專利名稱：一種真菌漆酶誘導(dǎo)活性化合物及其發(fā)酵制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于化合物分離純化技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種微生物來源的真菌漆酶誘導(dǎo)活性化合物的發(fā)酵制備、高純度漆酶誘導(dǎo)活性化合物的純化工藝及其在真菌漆酶誘導(dǎo)方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
漆酶(Laccase，EC I. 10. 3. 2)是一類含銅的多酚氧化酶，能夠催化多種酚類和非酚類化合物氧化，同時伴隨有分子氧還原成水。漆酶作用底物廣泛、催化效率高，在生物制漿和漂白、食品風(fēng)味改良、飼料營養(yǎng)改善、人工合成染料脫色、紡織纖維軟化細(xì)化、新型藥物開發(fā)、生物傳感器制造及新型能源開發(fā)等領(lǐng)域具有潛在重要應(yīng)用價值(Arora DS, SharmaRK (2010) Ligninolytic fungal laccases and their biotechnological applications.Appl Biochem Biotechnol 160:1760 - 1788),近年來成為國際酶工程學(xué)和環(huán)境科學(xué)交叉領(lǐng)域研究的一個熱點。漆酶廣泛存在于高等真菌(特別是擔(dān)子菌)中。多數(shù)真菌分泌的天然漆酶存在產(chǎn)量低、發(fā)酵周期長、后處理繁瑣等缺點，無法滿足工業(yè)化應(yīng)用的需要。目前，用來提高漆酶的生物合成產(chǎn)量主要有兩種方法重組表達和添加化合物誘導(dǎo)。然而，重組表達產(chǎn)量依然較低、且生產(chǎn)成本高、后處理難度大，使漆酶生產(chǎn)的成本大大提高，限制了漆酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用；有效的誘導(dǎo)劑多為芳香類化合物或重金屬離子，其有環(huán)境毒性并且價格昂貴，有效作用濃度大，通常在10_，10_2摩爾級別，易造成環(huán)境污染，生產(chǎn)后的發(fā)酵液需要脫毒處理，提高了生產(chǎn)成本，同樣無法突破漆酶產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的瓶頸。因此，尋找一種清潔、高效的漆酶生產(chǎn)方式是推進漆酶產(chǎn)業(yè)化進程的迫切需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為避免上述現(xiàn)有技術(shù)所存在的不足之處，提供一種高效真菌漆酶誘導(dǎo)活性化合物(名稱為3-羥基-2-辛基-戊二酸)的發(fā)酵制備和分離純化工藝及其在真菌漆酶誘導(dǎo)發(fā)酵方面的應(yīng)用。本發(fā)明的目的之一是提供一種對真菌漆酶具有高誘導(dǎo)活性的化合物，該化合物有如下分子式
權(quán)利要求
1.一種對真菌漆酶具有高誘導(dǎo)活性的化合物，其特征在于，該化合物有如下分子式
2.如權(quán)利要求I所述的活性化合物在誘導(dǎo)真菌漆酶合成方面的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求I所述的活性化合物的發(fā)酵制備方法，其特征在于使用的發(fā)酵菌株為Gongronella sp.，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得發(fā)酵液，所述發(fā)酵液經(jīng)分離純化后獲得權(quán)利要求I所述的純活性化合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的活性化合物的發(fā)酵制備方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)是指將Gongronella sp.接種在經(jīng)滅菌的ρΗ4· 0^7. O的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于溫度25 31°C、搖床轉(zhuǎn)速10(Tl50rpm條件下培養(yǎng)3 7天后通過紗布過濾收集發(fā)酵液備用；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為每升水中含10 20g蔗糖、I 2g DL-天冬酰胺、O. 7 I. 5g ΚΗ2Ρ04、0· 2 O. 6g MgSO4 · 7H20、O.02 O. 15g Na2PO4 · 7Η20、0· 0Γ0. 05g CaCl2,0. ΟΓΟ. 05g FeSO4 · 7Η20、0· ΟΓΟ. 04g 腺嘌呤、20 60μ g VB10
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的活性化合物的發(fā)酵制備方法，其特征在于，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為每升水中含15g蔗糖、1.5g DL-天冬酰胺、Ig KH2P04、0. 5g MgSO4 · 7H20、0. IgNa2PO4 · 7Η20、0· Olg CaCl2,0. Olg FeSO4 · 7Η20、0· 0275g 腺嘌呤、50 μ g VB10
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的活性化合物的發(fā)酵制備方法，其特征在于，所述分離純化依次包括以下步驟 (1)制備的發(fā)酵液通過萃取劑1:1(v/v)萃取，萃取液在10(T2000Pa，3(T55°C的條件下減壓蒸餾，去除萃取劑，得到活性化合物粗制品；所述萃取劑為乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚中的任意一種； (2)將粗制品通過甲醇溶解，按照粗制品與層析樹脂A質(zhì)量比I:1(Γ20上樣，使用體積濃度20%、40%、60%、80%、100%甲醇水溶液梯度洗脫，每個濃度洗脫3 5柱體積，收集合并活性化合物組分并在10(T2000Pa，3(T55°C的條件下減壓蒸餾濃縮收集的層析組分，得濃縮產(chǎn)物一； (3)步驟(2)中獲得的濃縮產(chǎn)物一通過甲醇溶解，按照粗制品與層析樹脂B質(zhì)量比I:10^20上樣，使用體積濃度20%、40%、60%、80%、100%甲醇水溶液梯度洗脫，每個濃度洗脫3飛柱體積，收集合并含活性化合物組分并在10(T2000Pa，30^55 0C的條件下減壓蒸餾，得濃縮產(chǎn)物二； (4)步驟(3)中獲得的濃縮產(chǎn)物二通過甲醇溶解，按照粗制品與層析樹脂C質(zhì)量比1:10^20上樣，使用體積20%、40%、60%、80%、100%甲醇水溶液梯度洗脫，每個濃度洗脫3 5柱體積，收集合并含活性化合物組分并在10(T2000Pa，3(T55°C的條件下減壓蒸餾獲得純物質(zhì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的活性化合物的發(fā)酵制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中所述的層析樹脂A為市售D101、LX-60非極性大孔樹脂。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的活性化合物的發(fā)酵制備方法，其特征在于，步驟(3)中所述的層析樹脂B為市售MCI GEL CHP 20P MCI系列精細(xì)層析樹脂。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的活性化合物的發(fā)酵制備方法，其特征在于，步驟(4)中所述的層析樹脂C為市售十八烷基硅烷鍵合硅膠(ODS)等非極性層析樹脂。
全文摘要
本發(fā)明屬化合物分離純化技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種微生物來源的新型真菌漆酶高效誘導(dǎo)化合物的發(fā)酵制備、分離純化工藝，及其在誘導(dǎo)真菌漆酶生產(chǎn)方面的應(yīng)用。其特征在于包括下述步驟通過真菌發(fā)酵制備含有活性化合物的發(fā)酵液，經(jīng)過萃取獲得的活性化合物粗提物依次經(jīng)不同層析樹脂吸附，以不同濃度甲醇-水作為洗脫劑純化精制，最終獲得純化的活性化合物分子；獲得的活性化合物在1~500 μM濃度下可以高效誘導(dǎo)漆酶生產(chǎn)真菌分泌胞外漆酶。本發(fā)明具有以下優(yōu)點誘導(dǎo)化合物來源于真菌次級代謝產(chǎn)物；誘導(dǎo)化合物工作濃度低，有效工作濃度為1~500μM；誘導(dǎo)化合物具有高的真菌漆酶誘導(dǎo)活性。
文檔編號C12N9/02GK102786411SQ20121013844
公開日2012年11月21日 申請日期2012年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月7日
發(fā)明者劉娟娟, 房偉, 方澤民, 洪宇植, 肖亞中 申請人:安徽大學(xué)