專(zhuān)利名稱(chēng)：一種與腦血管狹窄有關(guān)的ⅰ型神經(jīng)纖維瘤nf1基因突變核苷酸序列及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種與腦血管狹窄有關(guān)放入核苷酸序列，具體涉及一種與腦血管狹窄有關(guān)的分離自I型神經(jīng)纖維瘤NFl基因的突變核苷酸序列及其在腦血管狹窄診斷中的應(yīng)用，屬于疾病診斷領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
腦血管狹窄是危害人類(lèi)健康的常見(jiàn)病，可導(dǎo)致高致殘率、高致死率的缺血性腦卒中。其發(fā)病機(jī)制不完全清楚，從而使腦血管狹窄的防治陷入“瓶頸”。目前，盡管隨著腦卒中I級(jí)預(yù)防、2級(jí)預(yù)防知識(shí)的普及，動(dòng)脈支架、頸動(dòng)脈內(nèi)膜剝脫及顱內(nèi)外動(dòng)脈搭橋技術(shù)的應(yīng)用，部分患者的腦缺血癥狀得到緩解，致殘率、致死率在一定程度上得到控制，但由于腦血管狹窄的發(fā)病原因、發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，而目前針對(duì)腦血管狹窄的防治僅僅處于疾病下游水平，其結(jié)果是治標(biāo)不治本。同時(shí)近年來(lái)腦血管狹窄的發(fā)病率越來(lái)越高，發(fā)病年齡越來(lái)越趨于年輕化，而且常常找不到發(fā)病誘因，所以基因水平尋找到腦血管狹窄的發(fā)生機(jī)制，從根本上降低該病的發(fā)生率，是防治腦血管狹窄的新的突破口之一。近年來(lái)，Nfl基因與血管性疾病的關(guān)系正在成為新的研究熱點(diǎn)，但Nfl基因突變位點(diǎn)多變、類(lèi)型不定，突變與腦血管狹窄之間的關(guān)系尚不明確。NFl是一種常見(jiàn)的常染色體顯性遺傳病，病因明確，即由17號(hào)染色體上的Nfl基因突變所致。在自然人群中的發(fā)病率約為1/3500，20°/Γ60%有家族史，發(fā)病無(wú)明顯的性別差異。臨床表現(xiàn)主要為累及全身皮膚的多發(fā)性神經(jīng)纖維瘤，同時(shí)NFl還可累及多個(gè)器官系統(tǒng)，發(fā)生腎動(dòng)脈狹窄、腦血管狹窄、視神經(jīng)膠質(zhì)瘤、脊柱側(cè)凸、椎管內(nèi)或顱內(nèi)腫瘤等。1989年，Nfl基因被定位于人類(lèi)染色體17qll.2，并于1990年克隆出該基因。Nfl基因是人類(lèi)基因組中較大的基因，全長(zhǎng)350kb，含60個(gè)外顯子，其轉(zhuǎn)錄部分的長(zhǎng)度約ll-13kb。NFl基因在Genbank的登錄號(hào)為NM_00104 2492. 2。從功能上來(lái)看，Nfl基因是抑癌基因，其編碼的由2838個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)即神經(jīng)纖維瘤蛋白(neurofibromin)是一種腫瘤抑制物，在機(jī)體多個(gè)組織與器官均有表達(dá)，如平滑肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及施旺細(xì)胞。神經(jīng)纖維瘤蛋白的主要功能域(GAP-related domain, GRD)由第21_27a外顯子編碼，與GTP酶激活蛋白家族有同源性，能夠激活體內(nèi)的Ras-GTPase，導(dǎo)致結(jié)合狀態(tài)的GTP水解，Ras失活，因此GRD是Ras信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的一種負(fù)調(diào)節(jié)因子，而Ras是機(jī)體的癌基因，如Nfl基因發(fā)生突變，神經(jīng)纖維瘤蛋白的質(zhì)或量發(fā)生改變，Ras活性增高，從而可產(chǎn)生神經(jīng)纖維瘤甚至惡性周?chē)窠?jīng)鞘瘤(Malignant Peripheral nerve sheath tumor, MPNST)。Nfl基因結(jié)構(gòu)復(fù)雜，突變位點(diǎn)多變，突變類(lèi)型不定，且在Nfl全長(zhǎng)基因存在大量假基因，因此，Nfl基因突變的篩查仍將是一個(gè)具有挑戰(zhàn)性的工作。根據(jù)人類(lèi)基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)(HGMD)顯示(http:1l www. hgmd. org/),截止到2011年4月，共發(fā)現(xiàn)Nfl基因的1273個(gè)突變，包括錯(cuò)義突變、剪切突變、插入、缺失及復(fù)雜重排等，但突變?nèi)狈γ黠@的熱點(diǎn)區(qū)域，大多數(shù)散發(fā)病例各自攜帶特異的突變位點(diǎn)，由于不同的NFl患者臨床癥狀不一，所以甚至在同一個(gè)家系患者中的不同成員之間也存在不同的突變位點(diǎn)及突變類(lèi)型。在2000年以前，很少有人關(guān)注Nfl基因與血管性疾病的關(guān)系，直到近幾年，Nfl基因與腦血管病之間的可能存在的關(guān)聯(lián)也多為單純的臨床病例報(bào)道，對(duì)于Nfl基因與血管之間的關(guān)系鮮有深入研究，不過(guò)人們發(fā)現(xiàn)NFl伴發(fā)的血管病變病程緩慢，呈進(jìn)行性損害?；颊咴缙诎Y狀隱匿，可無(wú)不適癥狀，隨著病情發(fā)展，出現(xiàn)的臨床癥狀可因病變累及血管的部位和損傷程度而不同。但目前尚未找到Nfl基因與腦血管狹窄相關(guān)的突變位點(diǎn)及突變類(lèi)型。在1993年，Ahlgren-Beckendorf等對(duì)Nfl與血管病變的關(guān)系進(jìn)行了初步的實(shí)驗(yàn)研究，他們檢測(cè)到血管壁上有Nfl的表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)Nfl催化域的表達(dá)和替代剪切模式在血管平滑肌細(xì)胞增殖過(guò)程中不斷發(fā)生著改變，提示Nfl在血管平滑肌的發(fā)育和血管病理過(guò)程當(dāng)中可能發(fā)揮著一定的作用，但沒(méi)有繼續(xù)深入的探討。兩年后，Norton再次證實(shí)了血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞中有神經(jīng)纖維瘤蛋白的表達(dá)，目前已認(rèn)為動(dòng)脈壁的內(nèi)在損害是NFl患者的重要表現(xiàn)，其血管病理過(guò)程中可能是由于神經(jīng)纖維瘤蛋白的功能改變所致。2006年，Li等人發(fā)現(xiàn)神經(jīng)纖維瘤蛋白是初級(jí)血管平滑肌細(xì)胞RAS-誘導(dǎo)信號(hào)通路的一個(gè)新的負(fù)調(diào)控子，Nfl基因突變可導(dǎo)致神經(jīng)纖維瘤蛋白的質(zhì)量發(fā)生改變，對(duì)RAS-信號(hào)通路抑制作用減弱，ras活性增強(qiáng)，從而導(dǎo)致神經(jīng)纖維瘤及血管病的發(fā)生。在Nfl+/-鼠模型中發(fā)現(xiàn)失控的RAS-信號(hào)通路可致新生血管內(nèi)膜增厚而致血管狹窄的發(fā)生。從Nfl+/-小鼠及缺乏神經(jīng)纖維瘤蛋白的病人中取得血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，并且鑒定了一個(gè)獨(dú)立的Ras效應(yīng)器通路，該通路嚴(yán)格地受到神經(jīng)纖維瘤蛋白的調(diào)控，從而限制著血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，維持著血管壁血管平滑肌的穩(wěn)定。同期，對(duì)于Nf+/-雜合突變小鼠神經(jīng)纖維瘤中的高度血管化及小鼠體內(nèi)血管發(fā)生的增加，Li和Munchhof探討了神經(jīng)纖維瘤蛋白調(diào)控新生血管形成的生化機(jī)制和其在內(nèi)皮細(xì)胞中的功能，發(fā)現(xiàn)不論在體內(nèi)還是體外，缺乏神經(jīng)纖維瘤蛋白的內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移發(fā)生了改變，這個(gè)改變與神經(jīng)纖維瘤蛋白源的生長(zhǎng)因子有關(guān)。2007年，針對(duì)NFl患者高發(fā)的心血管疾病、腦血管梗塞性疾病，Xu等人獲得平滑肌細(xì)胞Nfl基因敲除小鼠(NflsmKO)，這些小鼠出現(xiàn)了相應(yīng)的血管損害，內(nèi)膜血脯氨酸增多以及Ras的下游效應(yīng)器-絲裂原活化的蛋白激酶異常活化。如果在NflsmKO小鼠平滑肌細(xì)胞表達(dá)NflRas調(diào)控域(GTP酶活化的相關(guān)蛋白域)，那么內(nèi)膜血脯氨酸增多癥狀可以得到恢復(fù)。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Ras效應(yīng)器活性同樣恢復(fù)正常，提示平滑肌細(xì)胞受損后，Nfl調(diào)控Ras在平滑肌細(xì)胞的增生過(guò)程中具有關(guān) 鍵作用。2008年，Lasater等人總結(jié)發(fā)現(xiàn)Nfl+/-小鼠血管內(nèi)有新內(nèi)膜形成，血管平滑肌細(xì)胞的過(guò)度增生，在血小板源生長(zhǎng)因子(platelet-derived growthfactor-BB, PDGF-BB)的刺激下高度活化Ras-Erk信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，提示神經(jīng)纖維瘤蛋白通過(guò)PDGF-BB-Ras-Erk信號(hào)軸控制著血管壁內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，包括血管內(nèi)皮細(xì)胞(ECs )和血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)。動(dòng)脈受損后TOGF-BB由血管內(nèi)局部的血小板或其它細(xì)胞釋放。也就是說(shuō)這個(gè)信號(hào)通路上的任一環(huán)節(jié)受抑制，都會(huì)有利于與Nfl基因相關(guān)的血管性疾患的恢復(fù)，提示Nfl基因是血管性疾病的一個(gè)潛在治療靶點(diǎn)。Milewicz同樣提出Nfl基因的突變是多種增生性血管疾病發(fā)生的重要因素。為了探討Nfl缺失所致血管性疾病的具體內(nèi)環(huán)境變化，Lasater等認(rèn)為神經(jīng)纖維瘤蛋白可調(diào)控每種類(lèi)型細(xì)胞的功能。然后通過(guò)在小鼠的內(nèi)皮細(xì)胞，血管平滑肌細(xì)胞，及骨髓衍生細(xì)胞(BMDC)細(xì)胞中敲除Nfl基因，以觀察究竟那種類(lèi)型的細(xì)胞對(duì)小鼠體內(nèi)新的內(nèi)膜形成起到了關(guān)鍵作用，最后證實(shí)了在BMDC中Nfl的失活對(duì)新生內(nèi)膜的形成是必要的，對(duì)Nfl+/-外周血分析發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)在新生血管內(nèi)膜處有顯著的巨噬細(xì)胞的聚集，提示炎癥反應(yīng)的存在，這與血管炎癥及血管閉塞性疾患明顯相關(guān)，再次提示ΝΠ在血管病變中的重要作用。Nfl基因外顯率為100%。但不同臨床癥狀或者表現(xiàn)不完全外顯，或者表現(xiàn)出一定的年齡相關(guān)性。多數(shù)研究表明，NFl突變與臨床表現(xiàn)之間似乎無(wú)明確聯(lián)系。相同的基因突變不一定產(chǎn)生相同的臨床表現(xiàn)，同一家族不同成員的臨床表現(xiàn)也可能不同。家族中攜帶相同NFl基因突變位點(diǎn)的患者臨床表現(xiàn)也各不相同，但在一級(jí)親屬中，臨床表現(xiàn)卻非常相似。Upadhyaya等研究了來(lái)自同一家族的3例NFl患者發(fā)現(xiàn)其基因突變各不相同，提出不能根據(jù)家族中某一患者的突變檢測(cè)來(lái)推斷整個(gè)家族的發(fā)病機(jī)制。Castle等研究113例NFl患者基因突變并分析了 110例患者基因型和表現(xiàn)型的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)錯(cuò)義突變患者Lisch結(jié)節(jié)的相對(duì)危險(xiǎn)度較無(wú)義突變和框架漂移低，但未見(jiàn)其他有意義的聯(lián)系。近年來(lái)有學(xué)者認(rèn)為，嚴(yán)重臨床表現(xiàn)型的出現(xiàn)可能與大側(cè)翼DNA功能缺失有關(guān)，而與NFl基因本身無(wú)關(guān)。總之，Nfl基因非常復(fù)雜，其突變可導(dǎo)致NFl的發(fā)生，但在NFl的不同患者中，Nfl基因突變位點(diǎn)及突變類(lèi)型“變化莫測(cè)”。而且NFl患者往往伴發(fā)多種疾病，近年來(lái)一些主要針對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的高影響因子文章均提示Nfl基因與血管性疾病的發(fā)生可能存在因果關(guān)系，但對(duì)Nfl基因突變位點(diǎn)與腦血管疾病的關(guān)系研究卻寥寥無(wú)幾。臨床上出現(xiàn)的一個(gè)合并腦血管狹窄的I型神經(jīng)纖維瘤(neurofibromatosistypel, NFl)病家系為此關(guān)系的確定提供了契機(jī)。本發(fā)明就以此合并腦血管狹窄的NFl家系為切入點(diǎn)，對(duì)該家系及單純腦血管狹窄病例的Nfl基因進(jìn)行全基因篩查，探尋與腦血管狹窄有關(guān)的突變位點(diǎn)、類(lèi)型及可能的熱點(diǎn)區(qū)域，并通對(duì)多例腦血管病人Nfl基因熱點(diǎn)區(qū)域的再篩查，有望找到與腦血管狹窄有關(guān)的Nfl基因突變位點(diǎn)及類(lèi)型，為腦血管狹窄發(fā)病機(jī)制的探索找到新的突破口，發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種與腦血管狹窄有關(guān)的I型神經(jīng)纖維瘤NFl基因突變核苷酸序列，它包含一核苷酸序列`，該核苷酸序列選自下組(a)編碼腦血管狹窄突變蛋白多肽的核苷酸序列；(b)與(a)中所述核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列，其中所述編碼腦血管狹窄突變蛋白多肽的核苷酸序列與NFl中包含的相應(yīng)核苷酸序列相比在以下位置發(fā)生了突變c. 541C>T(即位于SEQ ID NO 1所示序列的第924位堿基的堿基由C突變?yōu)棣常a(chǎn)生無(wú)義突變)，自NFl基因編碼區(qū)第I位堿基(即SEQ ID NO 1所示序列的第384位堿基)起算，所述突變導(dǎo)致患者發(fā)生腦血管狹窄。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的核苷酸序列，其含有選自下組的核苷酸序列(1)編碼具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；(2) SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列；(3) SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列。本發(fā)明的目的之二是提供一種與腦血管狹窄有關(guān)的多肽，它包括具有SEQ IDNO 2所示氨基酸序列的多肽，或其含有氨基酸序列SEQ ID NO :2的保守性變異多肽或其活性片段或其活性衍生物。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的多肽，其選自下組(a)具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的仍能夠?qū)е履X血管狹窄的多肽。
含有以上任一項(xiàng)所述的核苷酸序列的表達(dá)載體以及被所述的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的含有所述載體的宿主細(xì)胞也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的目的之三是提供了本發(fā)明所述的核苷酸序列及多肽的用途，該用途包括本發(fā)明所述的核苷酸序列在制備腦血管狹窄診斷試劑中的應(yīng)用，及/或在制備I型神經(jīng)纖維瘤合并腦血管狹窄診斷試劑中的應(yīng)用。及本發(fā)明所述的多肽在制備腦血管狹窄診斷試劑中的應(yīng)用，及/或在制備I型神經(jīng)纖維瘤合并腦血管狹窄診斷試劑中的應(yīng)用。及本發(fā)明所述的核苷酸序列在構(gòu)建I型神經(jīng)纖維瘤合并腦血管狹窄動(dòng)物模型中的應(yīng)用。及本發(fā)明所述的多肽在構(gòu)建I型神經(jīng)纖維瘤合并腦血管狹窄動(dòng)物模型中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的之四是提供一種用于腦血管狹窄診斷的試劑盒，它包括(1)以含有c. 541C>T突變位點(diǎn)的NFl基因片段作為靶序列設(shè)計(jì)的特異性擴(kuò)增人NFl基因的引物對(duì)，突變位點(diǎn)自NFl基因編碼區(qū)第I位堿基起算；(2)用于檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物與正常NFl基因相比是否存在變化所需的試劑。在本發(fā)明中，所述的含有c. 541C>T突變位點(diǎn)的NFl基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。在本發(fā)明中優(yōu)選的，所述的試劑盒中包含的引物對(duì)如下所示

5’ GAAGGAAGTTAGAAGTTTGTGACA3’ (SEQ ID NO 6)與5’CAATCGTATCCTTACCAGCCAT3’ (SEQ ID NO :7)。進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了所述的試劑盒在制備腦血管狹窄診斷試劑中的應(yīng)用，及/或在制備I型神經(jīng)纖維瘤合并腦血管狹窄診斷試劑中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的之五是提供一種診斷腦血管狹窄疾病的方法，它包括以下步驟檢測(cè)血細(xì)胞或血管平滑肌細(xì)胞樣品中腦血管狹窄轉(zhuǎn)錄本與正常轉(zhuǎn)錄本相比是否有變化，有變化就表示存在腦血管狹窄風(fēng)險(xiǎn)；或者檢測(cè)受檢細(xì)胞樣品中NFl基因編碼蛋白的活性與正常NFl基因編碼蛋白的活性相比是否有變化，有變化就表示存在腦血管狹窄風(fēng)險(xiǎn)；或者檢測(cè)基因組樣品中NFl基因組序列與正常NFl基因組序列相比是否有變化，有變化就表示存在腦血管狹窄風(fēng)險(xiǎn)。在一優(yōu)選例中，所述的變化包括NF1基因外顯子5 (堿基863-969，其核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示)中的核苷酸的缺失、插入和置換突變。更佳地，所述的變化選自下組SEQ ID NO :1中編碼區(qū)第541位核苷酸(自SEQ ID NO :1所示序列第384位堿基(即起始密碼子ATG中的“A”)起算，即SEQ ID NO :1所示序列的第924位堿基，下同)由C突變?yōu)門(mén)，產(chǎn)生無(wú)義突變。本發(fā)明的目的之六是提供一種轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物(動(dòng)物模型)，其基因組中對(duì)應(yīng)于人NFl基因外顯子5的核苷酸序列發(fā)生了改變，從而具有患腦血管狹窄的風(fēng)險(xiǎn)。在一優(yōu)選例中，所述的動(dòng)物是小鼠，其基因組中NFl基因的外顯子5中包含的核苷酸 541 由 C 突變?yōu)?T (c. 541C>T)。本發(fā)明的其它方面由于本文的技術(shù)的公開(kāi)并結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而目是顯而易見(jiàn)的。


圖1為合并腦血管狹窄的I型神經(jīng)纖維瘤病家系圖譜；圖2為先證者IV -7的皮膚改變和DSA檢測(cè)結(jié)果；A :皮膚牛奶咖啡斑和神經(jīng)纖維瘤；B DSA,箭頭所指處為血管狹窄的部位；圖3為NFl患者IV -3的皮膚咖啡斑和DSA檢測(cè)結(jié)果，其中，箭頭所指處為血管狹窄的部位；圖4為DHPLC流程圖；圖5為Nfl基因第5外顯子突變檢測(cè)的DHPLC色譜圖及測(cè)序結(jié)果；其中，A圖為對(duì)照野生型的DHPLC峰型圖，其右側(cè)為相應(yīng)測(cè)序圖出圖為家系合并腦血管狹窄的NFl患者Nfl基因的第5外顯子相應(yīng)檢測(cè)圖(箭頭所指部位出現(xiàn)了肩峰)及測(cè)序圖(測(cè)序圖中箭頭所指部位出現(xiàn)無(wú)義突變c. 541C-T)；C圖為單純腦血管狹窄患者的DNA的第5外顯子相應(yīng)檢測(cè)圖(箭頭所指部位出現(xiàn)了肩峰)及測(cè)序圖(測(cè)序圖中箭頭所指部位同樣出現(xiàn)無(wú)義突變c. 541C-T)；圖6為Nfl基因的外顯子5的突變與其功能區(qū)域的關(guān)系(GRD區(qū)和CSRD區(qū))。
具體實(shí)施例下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏 離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)施例1合并腦血管狹窄的I型神經(jīng)纖維瘤病家系分析I對(duì)象和方法1.1 對(duì)象先證者(IV 4，圖1)，男，24歲，8年前因突發(fā)血壓升高及頭部較大神經(jīng)纖維瘤手術(shù)就診，體檢發(fā)現(xiàn)血壓180/100mmHg，近期再次因無(wú)特殊誘因而出現(xiàn)劇烈頭痛、惡心嘔吐伴視物模糊入院，測(cè)血壓210/135mmHg。診斷為腎血管性高血壓、神經(jīng)纖維瘤入院。入院后超聲結(jié)果發(fā)現(xiàn)腎動(dòng)脈狹窄，左側(cè)MCA狹窄。另外，該患者智力正常，有腎內(nèi)多處動(dòng)脈瘤(AN)、前交通動(dòng)脈(ACOA)瘤。其他系統(tǒng)檢查無(wú)異常。胸背腹及大腿內(nèi)側(cè)出現(xiàn)直徑約f 2厘米圓形或橢圓形淡褐色斑多處，邊界清晰，有皮膚纖維瘤。該家系共涉及5代34人，與NFl疾病有遺傳關(guān)聯(lián)的為21人(圖1)。其中4人已死亡(3男I女，均為NFl患者，3人死于腦卒中)，其余人中，患者7人，男4人女3人。該病在本家族連續(xù)5代相傳，5代中患病總?cè)藬?shù)11人。皆在幼年出現(xiàn)多個(gè)淡褐色斑或片狀褐色牛奶咖啡斑,腋窩牛奶咖啡斑，隨年齡增大癥狀加重,并且隨著年齡的增加,血管性疾病的發(fā)生率增加。1. 2血管監(jiān)測(cè)方法包括經(jīng)顱多普勒CTCD)、頸部動(dòng)脈超聲檢查及數(shù)字減影血管造影技術(shù)(DigitalSubtraction Angiography, DSA)。2 結(jié)果
2.1合并腦血管狹窄的NFl家系中腦血管病人的發(fā)病比例該家系中4人已死亡(3男I女，均為NFl患者，3人死于腦卒中)，其余患者7人，合并血管性疾病的有5人(其中一人未來(lái)院體檢)。除去無(wú)該家系遺傳因素的婚配者,該病在5代中患病總?cè)藬?shù)11人，占圖1總?cè)藬?shù)的52. 38% (11/21)。10人(體檢的6例患者+死亡的4例)中患血管性疾病的確定人數(shù)(血管狹窄+血管走形異常)為8人，不確定者I人(未體檢)，血管性疾病患者占NFl發(fā)病人數(shù)的比例>80%。2. 2家系神經(jīng)纖維瘤病患者皮膚改變、血管超聲和DSA結(jié)果2. 2.1先證病例(IV-4)男，24歲，胸背腹可見(jiàn)多處圓形或橢圓形淡褐色斑多處，邊界清晰，頭部原有較大神經(jīng)纖維瘤(已手術(shù)切除)。入院后超聲結(jié)果發(fā)現(xiàn)腎動(dòng)脈狹窄，左側(cè)MCA狹窄。DSA結(jié)果顯示見(jiàn)圖2。其祖父、父親和姑奶奶均患有神經(jīng)纖維瘤并死于腦卒中。2. 2.1其他病例II1-4 :男，39歲，皮膚多處大小不一的神經(jīng)纖維瘤，血管超聲發(fā)現(xiàn)雙側(cè)椎動(dòng)脈走行變異。II1-7 :男，45歲，除皮膚多處大小不一的神經(jīng)纖維瘤外，腹部有一特大的神經(jīng)纖維瘤，但血管超聲未見(jiàn)異常。IV -2 :女， 31歲，皮膚多發(fā)咖啡斑，血管超聲可見(jiàn)雙側(cè)ICA終末段-MCA重度狹窄；雙側(cè)大腦后動(dòng)脈(PCA)重度狹窄；雙側(cè)大腦前動(dòng)脈(ACA)、基底動(dòng)脈(BA)中度狹窄；脾大；左側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)遠(yuǎn)端節(jié)段性狹窄；左側(cè)椎動(dòng)脈(VA)走行變異。DSA可見(jiàn)顱內(nèi)血管狹窄處(圖3)IV-5 :女，15歲，皮膚多發(fā)咖啡斑及前臂處可見(jiàn)大片牛奶咖啡斑。血管超聲可見(jiàn)腹腔動(dòng)脈起始部狹窄(50-69%);雙側(cè)VA走行變異。V -2 :男，6歲，可見(jiàn)皮膚咖啡斑和腋窩雀斑及咖啡斑。血管超聲可見(jiàn)雙側(cè)ICA、VA走行彎曲。實(shí)施例2DHPLC篩查合并腦血管狹窄的I型神經(jīng)纖維瘤病家系的Nfl基因突變及單純腦血管狹窄患者的Nfl基因突變I對(duì)象與方法1.1Nfl全基因突變篩查的研究對(duì)象Nfl全基因篩查包括家系收集到的血樣13例參見(jiàn)圖1中合并血管疾病的6例病人(II1-4 JI1-7、IV -2、IV _4、IV -5、V -2 ;檢測(cè)號(hào)1_6號(hào))和家系中無(wú)神經(jīng)纖維瘤病表現(xiàn)的7 例(II1-2 JI1-5 JI1-6、IV -UIV -3、IV -7,1V -8 ;檢測(cè)號(hào)13-18)及 5 例無(wú)其他危險(xiǎn)因素或基礎(chǔ)疾病的單純腦血管狹窄患者(檢測(cè)號(hào)8-12號(hào))。表118例Nfl全基因突變篩查的對(duì)象
權(quán)利要求
1.一種與腦血管狹窄有關(guān)的I型神經(jīng)纖維瘤NFl基因突變核苷酸序列，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列選自下組(a)編碼腦血管狹窄突變蛋白多肽的核苷酸序列；(b)與(a)中所述核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列，其中所述編碼腦血管狹窄突變蛋白多肽的核苷酸序列與NFl中包含的相應(yīng)核苷酸序列相比在以下位置發(fā)生了突變c. 5410T,自NFl基因編碼區(qū)第I位堿基起算，所述突變導(dǎo)致患者發(fā)生腦血管狹窄。
2.如權(quán)利要求1所述的核苷酸序列，其含有選自下組的核苷酸序列(I)編碼具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；(2) SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列；(3) SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列。
3.一種與腦血管狹窄有關(guān)的多肽，它包括具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多肽， 或其含有氨基酸序列SEQ ID NO :2的保守性變異多肽或其活性片段或其活性衍生物。
4.如權(quán)利要求3所述的多肽，其選自下組(a)具有SEQID NO :2所示氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的仍能夠?qū)е履X血管狹窄的多肽。
5.—種表達(dá)載體,其特征在于含有權(quán)利要求1或2所述的核苷酸序列。
6.一種宿主細(xì)胞，其特征在于含有權(quán)利要求5所述的載體。
7.權(quán)利要求1或2所述的核苷酸序列在制備腦血管狹窄診斷試劑中的應(yīng)用，及/或在制備I型神經(jīng)纖維瘤合并腦血管狹窄診斷試劑中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求3或4所述的多肽在制備腦血管狹窄診斷試劑中的應(yīng)用，及/或在制備I 型神經(jīng)纖維瘤合并腦血管狹窄診斷試劑中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1或2所述的核苷酸序列在構(gòu)建I型神經(jīng)纖維瘤合并腦血管狹窄動(dòng)物模型中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求3或4所述的多肽在構(gòu)建I型神經(jīng)纖維瘤合并腦血管狹窄動(dòng)物模型中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種與腦血管狹窄有關(guān)的Ⅰ型神經(jīng)纖維瘤NF1基因突變核苷酸序列及其應(yīng)用，本發(fā)明的一種與腦血管狹窄有關(guān)的核苷酸序列，其與NF1中包含的相應(yīng)核苷酸序列相比在以下位置發(fā)生了突變c.541C>T，自NF1基因編碼區(qū)第1位堿基起算，所述突變導(dǎo)致患者發(fā)生腦血管狹窄。研究發(fā)現(xiàn)，該無(wú)義突變存在于所有合并腦血管狹窄的NF1家系患者，但不存在于NF1家系中正常的人群中。該突變點(diǎn)可為類(lèi)似臨床癥狀腦血管狹窄動(dòng)物模型的建立提供了依據(jù)，并進(jìn)一步為散發(fā)的NF1患者潛在的腦血管狹窄進(jìn)行超早期診斷及預(yù)防。
文檔編號(hào)C12N15/63GK103045605SQ201210576929
公開(kāi)日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2012年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月26日
發(fā)明者凌鋒, 梁建濤, 霍麗蓉, 鮑遇海 申請(qǐng)人:首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院