專利名稱：內(nèi)生真菌hl-02及其在制備d-泛解酸內(nèi)酯中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物新菌株內(nèi)生真菌HL-02及其在微生物轉(zhuǎn)化制備D-泛解酸內(nèi)酯中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
泛酸(Pantothenicacid, α，y 二羥基-β，β - 二甲基丁酰-β 丙氨酸)，又稱本多生酸、維生素&或 ，是一種重要的食品添加劑和飼料添加劑，也是一種重要的維生素藥物。D-泛酸有100%的生理活性，而L-泛酸沒有活性，由于D-泛酸對(duì)熱、堿、酸均不穩(wěn)定， 多以D-泛酸鈣形式存在。D-泛酸屬于B族維生素類物質(zhì)，進(jìn)入人體內(nèi)能轉(zhuǎn)化合成為輔酶Α，促進(jìn)人體蛋白質(zhì)、脂肪、糖類的代謝，保護(hù)皮膚表面的粘膜和毛發(fā)光澤，防止疾病的發(fā)生。缺乏D-泛酸會(huì)導(dǎo)致皮膚病變及生理障礙。D-泛解酸內(nèi)酯是生產(chǎn)D-泛酸的關(guān)鍵手性中間體，生產(chǎn)D-泛酸的關(guān)鍵是拆分 DL-泛解酸內(nèi)酯。DL-泛解酸內(nèi)酯的拆分通常是采用化學(xué)方法拆分，用手性拆分劑(奎寧化合物、二甲馬錢子堿或氯霉胺等)拆分泛解酸內(nèi)酯，但是化學(xué)拆分法存在價(jià)格昂貴、成本高、分離困難并有環(huán)境污染和毒性問題。而生物酶法具有成本低，反應(yīng)條件溫和，環(huán)境污染小的優(yōu)點(diǎn)， 隨著人們對(duì)綠色環(huán)保的追求，生物酶法越來越引起人們的重視。生物酶法拆分DL-泛解酸內(nèi)酯，是用微生物產(chǎn)的酶進(jìn)行拆分轉(zhuǎn)化，得到D-泛解酸內(nèi)酯。生物酶法生產(chǎn)D-泛解酸內(nèi)酯有多種技術(shù)路線，其中，D-泛解酸內(nèi)酯水解酶法的生產(chǎn)技術(shù)相對(duì)成熟，具有底物總利用率高，產(chǎn)品純度較高等優(yōu)點(diǎn)，在特定的反應(yīng)條件下，游離酶或固定化細(xì)胞可選擇性的水解D-泛解酸內(nèi)酯為D-泛醇，經(jīng)分離和內(nèi)酯化，可得到高純度的 D-泛解酸內(nèi)酯，未水解的L-泛解酸內(nèi)酯可經(jīng)消旋化再利用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種微生物新菌株內(nèi)生真菌HL-02及其在微生物轉(zhuǎn)化制備 D-泛解酸內(nèi)酯中的應(yīng)用。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是內(nèi)生真菌 HL-2 (PlectospHaereella cucumerina HL-2)，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國武漢武漢大學(xué)，保藏日期2010年12月13日，保藏編號(hào)CCTCC M 2010348。本發(fā)明內(nèi)生真菌HL-02菌株篩選(1)菌種采集在杭州師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)室周邊采集的垃圾堆邊土、草坪土，在杭州地區(qū)采集水稻田泥、菜地土，在寧波地區(qū)采集水稻田泥、菜地土，以及儲(chǔ)藏于本單位實(shí)驗(yàn)室的土樣南京紫金山淤泥、遼寧盤錦市淤泥、西湖泥、武漢泥、成都古楠村泥土 ；本發(fā)明所述的內(nèi)生真菌HL-02從寧波水稻田泥土中篩選獲得。
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(2)菌種初篩將0.04%溴甲酚紫乙醇溶液及10% D-泛解酸內(nèi)酯水溶液，用濾器過濾除菌后加入已滅菌的未凝固的SOC固體培養(yǎng)基中，制備成終濃度為0. 0025%溴甲酚紫及0. 5% D-泛解酸內(nèi)酯的SOC平板；取少許土壤樣品用無菌水稀釋，取100 μ L 土壤稀釋液涂布于該平板上，隔水式恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 7d，每天觀察，取有黃色透明圈的菌落作復(fù)篩；(3)菌種復(fù)篩將0.04%溴甲酚紫乙醇溶液及10% D-泛解酸內(nèi)酯水溶液，用濾器過濾除菌后加入已滅菌的未凝固的SOC固體培養(yǎng)基中，制備成終濃度為0. 0025%溴甲酚紫及0. 5% D-泛解酸內(nèi)酯的SOC平板，并以只含有0. 0025%溴甲酚紫的SOC平板作對(duì)照；將初篩培養(yǎng)基中出現(xiàn)黃色透明圈的菌落分別接種于上述兩份培養(yǎng)基中，隔水式恒溫培養(yǎng)箱中
培養(yǎng)1 7d，每天觀察，取在D-泛解酸內(nèi)酯與溴甲酚紫培養(yǎng)基上出現(xiàn)黃色透明圈，而溴甲酚紫培養(yǎng)基上未出現(xiàn)黃色透明圈的菌落作后續(xù)試驗(yàn)，初步得到具有產(chǎn)泛解酸內(nèi)酯水解酶的菌株；本發(fā)明內(nèi)生真菌HL-02活性菌株的培養(yǎng)取含SOC液體培養(yǎng)基IOOmL的搖瓶，挑一接種環(huán)的復(fù)篩有活性的產(chǎn)泛解酸內(nèi)酯水解酶的菌株接種于該搖瓶，280C、160rpm搖床培養(yǎng)Mh，獲得內(nèi)生真菌HL-02活性菌株。內(nèi)生真菌HL-02活性菌株顯微觀察將內(nèi)生真菌HL-02活性菌體制備玻片，滴上革蘭氏染液I，革蘭氏染色后置于顯微鏡觀察。SOC液體培養(yǎng)基終濃度組成為胰化蛋白胨20g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 0. 5g/ L、KC1 0. 186g/L、MgCl2 0. 95g/L、葡萄糖 3. 6g/L，溶劑為水，用 5mol/L NaOH 溶液調(diào) pH 至 7. O。SOC固體培養(yǎng)基是在SOC液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入1. 5%瓊脂粉/L。內(nèi)生真菌HL-2菌落特征和生理生化特性為桿狀，無鞭毛，革蘭氏陽性，在SOC固體培養(yǎng)基觀培養(yǎng)2 3d后，菌落呈白色，有氣生菌絲，表面干燥。內(nèi)生真菌HL-02菌種ITS測(cè)序鑒定提取該菌種的DNA，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)定ITS序列，在NCBI基因庫比對(duì)后確定為內(nèi)生真菌PlectospHaereella cucumerina,命名為內(nèi)生真菌HL-O2。本發(fā)明所述的內(nèi)生真菌HL-2保藏編號(hào)CCTCC M 2010348，其ITS序列為cgtggggata gtacctgatc cgaggtcaac cttggtgccg ccgaagcgga cttgtggggg 60gtttagaggc aggacgccga ggactcccaa tgcgaggcga atgctactgc gcaaaggaga 120gggcccttcg ggtccgccac tggttttagg ggcctgccgt ggcagatccc caacgccggg 180ccacaggggc tcgagggttg aaacgacgct cggacaggca tgcctcccag gatactggaa 240ggcgccatgt gcgttcaaag attcgatgat tcactgaatt ctgcaattca cattacatat 300cgcgtttcgc tgcgttcttc atcgatgctg gagccaagag atccgttgtt aaaagttttg 360acagttcgct aagaacactc agaagtatcg tcgggttcga aaacagagat tctgatgaga 420ccggcgggca cccttgcggg cgccgccgaa gcaacaggta taatagttca caaagggtag 480agagtgtagt actcagtaat gatccctccg ctgtcacccc accggagacc ttgttacg 538可利用本發(fā)明所述的內(nèi)生真菌HL-2生物法制備D-泛解酸內(nèi)酯。本發(fā)明具體的應(yīng)用為以DL-泛解酸內(nèi)酯為底物，以內(nèi)生真菌HL-2發(fā)酵所得菌液或菌液制備的初酶液為酶源，20 45°C下，在含有氯化鈣的Tris-HCl緩沖溶液的反應(yīng)體系中進(jìn)行水解反應(yīng)得水解液，取水解液用乙酸乙酯進(jìn)行酯化反應(yīng)，反應(yīng)液經(jīng)后處理制得D-泛解酸內(nèi)酯。本發(fā)明所述的反應(yīng)體系中DL-泛解酸內(nèi)酯初始濃度優(yōu)選為1 5g/L ；所述氯化鈣的質(zhì)量濃度優(yōu)選為0. 1 lg/L。進(jìn)一步，所述的酶源為內(nèi)生真菌HL-2發(fā)酵得到的發(fā)酵液，加入的發(fā)酵液中內(nèi)生真菌HL-2的終濃度以細(xì)胞干重計(jì)為0. 5 5g/L。進(jìn)一步，本發(fā)明所述的應(yīng)用是將DL-泛解酸內(nèi)酯、酶源，加入到含有氯化鈣的 Tris-HCl緩沖溶液的反應(yīng)體系中，并使反應(yīng)體系中DL-泛解酸內(nèi)酯初始濃度為1 5g/L ； 所述氯化鈣的質(zhì)量濃度為0. 1 lg/L，所述的酶源為內(nèi)生真菌HL-2發(fā)酵得到的發(fā)酵液，加入的發(fā)酵液中內(nèi)生真菌HL-2的終濃度以細(xì)胞干重計(jì)為以0. 5 5g/L，在20 45°C下，進(jìn)行水解反應(yīng)得水解液，取水解液用乙酸乙酯進(jìn)行酯化反應(yīng)，反應(yīng)液經(jīng)后處理制得D-泛解酸內(nèi)酯；所述內(nèi)生真菌HL-2發(fā)酵得到的發(fā)酵液于已滅菌的離心管中，3000gX5min離心后棄上清，加入50mmol/L CaCl2,0. 2mol/L Tris-HCl, pH 7. 5的混合液洗滌，洗去其中的培養(yǎng)基， 3000gX5min 離心后棄上清；再次用 50mmol/L CaCl2,0. 2mol/L Tris-HCl, pH 7. 5 的混合液洗滌，3000gX5min離心后棄上清，獲得酶源。再進(jìn)一步，本發(fā)明所述的水解反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為10 50h。本發(fā)明所述的后處理為將反應(yīng)液離心，取上清液加入等體積乙酸乙酯萃取，棄去上層有機(jī)相，下層水相中加入濃鹽酸使HCl的終濃度為100 300mmol/L，于60 95°C反應(yīng)0. 5 證，反應(yīng)結(jié)束后用等體積乙酸乙酯再次萃取，取上層有機(jī)相旋蒸，制得D-泛解酸內(nèi)酯。本發(fā)明酶源來源于內(nèi)生真菌HL-2發(fā)酵得到，具體按如下方法獲得酶源(1)斜面培養(yǎng)將內(nèi)生真菌HL-2接種至斜面培養(yǎng)基20 37°C培養(yǎng)1 7d得到斜面菌種；斜面培養(yǎng)基終濃度組成為胰化蛋白胨10 20g/L、酵母提取物5 10g/L、NaCl 0. 5 2g/L、KCl 0. 1 lg/L、MgCl2 0. 5 5g/L、葡萄糖 2 10g/L，瓊脂粉 10 25g/L， 溶劑為水，用5mol/L NaOH溶液調(diào)pH至6. 0 8. 0 ；(2)種子培養(yǎng)將步驟(1)斜面培養(yǎng)的菌種接種至種子培養(yǎng)基，20 37°C，100 250r/min培養(yǎng)5 72h，得種子液；種子培養(yǎng)基終濃度組成為胰化蛋白胨10 20g/L、酵母提取物 5 10g/L、NaCl 0. 5 2g/L、KCl 0. 1 lg/L、MgCl2 0. 5 5g/L、葡萄糖 2 10g/L,溶劑為水，用5mol/L NaOH溶液調(diào)pH至6. 0 8. 0 ；(3)發(fā)酵培養(yǎng)將步驟( 經(jīng)種子培養(yǎng)的種子液以體積比1 50 100的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，20 37°C、100 250r/min培養(yǎng)5 72h，得發(fā)酵液；發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為胰化蛋白胨10 20g/L、酵母提取物5 10g/L、NaCl 0. 5 2g/L、KCl 0. 1 lg/L、MgCl2 0. 5 5g/L、葡萄糖2 10g/L，溶劑為水，用5mol/L NaOH溶液調(diào)pH至6. 0 8. 0。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在本發(fā)明提供了一株新的可產(chǎn)D-泛解酸內(nèi)酯水解酶的微生物菌種內(nèi)生真菌HL-2，該菌種應(yīng)用于拆分DL-泛解酸內(nèi)酯，立體選擇性好，反應(yīng)條件溫和。


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圖1實(shí)施例1內(nèi)生真菌HL-02菌種在含溴甲酚紫及D-泛解酸內(nèi)酯培養(yǎng)基中的菌落特征圖2實(shí)施例1內(nèi)生真菌HL-02菌種在含溴甲酚紫培養(yǎng)基中的菌落特征圖3內(nèi)生真菌HL-02革蘭氏染色顯微照片圖4D-泛解酸內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品HPLC5DL-泛解酸內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品HPLC6D-泛解酸內(nèi)酯HPLC圖
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此HPLC色譜條件采用Varian prostar410液相色譜儀測(cè)定，柱型ADH θ CE-MD θ 72 DAICEL CHEMICAL INDUSTRIES，LTD，流動(dòng)相為正己烷異丙醇=92 8 流速 lmL/min，檢測(cè)波長215nm，溫度35 °C，每針進(jìn)樣20min。SOC液體培養(yǎng)基的配制將胰化蛋白胨20g、酵母提取物5g、NaCl 0. 5g加入去離子水中攪拌至完全溶解，加250mmol/L KCl溶液10mL，用5mol/LNaOH溶液調(diào)pH至7. 0，用去離子水定溶至1L，在15psi(l. 05kg/cm2)高壓下蒸汽滅菌20min，加入5mL已滅菌的2mol/ L MgCl2,待培養(yǎng)基冷卻至60°C或60°C以下，加入lmol/L在15psi (1. 05kg/cm2)條件下高壓蒸汽滅菌20min的葡萄糖溶液20mL。SOC固體培養(yǎng)基的配制在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入1. 5%瓊脂粉/L。斜面培養(yǎng)基終濃度組成胰化蛋白胨20g/L、酵母提取物5g/L、NaClO. 5g/L、KCl 0. 2g/L、MgCl2 lg/L、葡萄糖4g/L，瓊脂粉15g/L，溶劑為水，用5mol/L NaOH溶液調(diào)pH至 7. 0 ；種子培養(yǎng)基的終濃度組成胰化蛋白胨20g/L、酵母提取物5g/L、NaClO. 5g/L、KCl 0. 2g/L、MgCl2 lg/L、葡萄糖 4g/L，溶劑為水，用 5mol/L NaOH 溶液調(diào) pH 至 7. 0 ；發(fā)酵培養(yǎng)基的終濃度組成胰化蛋白胨20g/L、酵母提取物5g/L、NaClO. 5g/L、KCl 0. 2g/L, MgCl2 lg/L、葡萄糖 4g/L，溶劑為水，用 5mol/L NaOH 溶液調(diào) pH 至 7. 0。實(shí)施例1內(nèi)生真菌HL-02菌種篩選(1)菌種采集在杭州師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)室周邊采集的垃圾堆邊土、草坪土，在杭州地區(qū)采集水稻田泥、菜地土，在寧波地區(qū)采集水稻田泥、菜地土，以及儲(chǔ)藏于本單位實(shí)驗(yàn)室的土樣南京紫金山淤泥、遼寧盤錦市淤泥、西湖泥、武漢泥、成都古楠村泥土 ；本發(fā)明所述的內(nèi)生真菌HL-02從寧波水稻田泥中篩選獲得。(2)菌種初篩將質(zhì)量濃度為0. 04%溴甲酚紫乙醇溶液及質(zhì)量濃度為10% D-泛解酸內(nèi)酯水溶液，用濾器過濾除菌后加入已滅菌的未凝固的SOC固體培養(yǎng)基中，制備成含終濃度為0. 0025%溴甲酚紫及0.5%D-泛解酸內(nèi)酯的SOC平板；將上述步驟(1)采集的各種土壤樣品各lg，分別用IOmL無菌水稀釋，各取100 μ L 土壤稀釋液分別涂布于SOC平板上，隔水式恒溫培養(yǎng)箱(GNP-9080，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)中培養(yǎng)7d，每天觀察， 取有黃色透明圈的菌落作復(fù)篩；(3)菌種復(fù)篩將質(zhì)量濃度為0. 04%溴甲酚紫乙醇溶液及質(zhì)量濃度為10% D-泛解酸內(nèi)酯水溶液，用濾器過濾除菌后加入已滅菌的未凝固的SOC固體培養(yǎng)基中，制備成含終濃度為0. 0025%溴甲酚紫及0. 5% D-泛解酸內(nèi)酯的SOC平板，并以只含有0. 0025%溴甲酚紫的SOC平板作對(duì)照；將初篩培養(yǎng)基中出現(xiàn)黃色透明圈的菌落分別接種于上述兩份培養(yǎng)基中，隔水式恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d，每天觀察，取在D-泛解酸內(nèi)酯與溴甲酚紫培養(yǎng)基上出現(xiàn)黃色透明圈，而在溴甲酚紫培養(yǎng)基上未出現(xiàn)黃色透明圈的菌落作后續(xù)試驗(yàn)，初步得到具有產(chǎn)泛解酸內(nèi)酯水解酶的活性菌株HL-02 ；結(jié)果見圖1、圖2 ；(4)內(nèi)生真菌HL-02活性菌株的培養(yǎng)取含SOC液體培養(yǎng)基IOOmL的搖瓶，挑一接種環(huán)的復(fù)篩有活性的產(chǎn)泛解酸內(nèi)酯水解酶HL-02菌株接種于該搖瓶，28°C、160rpm搖床培養(yǎng)Mh，獲得內(nèi)生真菌HL-02活性菌株。實(shí)施例2內(nèi)生真菌HL-02菌種的顯微觀察內(nèi)生真菌HL-02活性菌株顯微觀察將內(nèi)生真菌HL-02活性菌體制備玻片，革蘭氏染色后置于顯微鏡觀察。革蘭氏染色顯微照片顯示為革蘭氏陽性菌，見圖3。實(shí)施例3內(nèi)生真菌HL-02發(fā)酵液的制備(1)斜面培養(yǎng)將內(nèi)生真菌HL-02接種至斜面培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)3d得到斜面菌種；(2)種子培養(yǎng)將步驟(1)制備的斜面菌種接種至種子培養(yǎng)基，28°C，160r/min培養(yǎng)Mh，得種子液；(3)發(fā)酵培養(yǎng)將步驟( 制備的種子液以體積比1 100的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，28°C、160r/min培養(yǎng)Mh，得發(fā)酵液1L，發(fā)酵液中菌體濃度為0. 50g/L ；實(shí)施例4內(nèi)生真菌HL-02發(fā)酵液的制備(1)斜面培養(yǎng)將內(nèi)生真菌HL-02接種至斜面培養(yǎng)基，35°C培養(yǎng)2d得到斜面菌種；(2)種子培養(yǎng)將步驟(1)制備的斜面菌種接種至種子培養(yǎng)基，35°C，160r/min培養(yǎng)Mh，得種子液；(3)發(fā)酵培養(yǎng)將步驟( 制備的種子液以體積比1 100的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，35°C、160r/min培養(yǎng)Mh，得發(fā)酵液1L，發(fā)酵液中菌體濃度為0. 87g/L ；實(shí)施例5內(nèi)生真菌HL-02制備D-泛解酸內(nèi)酯溶液1 =CaCl2 水溶液50mmol/LTris-HCl 緩沖液0. 2mol/L pH 7. 5溶液 2 =CaCl250mmol/LDL-泛解酸內(nèi)酯乙醇溶液2g/LTris-HCl 緩沖液0. 2mol/L pH 7. 5取20mL實(shí)施例3制備的發(fā)酵液(內(nèi)生真菌HL_2的終濃度以細(xì)胞干重計(jì)為以 0. 50g/L)于已滅菌的50mL離心管中，3000gX5min離心后棄上清，加入IOmL溶液1 (CaCl2 50mmol/L, Tris-HCl 0. 2mol/L, pH 7.5)洗滌，洗去其中的培養(yǎng)基，3000gX 5min 離心后棄上清；再次用溶液1洗滌，3000gX5min離心后棄上清；加入8mL溶液2 (CaCl2 50mmol/L, DL-泛解酸內(nèi)酯 2g/L，Tris-HCl 0. 2mol/L, pH 7. 5)，、160rpm 搖床反應(yīng) M 小時(shí)，制得反應(yīng)液，將反應(yīng)液4000gX5min離心，取上清液于新的50mL離心管中，加入等體積無水乙酸乙酯萃取6次，棄去上層有機(jī)相，向下層水相中加入2mL37%濃鹽酸使?jié)恹}酸終濃度為 300mmol/L,于85°C反應(yīng)60min，反應(yīng)結(jié)束后加入等體積的無水乙酸乙酯萃取1次，取上層有機(jī)相旋蒸，除去其中的乙酸乙酯，得到3. 9mgD-泛解酸內(nèi)酯，收率為4%。
分別將產(chǎn)物D-泛解酸內(nèi)酯、D-泛解酸內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)樣和DL-泛解酸內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)樣(購自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司)進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)，檢測(cè)條件用Varian prostar410 液相色譜儀測(cè)定，柱型ADH θ CE-MD θ 72DAICEL CHEMICAL INDUSTRIES，LTD，流動(dòng)相為正己烷異丙醇=92 8流速lmL/min，檢測(cè)波長215nm，溫度35°C，每針進(jìn)樣20min，結(jié)果見圖 4 =D-泛解酸內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖、圖5 =DL-泛解酸內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖、圖6 :D_泛解酸內(nèi)酯 HPLC 圖。實(shí)施例6內(nèi)生真菌HL-02制備D-泛解酸內(nèi)酯溶液l:CaClyjC溶液50mmol/LTris-HCl 緩沖液0. 2mol/L pH 7. 5溶液 2 =CaCl250mmol/LDL-泛解酸內(nèi)酯乙醇溶液5g/LTris-HCl 緩沖液0. 2mol/L pH 7. 5取20mL實(shí)施例3制備的發(fā)酵液(內(nèi)生真菌HL_2的終濃度以細(xì)胞干重計(jì)為以 0. 50g/L)于已滅菌的50mL離心管中，3000gX5min離心后棄上清，加入IOmL溶液1 (CaCl2 50mmol/L, Tris-HCl 0. 2mol/L, pH 7.5)洗滌，洗去其中的培養(yǎng)基，3000gX 5min 離心后棄上清；再次用溶液1洗滌，3000gX5min離心后棄上清；加入8mL溶液2 (CaCl2 50mmol/L, DL-泛解酸內(nèi)酯 5g/L，Tris-HCl 0. 2mol/L, pH 7. 5)，、160rpm 搖床反應(yīng) M 小時(shí)，制得反應(yīng)液，將反應(yīng)液4000gX5min離心，取上清液于新的50mL離心管中，加入等體積無水乙酸乙酯萃取6次，棄去上層有機(jī)相，向下層水相中加入2mL37%濃鹽酸使?jié)恹}酸終濃度為 300mmol/L,于85°C反應(yīng)60min，反應(yīng)結(jié)束后加入等體積的無水乙酸乙酯萃取1次，取上層有機(jī)相旋蒸，除去其中的乙酸乙酯，得到7. 67mgD-泛解酸內(nèi)酯，收率為19.2%。
實(shí)施例7內(nèi)生真菌HL-02制備D-泛解酸內(nèi)酯溶液 1 =CaCl2 水溶液50mmol/L
Tris-HCl 緩沖液0. 2mol/L pH 7. 5溶液 2 =CaCl250mmol/LDL-泛解酸內(nèi)酯乙醇溶液5g/LTris-HCl 緩沖液0. 2mol/L pH 7. 5取20mL實(shí)施例4制備的發(fā)酵液(內(nèi)生真菌HL_2的終濃度以細(xì)胞干重計(jì)為以 0. 87g/L)于已滅菌的50mL離心管中，3000gX5min離心后棄上清，加入IOmL溶液1 (CaCl2 50mmol/L, Tris-HCl 0. 2mol/L, pH 7.5)洗滌，洗去其中的培養(yǎng)基，3000gX 5min 離心后棄上清；再次用溶液1洗滌，3000gX5min離心后棄上清；加入8mL溶液2 (CaCl2 50mmol/L, DL-泛解酸內(nèi)酯 5g/L，Tris-HCl 0. 2mol/L, pH 7. 5)，、160rpm 搖床反應(yīng) M 小時(shí)，制得反應(yīng)液，將反應(yīng)液4000gX5min離心，取上清液于新的50mL離心管中，加入等體積無水乙酸乙酯萃取6次，棄去上層有機(jī)相，向下層水相中加入2mL37%濃鹽酸使?jié)恹}酸終濃度為 300mmol/L，于85°C反應(yīng)60min，反應(yīng)結(jié)束后加入等體積的無水乙酸乙酯萃取1次，取上層有機(jī)相旋蒸，除去其中的乙酸乙酯，得到8. 56mgD-泛解酸內(nèi)酯，收率為21. 4%。.
權(quán)利要求
1.內(nèi)生真菌HL-2 (Plectosphaereella cucumerina HL-2)，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國武漢武漢大學(xué)，保藏日期2010年12月13日，保藏編號(hào)CCTCC M 2010348。
2.如權(quán)利要求1所述的內(nèi)生真菌HL-2，其特征在于所述的內(nèi)生真菌HL-2的ITS序列為cgtggggatagtacctgatccgaggtcaacCttggtgCCgccgaagcggaCttgtggggg60gtttagaggcaggacgccgaggactcccaatgcgaggcgaatgctactgcgcaaaggaga120gggcccttcgggtccgccactggttttaggggcctgccgtggcagatccccaacgccggg180ccacaggggctcgagggttgaaacgacgctcggacaggcatgcctcccaggatactggaa240ggcgccatgtgcgttcaaagattcgatgattcactgaattctgcaattcacattacatat300CgCgtttCgCtgcgttcttcatcgatgctggagccaagagatccgttgttaaaagttttg360acagttcgctaagaacactcagaagtatcgtcgggttcgaaaacagagattctgatgaga420ccggcgggcaCCCttgCgggcgccgccgaagcaacaggtataatagttcacaaagggtag480agagtgtagtactcagtaatgatccctccgctgtcaccccaccggagaccttgttacg538
3.如權(quán)利要求1或2所述的內(nèi)生真菌HL-2在制備D-泛解酸內(nèi)酯中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用為以DL-泛解酸內(nèi)酯為底物，以內(nèi)生真菌HL-2發(fā)酵所得菌液或菌液制備的初酶液為酶源，20 45°C下，在含有氯化鈣的 Tris-HCl緩沖液的反應(yīng)體系中進(jìn)行水解反應(yīng)得水解液，取水解液用乙酸乙酯進(jìn)行酯化反應(yīng)，反應(yīng)液經(jīng)后處理制得D-泛解酸內(nèi)酯。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述的反應(yīng)體系中DL-泛解酸內(nèi)酯初始濃度為1 5g/L ；所述氯化鈣的質(zhì)量濃度為0. 1 lg/L。
6.如權(quán)利要4所述的應(yīng)用，其特征在于所述的酶源為內(nèi)生真菌HL-2發(fā)酵得到的發(fā)酵液，加入的發(fā)酵液中內(nèi)生真菌HL-2的終濃度以細(xì)胞干重計(jì)為以0. 5 5g/L。
7.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用是將DL-泛解酸內(nèi)酯、酶源，加入到含有氯化鈣的Tris-HCl緩沖溶液的反應(yīng)體系中，并使反應(yīng)體系中DL-泛解酸內(nèi)酯初始濃度為1 5g/L ；所述氯化鈣的質(zhì)量濃度為0. 1 lg/L，所述的酶源為內(nèi)生真菌HL-2發(fā)酵得到的發(fā)酵液，加入的發(fā)酵液中內(nèi)生真菌HL-2的終濃度以細(xì)胞干重計(jì)為0. 5 5g/L，在20 45°C下，進(jìn)行水解反應(yīng)得水解液，取水解液用乙酸乙酯進(jìn)行酯化反應(yīng)，反應(yīng)液經(jīng)后處理制得 D-泛解酸內(nèi)酯。
8.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述的水解反應(yīng)時(shí)間為10 50h。
9.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述的后處理為將反應(yīng)液離心，取上清液加入等體積乙酸乙酯萃取，棄去上層有機(jī)相，下層水相中加入濃鹽酸使HCl的終濃度為100 300mmol/L,于60 95°C反應(yīng)0. 5 5h，反應(yīng)結(jié)束后用等體積乙酸乙酯再次萃取，取上層有機(jī)相旋蒸，制得D-泛解酸內(nèi)酯。
10.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用按如下方法獲得酶源(1)斜面培養(yǎng)將內(nèi)生真菌HL-2接種至斜面培養(yǎng)基20 37°C培養(yǎng)1 7d得到斜面菌種；斜面培養(yǎng)基終濃度組成為胰化蛋白胨10 20g/L、酵母提取物5 10g/L、NaCl 0. 5 2g/L、KCl 0. 1 lg/L、MgCl2 0. 5 5g/L、葡萄糖 2 10g/L，瓊脂粉 10 25g/L，溶劑為水,用5mol/L NaOH溶液調(diào)pH至6. 0 8. 0 ；(2)種子培養(yǎng)將步驟(1)斜面培養(yǎng)的菌種接種至種子培養(yǎng)基，20 37°C，100 250r/ min培養(yǎng)5 72h，得種子液；種子培養(yǎng)基終濃度組成為胰化蛋白胨10 20g/L、酵母提取物 5 10g/L、NaCl 0. 5 2g/L、KCl 0. 1 lg/L、MgCl2 0. 5 5g/L、葡萄糖 2 10g/L, 溶劑為水，用5mol/L NaOH溶液調(diào)pH至6. 0 8. 0 ；(3)發(fā)酵培養(yǎng)將步驟( 經(jīng)種子培養(yǎng)的種子液以體積比1 50 100的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，20 37°C、100 250r/min培養(yǎng)5 72h，得發(fā)酵液；發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為胰化蛋白胨10 20g/L、酵母提取物5 10g/L、NaClO. 5 2g/L、KCl 0. 1 lg/L、 MgCl2 0. 5 5g/L、葡萄糖2 10g/L，溶劑為水，用5mol/L NaOH溶液調(diào)pH至6. 0 8. 0。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種微生物新菌株內(nèi)生真菌HL-02(PlectospHaereella cucumerina HL-2)及其在微生物轉(zhuǎn)化制備D-泛解酸內(nèi)酯中的應(yīng)用，所述的應(yīng)用以DL-泛解酸內(nèi)酯為底物，以內(nèi)生真菌HL-2發(fā)酵所得菌液或菌液制備的初酶液為酶源，20～45℃下，在含有氯化鈣的Tris-HCl緩沖溶液的反應(yīng)體系中進(jìn)行水解反應(yīng)得水解液，取水解液用乙酸乙酯進(jìn)行酯化反應(yīng)，反應(yīng)液經(jīng)后處理制得D-泛解酸內(nèi)酯；本發(fā)明提供了一株新的可產(chǎn)D-泛解酸內(nèi)酯水解酶的微生物菌種內(nèi)生真菌HL-2，該菌種應(yīng)用于拆分DL-泛解酸內(nèi)酯，立體選擇性好，反應(yīng)條件溫和。
文檔編號(hào)C12P41/00GK102229894SQ20111014995
公開日2011年11月2日 申請(qǐng)日期2011年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月3日
發(fā)明者徐爽, 王秋艷, 藍(lán)袁洋, 謝恬, 黃黎鋒 申請(qǐng)人:杭州師范大學(xué)