專利名稱：大白菜控制器官大小基因BrGRF5及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種控制大白菜器官的基因，特別是一種控制大白菜器官大小的 BrGRF5基因及其應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
發(fā)掘和利用與重要經(jīng)濟(jì)性狀有關(guān)的功能基因是實現(xiàn)農(nóng)作物優(yōu)良品種培育的有效途徑。在作物育種史上，凡是突破性的成就，都與關(guān)鍵基因的利用密不可分。20世紀(jì)50年代，由于美國通過對抗胞囊線蟲基因的有效利用，從而使得大豆總產(chǎn)量超過中國，躍居世界第一，并一直保持至今；60年代，矮桿基因的應(yīng)用導(dǎo)致世界糧食的“綠色革命”和糧食產(chǎn)量的飛躍；70年代，袁隆平先生對水稻野生不育基因的改良催生了中國雜交水稻的誕生并轟動世界；90年代，世界種業(yè)巨頭對重要基因資源系統(tǒng)性地研究和應(yīng)用導(dǎo)致了他們在中國的迅猛擴(kuò)張。蔬菜是我們?nèi)粘Ｉ畹谋匦杵贰Ｎ覈诖_保糧食安全生產(chǎn)的同時，也非常重視“菜籃子”工程的建設(shè)。大白菜起源于中國，是我國的特色蔬菜。據(jù)調(diào)查，在黃河以北地區(qū)，秋冬大白菜的種植面積占秋菜種植面積的50%左右，東北地區(qū)可達(dá)60%左右。大白菜生長期較短，生產(chǎn)成本低、產(chǎn)量高，且價格低，尤其在秋冬大白菜的收獲季節(jié)，其價格是所有蔬菜中最低的。因此，它適合于城鎮(zhèn)中低收入水平的家庭和廣大農(nóng)民的要求，可以算得上是一般家庭的“當(dāng)家菜”。由于大白菜在我國及東亞國家的蔬菜生產(chǎn)和消費(fèi)中占有舉足輕重的地位，因此，挖掘大白菜重要功能基因并用于遺傳改良顯得十分重要。器官大小是大白菜的一個重要經(jīng)濟(jì)性狀。有效利用控制大白菜器官大小的基因， 在分子水平上有目的調(diào)控器官的大小和形態(tài)，可以滿足市場對大白菜的不同需求。因此，控制器官大小在提高大白菜產(chǎn)量和質(zhì)量方面具有極為重要的意義。不同物種間，植物種子和器官大小有著顯著的差異，但在物種內(nèi)個體之間器官的大小相對一致，說明植物器官的大小是受遺傳控制。在植物體中存在著控制器官大小的基因，它們通過協(xié)調(diào)細(xì)胞分裂和生長來決定器官大小。器官大小通常和細(xì)胞數(shù)目相聯(lián)系，已有的研究表明在器官發(fā)育過程中細(xì)胞分裂受嚴(yán)格控制。例如，在煙草中過量表達(dá)SUPERMAN 基因可導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)目減少從而造成植株矮小。擬南芥struwwelpeter突變體由于地上器官中細(xì)胞數(shù)目減少，產(chǎn)生了侏儒表型。擬南芥AINTEGUMENTA (ANT)基因功能缺失突變體減小了葉、花的大小和數(shù)目，而ANT基因的異位表達(dá)增大了營養(yǎng)器官(如葉和莖)和花器官。 ANT基因主要通過影響總細(xì)胞數(shù)目和細(xì)胞分裂程度來改變成熟器官的大小。該基因并不控制細(xì)胞生長速率和細(xì)胞周期，而是在器官形成過程中調(diào)節(jié)器官生長和細(xì)胞分裂。這些結(jié)果表明ANT基因很可能維持與生長相協(xié)調(diào)的持續(xù)的細(xì)胞分裂。ANT基因功能缺失致使細(xì)胞有絲分裂減少，細(xì)胞生長提前終止，從而使器官減小。相反，ANT基因過量表達(dá)的植株能使自身細(xì)胞比正常細(xì)胞生長和分裂時間更長，因而使器官增大。ANT基因的功能并不僅限于擬南芥，35S: :ANT的表達(dá)也使轉(zhuǎn)基因煙草植株增大。ANT基因編碼一個具有AP2-domain的轉(zhuǎn)錄因子，它的同源基因已經(jīng)從其它植物中分離出來。油菜BANT基因在擬南芥中異位表達(dá)也使擬南芥器官增大，這進(jìn)一步支持了不同植物中ANT基因在控制器官大小方面具有保守的功能。ARGOS基因在ANT基因的上游起作用并影響器官細(xì)胞的分裂能力。表達(dá)正義或反義 ARGOS基因的植株器官分別增大或減小，這是因為細(xì)胞數(shù)目和器官生長持續(xù)時間的變化而改變了器官大小。GIFl蛋白是人類SYT轉(zhuǎn)錄共激活因子的同源蛋白。通過對GIFl功能缺失突變體以及特異抑制GIFl功能的RNAi轉(zhuǎn)基因擬南芥的研究發(fā)現(xiàn)。突變體和轉(zhuǎn)基因植株都產(chǎn)生了較窄的葉和花瓣。較窄的葉是由在葉寬軸方向上的細(xì)胞數(shù)目減少引起的。這些結(jié)果說明GIFl基因參與了調(diào)節(jié)葉和花瓣的生長和形狀。
植物器官的最終大小不僅與細(xì)胞數(shù)目，而且與細(xì)胞體積有關(guān)。最近的研究表明，不同的細(xì)胞體積或細(xì)胞的極性伸長都能導(dǎo)致植物器官大小改變。例如，擬南芥angutifolia 突變體影響葉寬方向的細(xì)胞延伸從而產(chǎn)生了較窄的葉。相反過量表達(dá)AtEXPIO、ARL和 AtGRFl基因都能促進(jìn)細(xì)胞延伸從而產(chǎn)生較大的器官。R0T3基因調(diào)節(jié)葉長方向的細(xì)胞生長并決定器官長度。由于細(xì)胞體積變大，e2ff-l突變體產(chǎn)生了較長的根和下胚軸。拓?fù)涿竀I 突變后導(dǎo)致細(xì)胞不能正常擴(kuò)張從而產(chǎn)生矮小的植株。擬南芥BIGPETAL (BPE)基因編碼轉(zhuǎn)錄因子，該基因的下調(diào)表達(dá)促進(jìn)花瓣細(xì)胞擴(kuò)張從而產(chǎn)生較大的花瓣。GRF是一類轉(zhuǎn)錄因子家族，在擬南芥中由9個成員組成。研究發(fā)現(xiàn)，過量表達(dá) AtGRFl和AtGGRF2使擬南芥產(chǎn)生了較大的葉和子葉，與野生型擬南芥相比轉(zhuǎn)基因植株抽苔時間延遲。相反，AtGRFl-AtGRF3三突變體產(chǎn)生了較小的葉和子葉，而單突變體沒有表型。 轉(zhuǎn)基因植株和三突變體葉的變化是細(xì)胞體積的增加或減小引起的。然而，在擬南芥中過量表達(dá)AtGRF5同樣可提高轉(zhuǎn)基因植株器官的大小，但其機(jī)制在于促進(jìn)或者維持了細(xì)胞的分離能力，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)目的多少達(dá)到調(diào)節(jié)植物器官大小的目的。這些結(jié)果表明，GRF家族成員可正調(diào)控植物器官的大小，但成員之間的調(diào)控機(jī)制存在一定的差異。因此，如果能夠找到控制大白菜器官大小的基因并加以利用，可以對大白菜品質(zhì)的改良起到非常關(guān)鍵的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種控制大白菜營養(yǎng)器官大小的BrGRF5基因及其應(yīng)用。一種控制大白菜營養(yǎng)器官大小的BrGRF5基因，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所
7J\ ο一種由上述BrGRF5基因編碼的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。一種插入上述SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的載體。一種重組細(xì)胞，插入了上述SEQ ID No. 1所示核苷酸序列或含有SEQ ID No. 1序列的載體。上述BrGRF5基因、載體或重組細(xì)胞在經(jīng)濟(jì)作物生產(chǎn)改良中的應(yīng)用。有益效果本發(fā)明從大白菜中克隆了一個BrGRF5基因，并驗證了該基因具有控制植物器官大小的功能，經(jīng)試驗，通過過量表達(dá)該基因，可以獲得比野生型植株產(chǎn)量更高的轉(zhuǎn)基因作物 (如圖1所示)。本發(fā)明的基因可為培育農(nóng)作物新品種提供理論依據(jù)和基因來源。


圖1為本基因在擬南芥中過量表達(dá)后與野生型擬南芥植株的對比照片；A為野生型植株，B為BrGRF5過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步描述，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。實施例基因的分離與轉(zhuǎn)化 以大白菜福山包頭10天苗齡幼苗的地上部分為材料，取至液氮預(yù)冷的研缽中，力口入液氮快速磨成粉末，將IOOmg粉末裝入1.5ml離心管中，加入Iml Trizol (Invitrogen 公司出售)顛倒混勻，室溫靜置10分鐘。在4。C，12000rpm離心10分鐘，取上清液移至新的1. 5ml離心管中。加入200 μ 1氯仿，用手劇烈搖晃15秒鐘，室溫靜置2_3分鐘。4°C， 12000rpm離心10分鐘。取無色上層水相至一新的離心管中，加入600 μ 1_20°C冰箱預(yù)冷異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10分鐘。4。C，12000rpm離心10分鐘，吸去上清液。加入Iml 75%乙醇，渦旋震蕩。4°C，7500rpm離心3分鐘。室溫干燥3_5分鐘，加入30 μ 1的無RNase 水溶解沉淀，然后置于55°C水浴中溶解10分鐘，迅速冰浴5分鐘后瞬時離心。利用RT-PCR方法擴(kuò)增BrGRF5基因的編碼序列。具體操作方法如下首先，將mRNA反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA，所用反轉(zhuǎn)錄酶為Takara公司生產(chǎn)的M-MLV reversetranscriptase,反應(yīng)體系為 20 μ 1。依次力口入 Ιμ oligo dT>2 μ g RNA 禾口無 RNase水至13. 5 μ 1，在70°C水浴中變性5分鐘，迅速冰浴5分鐘，瞬時離心，然后依次加入 1 μ 1 IOmM dNTP,4y 15 X RT 緩沖液，0· 5 μ 1 RNase inhibitor 禾Π 1 μ 1 M-MLV reverse transcriptase。輕輕混合均勻，42°C反應(yīng)60分鐘，70°C水浴10分鐘使酶失活。以第一鏈 cDNA為模板擴(kuò)增目的基因，所用引物為BrGRF5-F 5' -CGGGATCCATGATGAACCTAAGTGGAACTAGTG-3，(SEQ ID NO. 3)BrGRF5-R 5' -TAGTCGACTCAGCTACCAGTGTCGAGTCTTGAC-3，(SEQ ID NO. 4)PCR 反應(yīng)體系為 25μ 1，依次加入 10XPCR 緩沖液 2· 5μ 1，2μ 1 2. 5mM dNTP, 2μ 1反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，正向引物0.5μ I(IOmM)，反向引物0.5μ I(IOmM)，5U/1 Taq DNA聚合酶 0. 25 μ 1，最后加水至25 μ 1。PCR反應(yīng)條件預(yù)變性94°C 3分鐘；變性94°C 30秒，退火58°C 30秒，延伸72°C 2 分鐘，30個循環(huán)；最后延伸10分鐘，4°C保存。瓊脂糖凝膠電泳后將PCR產(chǎn)物裝入pUC18DNA vector中pUC18DNA vector由 Takara公司產(chǎn)售。將PCR產(chǎn)物與pUC18DNA vector進(jìn)行連接反應(yīng)，連接體系10 μ 1，各組分為Ιμ pUC18DNA vector,2y 1 PCR產(chǎn)物，5 μ 1連接酶液，加水至10 μ 1。在16°C水浴中連接30分鐘，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞。將連接好的載體進(jìn)行測序，確認(rèn)正確無誤。用Takara公司生產(chǎn)的BamHI和SalI酶切，操作如下酶切體系50μ 1，包括7. 5μ 1 10 X T緩沖液，20 μ 1已插入片段的載體，2 μ 1 BamHI, 2 μ ISalI 禾Π 18. 5 μ 1 水。在 37°C水浴 4 個小時。用杭州博日科技有限公司產(chǎn)售的Biospin Gel Extraction Kit回收基因片段，操作如下用干凈、鋒利的手術(shù)刀，將含有目的DNA片段的瓊脂糖凝膠切下，并放入1. 5ml離心管中。按1 3的比例加入Extraction buffer。于50°C恒溫水浴中直到凝膠融化。將混合液全部轉(zhuǎn)入Spin column內(nèi)，于6000rpm離心1分鐘，棄去接液管內(nèi)液體。向Spin column 中加入500μ1 Extraction buffer，于12000rpm離心1分鐘，棄去接液管內(nèi)液體。向Spin column中加入750 μ 1 Wash Buffer，于12000rpm離心1分鐘,棄去接液管內(nèi)液體。再次于 12000rpm離心1分鐘，然后將Spin column轉(zhuǎn)移至無菌的1. 5ml離心管內(nèi)。向Spin column 中加入50 μ 1 Elution Buffer,并于室溫放置1分鐘 。12000rpm離心1分鐘，收集DNA溶液。將回收的基因片段連接入植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S-0CS中，操作如下連接體系10μ 1，包括1μ 1 pCAMBIA2300-35S-0CS，5y 1回收的基因片段，1μ 1 10ΧΤ4連接酶緩沖液和ι μ 1 Τ4連接酶，最后加水至 ομ 1，在16°C下連接12小時，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。將構(gòu)建好的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404中，操作如下取100 μ 1農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，加入3 μ 1構(gòu)建好的質(zhì)粒DNA，冰浴5分鐘，液氮冷凍1分鐘，37°C水浴5分鐘，然后加入Iml LB培養(yǎng)基(1升LB培養(yǎng)基含5g酵母提取物，IOg胰蛋白胨，IOg氯化鈉)，28°C， 200rpm振蕩3小時。IOOOOrpm離心1分鐘，棄上清，加入100 μ 1 LB培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，涂布于含有50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平的LB平板培養(yǎng)基上(1升LB平板培養(yǎng)基含5g酵母提取物，IOg胰蛋白胨，IOg氯化鈉，15g瓊脂)，28°C培養(yǎng)2-3天。選取莖轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌LBA4404，通過浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥(Columbia ecotype)。 操作如下將農(nóng)桿菌菌落接種于5ml LB培養(yǎng)基中，28°C，200rpm振蕩過夜。按1/50接種于 200ml含相同抗生素的新鮮培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD6tltl為1. 0,4500rpm離心5分鐘收集菌體，重懸于侵染液中。轉(zhuǎn)化所用侵染液含有5%蔗糖，0.03% Tween(吐溫)-20。將擬南芥的花序浸入侵染液中30秒鐘，把花盆側(cè)放于托盤中，蒙上地膜避光24小時，第二天取下地膜，將花盆直立。制備1/2MS篩選平板(1/2MS培養(yǎng)基加50mg/L卡那霉素，100mg/L羧芐青霉素)， T1代種子莖70%乙醇消毒5分鐘，2%次氯酸鈉消毒10分鐘后播種于1/2MS篩選平板，每板播種IOOyg的擬南芥種子。4°C春化3天后放于培養(yǎng)箱(22°C，16小時光照/8小時黑暗) 中。6天后選出綠色的生長正常的陽性植株，移入蛭石中培養(yǎng)，單株收獲T2代種子。繁殖并鑒定T3代，獲得純合的轉(zhuǎn)基因株系10個?；蚬δ艿蔫b定T3代純合體株系和野生型擬南芥種子在冰箱中春化3天，消毒后將種子播于含 50mg/L卡那霉素的1/2MS培養(yǎng)基平板。于22°C，16小時光照/8小時黑暗培養(yǎng)箱中6天。 待幼苗子葉完全張開后，將轉(zhuǎn)基因株系和野生型幼苗轉(zhuǎn)入蛭石中，然后置于培養(yǎng)間(22°C， 16小時光照/8小時黑暗)中培養(yǎng)。培養(yǎng)30天后觀察轉(zhuǎn)基因株系和野生型植株的表型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系的各個器官比野生型的對應(yīng)器官顯著增大，具體實驗數(shù)據(jù)請參見表1，說明BrGRF5基因的過量表達(dá)促進(jìn)植物器官增大，從而增加生物量。表1超量表達(dá)BrGRF5與對照的比較(P彡0. 05)
權(quán)利要求
1.一種控制大白菜器官大小的BrGRF5基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
2.一種由上述BrGRF5基因編碼的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
3.—種插入上述SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的載體。
4.一種重組細(xì)胞，其特征在于，插入了上述SEQ ID No. 1所示核苷酸序列或含有SEQ IDNo. 1序列的載體。
5.如權(quán)利要求1所述BrGRF5基因、權(quán)利要求3所述載體或權(quán)利要求4所述重組細(xì)胞在經(jīng)濟(jì)作物生產(chǎn)改良中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種控制大白菜器官的基因，特別是一種控制大白菜器官大小的BrGRF5基因及其應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。一種控制大白菜營養(yǎng)器官大小的BrGRF5基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本發(fā)明從大白菜中克隆了一個BrGRF5基因，并驗證了該基因具有控制植物器官大小的功能，經(jīng)試驗，通過過量表達(dá)該基因，可以獲得比野生型植株產(chǎn)量更高的轉(zhuǎn)基因作物。本發(fā)明的基因可為培育農(nóng)作物新品種提供理論依據(jù)和基因來源。
文檔編號C12N1/21GK102229935SQ20111014945
公開日2011年11月2日 申請日期2011年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月3日
發(fā)明者劉立鋒, 李利斌, 李化銀, 王鳳德, 高建偉 申請人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所