一種DNA Marker的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種DNA?Marker的制備方法，其特征在于：在制備過程中采用DNA序列為SEQ?ID?NO.1和DNA序列為SEQ?ID?NO.2的兩種質(zhì)粒中的一種或兩種。本發(fā)明DNA?Marker制備方法穩(wěn)定性高，可以保證批次之間重復(fù)性的生產(chǎn)，從而實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)；本方法生產(chǎn)過程簡(jiǎn)單，前期載體構(gòu)建好后，后期Marker生產(chǎn)成本很低，生產(chǎn)量可大可小，存放非常方便。
【專利說明】—種DNA Marker的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)與基因工程領(lǐng)域，涉及DNA Marker和質(zhì)粒，尤其是一種DNAMarker的制備方法及兩種質(zhì)粒和質(zhì)粒的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]基因工程(genetic engineering)又稱基因拼接技術(shù)和DNA重組技術(shù),是以分子遺傳學(xué)為理論基礎(chǔ)，以分子生物學(xué)和微生物學(xué)的現(xiàn)代方法為手段，將不同來源的基因按預(yù)先設(shè)計(jì)的藍(lán)圖，在體外分子水平上對(duì)DNA進(jìn)行切割、連接、轉(zhuǎn)化等一系列操作的過程，構(gòu)建雜種DNA分子?；蚬こ淌窃诜肿由飳W(xué)和分子遺傳學(xué)的基礎(chǔ)上綜合發(fā)展起來，誕生于20世紀(jì)70年代的一門嶄新的生物科學(xué)技術(shù)。盡管該技術(shù)是一門年輕的技術(shù)，但其在生命科學(xué)、生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的研究和應(yīng)用中起到了非常巨大的作用?；蚬こ碳夹g(shù)為基因的結(jié)構(gòu)和功能的研究提供了有力的手段。
[0003]在DNA的體外操作中，涉及到DNA分子的擴(kuò)增、純化、切割、連接等許多過程，其中，最基礎(chǔ)而且應(yīng)用非常廣泛的一項(xiàng)操作是DNA擴(kuò)增和電泳。DNA擴(kuò)增是指通過PCR (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)強(qiáng)大的擴(kuò)增能力，在DNA聚合酶的作用下，根據(jù)特定的模板設(shè)計(jì)特定的引物擴(kuò)增出不同大小的DNA片段。DNA電泳是指利用DNA在中性緩沖液中帶負(fù)電的性質(zhì)，在一定的電場(chǎng)作用下，在特定的支持介質(zhì)中(比如瓊脂糖凝膠)，不同大小的DNA片段由于帶有的電荷量以及空間位阻等的不同而在支持介質(zhì)中具有不同的泳動(dòng)速度從而得以分離的過程。DNA擴(kuò)增和電泳是基因工程中最基本的技術(shù)。
[0004]在凝膠電泳中，在一定的范圍內(nèi)，具有相同構(gòu)型的DNA在相同的凝膠濃度和電場(chǎng)強(qiáng)度下，其遷移率與DNA分子的大小(通常也就是DNA片段的長(zhǎng)度)呈線性關(guān)系。因此，可以用一組分子量(長(zhǎng)度)已知的DNA片段混合物來指示未知DNA分子的大小。這種由一組分子量已知的，電泳后按其分子量大小和遷移率的不同可以在凝膠上形成一個(gè)DNA片段分布梯度，從而可以指示電泳過程中未知DNA樣品的分子量的DNA片段混合物就成為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，簡(jiǎn)稱DNA Marker。DNA Marker的應(yīng)用非常廣泛，是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的常用試劑。盡管實(shí)現(xiàn)DNA Marker的原理非常簡(jiǎn)單,但要制作低成本高質(zhì)量的DNA Marker還是有相當(dāng)?shù)碾y度。目前，許多生物公司也為此開發(fā)了多種針對(duì)不同應(yīng)用的，具有不同分子量范圍的 DNA Marker 產(chǎn)品。
[0005]在DNA Marker的制備上，目前主要有兩種方法:酶切法和PCR法。
[0006]酶切法分為以天然來源的基因組DNA的限制性酶切和基于人工構(gòu)建載體的限制性酶切。天然來源的基因組DNA酶切是指分離某種來源固定、背景信息清晰的基因組DNA分子，用一種或幾種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化。從而產(chǎn)生一系列DNA片段組合。用該方法生產(chǎn)的最經(jīng)典的DNA Marker是Lambda DNA/Hind III Marker, Lambda卩遼菌體基因組DNA經(jīng)過內(nèi)切酶Hind III消化后，產(chǎn)生125bp至23130bp大小的8條條帶。用這種方法生產(chǎn)DNAMarker制作方便，在DNA來源方便的情況下，成本也比較低。但其缺點(diǎn)也是顯而易見的:
1、條帶距離不均勻，由于來自天然的基因組，DNA分子上的酶切位點(diǎn)的位置也是天然的，是不可控的，因此DNA Marker中有的兩個(gè)條帶之間相距很遠(yuǎn)，不能清晰地指示該區(qū)域內(nèi)的未知DNA分子量情況，有的兩個(gè)條帶之間距離很近，難以清晰地分開；2、基于同樣的原因，條帶的分子量未能是整數(shù)；3、條帶亮度嚴(yán)重不均一，由于對(duì)應(yīng)片段在基因組中的拷貝數(shù)不可控，分子量大的條帶的亮度與分子量較小的條帶的亮度相差很遠(yuǎn)，以Lambda DNA/Hind IIIMarker為例，最大的條帶23130bp與最小的條帶125bp在亮度上要相差上百倍，電泳過程中往往導(dǎo)致大條帶為實(shí)現(xiàn)良好分離而小條帶已經(jīng)嚴(yán)重?cái)U(kuò)散導(dǎo)致亮度很低甚至不可見。[0007]PCR法是根據(jù)特定的模板設(shè)計(jì)特定的引物擴(kuò)增出一系列不同大小的DNA片段，通過純化、定量和組合即形成了 DNA Marker0該方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、制作方便，各條帶的大小控制方便，不同大小的條帶可以靈活的組合成不同的DNA Marker。但其成本較高，長(zhǎng)片段擴(kuò)增困難或效率不高，條帶不夠銳利，條帶之間的亮度難以完全一致，重復(fù)性差，穩(wěn)定性不高，不易長(zhǎng)時(shí)期保存，且保存環(huán)境在-20度，不能保存在室溫條件下，不便于使用。
[0008]為此，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，人們想到用人工構(gòu)建的DNA分子(比如質(zhì)粒)進(jìn)行限制性酶切來制備DNA Marker0通過一次性將所需要的片段以設(shè)計(jì)好的酶切方式連接到載體中，通過發(fā)酵培養(yǎng)和質(zhì)粒DNA提取，適當(dāng)酶切后既可獲得大量目標(biāo)DNA片段。這種方法的優(yōu)勢(shì)在于可以通過大腸桿菌的培養(yǎng)獲得大量廉價(jià)的質(zhì)粒DNA，通過酶切方法獲得的片段電泳時(shí)條帶銳利，生產(chǎn)重復(fù)性高，穩(wěn)定性高，可長(zhǎng)期保存在室溫狀態(tài)，一旦質(zhì)粒構(gòu)建好，后續(xù)生產(chǎn)成本低。
[0009]酶切的方法又分為部分酶切和完全酶切。部分酶切是將具有某種單位長(zhǎng)度而且?guī)в性O(shè)計(jì)好的酶切位點(diǎn)的片段順序連接到載體中，通過控制酶的活性，溫度和反應(yīng)時(shí)間等酶切條件，實(shí)現(xiàn)載體的部分酶切，酶切產(chǎn)物將是質(zhì)粒上該單位長(zhǎng)度的倍數(shù)的片段。該方法是用于以單位長(zhǎng)度遞增的DNA Marker (比如IOObp DNA Ladder,條帶為IOObp, 200bp, 300bp等依次遞增)的制備，其優(yōu)點(diǎn)是制備方便，條帶分布均勻，但其缺點(diǎn)是部分酶切的程度難以掌握，條帶亮度與酶切的完全程度相關(guān)。
[0010]完全酶切是將設(shè)計(jì)好的一組不同大小的DNA片段克隆到特定的載體中，經(jīng)過大腸桿菌擴(kuò)增后，將純化得到的質(zhì)粒DNA通過完全酶切，獲得相應(yīng)大小的DNA片段。該方法制備的DNA Marker質(zhì)量較好。
[0011]綜上所述，在目前DNA Marker的生產(chǎn)過程中，主要采用的PCR擴(kuò)增的方式，雖然該方法簡(jiǎn)單，但是一種勞動(dòng)密集型的，難以保證批次之間重復(fù)性的生產(chǎn)，從而難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，總體成本較高的方法。酶切法中的人工構(gòu)建DNA分子的酶切是將來技術(shù)發(fā)展的主流。
[0012]通過檢索，發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明專利申請(qǐng)相關(guān)的如下專利公開文獻(xiàn):
[0013]1、一種用于DNA Marker制備的質(zhì)粒及其構(gòu)建方法與用途(CN102337284A)，本發(fā)明所述質(zhì)粒含有組成目標(biāo)DNA ? Marker的各大小不同的DNA片段，各大小不同的DNA ?Marker片段在所述質(zhì)粒中的拷貝數(shù)為一個(gè)以上，且各DNA? Marker片段之間含有同樣的單酶切位點(diǎn)。本發(fā)明還提供了低成本快速制備DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)的方法，用該方法生產(chǎn)的DNA ?Marker具有條帶銳利,亮度均一或可隨意控制,批次間重復(fù)性好等特點(diǎn)。
[0014]2、AMF群落多樣性巢式PCR-DGGE檢測(cè)中DNA Marker的制備方法(CN102146370A)，其技術(shù)方案是提取土壤DNA，DGGE分析，克隆轉(zhuǎn)化，驗(yàn)證條帶在DGGE膠片上的位置，制作AMF群落多樣性巢式PCR-DGGE ? Marker，使用NS31-GC和GloI為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)合序列分析結(jié)果并命名使用。本發(fā)明在AMF群落結(jié)構(gòu)的Nested ? PCR-DGGE研究中有重要的應(yīng)用價(jià)值?？煽s短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，尤其適用實(shí)驗(yàn)樣品量大的實(shí)驗(yàn)過程。依照本發(fā)明可以開發(fā)出一系列研究AMF群落的DNA ? Marker,使得巢式PCR-DGGE技術(shù)在AMF分子群落研究中更加適用、快捷、準(zhǔn)確。
[0015]通過對(duì)比，本發(fā)明專利申請(qǐng)與上述的專利公開文獻(xiàn)存在本質(zhì)的不同。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種可用于生產(chǎn)成本低、質(zhì)量高的DNA Marker的制備方法及兩種質(zhì)粒和質(zhì)粒的構(gòu)建方法,該DNA Marker制備方法穩(wěn)定性高，可以保證批次之間重復(fù)性的生產(chǎn)，從而實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)；使用該方法可以根據(jù)自身需要制備具有不同條帶的Marker，針對(duì)性強(qiáng)，靈活度高，對(duì)于條帶大小可控；使用該方法可以大大降低生產(chǎn)成本，克服使用PCR法時(shí)的長(zhǎng)片段擴(kuò)增效率不高的困難，且重復(fù)性高，穩(wěn)定性高，可室溫保存，便于使用；使用該方法可以克服部分酶切難以掌握程度的困難；使用該方法所獲得的DNA Marker產(chǎn)物使用時(shí)具有條帶均一、銳利、條帶間亮度均一'丨生極佳的特點(diǎn)，可以廣泛應(yīng)用于DNA電泳過程中的分子量指示。
[0017]本發(fā)明實(shí)現(xiàn)目的的技術(shù)方案是:
[0018]采用PCR技術(shù)擴(kuò)增出所要Marker各片段條帶，并在各條帶兩端加上不同的酶切位點(diǎn)(同時(shí)在各片段的5’端均帶有Xmn I (或BamH I)酶切位點(diǎn))，通過酶切方式將各片段進(jìn)行連接，然后用首片段5’端引物和尾片段3’端引物以連接產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，以此類推，最終將所有Marker片段連接成為一條大片段，將其連接進(jìn)入載體后，獲得我們所需要的重組質(zhì)粒。以Xmn I (或BamH I)對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切，最終得到所需要的DNA分子Marker。
[0019]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果為:
[0020]1、本發(fā)明DNA Marker制備方法方法穩(wěn)定性高，可以保證批次之間重復(fù)性的生產(chǎn)，從而實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)；本方法生產(chǎn)過程簡(jiǎn)單，前期載體構(gòu)建好后，后期Marker生產(chǎn)成本很低，生產(chǎn)量可大可小，存放非常方便。
[0021]2、本發(fā)明DNA Marker制備方法根據(jù)現(xiàn)有的DL2000設(shè)計(jì)出所需要的DNA Marker的片段并加以改動(dòng)，另外又在其基礎(chǔ)上加上了一條3000bp的條帶，使得此DNA Marker更具有實(shí)用價(jià)值。
[0022]3、本發(fā)明DNA Marker制備方法所獲得的DNA Marker產(chǎn)物使用時(shí)具有條帶均一、銳利、條帶間亮度均一性極佳的特點(diǎn)，可以廣泛應(yīng)用于DNA電泳過程中的分子量指示，而且可長(zhǎng)期存放于室溫條件下，便于使用。
[0023]4、本發(fā)明通過在載體構(gòu)建過程中合理搭配不同大小的DNA片段及其拷貝數(shù)，使得質(zhì)粒DNA通過完全酶切后，一次性得到DNA Marker中各條帶，且各條帶之間的亮度基本一致，從而實(shí)現(xiàn)DNA Marker在凝膠上的均一'丨生。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1是本發(fā)明pCN1850酶切后DNA Marker組成片段大小與拷貝數(shù)的關(guān)系示意圖；
[0025]圖2是本發(fā)明pCN1050酶切后DNA Marker組成片段大小與拷貝數(shù)的關(guān)系示意圖；[0026]圖3是本發(fā)明pCN1850與pCN1050酶切后DNA Marker組成片段大小與拷貝數(shù)總和的關(guān)系不意圖；
[0027]圖4是本發(fā)明用于制備DNA Marker的質(zhì)粒DNA及其中的片段大小與拷貝數(shù)關(guān)系示意圖；其中，a表示質(zhì)粒pCN1850 ；b表示質(zhì)粒pCN1050 ；
[0028]圖5是本發(fā)明PCN1850外加各片段之間相連的示意圖；
[0029]圖6是本發(fā)明PCN1050外加各片段之間相連的示意圖；
[0030]圖7是本發(fā)明實(shí)施例中所述DNA Marker瓊脂糖凝膠電泳效果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0031]下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳述，以下實(shí)施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0032]本發(fā)明中所使用的方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；本發(fā)明中所使用的試劑，如無特殊說明，均為常規(guī)試劑。
[0033]下列實(shí)施例中未注明具體條件的試驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆:實(shí)驗(yàn)指南中所述的條件，或按照制造商所建議的條件。
[0034]本發(fā)明根據(jù)準(zhǔn)備生產(chǎn)的DNA Marker的條帶組成一個(gè)大片段，與特定載體相連后，使得兩種重組質(zhì)粒可以分別用單一的酶釋放組成DNA Marker中的各片段，對(duì)載體中各片段的拷貝數(shù)設(shè)計(jì)使得酶切后得到的各條帶的量基本一致。然后，將構(gòu)建好的質(zhì)粒擴(kuò)增后，用完全酶切的方法制備DNA Marker。
[0035]本發(fā)明提供了兩個(gè)DNA Marker制備的質(zhì)粒,所述質(zhì)粒符合下列要求:
[0036]含有組成目標(biāo)DNA Marker的各大小不同的DNA Marker片段(為DNA片段)，各大小不同的DNA Marker片段在所述質(zhì)粒中的拷貝數(shù)為一個(gè)以上(包括一個(gè))，且同一質(zhì)粒上各DNA Marker片段之間含有同樣的單酶切位點(diǎn)。
[0037]目標(biāo)DNA Marker的片段大小可以根據(jù)需求設(shè)計(jì)。
[0038]所述單酶切位點(diǎn)可以是II型限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)。所述的酶切位點(diǎn)應(yīng)該是任意片段內(nèi)不存在多余的識(shí)別位點(diǎn)而且不與載體構(gòu)建過程中的酶相沖突的II型限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，且應(yīng)該選擇酶切效果好的酶切位點(diǎn)。且這些單酶切位點(diǎn)僅存在于各DNAMarker片段之間，不 存在于各DNA Marker片段內(nèi)部。由于單一的酶釋放即能得到組成目標(biāo)DNA Marker的各片段，因此，質(zhì)粒中每?jī)蓚€(gè)相鄰的所述單酶切位點(diǎn)之間的堿基數(shù)均與目標(biāo)DNA Marker中某一 DNA片段的堿基數(shù)相等。滿足上述設(shè)計(jì)要求的質(zhì)粒能用單一的酶釋放得到組成目標(biāo)DNA Marker的各片段。
[0039]根據(jù)現(xiàn)有的DL2000設(shè)計(jì)出所需要的DNA Marker的片段并加以改動(dòng)，另外又在其基礎(chǔ)上加上了一條3000bp的條帶，使得此DNA Marker更具有實(shí)用價(jià)值。為了構(gòu)建出這樣的質(zhì)粒，我們?cè)谠械氖荏w質(zhì)粒上連接上含有組成目標(biāo)DNA Marker的各大小不同的DNAMarker片段,先在體外將設(shè)計(jì)好的各DNA Marker片段連接成為一條單獨(dú)的長(zhǎng)鏈DNA片段，再將其與載體相連，隨后進(jìn)行轉(zhuǎn)化。得到所需要的重組質(zhì)粒。
[0040]本發(fā)明進(jìn)一步公開了符合上述設(shè)計(jì)要求的用于DNA Marker制備的質(zhì)粒的制備方法。
[0041]本發(fā)明是在體外先進(jìn)行連接反應(yīng),將設(shè)計(jì)好的帶有單酶切位點(diǎn)的DNA Marker的片段進(jìn)行連接，隨后進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到一整條片段連接到受體載體中。
[0042]該質(zhì)粒的制備方法具體包括如下的步驟:
[0043](1)根據(jù)目標(biāo)DNA Marker的片段組成設(shè)計(jì)目標(biāo)質(zhì)粒，設(shè)計(jì)的目標(biāo)質(zhì)粒滿足下列要求:含有組成目標(biāo)DNA Marker的各大小不同的DNA片段，各大小不同的DNA Marker片段在所述質(zhì)粒中的拷貝數(shù)為一個(gè)以上(包括一個(gè))。
[0044](2)各DNA Marker片段上含有同樣的單酶切位點(diǎn)，在各片段的兩端含有不同于各片段上的單酶切位點(diǎn)，各片段5’端帶有的酶切位點(diǎn)與前一片段3’端帶有的酶切位點(diǎn)一樣，且各片段兩端的酶切位點(diǎn)在各片段上不能夠出現(xiàn)。
[0045](3)將這些DNA Marker片段先進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到單一的目的條帶，回收后進(jìn)行酶切反應(yīng)，將這些片段依次進(jìn)行連接，隨后進(jìn)行PCR反應(yīng)，最終得到一條1838bp的片段，且在各片段中都含有單一的酶切位點(diǎn)Xmn I。
[0046](4)選擇高拷貝數(shù)質(zhì)粒作為骨架載體，且該骨架載體上帶有唯一的一個(gè)Xmn I酶切位點(diǎn)，隨后將1838bp片段連接進(jìn)入骨架載體，構(gòu)建得到一個(gè)含有6個(gè)Xmn I酶切位點(diǎn)的
重組質(zhì)粒。
[0047]從圖4可以看出，a質(zhì)粒共有6個(gè)條帶,受體質(zhì)粒本身是一個(gè)大小為3000bp的質(zhì)粒，從受體質(zhì)粒上找到了一個(gè)Xmn I單酶切位點(diǎn),DNA Marker片段中設(shè)計(jì)時(shí)也采用了 Xmn I單酶切位點(diǎn)，最終用Xmn I單酶切消化。
[0048]從圖4可以看出，b質(zhì)粒共有6個(gè)條帶,受體質(zhì)粒本身是一個(gè)大小為3000bp的質(zhì)粒，DNA Marker片段中設(shè)計(jì)時(shí)采用了 BamH I單酶切位點(diǎn)，受體質(zhì)粒不含有BamH I酶切位點(diǎn)，最終用BamH I單酶切消化。
[0049]b質(zhì)粒的制備與第一個(gè)質(zhì)粒的制備相似，只有片段種類和單酶切位點(diǎn)不同，且b質(zhì)粒的單酶切位點(diǎn)不能夠存在于骨架載體上。b質(zhì)粒的制備在PCR反應(yīng)后最終得到一條1072bp的片段，在各片段中含有的單一酶切位點(diǎn)是BamH I，將這條片段與骨架載體連接后，構(gòu)建得到一個(gè)含有6個(gè)BamH I酶切位點(diǎn)的重組質(zhì)粒。
[0050]步驟(1)中目標(biāo)質(zhì)粒的設(shè)計(jì)還可進(jìn)一步滿足之前所述的各種要求。
[0051]步驟(2)中，各DNA Marker片段兩端所含的酶切位點(diǎn)不同于所述單酶切位點(diǎn)，且同一片段的兩端酶切位點(diǎn)也不可相同。即每一片段上含有三個(gè)不同的單酶切位點(diǎn)，而后一個(gè)片段的5’端的酶切位點(diǎn)與前一片段3’端帶有的酶切位點(diǎn)相同，且每一片段中間都帶有所述單酶切位點(diǎn)，該單酶切位點(diǎn)在每一個(gè)片段上都與5’端酶切位點(diǎn)相鄰。各片段中間不能帶有外加的各酶切位點(diǎn)。
[0052]步驟(3)中，各片段通過PCR及回收后，進(jìn)行酶切反應(yīng)，將前一片段的3’端和后一片段的5’端分別進(jìn)行酶切，回收后進(jìn)行連接反應(yīng)，隨后用前一片段的上游引物和后一片段的下游引物以連接產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR，同理，將所有片段連接為一條長(zhǎng)為1838bp的片段。
[0053]步驟(4)中，所述高拷貝數(shù)質(zhì)粒是指可以存在于細(xì)菌體內(nèi)的，其復(fù)制與細(xì)菌基因組DNA的復(fù)制不關(guān)聯(lián)的，在單個(gè)細(xì)菌體內(nèi)可以達(dá)到300個(gè)拷貝數(shù)以上的質(zhì)粒。
[0054]本發(fā)明專利申請(qǐng)還提供了一種DNA Marker的制備方法,包括下列步驟:
[0055](1)構(gòu)建前述用于制備DNA Marker的質(zhì)?；蛘咧苯硬捎脴?gòu)建好的用于制備DNAMarker的質(zhì)粒；
[0056](2)將步驟⑴所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)入合適的宿主菌后擴(kuò)增質(zhì)粒；[0057](3)分離質(zhì)粒并采用所述單酶切位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的限制性內(nèi)切酶完全酶切質(zhì)粒獲得DNAMarker。
[0058]所述的宿主菌可以是大腸桿菌。
[0059]所述完全酶切法制備DNA Marker是指用一個(gè)或多個(gè)限制性內(nèi)切酶對(duì)質(zhì)粒DNA過量消化，使得質(zhì)粒上的每一個(gè)該酶的識(shí)別位點(diǎn)均被切開，釋放相應(yīng)大小的片段。
[0060]當(dāng)采用實(shí)施例例舉的序列為SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2的質(zhì)粒制備DNA Marker時(shí)，可將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌復(fù)制，并分別采用Xmn I和BamH I對(duì)兩種質(zhì)粒進(jìn)行完全酶切獲得DNA Marker。
[0061]如無特殊說明，以下實(shí)施例中的Restriction Enzyme表示限制性內(nèi)切酶，BSA表示牛血清白蛋白。
[0062]實(shí)施例1
[0063]一、構(gòu)建第一種高效穩(wěn)定重組質(zhì)粒
[0064]本實(shí)施例講述一種用于制備DNA Marker的質(zhì)粒的構(gòu)建，該質(zhì)粒包含了 D3000Marker 中所含有的 6 個(gè)條帶，分別為 2000bp，I IOObp, 750bp, 500bp, 250bp X 2 ?
[0065]如未特別注明，本實(shí)施例中所用的生化試劑以及PCR或核酸提取與純化試劑盒等均來自沙船(天津)生物科技發(fā)展有限公司；所有引物合成均由北京博邁德科技發(fā)展有限公司合成；所有限制性內(nèi)切酶均采用普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司。
[0066]如未特別注明，本實(shí)施例中所用的各DNA片段PCR反應(yīng)體系為:
[0067]`
【權(quán)利要求】
1.一種DNA Marker的制備方法，其特征在于:在制備過程中采用DNA序列為SEQ IDN0.1和DNA序列為SEQ ID N0.2的兩種質(zhì)粒中的一種和兩種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNAMarker的制備方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)在制備過程中采用DNA序列為SEQID N0.1和DNA序列為SEQ ID N0.2的兩種質(zhì)粒; (2)將步驟(1)所述兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主菌后擴(kuò)增質(zhì)粒； (3)分離質(zhì)粒并采用單酶切位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的限制性內(nèi)切酶完全酶切獲得DNAMarker所需片段，并將兩種質(zhì)粒完全酶切的產(chǎn)物按照2: I的濃度比例混合，即獲得DNA Marker。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的DNAMarker的制備方法，其特征在于:所述步驟⑵中宿主菌為大腸桿菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的DNAMarker的制備方法，其特征在于:所述步驟⑶中限制性內(nèi)切酶為:DNA序列為SEQ ID N0.1的質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶為Xmn I，DNA序列為SEQ IDN0.2的質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶BamH I。
5.一種用于DNA Marker制備的質(zhì)粒，其特征在于:所述質(zhì)粒的DNA序列為SEQ ID N0.1和 SEQ ID N0.2。
6.—種如權(quán)利要求5所述的用于DNA Marker制備的質(zhì)粒的構(gòu)建方法,其特征在于:包括如下步驟: (1)根據(jù)目標(biāo)DNAMarker的片段組成設(shè)計(jì)目標(biāo)質(zhì)粒，設(shè)計(jì)的目標(biāo)質(zhì)粒滿足下列要求:含有組成目標(biāo)DNA Marker的各大小不同的DNA片段，各大小不同的DNA Marker片段在所述質(zhì)粒中的拷貝數(shù)為一個(gè)以上，且各DNA Marker片段之間含有同樣的單酶切位點(diǎn)； (2)制備組成DNAMarker的各個(gè)條帶的DNA Marker前體片段，在每個(gè)DNA Marker片段兩端加上一個(gè)不同于單酶切位點(diǎn)的酶切位點(diǎn)，且同一片段的兩端酶切位點(diǎn)不可相同，后一片段的5’端酶切位點(diǎn)與前一片段的3’端酶切位點(diǎn)相同； (3)將DNAMarker片段依次進(jìn)行連接后采用第一片段的上游引物和最后一個(gè)片段的下游引物進(jìn)行PCR，從而得到所需要的大片段，在大片段中含有所述單酶切位點(diǎn)個(gè)數(shù)為最終得到片段的個(gè)數(shù)； (4)在第一個(gè)質(zhì)粒構(gòu)建中單酶切位點(diǎn)在骨架載體中存在一個(gè)，第二個(gè)質(zhì)粒構(gòu)建中單酶切位點(diǎn)不存在于骨架載體中； (5)選擇高拷貝數(shù)質(zhì)粒作為骨架載體，將體外連接好的片段與骨架載體進(jìn)行連接，形成可以用于DNA Marker制備的質(zhì)粒。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用于DNAMarker制備的質(zhì)粒的構(gòu)建方法,其特征在于:所述步驟(3)具體步驟為: 分別以步驟⑵獲得的各DNA Marker前體片段為起點(diǎn)，反復(fù)利用PCR的方式獲得含有各DNA Marker前體片段的片段，直至各DNA Marker前體片段連成一條大片段，然后將此片段連接入步驟(5)的骨架載體中，形成可以用于DNA Marker制備的質(zhì)粒。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用于DNAMarker制備的質(zhì)粒的構(gòu)建方法,其特征在于:所述各片段兩端酶切位點(diǎn)及單酶切位點(diǎn)選自II型限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用于DNAMarker制備的質(zhì)粒的構(gòu)建方法,其特征在于:所述單酶切位點(diǎn)選自Xmn !,BamH I, Hind III或EcoR I。
10.根據(jù)權(quán)利要求6-9任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的用于DNAMarker制備的質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于:步驟(1)設(shè)計(jì)的目標(biāo)質(zhì)粒中，所述單酶切位點(diǎn)僅存在于各DNA Marker片段之間，不存在于各DNA Marker片段內(nèi)部，且質(zhì)粒中每?jī)蓚€(gè)相鄰的所述單酶切位點(diǎn)之間的距離均對(duì)應(yīng)等于目標(biāo)DNA Marker中某一 DNA片段的大??； 各DNA Marker片段5’端和3’端帶有不同于所述單酶切位點(diǎn)的酶切位點(diǎn)，同一片段的兩端的酶切位點(diǎn)不相 同，且后一片段的5’端酶切位點(diǎn)與前一片段的3’端酶切位點(diǎn)相同。
【文檔編號(hào)】C12N15/66GK103667264SQ201210316670
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2012年8月31日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月31日
【發(fā)明者】劉忱, 高潔, 張京, 安娜, 程倩 申請(qǐng)人:沙船（天津）生物科技發(fā)展有限公司