專利名稱：一種用于診斷腦血管狹窄的試劑盒及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種疾病診斷試劑盒，特別涉及一種用于診斷腦血管狹窄的試劑盒及其在診斷腦血管疾病或在診斷I型神經(jīng)纖維瘤合并腦血管狹窄疾病中的應用，屬于疾病診斷領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
腦血管狹窄是危害人類健康的常見病，可導致高致殘率、高致死率的缺血性腦卒中。其發(fā)病機制不完全清楚，從而使腦血管狹窄的防治陷入“瓶頸”。目前，盡管隨著腦卒中I級預防、2級預防知識的普及，動脈支架、頸動脈內(nèi)膜剝脫及顱內(nèi)外動脈搭橋技術(shù)的應用，部分患者的腦缺血癥狀得到緩解，致殘率、致死率在一定程度上得到控制，但由于腦血管狹窄的發(fā)病原因、發(fā)病機制尚不完全清楚，而目前針對腦血管狹窄的防治僅僅處于疾病下游水平，其結(jié)果是治標不治本。同時近年來腦血管狹窄的發(fā)病率越來越高，發(fā)病年齡越來越趨于年輕化，而且常常找不到發(fā)病誘因，所以從基因水平尋找到腦血管狹窄的發(fā)生機制，從根本上降低該病的發(fā)生率，是防治腦血管狹窄的新的突破口之一。近年來，Nfl基因與血管性疾病的關(guān)系正在成為新的研究熱點，但Nfl基因突變位點多變、類型不定，突變與腦血管狹窄之間的關(guān)系尚不明確。NFl是一種常見的常染色體顯性遺傳病，病因明確，即由17號染色體上的Nfl基因突變所致。在自然人群中的發(fā)病率約為1/3500，20°/Γ60%有家族史，發(fā)病無明顯的性別差異。臨床表現(xiàn)主要為累及全身皮膚的多發(fā)性神經(jīng)纖維瘤，同時NFl還可累及多個器官系統(tǒng)，發(fā)生腎動脈狹窄、腦血管狹窄、視神經(jīng)膠質(zhì)瘤、脊柱側(cè)凸、椎管內(nèi)或顱內(nèi)腫瘤等。1989年，Nfl基 因被定位于人類染色體17qll.2，并于1990年克隆出該基因。Nfl基因是人類基因組中較大的基因，全長350kb，含60個外顯子，其轉(zhuǎn)錄部分的長度約ll-13kb。NFl基因在Genbank的登錄號為NM_001042492. 2。從功能上來看，Nfl基因是抑癌基因，其編碼的由2838個氨基酸組成的蛋白質(zhì)即神經(jīng)纖維瘤蛋白(neurofibromin)是一種腫瘤抑制物，在機體多個組織與器官均有表達，如平滑肌細胞、血管內(nèi)皮細胞及施旺細胞。神經(jīng)纖維瘤蛋白的主要功能域(GAP-relateddomain,GRD)由第21_27a外顯子編碼,與GTP酶激活蛋白家族有同源性，能夠激活體內(nèi)的Ras-GTPase，導致結(jié)合狀態(tài)的GTP水解，Ras失活，因此GRD是Ras信號轉(zhuǎn)導的一種負調(diào)節(jié)因子，而Ras是機體的癌基因，如Nfl基因發(fā)生突變，神經(jīng)纖維瘤蛋白的質(zhì)或量發(fā)生改變，Ras活性增高，從而可產(chǎn)生神經(jīng)纖維瘤甚至惡性周圍神經(jīng)鞘瘤(Malignant Peripheral nerve sheath tumor, MPNST)。Nfl基因結(jié)構(gòu)復雜，突變位點多變，突變類型不定，且在Nfl全長基因存在大量假基因，因此，Nfl基因突變的篩查仍將是一個具有挑戰(zhàn)性的工作。根據(jù)人類基因突變數(shù)據(jù)庫(HGMD)顯示(http://www. hgmd. org/),截止到2011年4月，共發(fā)現(xiàn)Nfl基因的1273個突變，包括錯義突變、剪切突變、插入、缺失及復雜重排等，但突變?nèi)狈γ黠@的熱點區(qū)域，大多數(shù)散發(fā)病例各自攜帶特異的突變位點，由于不同的NFl患者臨床癥狀不一，所以甚至在同一個家系患者中的不同成員之間也存在不同的突變位點及突變類型。
在2000年以前，很少有人關(guān)注Nfl基因與血管性疾病的關(guān)系，直到近幾年，Nfl基因與腦血管病之間的可能存在的關(guān)聯(lián)也多為單純的臨床病例報道，對于Nfl基因與血管之間的關(guān)系鮮有深入研究，不過人們發(fā)現(xiàn)NFl伴發(fā)的血管病變病程緩慢，呈進行性損害?；颊咴缙诎Y狀隱匿，可無不適癥狀，隨著病情發(fā)展，出現(xiàn)的臨床癥狀可因病變累及血管的部位和損傷程度而不同。但目前尚未找到Nfl基因與腦血管狹窄相關(guān)的突變位點及突變類型。在1993年，Ahlgren-Beckendorf等對Nfl與血管病變的關(guān)系進行了初步的實驗研究，他們檢測到血管壁上有Nfl的表達，并且發(fā)現(xiàn)Nfl催化域的表達和替代剪切模式在血管平滑肌細胞增殖過程中不斷發(fā)生著改變，提示Nfl在血管平滑肌的發(fā)育和血管病理過程當中可能發(fā)揮著一定的作用，但沒有繼續(xù)深入的探討。兩年后，Norton再次證實了血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞中有神經(jīng)纖維瘤蛋白的表達，目前已認為動脈壁的內(nèi)在損害是NFl患者的重要表現(xiàn)，其血管病理過程中可能是由于神經(jīng)纖維瘤蛋白的功能改變所致。2006年，Li等人發(fā)現(xiàn)神經(jīng)纖維瘤蛋白是初級血管平滑肌細胞RAS-誘導信號通路的一個新的負調(diào)控子，Nfl基因突變可導致神經(jīng)纖維瘤蛋白的質(zhì)量發(fā)生改變，對RAS-信號通路抑制作用減弱，ras活性增強，從而導致神經(jīng)纖維瘤及血管病的發(fā)生。在Nfl+/-鼠模型中發(fā)現(xiàn)失控的RAS-信號通路可致新生血管內(nèi)膜增厚而致血管狹窄的發(fā)生。從Nfl+/-小鼠及缺乏神經(jīng)纖維瘤蛋白的病人中取得血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞，并且鑒定了一個獨立的Ras效應器通路，該通路嚴格地受到神經(jīng)纖維瘤蛋白的調(diào)控，從而限制著血管平滑肌細胞的增殖和遷移，維持著血管壁血管平滑肌的穩(wěn)定。同期，對于Nf+/-雜合突變小鼠神經(jīng)纖維瘤中的高度血管化及小鼠體內(nèi)血管發(fā)生的增加，Li和Munchhof探討了神經(jīng)纖維瘤蛋白調(diào)控新生血管形成的生化機制和其在內(nèi)皮細胞中的功能，發(fā)現(xiàn)不論在體內(nèi)還是體外，缺乏神經(jīng)纖維瘤蛋白的內(nèi)皮細胞的增殖和遷移發(fā)生了改變，這個改變與神經(jīng)纖維瘤蛋白源的生長因子有關(guān)。2007年，針對NFl患者高發(fā)的心血管疾病、腦血管梗塞性疾病，Xu等人獲得平滑肌細胞Nfl基因敲除小鼠(NflsmKO)，這些小鼠出現(xiàn)了相應的血管損害，內(nèi)膜血脯氨酸增多以及Ras的下游效應器-絲裂原活化的蛋白激酶異?；罨?。如果在NflsmKO小鼠平滑肌細胞表達NflRas調(diào)控域(GTP酶活化的相關(guān)蛋白域)，那么內(nèi)膜血脯氨酸增多癥狀可以得到恢復。體外實驗發(fā)現(xiàn)Ras效應器活性同樣恢復正常，提示平滑肌細胞受損后，Nfl調(diào)控Ras在平滑肌細胞的增生過程中具有關(guān)鍵作用。2008年，Lasater等人總結(jié)發(fā)現(xiàn)Nfl+/-小鼠血管內(nèi)有新內(nèi)膜形成，血管平滑肌細胞的過度增生，在血小板源生長因子(platelet-derived growthfactor-BB, PDGF-BB)的刺激下高度活化Ras-Erk信號轉(zhuǎn)導通路，提示神經(jīng)纖維瘤蛋白通過PDGF-BB-Ras-Erk信號軸控制著血管壁內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，包括血管內(nèi)皮細胞(ECs )和血管平滑肌細胞(VSMCs)。動脈受損后TOGF-BB由血管內(nèi)局部的血小板或其它細胞釋放。也就是說這個信號通路上的任一環(huán)節(jié)受抑制，都會有利于與Nfl基因相關(guān)的血管性疾患的恢復，提示Nfl基因是血管性疾病的一個潛在治療靶點。Milewicz同樣提出Nfl基因的突變是多種增生性血管疾病發(fā)生的重要因素。為了探討Nfl缺失所致血管性疾病的具體內(nèi)環(huán)境變 化，Lasater等認為神經(jīng)纖維瘤蛋白可調(diào)控每種類型細胞的功能。然后通過在小鼠的內(nèi)皮細胞，血管平滑肌細胞，及骨髓衍生細胞(BMDC)細胞中敲除Nfl基因，以觀察究竟那種類型的細胞對小鼠體內(nèi)新的內(nèi)膜形成起到了關(guān)鍵作用，最后證實了在BMDC中Nfl的失活對新生內(nèi)膜的形成是必要的，對Nfl+/-外周血分析發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)在新生血管內(nèi)膜處有顯著的巨噬細胞的聚集，提示炎癥反應的存在，這與血管炎癥及血管閉塞性疾患明顯相關(guān)，再次提示Nfl在血管病變中的重要作用。Nfl基因外顯率為100%。但不同臨床癥狀或者表現(xiàn)不完全外顯，或者表現(xiàn)出一定的年齡相關(guān)性。多數(shù)研究表明，NFl突變與臨床表現(xiàn)之間似乎無明確聯(lián)系。相同的基因突變不一定產(chǎn)生相同的臨床表現(xiàn)，同一家族不同成員的臨床表現(xiàn)也可能不同。家族中攜帶相同NFl基因突變位點的患者臨床表現(xiàn)也各不相同，但在一級親屬中，臨床表現(xiàn)卻非常相似。Upadhyaya等研究了來自同一家族的3例NFl患者發(fā)現(xiàn)其基因突變各不相同，提出不能根據(jù)家族中某一患者的突 變檢測來推斷整個家族的發(fā)病機制。Castle等研究113例NFl患者基因突變并分析了 110例患者基因型和表現(xiàn)型的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)錯義突變患者Lisch結(jié)節(jié)的相對危險度較無義突變和框架漂移低，但未見其他有意義的聯(lián)系。近年來有學者認為，嚴重臨床表現(xiàn)型的出現(xiàn)可能與大側(cè)翼DNA功能缺失有關(guān)，而與NFl基因本身無關(guān)?？傊?，Nfl基因非常復雜，其突變可導致NFl的發(fā)生，但在NFl的不同患者中，Nfl基因突變位點及突變類型“變化莫測”。而且NFl患者往往伴發(fā)多種疾病，近年來一些主要針對動物實驗的高影響因子文章均提示Nfl基因與血管性疾病的發(fā)生可能存在因果關(guān)系，但對Nfl基因突變位點與腦血管疾病的關(guān)系研究卻寥寥無幾。臨床上出現(xiàn)的一個合并腦血管狹窄的I型神經(jīng)纖維瘤(neurofbromatosistypel, NFl)病家系為此關(guān)系的確定提供了契機。本發(fā)明就以此合并腦血管狹窄的NFl家系為切入點，對該家系及單純腦血管狹窄病例的Nf I基因進行全基因篩查，探尋與腦血管狹窄有關(guān)的突變位點、類型及可能的熱點區(qū)域，并通對多例腦血管病人Nfl基因熱點區(qū)域的再篩查，有望找到與腦血管狹窄有關(guān)的Nfl基因突變位點及類型，為腦血管狹窄發(fā)病機制的探索找到新的突破口，發(fā)現(xiàn)新的治療靶點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種與腦血管狹窄有關(guān)的I型神經(jīng)纖維瘤NFl基因突變核苷酸序列，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列選自下組(a)編碼腦血管狹窄突變蛋白多肽的核苷酸序列；(b)與(a)中所述核苷酸序列互補的核苷酸序列，其中所述編碼腦血管狹窄突變蛋白多肽的核苷酸序列與NFl中包含的相應核苷酸序列相比在以下位置發(fā)生了突變c. 541C>T(即位于SEQ ID NO 1所示序列的第924位堿基的堿基由C突變?yōu)棣?，產(chǎn)生無義突變)，自NFl基因編碼區(qū)第I位堿基(即SEQ ID NO :1所示序列的第384位堿基)起算，所述突變導致患者發(fā)生腦血管狹窄。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的核苷酸序列，其含有選自下組的核苷酸序列(1)編碼具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；(2) SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列；(3) SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列。本發(fā)明的目的之二是提供一種與腦血管狹窄有關(guān)的多肽，它包括具有SEQ IDNO 2所示氨基酸序列的多肽，或其含有氨基酸序列SEQ ID NO :2的保守性變異多肽或其活性片段或其活性衍生物。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的多肽，其選自下組(a)具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的仍能夠?qū)е履X血管狹窄的多肽。含有以上任一項所述的核苷酸序列的表達載體以及被所述的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導的含有所述載體的宿主細胞也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。本發(fā)明的目的之三是提供了本發(fā)明所述的核苷酸序列及多肽的用途，該用途包括本發(fā)明所述的核苷酸序列在制備腦血管狹窄診斷試劑中的應用，及/或在制備I型神經(jīng)纖維瘤合并腦血管狹窄診斷試劑中的應用。及本發(fā)明所述的多肽在制備腦血管狹窄診斷試劑中的應用，及/或在制備I型神經(jīng)纖維瘤合并腦血管狹窄診斷試劑中的應用。及本發(fā)明所述的核苷酸序列在構(gòu)建I型神經(jīng)纖維瘤合并腦血管狹窄動物模型中的應用。及本發(fā)明所述的多肽在構(gòu)建I型神經(jīng)纖維瘤合并腦血管狹窄動物模型中的應用。本發(fā)明的目的之四是提供一種用于腦血管狹窄診斷的試劑盒，它包括(1)以含有c. 541C>T突變位點的NFl基因片段作為靶序列設(shè)計的特異性擴增人NFl基因的引物對，突變位點自NFl基因編碼區(qū)第I位堿基起算；還可包括(2)用于檢測擴增產(chǎn)物與正常NFl基因相比是否存在變化所需的試劑。在本發(fā)明中，所述的含有c. 541C>T突變位點的NFl基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。在本發(fā)明中優(yōu)選的，所述的試劑盒中包含的引物對如下所示5’ GAAGGAAGTTAGAAGTTTGTGACA3’ (SEQ ID NO 6)與5’CAATCGTATCCTTACCAGCCAT3’ (SEQ ID NO :7)。進一步的，本發(fā)明 還提出了所述的試劑盒在制備腦血管狹窄診斷試劑中的應用，及/或在制備I型神經(jīng)纖維瘤合并腦血管狹窄診斷試劑中的應用。本發(fā)明的目的之五是提供一種診斷腦血管狹窄疾病的方法，它包括以下步驟檢測血細胞或血管平滑肌細胞樣品中腦血管狹窄轉(zhuǎn)錄本與正常轉(zhuǎn)錄本相比是否有變化，有變化就表示存在腦血管狹窄風險；或者檢測受檢細胞樣品中NFl基因編碼蛋白的活性與正常NFl基因編碼蛋白的活性相比是否有變化，有變化就表示存在腦血管狹窄風險；或者檢測基因組樣品中NFl基因組序列與正常NFl基因組序列相比是否有變化，有變化就表示存在腦血管狹窄風險。在一優(yōu)選例中，所述的變化包括NF1基因外顯子5 (堿基863-969，其核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示)中的核苷酸的缺失、插入和置換突變。更佳地，所述的變化選自下組SEQ ID NO :1中編碼區(qū)第541位核苷酸(自SEQ ID NO :1所示序列第384位堿基(即起始密碼子ATG中的“A”)起算，即SEQ ID NO :1所示序列的第924位堿基，下同)由C突變?yōu)門，產(chǎn)生無義突變。本發(fā)明的目的之六是提供一種轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物(動物模型)，其基因組中對應于人NFl基因外顯子5的核苷酸序列發(fā)生了改變，從而具有患腦血管狹窄的風險。在一優(yōu)選例中，所述的動物是小鼠，其基因組中NFl基因的外顯子5中包含的核苷酸 541 由 C 突變?yōu)?T (c. 541C>T)。本發(fā)明的其它方面由于本文的技術(shù)的公開并結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而目是顯而易見的。


圖1為合并腦血管狹窄的I型神經(jīng)纖維瘤病家系圖譜；圖2為先證者IV -7的皮膚改變和DSA檢測結(jié)果；A :皮膚牛奶咖啡斑和神經(jīng)纖維瘤；B DSA,箭頭所指處為血管狹窄的部位；圖3為NFl患者IV -3的皮膚咖啡斑和DSA檢測結(jié)果，其中，箭頭所指處為血管狹窄的部位；圖4為DHPLC流程圖；圖5為Nfl基因第5外顯子突變檢測的DHPLC色譜圖及測序結(jié)果；其中，A圖為對照野生型的DHPLC峰型圖，其右側(cè)為相應測序圖出圖為家系合并腦血管狹窄的NFl患者Nfl基因的第5外顯子相應檢測圖(箭頭所指部位出現(xiàn)了肩峰)及測序圖(測序圖中箭頭所指部位出現(xiàn)無義突變c. 541C-T)；C圖為單純腦血管狹窄患者的DNA的第5外顯子相應檢測圖(箭頭所指部位出現(xiàn)了肩峰)及測序圖(測序圖中箭頭所指部位同樣出現(xiàn)無義突變c. 541C-T)；圖6為Nfl基因的外顯子5的突變與其功能區(qū)域的關(guān)系(GRD區(qū)和CSRD區(qū))。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。

實施例1合并腦血管狹窄的I型神經(jīng)纖維瘤病家系分析I對象和方法1.1 對象先證者(IV 4，圖1)，男，24歲，8年前因突發(fā)血壓升高及頭部較大神經(jīng)纖維瘤手術(shù)就診，體檢發(fā)現(xiàn)血壓180/100mmHg，近期再次因無特殊誘因而出現(xiàn)劇烈頭痛、惡心嘔吐伴視物模糊入院，測血壓210/135mmHg。診斷為腎血管性高血壓、神經(jīng)纖維瘤入院。入院后超聲結(jié)果發(fā)現(xiàn)腎動脈狹窄，左側(cè)MCA狹窄。另外，該患者智力正常，有腎內(nèi)多處動脈瘤(AN)、前交通動脈(ACOA)瘤。其他系統(tǒng)檢查無異常。胸背腹及大腿內(nèi)側(cè)出現(xiàn)直徑約f 2厘米圓形或橢圓形淡褐色斑多處，邊界清晰，有皮膚纖維瘤。該家系共涉及5代34人，與NFl疾病有遺傳關(guān)聯(lián)的為21人(圖1)。其中4人已死亡(3男I女，均為NFl患者，3人死于腦卒中)，其余人中，患者7人，男4人女3人。該病在本家族連續(xù)5代相傳，5代中患病總?cè)藬?shù)11人。皆在幼年出現(xiàn)多個淡褐色斑或片狀褐色牛奶咖啡斑,腋窩牛奶咖啡斑，隨年齡增大癥狀加重,并且隨著年齡的增加,血管性疾病的發(fā)生率增加。1. 2血管監(jiān)測方法包括經(jīng)顱多普勒CTCD)、頸部動脈超聲檢查及數(shù)字減影血管造影技術(shù)(DigitalSubtraction Angiography, DSAX2 結(jié)果2.1合并腦血管狹窄的NFl家系中腦血管病人的發(fā)病比例
該家系中4人已死亡(3男I女，均為NFl患者，3人死于腦卒中)，其余患者7人，合并血管性疾病的有5人(其中一人未來院體檢)。除去無該家系遺傳因素的婚配者,該病在5代中患病總?cè)藬?shù)11人，占圖1總?cè)藬?shù)的52. 38% (11/21)。10人(體檢的6例患者+死亡的4例)中患血管性疾病的確定人數(shù)(血管狹窄+血管走形異常)為8人，不確定者I人(未體檢)，血管性疾病患者占NFl發(fā)病人數(shù)的比例>80%。2. 2家系神經(jīng)纖維瘤病患者皮膚改變、血管超聲和DSA結(jié)果2. 2.1先證病例(IV _4)男，24歲，胸背腹可見多處圓形或橢圓形淡褐色斑多處，邊界清晰，頭部原有較大神經(jīng)纖維瘤(已手術(shù)切除)。入院后超聲結(jié)果發(fā)現(xiàn)腎動脈狹窄，左側(cè)MCA狹窄。DSA結(jié)果顯示見圖2。其祖父、父親和姑奶奶均患有神經(jīng)纖維瘤并死于腦卒中。2. 2.1其他病例III _4 :男，39歲，皮膚多處大小不一的神經(jīng)纖維瘤，血管超聲發(fā)現(xiàn)雙側(cè)椎動脈走行變異。II1-7 :男，45歲，除皮膚多處大小不一的神經(jīng)纖維瘤外，腹部有一特大的神經(jīng)纖維瘤，但血管超聲未見異常。IV -2 :女，31歲，皮膚多發(fā)咖啡斑，血管超聲可見雙側(cè)ICA終末段-MCA重度狹窄；雙側(cè)大腦后動脈(PCA)重度狹窄；雙側(cè)大腦前動脈(ACA)、基底動脈(BA)中度狹窄；脾大；左側(cè)頸內(nèi)動脈(ICA)遠端節(jié)段性狹窄；左側(cè)椎動脈(VA)走行變異。DSA可見顱內(nèi)血管狹窄處(圖3)。IV-5 :女，15歲，皮膚多發(fā)咖啡斑及前臂處可見大片牛奶咖啡斑。血管超聲可見腹腔動脈起始部狹窄(50-69%);雙側(cè)VA走行變異。V -2 :男，6歲，可見皮膚咖啡斑和腋窩雀斑及咖啡斑。血管超聲可見雙側(cè)ICA、VA走行彎曲。實施例2DHPLC篩查合并腦血管狹窄的I型神經(jīng)纖維瘤病家系的Nfl基因突變及單純腦血管狹窄患者的Nfl基因突變I對象與方法1.1Nfl全基因突變篩查的研究對象Nfl全基因篩查包括家系收集到的血樣13例參見圖1中合并血管疾病的6例病人(III-4 III1-7、IV -2、IV _4、IV -5、V -2 ;檢測號1_6號)和家系中無神經(jīng)纖維瘤病表現(xiàn)的7 例(III-2 JII-5 JII-6、IV -UIV -3、IV -7,IV -8 ;檢測號13-18)及 5 例無其他危險因素或基礎(chǔ)疾病的單純腦血管狹窄患者(檢測號8-12號)。表118例Nfl全基因突變篩查的對象
權(quán)利要求
1.一種用于腦血管狹窄診斷的試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括以含有C. 541C>T 突變位點的NFl基因片段作為靶序列設(shè)計的特異性擴增人NFl基因的引物對，突變位點自 NFl基因編碼區(qū)第I位堿基起算。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的含有c.541C>T突變位點的NFl基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于所述的試劑盒中包含的引物對如下所示5’ GAAGGAAGTTAGAAGTTTGTGACA3’5’ CAATCGTATCCTTACCAGCCAT3’。
4.權(quán)利要求1-3任一項所述的試劑盒在制備腦血管狹窄診斷試劑中的應用。
5.權(quán)利要求1-3任一項所述的試劑盒在制備I型神經(jīng)纖維瘤合并腦血管狹窄診斷試劑中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于腦血管狹窄診斷的試劑盒，本發(fā)明所述試劑盒包括以含有c.541C>T突變位點的NF1基因片段作為靶序列設(shè)計的特異性擴增人NF1基因的引物對，自NF1基因編碼區(qū)第1位堿基起算。本發(fā)明通過研究發(fā)現(xiàn)一種與腦血管狹窄有關(guān)的Ⅰ型神經(jīng)纖維瘤NF1基因突變核苷酸序列，其與NF1中包含的相應核苷酸序列相比在以下位置發(fā)生了突變c.541C>T，自NF1基因編碼區(qū)第1位堿基起算，所述突變導致患者發(fā)生腦血管狹窄。該無義突變存在于所有合并腦血管狹窄的NF1家系患者，但不存在于NF1家系中正常人群中。本發(fā)明試劑盒的提出為散發(fā)的NF1患者潛在的腦血管狹窄進行超早期診斷及預防提供了新的技術(shù)手段。
文檔編號C12Q1/68GK103045741SQ20121057612
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月26日
發(fā)明者梁建濤, 鮑遇海, 凌鋒, 霍麗蓉 申請人:首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院