專利名稱：與陸地棉棉籽油份含量主效qtl緊密連鎖的分子標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種與陸地棉棉籽油份含量主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記及其應(yīng)用， 屬于棉花育種和分子生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
棉籽作為棉纖維生產(chǎn)中的副產(chǎn)品，也是很好的油料資源。在食用油中，亞油酸含量最高的莫過于棉籽油(邱新棉等，1999)。棉籽油的亞油酸含量高達(dá)55.6%，是一種亞油酸含量極高的高級保健油(陳旭升等，200 。同時(shí)作為生物柴油的原料，棉籽油有以下幾個(gè)優(yōu)勢(1)石化柴油的碳鏈分布長度在C15-C18，而棉籽油中脂肪酸的碳鏈長度99%集中在 C16和C18，因此棉籽油具有生物柴油的良好化學(xué)基礎(chǔ)；O)與油菜、大豆相比，棉籽油的價(jià)格較低，利用棉籽油生產(chǎn)生物柴油在經(jīng)濟(jì)上更有利；(3)對棉花而言，皮棉是主產(chǎn)品，棉籽是副產(chǎn)品，用棉籽油生產(chǎn)生物柴油可最大限度地利用資源，提高棉副產(chǎn)品利用率。目前國內(nèi)外對棉籽油份含量的遺傳基礎(chǔ)研究不多，棉籽油份含量的遺傳一般表現(xiàn)為數(shù)量遺傳，受許多微效基因控制。但由于所采用的試驗(yàn)材料和設(shè)計(jì)方法的不同，獲得的結(jié)論也不完全一致，表明棉籽油份含量的遺傳方式是比較復(fù)雜的。王國印等(1991)、季道藩等(1988)、Singh等(1985)均認(rèn)為棉籽油份含量主要受顯性效應(yīng)控制，Kohel等(1980)、 Ramous等(1986)認(rèn)為棉籽的油份含量還受顯著的加性效應(yīng)的影響。Boghra等(1985)的研究結(jié)果表明油份含量的非加性基因作用類型比較普遍。Dani等(1989) Je等Q003)認(rèn)為油份含量的遺傳還存在母體效應(yīng)和上位性效應(yīng)。關(guān)于棉籽油份含量QTL的研究還鮮有報(bào)道。Song等Q007)對棉籽油份含量進(jìn)行 QTL分析，通過兩年的重復(fù)的田間實(shí)驗(yàn)，定位到油份含量主效QTL。棉籽油分含量QTL位于 D8 (Chr. 24)上的BNL3860-NAU1369標(biāo)記區(qū)間，可以解釋29. 的表型變異。但所用材料為海島棉與陸地棉組合Hai71MXTM-l。海島棉雖具有良好的營養(yǎng)品質(zhì)，但產(chǎn)量等主要農(nóng)藝性狀較差，種間雜交的瘋狂分離使得利用海島棉優(yōu)良的基因位點(diǎn)存在一定困難。從陸地棉基因組中挖掘并轉(zhuǎn)育高油份含量等位基因是改良棉籽營養(yǎng)品質(zhì)快速有效的途徑。但目前有關(guān)陸地棉分析棉籽油份含量QTL的研究還未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的在于，提供陸地棉棉籽油份含量主效QTL的分子標(biāo)記及其在棉籽營養(yǎng)品質(zhì)育種中的應(yīng)用。一種與陸地棉棉籽油份含量主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記，是TMB1216。所述的與陸地棉棉籽油份含量主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記，是通過以下方法確定的a)以高油份陸地棉品種DPLSR3為母本和低油份陸地棉品種為父本雜交，得到雜交種F1 ；
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b)由雜交種F1自交獲得F2群體；c)分離各個(gè)&單株葉片的DNA，采用簡單重復(fù)序列標(biāo)記(SSR)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 擴(kuò)增產(chǎn)物在12%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，獲得分子標(biāo)記資料；d)基于遺傳連鎖交換定律，對分子標(biāo)記分析資料構(gòu)建陸地棉種內(nèi)遺傳連鎖圖譜；e)用近紅外分析方法測量F2各單株、F2 : 3各家系的棉籽油份含量；f)結(jié)合F2、F2 : 3兩個(gè)世代群體棉籽油份含量的測定結(jié)果，利用軟件 QTLcartographer V2. 5 (Wang et al. 2001)，采用復(fù)合區(qū)間作圖法(Composite interval mapping) (Zeng, 1994)篩選與陸地棉棉籽油份含量緊密連鎖的QTL位點(diǎn)。篩選到在F2和 F2 ； 3兩個(gè)世代均能穩(wěn)定表達(dá)的棉籽油份含量主效QTL，確定與該主效QTL連鎖的分子標(biāo)記為 TMB1216。所述的與陸地棉棉籽油份含量主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記通過下述方法獲得用陸地棉D(zhuǎn)PLSR3葉片分離的DNA，采用引物5’ AATTTAGTTTCATACACAC3’和 5’ TGGTCACCCATCGTTAAC3’進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在12%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后， 獲得分子標(biāo)記TMB1216，大小為190bp。TMB1216作為陸地棉棉籽油份含量主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記的應(yīng)用還包括 將分子標(biāo)記TMB1216用于陸地棉品種或品系的基因型檢測，以判斷該品種或品系油份含量的大小a)以陸地棉品種DPLSR3及其衍生品種或品系為父本或母本與其它陸地棉品種雜交并繁衍至F2代及以上；b)對通過步驟a)獲得的陸地棉單株，分離葉片DNA，檢測分離的DNA中是否存在棉籽油份含量主效QTL相連鎖的分子標(biāo)記；存在所述分子標(biāo)記的陸地棉品種DPLSP3的衍生品種或品系的棉籽油份含量顯著高于不存在所述分子標(biāo)記的陸地棉品種DPLSP3的衍生品種或品系。所用陸地棉品種DPLSR3衍生品種或品系是指以陸地棉品種DPLSR3為親本，通過常規(guī)雜交、或采用組織培養(yǎng)、遺傳轉(zhuǎn)化方法獲得的陸地棉衍生品種或品系。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于充分發(fā)揮分子標(biāo)記TMB1216輔助選擇的特長，利用分子標(biāo)記 TMB1216輔助選擇不受環(huán)境條件的影響的特點(diǎn)，通過檢測分子標(biāo)記可以預(yù)測棉籽油份含量的大小，在低世代就可以對陸地棉新品系的棉籽油份含量進(jìn)行選擇。采用分子標(biāo)記TMB1216 輔助選擇不僅準(zhǔn)確性高，加快選擇進(jìn)度，同時(shí)也將大大減少了育種的工作量，提高了育種效率，克服了常規(guī)育種周期長、后期篩選工作量大、對品種或品系進(jìn)行鑒定的效率低等缺陷和不足。


圖1是F2、F3世代在13號染色體上棉籽油份含量主效QTL分析的LOD值分布圖。 注實(shí)線表示F2世代的LOD值分布，虛線表示F3世代的LOD值分布。圖2是部分單株分子標(biāo)記鑒定電泳圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
與陸地棉棉籽油份含量主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記是通過以下方法獲得的(1)群體的構(gòu)建及棉籽油份含量的測定以高油份陸地棉品種DPLSR3為母本，以低油份陸地棉品種鹽城115為父本，2008 年于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院溧水植物實(shí)驗(yàn)基地配置雜交組合，同年年底海南南繁F1,自交產(chǎn)生 F2。2009年在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院溧水植物基地種植F2及親本，共151個(gè)F2單株，收獲F2種子，對F2種子脫絨并烘干，用近紅外分析方法(徐鵬，等2010)測量F2的油份含量。2010年種植F2 3株行，按株行收種，同樣對種子進(jìn)行脫絨并烘干，用近紅外分析方法測量F2 3的油份含量。(2)遺傳圖譜構(gòu)建及QTL定位采用SSR標(biāo)記進(jìn)行棉籽油份含量QTL的篩選，首先用覆蓋整個(gè)棉花基因組的1221 對SSR引物對親本進(jìn)行多態(tài)性篩選，SSR引物序列可從http //www. cottonmarker. org網(wǎng)站上獲得。這些SSR引物中，其中以BNL編號的引物為布魯克海文國家實(shí)驗(yàn)室(美國)開發(fā)， 用NAU編號的為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)(中國)開發(fā)，CHR編號的為國際農(nóng)業(yè)研究發(fā)展中心(法國) 開發(fā)，JESra編號的為德州農(nóng)工大學(xué)(美國)開發(fā)，以TMB編號的為美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究所服務(wù)署開發(fā)，DPL編號的為Delta and Pine Land公司(美國)開發(fā)。引物由上海英俊公司合成。SSR擴(kuò)增反應(yīng)體系為 10ul，其中 IOXBuffer 1. 5ul,Mg2+Iul, IOmM dNTPO. 5ul, IOuM引物Iul，模板DNA lul，taq酶0. Iul，超純水4. 4ul。PCR反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性!Min ；94°C 變性30s，55°C退火45s，72°C延伸lmin，35個(gè)循環(huán)；72°C延伸IOmin ；4°C保存。擴(kuò)增產(chǎn)物在 12%的聚丙烯凝膠中(100ml聚丙烯酰胺膠溶液中含有11. 6克丙烯酰胺和0. 4克甲叉雙丙烯酰胺)電泳，凝膠銀染，記錄結(jié)果。利用MapMaker/EXP 3. 0b (Lander et al. 1987)軟件構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，采用Kosambi作圖函數(shù)(Kosambi，1944)。結(jié)合F2、F2 ； 3兩個(gè)世代群體棉籽油份含量的測定結(jié)果，利用軟件QTL cartographer V2. 5 (Wang et al. 2001)，采用復(fù)合區(qū)間作圖法(Composite interval mapping) (kng，1994)篩選與陸地棉棉籽油份含量緊密連鎖的QTL位點(diǎn)。walk speed = 2cM，采用模型6分析，對每個(gè)性狀進(jìn)行1000次permutation test,以確定每個(gè)性狀的LOD閾值(顯著水平0. 05)。篩選到在F2和F2 3兩個(gè)世代均能穩(wěn)定表達(dá)的棉籽油份含量主效QTL確定與該主效QTL連鎖的分子標(biāo)記為TMB1216，兩個(gè)世代中 LOD值分別為3. 1、3. 9，分別可以解釋9. 21 %、12. 01 %的表型變異。實(shí)施例2 與陸地棉棉籽油份含量主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記在遺傳群體中得驗(yàn)證利用大小為190bp的分子標(biāo)記TMB1216對陸地棉品種DPLSR3的衍生品系進(jìn)行棉籽油份含量進(jìn)行篩選鑒定對象采用陸地棉品種DPLSR3與鹽城115雜交，繁衍到F3代，將它們作為棉籽油份含量大小的鑒定對象。鑒定過程a)利用與陸地棉棉籽油份含量主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行鑒定先從各鑒定對象的葉片采用CTAB提取方法進(jìn)行分離提取獲得的DNA， 然后用分子標(biāo)記 TMB1216 的弓丨物 5，AATTTAGTTTCATACACAC3，(SEQ ID NO 1)和 5，TGGTCACCCATCGTTAAC3，(SEQ ID NO 2)分別對這些DNA進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，分離提取DNA以及PCR擴(kuò)增和電泳分離過程與實(shí)施例1相同。當(dāng)PCR擴(kuò)增、電泳分離后存在相應(yīng)的分子標(biāo)記時(shí)，記錄為“ + ”，否則記錄為“_”(圖2)。b)將經(jīng)過分子標(biāo)記鑒定的株系，后續(xù)兩年田間試驗(yàn)將以上鑒定材料分別于2009、2010年種植于江蘇省農(nóng)科院溧水植物基地。在所有鑒定株系中，32個(gè)“ + ”型條帶的株系，平均棉籽油份含量為32. 10%，37個(gè)“-”型條帶的株系，平均棉籽油份含量為觀.98%，F(xiàn)測驗(yàn)分析表明油份含量差異顯著。因此，當(dāng)PCR擴(kuò)增、 電泳分離后存在分子標(biāo)記TMB1216時(shí)，該株系棉籽油份含量顯著大于當(dāng)PCR擴(kuò)增時(shí)電泳分離后不存在分子標(biāo)記TMB1216的株系。棉籽油份含量測量結(jié)果與分子標(biāo)記鑒定對應(yīng)的記錄在表1中。以上各實(shí)施例不是對本發(fā)明的具體限制，只要在權(quán)利要求的限定范圍內(nèi)，結(jié)合本領(lǐng)域的基本常識(例如鑒定對象是通過以陸地棉品種DPLSR3為親本，通過常規(guī)雜交、或采用組織培養(yǎng)、遺傳轉(zhuǎn)化方法獲得的陸地棉衍生品種或品系等)，運(yùn)用本發(fā)明的公開的分子標(biāo)記，借助本發(fā)明公開的方法對陸地棉品種DPLSR3的衍生品種或品系的基因型檢測以判斷該衍生品種或品系棉籽油份含量的大小，都屬于本發(fā)明的保護(hù)范疇。表1 DPLSP3和鹽城115的F2后代的植株棉籽油份含量測量結(jié)果
分子標(biāo)分子標(biāo)
株系記結(jié)果油份含量測量結(jié)果株系記結(jié)果油份含量測量結(jié)果號TMB20092010平均號TMB20092010平均1216(%)(%)(%)1216(%)(%)(%)D7+33.7934.0433.92D5-29.529.829.65D8+31.1531.0531.10D6-2928.0728.54D13+30.5131.7731.14Dll_25.5825.4925.5權(quán)利要求
1.一種與陸地棉棉籽油份含量主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記，是TMB1216。
2.一種與陸地棉棉籽油份含量主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記，是通過以下方法確定的a)以高油份陸地棉品種DPLSR3為母本和低油份陸地棉品種為父本雜交，得到雜交種F1;b)由雜交種F1自交獲得F2群體；c)分離各個(gè)F2單株葉片的DNA，采用簡單重復(fù)序列標(biāo)記(SSR)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，獲得分子標(biāo)記資料；d)基于遺傳連鎖交換定律，對分子標(biāo)記資料分析構(gòu)建陸地棉種內(nèi)遺傳連鎖圖譜；e)用近紅外分析方法測量F2各單株、F213各家系的棉籽油份含量；f)結(jié)合F2、F2:3兩個(gè)世代群體棉籽油份含量的測定結(jié)果，利用軟件QTLcartographer V2. 5，采用復(fù)合區(qū)間作圖法篩選與陸地棉棉籽油份含量緊密連鎖的QTL位點(diǎn)；篩選到在F2 和F2:3兩個(gè)世代均能穩(wěn)定表達(dá)的棉籽油份含量主效QTL，確定與該主效QTL連鎖的分子標(biāo)記為 TMB1216。
3.權(quán)利要求1所述的與陸地棉棉籽油份含量主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記，其特征在于，用陸地棉D(zhuǎn)PLSR3葉片分離的DNA，采用引物5 ’ AATTTAGTTTCATACACAC3，和5 ’ TGGTCACCCATCGTTAAC3 ’進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在1 聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，獲得分子標(biāo)記TMB1216，大小為190bp。
4.如權(quán)利要求1所述的與陸地棉棉籽油份含量主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記應(yīng)用，其特征在于a)以DPLSR3及其衍生品種或品系為父本或母本與其它陸地棉品種雜交并繁衍至F2代及以上；b)對通過步驟a)獲得的陸地棉單株，分離葉片DNA，檢測分離的DNA中是否存在于棉籽油份含量主效QTL相連鎖的分子標(biāo)記；存在所述分子標(biāo)記的陸地棉品種DPLSP3的衍生品種或品系的棉籽油份含量顯著高于不存在所述分子標(biāo)記的陸地棉品種DPLSP3的衍生品種或品系。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的分子標(biāo)記的應(yīng)用，其特征在于將分子標(biāo)記用于陸地棉品種或品系的基因型檢測，以判斷該品種或品系棉籽油份含量的大小。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種與陸地棉棉籽油份含量主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。所說的與陸地棉棉籽油份含量主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記，是TMB1216?？蓪⒎肿訕?biāo)記TMB1216用于陸地棉品種或品系的基因型檢測，以判斷該品種或品系油份含量的大小。本發(fā)明采用分子標(biāo)記TMB1216輔助選擇不僅準(zhǔn)確性高，加快選擇進(jìn)度，同時(shí)也將大大減少了育種的工作量，提高了育種效率，克服了常規(guī)育種周期長、后期篩選工作量大、對品種或品系進(jìn)行鑒定的效率低等缺陷和不足。
文檔編號C12Q1/68GK102250888SQ20111014958
公開日2011年11月23日 申請日期2011年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月4日
發(fā)明者倪萬潮, 張香桂, 徐鵬, 沈新蓮, 郭書巧, 郭婷婷 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院