專利名稱：誘導(dǎo)白木香產(chǎn)生沉香的3株真菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是涉及3株真菌，將它們接種在白木香的樹干或枝干上，能誘導(dǎo)白木香產(chǎn)生沉香。
背景技術(shù)：
2010版《中國藥典》中記載中藥沉香的基源植物為瑞香科(Thymelaeceae)沉香屬(Aquilaria)植物白木香[A. sinensis (Lour. )Gilg.]含樹脂的木材。在我國中藥史上，沉香的藥用價(jià)值已經(jīng)認(rèn)識(shí)很久。李時(shí)珍在《本草綱目》中記載“沉香性辛，微溫，無毒，有降氣、調(diào)中、清肝之效，為香簾沖動(dòng)藥?！?010版《中國藥典》記載 沉香的功能與主治為行氣止痛，溫中止嘔，納氣平喘。用于胸腹脹悶疼痛，胃寒嘔吐呃逆，腎虛氣逆喘急。關(guān)于沉香的生產(chǎn)和獲取，有多種說法，但遇到的問題基本一致，即白木香結(jié)香周期很長，數(shù)量很少，品質(zhì)不一，因此有“25年以下樹齡不結(jié)香”的說法，在宋《本草衍義》中“有香者百無一二”的記載。長期的實(shí)踐中，勞動(dòng)人民發(fā)現(xiàn)沉香總是存在于白木香受傷和腐朽處，因此，李時(shí)珍在《本草綱目》中有“乃膏脈凝出自朽出者”，“乃刀斧伐仆膏脈結(jié)凝者”，“乃木朽而結(jié)者”和“因蠹隙而結(jié)者”的記載。在現(xiàn)在的實(shí)際生產(chǎn)中，和傳統(tǒng)手段一樣，仍然主要依靠用刀斧砍傷的辦法來促使白木香結(jié)香，比起天然結(jié)香，時(shí)間大大縮短，但這樣的方法仍然需要數(shù)年甚至十多年才能使白木香結(jié)香，生產(chǎn)速度慢的問題仍然困擾著沉香的合理使用和醫(yī)藥的供應(yīng)，也致使白木香野生資源的蘊(yùn)藏量急劇下降。1987年，白木香被列為國家珍稀瀕危三級(jí)保護(hù)植物，1999年又被國務(wù)院批準(zhǔn)為國家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生植物。因此，發(fā)展快速有效的白木香結(jié)香的生產(chǎn)技術(shù)顯得尤為迫切。在自然條件下，白木香受到蟲咬、真菌侵染、風(fēng)吹折枝或人為致傷等隨機(jī)因素的誘導(dǎo)，并經(jīng)過長時(shí)間的積累，才有可能形成沉香?？茖W(xué)研究初步發(fā)現(xiàn)，某些真菌能夠誘導(dǎo)白木香產(chǎn)生沉香，但是，到目前為止，尚未見有高效誘導(dǎo)活性真菌應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中。本專利采用人工接菌技術(shù),將活性真菌接種到白木香樹上,從而提高沉香結(jié)香率,縮短沉香的生產(chǎn)周期并提高結(jié)香質(zhì)量。這是用科學(xué)的方法生產(chǎn)沉香，提高沉香的產(chǎn)量和質(zhì)量，滿足醫(yī)藥衛(wèi)生需要、維護(hù)人民群眾健康的有效途徑，也是實(shí)現(xiàn)野生白木香資源保護(hù)和可持續(xù)利用的有效途徑之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供3株能夠誘導(dǎo)白木香產(chǎn)生沉香的真菌，將它們接種在白木香的樹干或枝干上，能夠使白木香產(chǎn)生與沉香理化性質(zhì)相似的黃褐色物質(zhì)。本發(fā)明提供的3株真菌，經(jīng)鑒定分別為保藏編號(hào)為CGMCC No. 4453的小球殼孢屬(Microsphaeropsis sp.)真菌 YNAS-4,保藏編號(hào)為 CGMCC No. 4455 的炭角菌屬(Xylariasp.)真菌YNAS-6,和保藏編號(hào)為CGMCC No. 4456的毛雙抱屬(Lasiodiplodia sp.)真菌YNAS-S0這3株真菌于2010年12月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。保藏單位地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所。菌株的保藏和存活證明見附件。3株真菌的培養(yǎng)特性分別為YNAS-4 :在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌落中央隆起，呈深青綠色，外圍為白色，中央到邊緣顏色由深漸淡，毛狀邊緣，菌絲較發(fā)達(dá)，為絮狀，無明顯分泌物。將直徑為O. 65cm的菌片接種在PDA培養(yǎng)基上，生長5天菌落直徑為3. 44cm。菌絲有不同直徑的由細(xì)變粗的多種形態(tài)，最細(xì)的菌絲直徑2 μ m,最粗的菌絲直徑5 μ m。細(xì)菌絲與粗菌絲相連，粗菌絲是由細(xì)菌絲發(fā)展而來的。細(xì)菌絲淡色，無隔。粗菌絲呈暗色，菌絲中圓形顆粒內(nèi)容物清晰可見。不產(chǎn)生分生孢子。YNAS-6 :在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌落乳白色，中央有均勻的棉絮狀隆起，菌絲的分布是輻射狀條形溝紋，像羽毛狀分布，一層一層由中央向外圍疊放，呈繩索條紋向外輻射，無明顯分泌物。將直徑為O. 65cm的菌片接種在PDA培養(yǎng)基上，生長5天菌落直徑為3. 08cm。菌落質(zhì)地堅(jiān)硬，干燥。培養(yǎng)時(shí)間超過6天之后，菌落中央開始變黃，出現(xiàn)黑色斑塊，并出現(xiàn)無色油滴狀分泌物。菌落背面呈繩索輻射狀。菌落長滿后繼續(xù)培養(yǎng)，黑白相間放射狀的菌落表面有絨毛狀菌絲團(tuán)不均勻分布。菌絲直徑3-4μπι，有隔。菌絲由無色透明和淡色兩種色調(diào)的間隔組成。不產(chǎn)生分生孢子。YNAS-8 :將直徑為O. 65cm的菌片接種在PDA培養(yǎng)基上，生長2天菌落直徑為4. 82cm ;生長3天菌落長滿直徑9cm的培養(yǎng)皿。培養(yǎng)3天之內(nèi)，菌落稀疏，呈白色；菌絲絮狀；菌落背面白色，泛黃。培養(yǎng)3天之后，菌絲開始變得發(fā)達(dá)，菌落顏色由白色漸變成灰色，最后呈黑色。培養(yǎng)時(shí)間超過15天后，菌落表面出現(xiàn)黑色油狀分泌物；菌落背面呈黑色。菌絲有粗、細(xì)2種。細(xì)菌絲直徑約1-2 μ m，淡色。粗菌絲直徑8-10 μ m，暗色。粗菌絲是由細(xì)菌絲發(fā)育而來的。菌絲有隔。細(xì)菌絲的隔間距較長。粗菌絲的隔間距較短。不產(chǎn)生分生孢子。3株真菌用蕎麥皮培養(yǎng)基培養(yǎng)。蕎麥皮培養(yǎng)基的組成為蕎麥皮、麥麩、玉米粉、硫酸鈣和糖類成分；其中糖類成分為葡萄糖、或果糖、或麥芽糖、或蔗糖、或葡萄糖、果糖、麥芽糖和蔗糖4種糖類成分中的任意兩種或兩種以上以任意比例混合的混合物。蕎麥皮培養(yǎng)基的配制方法為(I)硫酸鈣和糖類成分用水配成混懸液，硫酸鈣的加入量按重量百分比計(jì)算為
O.5% -I. 5%，糖類成分的加入量按重量百分比計(jì)算為O. 5% -I. 5%。硫酸鈣微溶于水，糖類成分能溶于水。由于它們?cè)谂浞街械挠昧枯^少，采用混懸液的方式加入，可以保證它們?cè)谂囵B(yǎng)基中均勻分散。(2)蕎麥皮、麥麩和玉米粉三種干料按體積比為1-5 1-3 O. 05-0. I的比例混
合均勻。(3)將含有硫酸鈣和糖類成分的混懸液攪拌均勻，加入蕎麥皮、麥麩和玉米粉混合的干料中，攪拌，使混合均勻。干料和混懸液的重量(g)與體積(mL)比為I : O. 8-1. 6。培養(yǎng)基PH自然，測量值一般在7. 5-8. 5之間。試管或罐頭瓶等玻璃器皿，容器裝量20-60%，121°C滅菌 120-180 分鐘。3株真菌的培養(yǎng)方法將3株真菌分別自低溫保藏的斜面試管菌種活化后，轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基的平皿中，恒溫25°C暗培養(yǎng)。培養(yǎng)至菌落直徑大約3cm左右時(shí)，挑取邊緣菌塊，轉(zhuǎn)接于裝有上述固體培養(yǎng)基的罐頭瓶中，20-28°C暗培養(yǎng)。待菌絲生長充滿培養(yǎng)基約一半時(shí)，將培養(yǎng)的固體菌種轉(zhuǎn)接于新的、相同的培養(yǎng)基中，于相同條件下培養(yǎng)。菌絲長滿培養(yǎng)基后的菌種可以用于接種白木香，誘導(dǎo)白木香產(chǎn)生沉香；也可以作為大規(guī)模培養(yǎng)真菌的種子菌種使用。將3株真菌的固體培養(yǎng)物接種于白木香的樹干或枝干上，能夠誘導(dǎo)白木香產(chǎn)生沉香。接種的時(shí)候，菌株可以分別單獨(dú)使用，也可以2株或3株同時(shí)使用。當(dāng)使用混合菌種接種時(shí)，先將單獨(dú)培養(yǎng)的各菌株的固體培養(yǎng)物以所需要的比例混合均勻，即可用于接種使用。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I應(yīng)用真菌YNAS-4誘導(dǎo)白木香產(chǎn)生沉香 (I)固體培養(yǎng)基的制作配制蔗糖和硫酸鈣濃度均為O. 5%的混懸液；將蕎麥皮、麥麩和玉米粉這3種材料按體積比為I : I : O. 05的比例混合均勻；每公斤干料中加入混懸液I升，攪拌均勻。培養(yǎng)基分裝后，于121°C滅菌165分鐘。(2)菌種的準(zhǔn)備挑取經(jīng)PDA平板活化的YNAS-4菌落邊緣的菌種塊，接種到裝有上述固體基質(zhì)的罐頭瓶中，于22-24°C暗培養(yǎng)15天。將生長旺盛的真菌菌絲塊再一次轉(zhuǎn)接到裝有蕎麥皮培養(yǎng)基的罐頭瓶中，于22-24°C暗培養(yǎng)30天，待用。(3)接種孔的準(zhǔn)備選取樹齡5年，胸徑> 8cm的白木香樹，在樹干或枝干上按照左右間隔5cm，上下間隔8cm的距離，用電鉆或手工打孔器打孔，孔口略向上，直徑為lcm，深約3cm。如果接種前孔周圍植物組織比較干燥，用無菌水噴灑孔壁，使其保持濕潤。(4)接菌將真菌YNAS-4的培養(yǎng)物用無菌鑷子或小勺接入接種孔中，接種量約為3克，輕輕按壓，保證菌種與開孔周圍植物組織的接觸，但不要將接種物壓得過于致密。用少量無菌棉覆蓋接種孔口，再用麻繩纏繞固定。以上處理重復(fù)3次。結(jié)果2個(gè)月之后觀察，在接種部位及其周圍有黑褐色物質(zhì)形成。真菌YNAS-4誘導(dǎo)白木香樹干或枝干變色，形成黑褐色物質(zhì)的范圍(左右寬度，上下寬度)數(shù)據(jù)見表I。從接種部位周圍取下木料燃燒時(shí)，能產(chǎn)生獨(dú)特的沉香香味。用手摸變色部位，有油膩的感覺，但不會(huì)把手抹黑。將黑褐色部位取出，陰干，稱重，數(shù)據(jù)見表I。實(shí)施例2應(yīng)用真菌YNAS-6誘導(dǎo)白木香產(chǎn)生沉香(I)固體培養(yǎng)基的制作配制葡萄糖濃度為I. 2 %，硫酸鈣濃度為I %的混懸液；將蕎麥皮、麥麩和玉米粉這3種材料按體積比為2 1.5 0.07的比例混合均勻；每公斤干料中加入混懸液O. 8升，攪拌均勻。培養(yǎng)基分裝后，于121°C滅菌140分鐘。(2)菌種的準(zhǔn)備挑取經(jīng)PDA平板活化的YNAS-6菌落邊緣的菌種塊，接種到裝有上述固體基質(zhì)的罐頭瓶中，于25-28°C暗培養(yǎng)15天。將生長旺盛的真菌菌絲塊再一次轉(zhuǎn)接到裝有蕎麥皮培養(yǎng)基的罐頭瓶中，于25-28°C暗培養(yǎng)20天，待用。3)接種孔的準(zhǔn)備選取樹齡5年以上，胸徑> IOcm的白木香樹，在樹干或枝干上按照左右間隔8cm，上下間隔IOcm的距離，用電鉆或手工打孔器打孔，孔口略向上，直徑為
I.5cm,深約5cm。如果接種前孔周圍植物組織比較干燥，用無菌水噴灑孔壁，使其保持濕潤。4)接菌將真菌YNAS-6的培養(yǎng)物用無菌鑷子或小勺接入接種孔中，接種量約為4克，輕輕按壓，保證菌種與開孔周圍植物組織的接觸，但不要將接種物壓得過于致密。用少量無菌棉覆蓋接種孔口，再用麻繩纏繞固定。以上處理重復(fù)3次。結(jié)果2個(gè)月之后觀察，在接種部位有黑或黃褐色物質(zhì)形成。真菌YNAS-6誘導(dǎo)白木香樹干或枝干變色，形成黑褐色物質(zhì)的范圍(左右寬度，上下寬度)數(shù)據(jù)見表I。從接種部位周圍取下木料燃燒時(shí)，能產(chǎn)生獨(dú)特的沉香香味。用手摸變色部位，有油膩的感覺，但不會(huì)把手抹成黑或黃褐色。將黑褐色部位取出，陰干，稱重，數(shù)據(jù)見表I。實(shí)施例3應(yīng)用真菌YNAS-8誘導(dǎo)白木香產(chǎn)生沉香(I)固體培養(yǎng)基的制作配制果糖濃度為O. 5 %，麥芽糖濃度為I %，硫酸鈣濃度為I %的混懸液；將蕎麥皮、麥麩和玉米粉這3種材料按體積比為I : 3 O. I的比例混合均勻；每公斤干料中加入混懸液I. 6升，攪拌均勻。培養(yǎng)基分裝后，于121°C滅菌180分鐘。
(2)菌種的準(zhǔn)備挑取經(jīng)PDA平板活化的YNAS-8菌落邊緣的菌種塊，接種到裝有上述固體基質(zhì)的罐頭瓶中，于20-22°C暗培養(yǎng)5天。將生長旺盛的真菌菌絲塊再一次轉(zhuǎn)接到裝有蕎麥皮培養(yǎng)基的罐頭瓶中，于20-22°C暗培養(yǎng)10天，待用。(3)接種孔的準(zhǔn)備選取樹齡5年以上，胸徑> IOcm)的白木香樹，在樹干或枝干上按照左右間隔8cm，上下間隔IOcm的距離，用電鉆或手工打孔器打孔，孔口略向上，直徑為2. 0cm，深約5cm。如果接種前孔周圍植物組織比較干燥，用無菌水噴灑孔壁，使其保持濕潤。(4)接菌將真菌YNAS-8的培養(yǎng)物用無菌鑷子或小勺接入接種孔中，接種量約為5克，輕輕按壓，保證菌種與開孔周圍植物組織的接觸，但不要將接種物壓得過于致密。用少量無菌棉覆蓋接種孔口，再用麻繩纏繞固定。以上處理重復(fù)3次。結(jié)果2個(gè)月之后觀察，在接種部位及其周圍有黑褐色物質(zhì)形成。真菌YNAS-8誘導(dǎo)白木香樹干或枝干變色，形成黑褐色物質(zhì)的范圍(左右寬度，上下寬度)數(shù)據(jù)見表I。從接種部位周圍取下木料燃燒時(shí)，能產(chǎn)生獨(dú)特的沉香香味。用手摸變色部位，有油膩的感覺，但不會(huì)把手抹黑。將黑褐色部位取出，陰干，稱重，數(shù)據(jù)見表I。比較例I(I)固體培養(yǎng)基的制作配制果糖、葡萄糖、蔗糖濃度均為O. 5%，硫酸鈣濃度為
I.5%的混懸液；將蕎麥皮、麥麩和玉米粉這3種材料按體積比為3 3 O. I的比例混合均勻；每公斤干料中加入混懸液I. 2升，攪拌均勻。培養(yǎng)基分裝后，于121°C滅菌120分鐘。(2)接種孔的準(zhǔn)備選取樹齡5年以上，胸徑彡IOcm的白木香樹，在樹干或枝干上按照左右間隔8cm，上下間隔IOcm的距離，用電鉆或手工打孔器打孔，孔口略向上，直徑為
I.5cm,深約3cm。如果接種前孔周圍植物組織比較干燥，用無菌水噴灑孔壁，使其保持濕潤。(3)空白處理用少量無菌棉覆蓋接種孔口，再用麻繩纏繞固定。以上處理重復(fù)3次。(4)陰性對(duì)照處理將滅菌后的蕎麥皮培養(yǎng)基用無菌鑷子或小勺接入接種孔中，接種量約為3克，輕輕按壓，保證培養(yǎng)基與開孔周圍植物組織的接觸，但不要將接種物壓得過于致密。用少量無菌棉覆蓋接種孔口，再用麻繩纏繞固定。以上處理重復(fù)3次。結(jié)果2個(gè)月之后觀察，空白處理的接種孔周圍變化很小，僅有很小范圍的顏色變化，與周圍組織顏色相比，略微發(fā)黃；陰性對(duì)照處理的接種孔周圍變化也很小，僅有很小范圍的顏色變化，顏色變黃。從以上2種處理的接種部位周圍取下木料燃燒，氣味不濃。以上2種處理形成的顏色變化的范圍(左右寬度，上下寬度)數(shù)據(jù)見表I。將顏色變化部位取出，陰干，稱重，數(shù)據(jù)見表I比較例2(I)固體培養(yǎng)基的制作配制葡萄糖濃度為O. 5%、蔗糖濃度為1%，硫酸鈣濃度為I. 5%的混懸液；將蕎麥皮、麥麩和玉米粉這3種材料按體積比為5 3 O. I的比例混合均勻；每公斤干料中加入混懸液I. 4升，攪拌均勻。培養(yǎng)基分裝后，于121°C滅菌150分鐘。(2)菌種的準(zhǔn)備分別挑取經(jīng)PDA平板活化的真菌YNAS-4，YNAS-6和YNAS-8的菌落邊緣的菌種塊，接種到裝有上述固體基質(zhì)的罐頭瓶中，于22-24°C暗培養(yǎng)至菌絲生長充滿培養(yǎng)基質(zhì)的1/3-2/3，待用。 (3)接種孔的準(zhǔn)備選取樹齡5年以上，胸徑彡IOcm的白木香樹，在樹干或枝干上按照左右間隔8cm，上下間隔IOcm的距離，用電鉆或手工打孔器打孔，孔ロ略向上，直徑為I. 5cm,深約5cm。如果接種前孔周圍植物組織比較干燥，用無菌水噴灑孔壁，使其保持濕潤。(4)接菌將真菌YNAS-4和YNAS-6的培養(yǎng)物按體積比約為I : I的比例混合均勻；將真菌YNAS-4和YNAS-8的培養(yǎng)物按體積比約為2 I的比例混合均勻；將真菌YNAS-6和YNAS-8的培養(yǎng)物按體積比約為I : 3的比例混合均勻；將真菌YNAS-4、YNAS-6和YNAS-8的培養(yǎng)物按體積比約為I : I : I的比例混合均勻；用無菌鑷子或小勺將以上4種混合菌種分別接入接種孔中，接種量約為4-5克，輕輕按壓，保證菌種與開孔周圍植物組織的接觸，但不要將接種物壓得過于致密。用少量無菌棉覆蓋接種孔ロ，再用麻繩纏繞固定。每種混合菌種分別重復(fù)3次。結(jié)果2個(gè)月之后觀察，在接種部位有黒褐色物質(zhì)形成?；旌暇N誘導(dǎo)白木香樹干或枝干變色，形成黒褐色物質(zhì)的范圍(左右寬度，上下寬度)數(shù)據(jù)見表I。從接種部位周圍取下木料燃燒時(shí)，能產(chǎn)生獨(dú)特的沉香香味。用手摸變色部位，有油膩的感覺，但不會(huì)把手抹黒?；旌辖泳绕鹂瞻缀完幮詫?duì)照有明顯的優(yōu)勢。將黑褐色部位取出，陰干，稱重，數(shù)據(jù)見表I。表I.白木香接種3種真菌后接種部位周圍形成顏色變化的擴(kuò)散范圍及擴(kuò)散部位木材的采收重量
權(quán)利要求
1.誘導(dǎo)白木香產(chǎn)生沉香的3株真菌，它們分別是保藏編號(hào)為CGMCCNo. 4453的小球殼孢屬(Microsphaeropsis sp.)真菌YNAS-4,保藏編號(hào)為CGMCC No. 4455的炭角菌屬(Xylaria sp.)真菌 YNAS-6,和保藏編號(hào)為 CGMCC No. 4456 的毛雙抱屬(Lasiodiplodiasp.)真菌 YNAS-8。
2.如權(quán)利要求I所述的真菌，其特征在于3株真菌的固體培養(yǎng)，其培養(yǎng)基組成為蕎麥皮、麥麩、玉米粉、硫酸鈣和糖類成分；其中糖類成分為葡萄糖、或果糖、或麥芽糖、或蔗糖、或葡萄糖、果糖、麥芽糖和蔗糖4種糖類成分中的任意兩種或兩種以上以任意比例混合的混合物； 固體培養(yǎng)基配制方法為 (1)硫酸鈣和糖類成分用水配成混懸液，硫酸鈣的加入量按重量百分比計(jì)算為0.5% -I. 5%，糖類成分的加入量按重量百分比計(jì)算為0. 5% -I. 5% ; (2)蕎麥皮、麥麩和玉米粉三種干料按體積比為1-5 1-3 0.05-0. I的比例混合均勻； (3)將含有硫酸鈣和糖類成分的混懸液加入蕎麥皮、麥麩和玉米粉混合的干料中，攪拌，使混合均勻；干料和混懸液的重量與體積比為I : 0. 8-1.6。
3.如權(quán)利要求I所述的真菌，其特征在于3株真菌的用途是能接種在白木香上，誘導(dǎo)白木香產(chǎn)生沉香。
4.如權(quán)利要求I所述的真菌，其特征在于3株真菌單獨(dú)使用，或3株真菌中的任意2株或2株以上以任意比例混合使用，都能夠誘導(dǎo)白木香產(chǎn)生沉香。
全文摘要
本發(fā)明公開了3株真菌，它們分別是保藏編號(hào)為CGMCC No.4453的小球殼孢屬(Microsphaeropsis sp.)真菌YNAS-4，保藏編號(hào)為CGMCC No.4455的炭角菌屬(Xylaria sp.)真菌YNAS-6和保藏編號(hào)為CGMCC No.4456的毛雙孢屬(Lasiodiplodia sp.)真菌YNAS-8。將它們接種到白木香的樹干或枝干上，能誘導(dǎo)白木香產(chǎn)生沉香，在提高中藥沉香的產(chǎn)量，保護(hù)白木香自然資源等方面有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N1/14GK102649939SQ20111004432
公開日2012年8月29日 申請(qǐng)日期2011年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月24日
發(fā)明者孟志霞, 崔晉龍, 王春蘭, 郭順星, 陳曉梅 申請(qǐng)人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所