專(zhuān)利名稱(chēng)：一種鑒別尼羅羅非魚(yú)、奧利亞羅非魚(yú)及其雜交魚(yú)的分子標(biāo)記方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子標(biāo)記技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種鑒別尼羅羅非魚(yú)、奧利亞羅非魚(yú)及其雜交魚(yú)的分子標(biāo)記方法，是對(duì)不同種羅非魚(yú)的鑒別。
背景技術(shù)：
羅非魚(yú)(Tilapia)原產(chǎn)于非洲，是世界性養(yǎng)殖品種，該魚(yú)上世紀(jì)50年代引入我國(guó)，得到了較快發(fā)展，現(xiàn)中國(guó)已是世界上最大的羅非魚(yú)生產(chǎn)國(guó)和出口國(guó)。目前，我國(guó)主要養(yǎng)殖的羅非魚(yú)品種有尼羅羅非魚(yú)ipreochromis nilo ticus)，奧利亞羅非魚(yú)ifireochromis aureus)和奧尼雜交羅非魚(yú)，其中奧尼羅非魚(yú)是尼羅羅非魚(yú)(早)和奧利亞羅非魚(yú)(古) 的雜交1代，具有雄性率高、生長(zhǎng)快、抗病力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但它的雄性率和養(yǎng)殖性能與親本的種質(zhì)純度密切相關(guān)。由于羅非魚(yú)品種間很容易雜交，且雜種可育，雜交種形態(tài)又與親本很相似，傳統(tǒng)的形態(tài)辨別方法又很難準(zhǔn)確辨別純種和雜交種。因此，很容易造成羅非魚(yú)種質(zhì)混雜，導(dǎo)致優(yōu)良經(jīng)濟(jì)性狀退化，這也是目前制約我國(guó)羅非魚(yú)良種保護(hù)和養(yǎng)殖發(fā)展的突出問(wèn)題。尼羅羅非魚(yú)，奧利亞羅非魚(yú)及其它們雜交魚(yú)鑒別方面，學(xué)者們?cè)猛っ讣夹g(shù)、 RAPD技術(shù)、微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)等建立了區(qū)別它們的生化和分子遺傳標(biāo)記。然而，同工酶是基因表達(dá)產(chǎn)物，但檢測(cè)位點(diǎn)有限，對(duì)親緣關(guān)系較近或遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜的品種不容易區(qū)分；RAPD方法雖然是從基因水平鑒別不同品種，但RAPD方法對(duì)反應(yīng)條件的變化很敏感，許多反應(yīng)因素稍微有差異就會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增帶型發(fā)生改變，穩(wěn)定性和重復(fù)性較差，從而限制了其應(yīng)用。微衛(wèi)星標(biāo)記又稱(chēng)簡(jiǎn)單序列重復(fù)標(biāo)記(SSR)與同工酶、RAPD、RFLP等技術(shù)相比，具有多態(tài)性頻率高、 檢測(cè)容易、重復(fù)性好、共顯性的孟德?tīng)柺竭z傳等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于品種及親子鑒定等研究， 但應(yīng)用微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行多重PCR來(lái)快速、準(zhǔn)確地鑒別不同羅非魚(yú)品種的研究還未見(jiàn)報(bào)道。 采用特異微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行多重PCR分析尼羅羅非魚(yú)、奧利亞羅非魚(yú)以及它們的雜交魚(yú)的遺傳特性，可以建立快速、準(zhǔn)確鑒別不同羅非魚(yú)品種的方法。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的
本發(fā)明的目的是提供一種鑒別尼羅羅非魚(yú)、奧利亞羅非魚(yú)及其雜交魚(yú)的分子標(biāo)記方法，有助于快速、準(zhǔn)確鑒別不同種羅非魚(yú)，在羅非魚(yú)保種、選育和養(yǎng)殖生產(chǎn)中有極大的應(yīng)用價(jià)值。技術(shù)方案
一種鑒別尼羅羅非魚(yú)、奧利亞羅非魚(yú)及其雜交魚(yú)的分子標(biāo)記方法，其特征在于，采用以下提取步驟
(1)選用3對(duì)特異微衛(wèi)星引物組合進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，其中這3對(duì)特異微衛(wèi)星引物如
下
CCCTCTGTTTCCATCTCA ； GATACCTGTCCATACCTCCTC ；
3GCTCGCTCCAGAAAAATCAC ； GTCAAAAAGGCATGGCAAAG ； CTGCACTTTTACTGAGGG ； TGGGAGATTAACAGAATAACA
(2)從待測(cè)羅非魚(yú)采樣血液或鰭條，采用DNA提取法提取基因組DNA；
(3)用步驟(2)的基因組DNA為模板，步驟(1)所選的3對(duì)微衛(wèi)星引物組合進(jìn)行多重 PCR擴(kuò)增；
(4)對(duì)步驟(3)的PCR產(chǎn)物用8.0%的非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，銀染法染色后，拍照記錄電泳結(jié)果。(5)根據(jù)多重PCR的電泳檢測(cè)結(jié)果，鑒別尼羅羅非魚(yú)、奧利亞羅非魚(yú)及它們的雜交
佳.ο步驟(3)中，在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，PCR反應(yīng)總體積為15 yL，其中含IOX反應(yīng)緩沖液 1.5 μ L, Mg2+ 2 mmol/L, dNTP 200ymol/L, 3 對(duì)上下游引物各 0· 2 μ mol/L，Taq 酶 0. 4U, DNA 50 ng 100 ng，用滅菌雙蒸餾水補(bǔ)足體積。步驟(3)中，PCR反應(yīng)條件為94 "C 3 min ；94 "C 20 s，52 °C退火 20s，72 "C 20s, 25 30個(gè)循環(huán)；72°C延伸5 min。本發(fā)明具體如下步驟實(shí)現(xiàn)
(1)選用3對(duì)特異微衛(wèi)星標(biāo)記引物組合進(jìn)行多重PCR反應(yīng)。(2)從待測(cè)羅非魚(yú)采樣血液或鰭條，采用DNA提取法提取基因組DNA。(3)用步驟(2)的基因組DNA為模板，步驟(1)所選的3對(duì)微衛(wèi)星引物組合進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增。(4)對(duì)步驟(3)的PCR產(chǎn)物用8. 0%的非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，銀染法染色后，拍照記錄電泳結(jié)果。(5)根據(jù)多重PCR的電泳檢測(cè)結(jié)果，就能鑒別尼羅羅非魚(yú)、奧利亞羅非魚(yú)及它們的雜交魚(yú)在引物GM017擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)，尼羅羅非魚(yú)條帶1條或2條，片段大小在144 148bp 左右；奧利亞羅非魚(yú)條帶1條，片段大小在160bp左右；雜交魚(yú)條帶都為2條，其中1條片段大小在144 148bp左右，另1條片段大小在160bp左右。在引物UNH948擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)，尼羅羅非魚(yú)條帶1條或2條，片段大小在170 178bp左右；奧利亞羅非魚(yú)條帶1或2條，片段大小在196 202bp左右；雜交魚(yú)條帶都為2條，其中1條片段大小在170 178bp左右， 另1條片段大小在196 202bp左右。在引物GM440擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)，尼羅羅非魚(yú)條帶1條或 2條，片段大小在262 266bp左右；奧利亞羅非魚(yú)條帶1條，片段大小在290bp左右；雜交魚(yú)條帶都為2條，其中1條片段大小在262 266bp左右，另1條片段大小在290bp左右。本發(fā)明中所選的3對(duì)微衛(wèi)星引物在尼羅羅非魚(yú)、奧利亞羅非魚(yú)及其雜交魚(yú)中PCR 擴(kuò)增反應(yīng)穩(wěn)定、擴(kuò)增片段清楚、不同種羅非魚(yú)擴(kuò)增片段差別明顯，且這3對(duì)微衛(wèi)星引物退火溫度相近，每對(duì)引物擴(kuò)增片段相差在20bp以上，在同一體系多重PCR反應(yīng)中相互不影響各自的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。這3對(duì)特異微衛(wèi)星引物其中這3對(duì)特異微衛(wèi)星引物如下
CCCTCTGTTTCCATCTCA ； GATACCTGTCCATACCTCCTC ； GCTCGCTCCAGAAAAATCAC ； GTCAAAAAGGCATGGCAAAG ； CTGCACTTTTACTGAGGG ； TGGGAGATTAACAGAATAACA
本發(fā)明中PCR反應(yīng)總體積為15 μ L，其中含IOX反應(yīng)緩沖液1. 5 μ L, Mg2+ 2 mmol/ L, dNTP 200 μ mol/L, 3 對(duì)上下游引物各 0. 2 μ mol/L, Taq 酶 0. 4U, DNA 50 ng 100 ng,用滅菌雙蒸餾水補(bǔ)足體積。本發(fā)明中擴(kuò)增PCR反應(yīng)均在PCR儀上完成。PCR反應(yīng)條件為94 V 3 min ；94 V 20 s, 52 °C退火 20s, 72 "C 20s，25 30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 5 min。有益效果
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本申請(qǐng)采用特異微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行多重PCR分析尼羅羅非魚(yú)、奧利亞羅非魚(yú)以及它們的雜交魚(yú)的遺傳特性，反應(yīng)穩(wěn)定，重復(fù)性好，可以準(zhǔn)確地將純種尼羅羅非魚(yú)、奧利亞羅非魚(yú)和它們的雜交后代鑒別開(kāi)。本申請(qǐng)一次可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，減少了檢測(cè)時(shí)間和降低了檢測(cè)成本。


圖1尼羅羅非魚(yú)、奧利亞羅非魚(yú)及其它們的雜交魚(yú)多重PCR電泳檢測(cè)結(jié)果，其中 M 分子量標(biāo)準(zhǔn)
1-13 尼羅羅非魚(yú) 14-20 奧尼羅非魚(yú) 21-28 尼奧羅非魚(yú) 29-40 奧利亞羅非魚(yú)
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1
本發(fā)明一種鑒別尼羅羅非魚(yú)、奧利亞羅非魚(yú)及其雜交魚(yú)的分子標(biāo)記方法采用以下技術(shù)步驟
尼羅羅非魚(yú)13尾從中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心宜興漁場(chǎng)采得。從每尾魚(yú)的尾靜脈采血0. 5!1^，取3(^1^血細(xì)胞抽提基因組0嫩。以尼羅羅非魚(yú)的基因組DNA為模板， 用引物GM017, UNH948和GM440 3對(duì)引物對(duì)進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)總體積為15 μ L， 其中含IOX反應(yīng)緩沖液1. 5 μ L, MgCl2 2 mmol/L, dNTP 200ymol/L, 3對(duì)上下游引物各0. 2μπιο1/1，7^《酶0. 4U，DNA 80 ng，用滅菌雙蒸餾水補(bǔ)足體積。PCR反應(yīng)條件為94 °C 3 min ；94 "C 30 s，52 °C退火 30s, 72 "C 30s，25 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 8 min。PCR 反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物用8. 0%的非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，銀染法染色后，拍照記錄電泳結(jié)果。電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在引物GM017擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)，尼羅羅非魚(yú)條帶1條或2條，片段大小在 144 148bp ；在引物UNH948擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)，尼羅羅非魚(yú)條帶1條或2條，片段大小在170 184bp ；在引物GM440擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)，尼羅羅非魚(yú)條帶1條或2條，片段大小在262 ^6bp。其中這3對(duì)特異微衛(wèi)星引物如下 CCCTCTGTTTCCATCTCA ； GATACCTGTCCATACCTCCTC； GCTCGCTCCAGAAAAATCAC ； GTCAAAAAGGCATGGCAAAG ； CTGCACTTTTACTGAGGG ； TGGGAGATTAACAGAATAACA。實(shí)施例2
本發(fā)明一種鑒別尼羅羅非魚(yú)、奧利亞羅非魚(yú)及其雜交魚(yú)的分子標(biāo)記方法采用以下技術(shù)步驟
奧尼雜交羅非魚(yú)(尼羅羅非魚(yú)早X奧利亞羅非魚(yú)￠)8尾從中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心宜興漁場(chǎng)采得。每尾魚(yú)取0. Ig尾鰭鰭條，抽提基因組DNA。以?shī)W尼雜交羅非魚(yú)的基因組DNA為模板，用引物GMO17，UNH948和GM440 3對(duì)引物對(duì)進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)總體積為15 μ L，其中含IOX反應(yīng)緩沖液1. 5 μ L5MgCl2 2 mmol/L,dNTP 200ymol/ L, 3對(duì)上下游引物各0. 2μπιο1/1，7^《酶0. 4U，DNA 50 ng，用滅菌雙蒸餾水補(bǔ)足體積。PCR 反應(yīng)條件為94 "C 3 min ；94 "C 30 s，52 °C退火 30s，72 "C 30s，30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 8 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物用8.0%的非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，銀染法染色后，拍照記錄電泳結(jié)果。電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在引物GM017擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)，奧尼雜交魚(yú)條帶都為2 條，其中1條片段大小在144 148bp左右，另1條片段大小在160bp左右。在引物UNH948 擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)，奧尼雜交魚(yú)條帶都為2條，其中1條片段大小在170 178bp左右，另1條片段大小在196 202bp左右。在引物GM440擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)，奧尼雜交魚(yú)條帶都為2條，其中1 條片段大小在262 266bp左右，另1條片段大小在290bp左右。其中這3對(duì)特異微衛(wèi)星引物如下 CCCTCTGTTTCCATCTCA ； GATACCTGTCCATACCTCCTC； GCTCGCTCCAGAAAAATCAC ； GTCAAAAAGGCATGGCAAAG ； CTGCACTTTTACTGAGGG ； TGGGAGATTAACAGAATAACA。實(shí)施例3
本發(fā)明一種鑒別尼羅羅非魚(yú)、奧利亞羅非魚(yú)及其雜交魚(yú)的分子標(biāo)記方法采用以下技術(shù)步驟
奧利亞羅非魚(yú)12尾，尼奧雜交羅非魚(yú)(尼羅羅非魚(yú)$ X奧利亞羅非魚(yú)早)7尾從中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心宜興漁場(chǎng)采得。每尾魚(yú)取30 μ L血細(xì)胞抽提基因組 DNA。以這些基因組DNA為模板，用引物GMO17，UNH948和GM440 3對(duì)引物對(duì)進(jìn)行多重PCR 擴(kuò)增，PCR反應(yīng)總體積為15 μ L，其中含IOX反應(yīng)緩沖液1. 5 μ L，MgCl2 2 mmol/L, dNTP 200 μ mol/L, 3對(duì)上下游引物各0. 2 μ mol/L，Taq酶0. 4U，DNA 70 ng，用滅菌雙蒸餾水補(bǔ)足體積。PCR反應(yīng)條件為94 "C 3 min ；94 "C 30 s，52 °C退火30s，72 "C 30s，沘個(gè)循環(huán)；72°C延伸8 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物用8. 0 %的非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，銀染法染色后，拍照記錄電泳結(jié)果。電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在引物GM017擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)，奧利亞羅非魚(yú)條帶1條，片段大小在160bp左右；尼奧雜交魚(yú)條帶都為2條，其中1條片段大小在 144 148bp左右，另1條片段大小在160bp。在引物UNH948擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)，奧利亞羅非魚(yú)條帶1或2條，片段大小在196 202bp左右；尼奧雜交魚(yú)條帶都為2條，其中1條片段大小在170 178bp左右，另1條片段大小在196 202bp左右。在引物GM440擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)，奧利亞羅非魚(yú)條帶1條，片段大小在290bp左右；尼奧雜交魚(yú)條帶都為2條，其中1條片段大小在262 266bp左右，另1條片段大小在290bp左右。其中這3對(duì)特異微衛(wèi)星引物如下 CCCTCTGTTTCCATCTCA ； GATACCTGTCCATACCTCCTC； GCTCGCTCCAGAAAAATCAC ； GTCAAAAAGGCATGGCAAAG ； CTGCACTTTTACTGAGGG ； TGGGAGATTAACAGAATAACA。
權(quán)利要求
1.一種鑒別尼羅羅非魚(yú)、奧利亞羅非魚(yú)及其雜交魚(yú)的分子標(biāo)記方法，其特征在于，采用以下提取步驟(1)選用3對(duì)特異微衛(wèi)星引物組合進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，其中這3對(duì)特異微衛(wèi)星引物如下CCCTCTGTTTCCATCTCA ； GATACCTGTCCATACCTCCTC； GCTCGCTCCAGAAAAATCAC ； GTCAAAAAGGCATGGCAAAG ； CTGCACTTTTACTGAGGG ； TGGGAGATTAACAGAATAACA(2)從待測(cè)羅非魚(yú)采樣血液或鰭條，采用DNA提取法提取基因組DNA；(3)用步驟(2)的基因組DNA為模板，步驟(1)所選的3對(duì)微衛(wèi)星引物組合進(jìn)行多重 PCR擴(kuò)增；(4)對(duì)步驟(3)的PCR產(chǎn)物用8.0%的非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，銀染法染色后，拍照記錄電泳結(jié)果；(5)根據(jù)多重PCR的電泳檢測(cè)結(jié)果，鑒別尼羅羅非魚(yú)、奧利亞羅非魚(yú)及它們的雜交魚(yú)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒別尼羅羅非魚(yú)、奧利亞羅非魚(yú)及其雜交魚(yú)的分子標(biāo)記方法，其特征在于，步驟(3)中，在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，PCR反應(yīng)總體積為15 yL，其中含IOX反應(yīng)緩沖液 1.5 μ L, Mg2+ 2 mmol/L, dNTP 200ymol/L, 3 對(duì)上下游引物各 0. 2 μ mol/L， Taq酶0. 4U，DNA 50 ng 100 ng，用滅菌雙蒸餾水補(bǔ)足體積。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒別尼羅羅非魚(yú)、奧利亞羅非魚(yú)及其雜交魚(yú)的分子標(biāo)記方法，其特征在于，步驟(3)中，PCR反應(yīng)條件為94 V 3 min ；94 V 20 s，52 °C退火20s， 72 "C 20s，25 30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 5 min。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鑒別尼羅羅非魚(yú)、奧利亞羅非魚(yú)及其雜交魚(yú)的分子標(biāo)記方法，其特征是選用3對(duì)特異微衛(wèi)星標(biāo)記引物組合，從待測(cè)羅非魚(yú)采樣血液或鰭條，提取基因組DNA，對(duì)待測(cè)羅非魚(yú)基因組DNA進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用8.0％的非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，銀染法染色后，拍照記錄電泳結(jié)果。根據(jù)多重PCR的電泳檢測(cè)結(jié)果，可鑒別尼羅羅非魚(yú)、奧利亞羅非魚(yú)及它們的雜交魚(yú)。本發(fā)明可快速、有效地鑒別尼羅羅非魚(yú)、奧利亞羅非魚(yú)及其雜交魚(yú)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102226220SQ20111016311
公開(kāi)日2011年10月26日 申請(qǐng)日期2011年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月17日
發(fā)明者俞菊華, 唐永凱, 徐跑, 李建林, 李紅霞 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心