刺魚和條文S盧(EU048546.1)的幾丁質(zhì)酶基因序列進行比對，篩選保守區(qū)域，利用premier5. O軟件設(shè)計尼羅羅非魚幾丁質(zhì)酶基因的簡并引物進行中間片段的克隆，根據(jù)已獲得的中間片段序列設(shè)計基因特異引物，進行3'RACE和5'RACE。利用拼接的序列，設(shè)計ORF的基因特異引物。
權(quán)利要求
1.一種尼羅羅非魚幾丁質(zhì)酶基因，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
2.一種尼羅羅非魚幾丁質(zhì)酶，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
3.一對克隆尼羅羅非魚幾丁質(zhì)酶基因的引物，其特征在于引物序列如SEQ ID NO:3^4所示。
4.一種載體，其特征在于，含有權(quán)利要求1所述的羅非魚幾丁質(zhì)酶基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述載體，其特征在于，所述載體為克隆載體T4-Cht，或者所述的載體為畢赤酵母表達載體PPICZa A-tcht。
6.一種重組株，其特征在于，是由權(quán)利要求4所述載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母得到的。
7.—種尼羅羅非魚幾丁質(zhì)酶重組蛋白的制備方法，其特征在于，包括如下步驟 51.將權(quán)利要求4或5所述表達載體轉(zhuǎn)入畢赤酵母中，利用抗生素抗性基因篩選陽性轉(zhuǎn)化子； 52.將陽性轉(zhuǎn)化子接種在含甘油碳源的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜，次日更換為含甲醇碳源的培養(yǎng)基中進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，每If 24hr進行一次甲醇添加，收集上清；S3.將上清過鎳離子柱后用5(T250mM咪唑洗滌柱子，收集洗滌液即得重組蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述制備方法，其特征在于，步驟SI所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的最優(yōu)條件為誘導(dǎo)培養(yǎng)基的PH值為5. O,甲醇的誘導(dǎo)終濃度為O. 5%，誘導(dǎo)時間為48小時，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中吐溫80的濃度為O. 4%。
9.一種根據(jù)權(quán)利要求2、7或8所述尼羅羅非魚幾丁質(zhì)酶重組蛋白在降解幾丁質(zhì)制備殼寡糖中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述應(yīng)用，其特征在于，所述尼羅羅非魚幾丁質(zhì)酶重組蛋白降解幾丁質(zhì)的酶解條件為采用PH為4飛的緩沖體系，每10(Γ500份重量的殼聚糖添加f 10份重量的幾丁質(zhì)酶，28°C 37V反應(yīng)廣3小時。
全文摘要
本發(fā)明公開了尼羅羅非魚幾丁質(zhì)酶基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。該基因是以尼羅羅非魚中腸組織的總RNA為模板，利用同源重組比對，RT-PCR以及RACE方法而獲得的包含尼羅羅非魚幾丁質(zhì)酶全長cDNA序列的基因片段；本發(fā)明還利用畢赤酵母構(gòu)建了該基因的分泌表達載體和工程菌株；利用本發(fā)明可以獲得來源穩(wěn)定，成本便宜的羅非魚幾丁質(zhì)酶重組蛋白。
文檔編號C12N1/19GK103014041SQ20121057785
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月27日
發(fā)明者李文笙, 李波 申請人:中山大學(xué)