專利名稱：一株黃單胞菌突變體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一株黃單胞菌突變體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
纖維素是地球上儲量最豐富的可再生資源，通過化學(xué)或生物分解，可轉(zhuǎn)化為許多高附加值的產(chǎn)品，如乙醇、生物燃料等。微生物通過產(chǎn)生與分泌一系列纖維素酶來分解纖維素，產(chǎn)生中間產(chǎn)物葡萄糖，之后再進一步轉(zhuǎn)化為下游的其它化學(xué)物質(zhì)。與化學(xué)轉(zhuǎn)化法相比，微生物轉(zhuǎn)化更為簡單、低耗與環(huán)保。為了提高最終高附加值產(chǎn)品的產(chǎn)量，研究者致力于通過增加中間產(chǎn)物即可溶性糖的濃度來實現(xiàn)。常見的方法有篩選新的纖維素酶高表達菌株；基因工程改造增強現(xiàn)有菌株的纖維素酶表達水平，降低終產(chǎn)物的抑制效應(yīng)；增強菌株的纖維素酶向外分泌的效率等。但是，由于葡萄糖是絕大多數(shù)微生物的優(yōu)勢碳源，在微生物生長過程中會被優(yōu)先 利用。這會導(dǎo)致即使纖維素向葡萄糖轉(zhuǎn)化的效率被提升，但是絕大部分由纖維素分解產(chǎn)生的葡萄糖會被微生物優(yōu)先利用，不僅使葡萄糖累積量降低，還會抑制微生物分解纖維素的效率。因此，如何降低生物轉(zhuǎn)化過程中的中間產(chǎn)物被消耗的水平，提高發(fā)酵液中葡萄糖的累積濃度，對于纖維素原料的充分利用和生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)品產(chǎn)量的提高具有重大意義。很多植物病原體微生物可以合成與分泌多種纖維素酶，達到侵染植物的目的。黃單胞菌(Xanthomonas)是一種可引起植物“黑腐病”的重要的植物病菌,它能夠產(chǎn)生并分泌多種胞外酶，如纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶和胞外多糖。同時，它具備完整的葡萄糖利用與轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，可有效地利用葡萄糖、甘油、果糖等多種物質(zhì)作為碳源生長。已有研究證實，因其具有多個纖維素酶的編碼基因并高效分泌多種纖維素酶，黃單胞菌可利用纖維素作為單一碳源生長，實現(xiàn)纖維素的分解。因此，本發(fā)明中我們選擇了黃單胞菌為目標菌株。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的，就是為了降低生物轉(zhuǎn)化過程中的中間產(chǎn)物被消耗的水平，提高發(fā)酵液中葡萄糖的累積濃度，提供一株黃單胞菌突變體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案一株黃單胞菌突變體，命名為XC2460，其保藏編號為CGMCC No. 6583。上述黃單胞菌突變體的構(gòu)建方法，包括以下步驟A、通過兩步同源重組法敲除野生型黃單胞菌菌株Xcc 8004的XC_2460基因；B、分別使用上游引物對XC_2460-U-F/XC_2460-U-R和下游引物對XC_2460_D_F/XC_2460-D-R PCR擴增XC_2460的上游500bp片段和下游500bp片段；C、以上述兩個擴增的片段為模板，利用引物對XC_2460-U-F/XC_2460-D-R通過重疊PCR方法，將這兩個片段融合；D、將兩個融合片段與質(zhì)粒pK18mobsacB進行EcoR Ι/HindIII雙酶切，回收酶切片段后，用T4DNA連接酶進行連接，獲得質(zhì)粒pK18mobsacB-Xc2460 ；
E、最后，借助于輔助菌株E. coli S17-1 ( λ pir)接合的方式將質(zhì)粒PK18mobsacB-Xc2460轉(zhuǎn)入野生型黃單胞菌菌株Xcc 8004中；首先將接合子在含10 μ g/ml卡那霉素和25 μ g/ml利福平的平板上進行一次篩選，所得陽性克隆再轉(zhuǎn)入含25 μ g/ml利福平和5%蔗糖平板上進行二次篩選，得到成功敲除了 XC_2460基因的黃單胞菌突變體菌株,命名為XC2460。上述黃單胞菌突變體的構(gòu)建方法，其中，所述XC2460-U-F 的序列為GTAGGAATTCgtgggtttggcgacgttggat ；XC2460-U-R 的序列為AacacgccgatcagggtcagXC_2460-D-F 的序列為GGACCAGACCCTGGCACTGACCCTGATCGGCGTGTTttaccctggatt
tctacgccaagttc ；XC2460-D-R 的序列為GTAGAAGCTTttaccagaacaccgcgtacag。上述黃單胞菌突變體在纖維素生物轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。上述黃單胞菌突變體在纖維素生物轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用，是通過限制黃單胞菌的葡萄糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)來提高其在纖維素生物轉(zhuǎn)化過程中胞外葡萄糖的累積量，葡萄糖作為纖維素生物轉(zhuǎn)化過程中的中間產(chǎn)物，其向胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運量下降，實現(xiàn)了其在胞外的大量積累，提高了胞外的葡萄糖濃度，有利于后續(xù)的進一步轉(zhuǎn)化。本發(fā)明以黃單胞菌Xcc 8004菌株為原始菌株，利用基因工程的方法敲除了其葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白的編碼基因XC_2460，構(gòu)建了一株突變體，命名為XC2460。該XC2460菌株已于2012年9月19日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號)保藏，登記入冊編號為CGMCCNo. 6583，其分類命名為野油菜黃單胞菌，拉丁名為 Xanthomonas campestrispv. campestris 。本發(fā)明中涉及的XC2460菌株的正常生理功能和代謝與野生型相比，在纖維素酶活性、胞外多糖含量及豐富培養(yǎng)基中的生長速度等方面沒有明顯差異。但是該菌株在以葡萄糖為單一碳源的培養(yǎng)基中生長明顯比野生型緩慢，表明其葡萄糖的利用因葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白的缺失而收到影響。然而，該XC2460菌株在水解羧甲基纖維素鈉時，其胞外葡萄糖的累積濃度比野生型高出了 67%，單個細胞產(chǎn)生葡萄糖的量超出了野生型近5倍?！ひ罁?jù)本發(fā)明，通過限制纖維素分解微生物的葡萄糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)可顯著提高其胞外葡萄糖的累積量，從而增加后續(xù)進一步轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的產(chǎn)量。因此，本發(fā)明對于提高生物轉(zhuǎn)化過程的中間產(chǎn)物葡萄糖的濃度及后續(xù)高附加值化學(xué)物質(zhì)的產(chǎn)量具有重大的實際意義與廣闊的應(yīng)用前景。


圖I為突變體構(gòu)建方法示意圖；圖2為Xcc 8004野生型和XC2460突變體的PCR鑒定結(jié)果。PCR使用的引物為 XC2460-U-F/XC2460-D-R。WT 表示野生型；Ml 表示突變體；M 表示 Takara 250bp DNAMarker。圖3為野生型與突變體菌株的纖維素酶活性鑒定結(jié)果，脫色圈的大小表示纖維素酶活性的高低，WT表示野生型；M1表示突變體；圖4為野生型與突變體菌株的胞外多糖產(chǎn)量鑒定結(jié)果，克隆大小可表示胞外多糖產(chǎn)量的高低，WT表示野生型；M1表示突變體；圖5為野生型與突變體在豐富培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基)中培養(yǎng)時菌株的生長曲線；■表示野生型菌株Xcc 8004 ； ▲表示突變體菌株XC2460。圖6為野生型與突變體在基礎(chǔ)培養(yǎng)基(M63培養(yǎng)基含2. O %葡萄糖2g/L(NH4)2S04,13. 6g/L KH2P04，O. 2g/L MgS04，0. 5mg/LFeS04 · 7H20 和 2· 0%葡萄糖)中培養(yǎng)時菌株的生長曲線，■表示野生型菌株Xcc 8004 ;▲表示突變體菌株XC2460。圖7為野生型與突變體的羧甲基纖維素(CMC)分解能力測定與胞外葡萄糖濃度測定曲線。使用的培養(yǎng)基為M63培養(yǎng)基(M63培養(yǎng)基含2. 0%葡萄糖，28/1(見14)2304，13. 6g/LKH2P04,0. 2g/LMgS04，0. 5mg/L FeS04 ·7Η20 和 0. 5% CMC)。■表示野生型菌株Xcc 8004 ；▲表示突變體菌株XC2460。所有實驗重復(fù)三次取平均值?！ぞ唧w實施方法下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的描述，但本發(fā)明的實施不局限于此。如無特殊說明，以下使用的材料、試劑或試劑盒均可通過商業(yè)途徑購買。引物由Invitrogen公司(上海，中國)合成。PCR反應(yīng)使用KOD plus聚合酶(Τ0Υ0Β0,日本)擴增。限制性內(nèi)切酶與T4連接酶均購自Fermentas公司(加拿大)。質(zhì)粒DNA的提取與PCR產(chǎn)物純化均使用試劑盒(Qiagen，德國)。一、構(gòu)建突變體菌株XC2460。通過兩步同源重組法敲除野生型黃單胞菌菌株Xcc 8004的XC_2460基因。分別使用引物 XC_2460-U-F/XC_2460-U-R (XC2460-U-F =GTAGGAATTCgtgggtttggcgacgttggat ；XC2460-U-R aacacgccgatcagggtcag)和 XC_2460-D-F/XC_2460_D-R (XC2460-D-F =GGACCAGACCCTGGCACTGACCCTGATCGGCGTGTTttaccc tggatttctacgccaagttc ；XC2460-D-R GTAGAAGCTTttaccagaacaccgcgtacag), PCR 擴增 XC_2460 上游 500bp 片段(U500)和下游 500bp 片段(D500)。之后，以這兩個片段為模板，利用引物對XC_2460-U-F/XC_2460-D-R通過重疊PCR方法，將這兩個片段融合。將兩個融合片段與質(zhì)粒pK18mobSaCB質(zhì)粒進行EcoR I/HindIII雙酶切，回收酶切片段后用T4DNA連接酶進行連接，獲得質(zhì)粒pK18mObsaCB-XC2460。最后，借助與輔助菌株E. coli S17-1 ( λ pir)接合的方式將質(zhì)粒pK18mobsacB-Xc2460轉(zhuǎn)入野生型黃單胞菌菌株Xcc 8004中。首先將接合子在含10 μ g/ml卡那霉素和25 μ g/ml利福平的平板上進行一次篩選；陽性克隆再轉(zhuǎn)入含25 μ g/ml利福平和5%蔗糖平板上進行二次篩選。二次篩選得到的克隆經(jīng)PCR鑒定為成功敲除XC_2460基因的突變體菌株，命名為XC2460。基因敲除流程如圖I所示，與PCR鑒定結(jié)果見圖2。二、纖維素酶活性鑒定利用剛果紅染色法鑒定菌株的纖維素酶活性。挑取新鮮的野生型Xcc 8004和突變體XC2460的單克隆接種于IOml LB液體培養(yǎng)基中，置于28°C搖床上220rpm/min培養(yǎng)。當(dāng)生長至對數(shù)生長期時，取等量菌體用滅菌水洗滌后點于含有O. 5% CMC的固體M63培養(yǎng)基上(2g/L(NH4)2SO4,13. 6g/L KH2PO4,0. 2g/L MgSO4,0. 5mg/L FeS04 · 7Η20，0· 5% CMC 和 2%瓊脂粉)，28°C培養(yǎng)48個小時。之后用I. 0%剛果紅溶液染色30分鐘；用IM氯化鈉溶液脫色數(shù)次。觀察并測定脫色圈的直徑大小，結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示野生型菌株與突變體菌株的纖維素酶活性無顯著差異。
三、胞外多糖產(chǎn)量鑒定根據(jù)文獻測定黃單胞菌的胞外多糖含量。挑取新鮮的野生型Xcc 8004和突變體XC2460的單克隆接種于IOml LB液體培養(yǎng)基中，置于28°C搖床上220rpm/min培養(yǎng)。當(dāng)生長至對數(shù)生長期時，取等量菌體用滅菌水洗滌后點子含有2%甘油的固體LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)72個小時。之后見光培養(yǎng)48小時。觀察并測定克隆大小，結(jié)果見圖4。結(jié)果顯示野生型菌株與突變體菌株的胞外多糖產(chǎn)量無顯著差異。四、生長曲線測定使用全自動生長曲線測試儀測定野生型Xcc 8004和突變體XC2460的生長情況。挑取新鮮的野生型Xcc 8004和突變體XC2460的單克隆接種子IOml LB液體培養(yǎng)基中，28°C搖床上220rpm/min培養(yǎng)5天，實時測定細胞的吸光度(OD6J，結(jié)果如圖5、圖6所示。結(jié)果顯 示，在營養(yǎng)豐富培養(yǎng)基中，突變體菌株和野生型菌株的生長速度幾乎一致。但在以2%葡萄糖為單一碳源的M63 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中(2g/L(NH4)2SO4,13. 6g/L KH2PO4,0. 2g/L MgSO4,0. 5mg/LFeSO4 · 7H20和2%葡萄糖)，突變體菌株XC2460的生長速度要明顯落后于野生型菌株Xcc8004。這說明，突變體菌株由于其葡萄糖轉(zhuǎn)運基因的敲除影響了其向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運葡萄糖的量，導(dǎo)致其生長較野生型菌株緩慢。五、CMC分解測試與胞外葡萄糖產(chǎn)量測定利用氧化酶法測定葡萄糖濃度。挑取新鮮的野生型Xcc 8004和突變體XC2460的單克隆接種于 IOOOml 含有 O. 5% CMC 的 M63 基礎(chǔ)培養(yǎng)基(2g/L(NH4)2S04,13. 6g/L KH2PO4,O. 2g/L MgSO4,0. 5mg/LFeS04 ·7Η20 和 0· 5% CMC)中，于 28°C搖床上 220rpm/min 培養(yǎng) 5 天。每12小時，取IOml培養(yǎng)液于12，OOOrpm離心5分鐘，取上清測定葡萄糖含量。重復(fù)5次取平均值，結(jié)果見圖7。結(jié)果顯示，突變體菌株XC2460的胞外葡萄糖濃度比野生型菌株Xcc8004的胞外葡萄糖濃度高出了 67%。結(jié)合其生長曲線，可算出突變體菌株XC2460單個細胞產(chǎn)生葡萄糖的量比野生型Xcc 8004單個細胞高出了近5倍。因此，通過限制纖維素分解微生物的葡萄糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)可顯著提高其胞外葡萄糖的累積量，從而增加后續(xù)進一步轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的產(chǎn)量。
權(quán)利要求
1.一株黃單胞菌突變體，命名為XC2460，其保藏編號為CGMCC No. 6583。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的黃單胞菌突變體的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟 A、通過兩步同源重組法敲除野生型黃單胞菌菌株Xcc8004的XC_2460基因； B、分別使用上游引物對XC_2460-U-F/XC_2460-U-R和下游引物對XC_2460_D_F/XC_2460-D-R PCR擴增XC_2460的上游500bp片段和下游500bp片段； C、以上述兩個擴增的片段為模板，利用引物對XC_2460-U-F/XC_2460-D-R通過重疊PCR方法，將這兩個片段融合； D、將兩個融合片段與質(zhì)粒pK18mobSaCB進行EcoRΙ/HindIII雙酶切，回收酶切片段后，用T4DNA連接酶進行連接，獲得質(zhì)粒pK18mobsacB-Xc2460 ； E、最后，借助于輔助菌株E.coli S17-1 (λ pir)接合的方式將質(zhì)粒PK18mobsacB-Xc2460轉(zhuǎn)入野生型黃單胞菌菌株Xcc 8004中；首先將接合子在含10 μ g/ml卡那霉素和25 μ g/ml利福平的平板上進行一次篩選，所得陽性克隆再轉(zhuǎn)入含25 μ g/ml利福平和5%蔗糖平板上進行二次篩選，得到成功敲除了 XC_2460基因的黃單胞菌突變體菌株,命名為XC2460。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的黃單胞菌突變體的構(gòu)建方法，其特征在于所述XC2460-U-F的序列為GTAGGAATTCgtgggtttggcgacgttggat ； XC2460-U-R 的序列為Aacacgccgatcagggtcag ； XC_2460-D~F的序列為GGACCAGACCCTGGCACTGACCCTGATCGGCGTGTTttaccctggatttctacgccaagttc ； XC2460-D-R 的序列為GTAGAAGCTTttaccagaacaccgcgtacag。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的黃單胞菌突變體在纖維素生物轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的黃單胞菌突變體在纖維素生物轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用，其特征在于通過限制黃單胞菌的葡萄糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)來提高其在纖維素生物轉(zhuǎn)化過程中胞外葡萄糖的累積量，葡萄糖作為纖維素生物轉(zhuǎn)化過程中的中間產(chǎn)物，其向胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運量下降，實現(xiàn)了其在胞外的大量積累，提高了胞外的葡萄糖濃度，有利于后續(xù)的進一步轉(zhuǎn)化。
全文摘要
本發(fā)明提供了一株黃單胞菌突變體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。本發(fā)明通過敲除葡萄糖轉(zhuǎn)運基因，限制葡萄糖的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運系統(tǒng)來改善葡萄糖胞外的累積量。以植物病原微生物黃單胞菌為目標菌株，敲除其主要的葡萄糖轉(zhuǎn)運基因，構(gòu)建了一株突變體，命名為XC2460，其保藏編號為CGMCC No.6583。在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中，突變體與野生型在性狀方面沒有差異；但在以葡萄糖為單一碳源的培養(yǎng)基中，突變體生長明顯比野生型緩慢。同時，在水解羧甲基纖維素時，突變體的胞外葡萄糖累積濃度比野生型高出了67％，單個細胞產(chǎn)生葡萄糖的量比野生型細胞高出近5倍。本發(fā)明對提高纖維素生物轉(zhuǎn)化過程中葡萄糖的累積量具有重大的意義和廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號C12R1/64GK102925399SQ20121040731
公開日2013年2月13日 申請日期2012年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月23日
發(fā)明者梁如冰, 馬辰, 劉建華 申請人:上海交通大學(xué)