棉花的內(nèi)生真菌cef-193及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及植物病理學(xué)，具體地涉及棉花的內(nèi)生真菌CEF-193及其應(yīng)用。本發(fā)明從棉花的內(nèi)生真菌入手，通過分離、篩選、鑒定、溫室的生物測定，獲得對棉花黃萎病具有顯著誘導(dǎo)免疫作用的菌株CEF-193(Acremonium?alternatum)，保藏編號為CGMCC?No.8302，CEF-193能夠在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)，容易獲得和培養(yǎng)，以利于工廠化生產(chǎn)和推廣應(yīng)用。室內(nèi)抑菌試驗表明，對黃萎病控制效果好，先接種CEF-193，4天后接種大麗輪枝菌，對棉花黃萎病的防治效果達(dá)到74.1％，對黃萎病有顯著的控制作用，與生產(chǎn)上應(yīng)用較多的枯草芽孢桿菌相比，防治效果提高40％左右，對人畜、昆蟲和作物安全，環(huán)境友好。
【專利說明】棉花的內(nèi)生真菌CEF-193及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物病理學(xué)，具體地涉及棉花的內(nèi)生真菌CEF-193及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]由大麗輪枝菌引起的黃萎病是世界性的棉花重要病害之一，由于缺乏真正有效的抗病品種或者是抗病品種的抗病性極易喪失，使得最經(jīng)濟(jì)有效的防治措施不能發(fā)揮其主導(dǎo)作用。90年代以來，該病在我國各大棉區(qū)爆發(fā)成災(zāi)，年發(fā)生面積為300萬公頃左右，產(chǎn)量損失約I億公斤皮棉，成為發(fā)展棉花生產(chǎn)的主要限制因子之一。由于輪作倒茬難，缺乏抗病品種，化學(xué)藥劑防治效果差，缺乏具有較好防治效果的農(nóng)藥，致使目前生產(chǎn)上對黃萎病的防治幾乎是空白。
[0003]利用有益微生物控制植物病害的發(fā)生危害具有經(jīng)濟(jì)、環(huán)境友好的特點。目前利用拮抗微生物防治棉花黃萎病研究較多的是枯草芽孢桿菌，作用機(jī)理是產(chǎn)生桿菌肽等多種抗菌物質(zhì)來抑制病原菌，對黃萎病的防治具有一定的效果，但是在生產(chǎn)應(yīng)用中存在不少問題，其中最主要的問題是防治效果較低，國內(nèi)登記的枯草芽孢桿菌劑型對棉花黃萎病的防治效果在50 %左右，且在不同年份效果不穩(wěn)定。例如2008年和2009年，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所承擔(dān)國家農(nóng)藥登記試驗中(任務(wù)來源于農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥鑒定所)，黑龍江強(qiáng)爾生化技術(shù)開發(fā)區(qū)有限公司生產(chǎn)的1000億活芽孢/克枯草芽孢桿菌可濕性粉劑對棉花黃萎病的防治效果為46.0-52.9%，但在2010年大面積試驗中防治效果只有32.7%。[0004]植物內(nèi)生真菌資源是個巨大的寶庫，目前對內(nèi)生真菌的研究還處于早期階段，所研究的植物類群不過數(shù)百種，僅涉及到很小的一部分。近年來，由于內(nèi)生真菌在病蟲害的生物防治、醫(yī)藥工業(yè)上的用途和范圍逐漸增大，因此有關(guān)內(nèi)生真菌的研究逐漸受到重視。
[0005]棉花黃萎病是一種土傳維管束真菌病害，從棉花的內(nèi)生真菌入手，分離篩選對黃萎病菌具有抑制活性的菌株，獲得對該病控制效果好的生防菌株，是值得探討的棉花黃萎病防治的新途徑。本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)多年的研究，從健康棉花的莖桿中獲得一株內(nèi)生真菌，經(jīng)溫室苗期試驗對棉花黃萎病的防治效果達(dá)74.1%，對棉花黃萎病的防治具有巨大的潛倉泛。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為解決現(xiàn)有的拮抗微生物防治棉花黃萎病效果較差的問題，提出并完成本發(fā)明。
[0007]本發(fā)明的目的是提供棉花的內(nèi)生真菌CEF-193。
[0008]本發(fā)明的再一目的是提供上述棉花的內(nèi)生真菌CEF-193在棉花黃萎病防治中的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明從棉花的內(nèi)生真菌入手，通過分離、篩選、鑒定、抑菌測定及溫室的生物測定，獲得對棉花黃萎病具有顯著控制作用的菌株CEF-193 (Acremonium alternatum),其保藏編號為=CGMCC N0.8302，該菌株經(jīng)鑒定是一株支頂孢屬真菌。
[0010]該菌株是一株棉花的內(nèi)生真菌，在分離時，首先要選擇健康的棉株，最重要的是，在分離過程中，一定要保證樣品的表面消毒徹底，確保分離到的是棉花的內(nèi)生真菌。以傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定為基礎(chǔ)，結(jié)合分子生物學(xué)的手段，對篩選到的菌株進(jìn)行鑒定，最后獲得目的菌株。
[0011]生防菌通?？衫酶偁?、抗生、寄生和交叉保護(hù)等直接的拮抗機(jī)制抑制植物病害；同時某些生防菌還能促進(jìn)植物生長，誘導(dǎo)植物對真菌、細(xì)菌和病毒引起的病害乃至對線蟲和昆蟲為害的抗性，稱為誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性(ISR)，又稱獲得性抗病性，是植物在一定的生物或非生物因子的刺激或作用下，產(chǎn)生對隨后病原物侵染的抗性。誘導(dǎo)的系統(tǒng)抗病性(或免疫作用)優(yōu)于化學(xué)防治和抗病育種，其優(yōu)點如下:(I)免疫作用能有效地防治病毒、細(xì)菌和真菌病害。(2)免疫作用是穩(wěn)定的，它決定幾種不同的機(jī)制，而內(nèi)吸殺菌劑往往具有單一的作用位點，容易產(chǎn)生新的抗藥小種，因而是不穩(wěn)定的。(3)免疫作用是系統(tǒng)的、持久的，瓜類中的免疫作用可通過嫁接，從砧木傳導(dǎo)到接穗。(4)在感病植物中亦具有免疫能力，說明潛在的抗病基因存在于所有的植物中。(5)免疫物質(zhì)，可從免疫植株的化學(xué)提取物中獲得，可在田一間噴施或種子處理。
[0012]本發(fā)明獲得的生防菌株CEF-193來自棉株體內(nèi)，通過用生防菌株的培養(yǎng)濾液來浸泡棉花種子，使棉花獲得對黃萎病的免疫作用。使用方法簡單，適宜生產(chǎn)上推廣用用。
[0013]利用棉花的內(nèi)生真菌CEF-193來控制棉花黃萎病在以下三方面產(chǎn)生有益效果。
[0014]UCEF-193能夠在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)，容易獲得和培養(yǎng)，用于生物防治的菌株必須能夠在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以利于工廠化生產(chǎn)和推廣應(yīng)用。CEF-193是一株棉花的內(nèi)生真菌，在土壤中廣泛存在，能侵染多種作物，也是美花石斛、高羊茅等植物的優(yōu)勢內(nèi)生真菌。該菌株在PDA、查氏及玉米沙粒培養(yǎng)基上生長良好，有利于大量繁殖和推廣應(yīng)用。
[0015]2、CEF-193對棉花黃萎病菌具有較好的抑制效果。在PDA培養(yǎng)基上，CEF-193和棉花黃萎病菌Verticillium dahliae對扣培養(yǎng)時，黃萎病菌的菌落直徑為57mm，空白對照的菌落直徑為9_，表明CEF-193產(chǎn)生的揮發(fā)性代謝物對黃萎病菌抑菌效果達(dá)到84.2%;在同樣條件下采用圓盤濾膜法培養(yǎng)時，黃萎病菌的菌落直徑為62mm，空白對照的菌落直徑為12_，表明CEF-193產(chǎn)生的非揮發(fā)性代謝物對黃萎病菌抑菌效果為80.6%。
[0016]3、CEF-193對棉花黃萎病具有較好的誘導(dǎo)免疫作用。將25%的CEF-193的查彼克培養(yǎng)發(fā)酵液浸泡感病棉花品種冀棉11的種子(光子)12小時，將棉花種子播種于蛭石沙土制作的無底紙缽中，于棉苗一片真葉平展時接種棉花黃萎病強(qiáng)致病力菌株Vd080，棉苗2-3片真葉期調(diào)查黃萎病的發(fā)病情況。用CEF-193發(fā)酵液處理再接種Vd080的棉花病情指數(shù)為14.6，未經(jīng)CEF-193發(fā)酵液處理直接接種Vd080的棉花病情指數(shù)為56.4，CEF-193對棉花黃萎病的控制效果為74.1%，與生產(chǎn)上應(yīng)用較多的枯草芽孢桿菌相比，防治效果提高40.1%。
[0017]4、CEF_193為一株芳香頂孢霉真菌，本發(fā)明獲得的CEF-193分離自棉花，土壤中廣泛存在，為環(huán)境友好型菌株，解決了具有生防潛力的微生物可能轉(zhuǎn)變?yōu)橹虏【膯栴}，因此對人畜、昆蟲和作物安全，環(huán)境友好。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為CEF-193在PDA上的菌落形態(tài)、分生孢子梗及孢子的形態(tài)；其中a為菌落正面，b為菌落反面，c為顯微鏡下觀察到的分生孢子梗及孢子的形態(tài)；[0019]圖2為對扣培養(yǎng)法測定CEF-193對棉花黃萎病菌的抑制作用。a，在直徑90mm培養(yǎng)皿的皿蓋和皿底分別倒入一定量的培養(yǎng)基，皿蓋培養(yǎng)基稍少些，凝固后，在皿蓋中心接入5 μ I的芳香頂孢霉CEF-193菌液(查彼液體培養(yǎng)7d)，在皿底中心接種5 μ I的黃萎病病原菌菌液(查彼液體培養(yǎng)7d)，25°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7d ;b，對照，直接在PDA平板中央接種的棉花黃萎病菌Vd080菌液5 μ I (查彼克液體培養(yǎng)7d)，25°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7d。
[0020]圖3為CEF-193對棉花黃萎病的控制作用，a，清水浸種，播種后18天用滅菌蒸餾水蘸根；b，50%的CEF-193培養(yǎng)濾液浸種，播種后18天接種大麗輪枝菌強(qiáng)致病力菌株Vd080 ;c，清水浸種，播種后18天接種大麗輪枝菌強(qiáng)致病力菌株Vd080。
[0021]內(nèi)生真菌CEF-193，于2013年10月10日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，100101)，其保藏編號是:CGMCC N0.8302。
【具體實施方式】
[0022]實施例1菌株的分離
[0023](一)樣品采集
[0024]于6-8月份,選擇健康棉株,取主莖的中上部及果枝15cm。
[0025]( 二 )菌株的分離
[0026]先將采集到的樣品(棉花莖桿)用清水洗凈，去皮，置于直徑為9cm的滅菌的培養(yǎng)皿中，用75%的酒精消毒lmin。再用5.0 %的次氯酸鈉進(jìn)行消毒60s，用滅菌水洗3次，每次時間不少于3min。然后用滅菌的吸水紙沾干表面的水分，用消毒的剪刀剪成0.4cm長的小段，置于9cm的培養(yǎng)皿中，25°C培養(yǎng)。用最后一遍清洗液為對照，檢查消毒是否徹底。每天檢查內(nèi)生真菌的生長情況，發(fā)現(xiàn)有菌落長出，及時轉(zhuǎn)移至直徑為6cm的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，然后觀察其菌落大小、顏色、表面特征、質(zhì)地。
[0027](三)CEF-193的特征
[0028]1、形態(tài)特征在PDA平板上，菌落呈氈狀，表面絮狀，最初為白色，后變?yōu)榛野咨?，菌落反面為褐色。顯微鏡下(400 X)該菌株分生孢子梗緊密，掃帚狀，長約30 μ m;分生孢子圓形，大約3.2 μ m(圖1)。
[0029]2、生理特征CEF-193在5_30°C條件下均能生長，最適生長溫度是25°C。
[0030]依據(jù)CEF-193形態(tài)特征、生理特征和分子鑒定結(jié)果，將CEF-193歸屬為芳香頂孢霉(Acremonium alternatum)。
[0031](四)培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件
[0032]1.PDA培養(yǎng)基馬鈴薯200克，葡萄糖20克，瓊脂15-20克，水I升，自然pH。稱取削皮的200g馬鈴薯，切成小塊置于鍋中加水煮爛(煮沸20-30分鐘)，用紗布過濾后，濾液中加入葡萄糖和瓊脂繼續(xù)加熱攪勻，稍冷卻后再補(bǔ)水至1L，分裝到錐形瓶，加塞包扎后120°C滅菌20分鐘。25°C，黑暗培養(yǎng)7d。
[0033]2.查彼(Czapek)液體培養(yǎng)基 KNO3,2.0Og ;K2HP04，1.0Og ;KCI，0.5Og ;MgSO4.7Η20，0.50g ；FeS04.7Η20，0.01g ;蔗糖，30.0Og ;加水至1L，分裝到錐形瓶，加塞包扎后120°C滅菌20分鐘。置搖床150rpm，25°C，黑暗條件震蕩培養(yǎng)7d。
[0034]3.玉米粉沙土培養(yǎng)基將2份玉米粉和1份沙土加適量水(將培養(yǎng)基捏在手中不滴水)混勻，悶半小時后，放入克氏瓶中，120°C滅菌30分鐘。25°C，黑暗培養(yǎng)14d。
[0035]實施例2CEF-193對棉花黃萎病菌的抑制作用
[0036]1、試驗方法
[0037]對扣培養(yǎng)法。在直徑90mm培養(yǎng)皿的皿蓋和皿底分別倒入一定量的培養(yǎng)基，皿蓋培養(yǎng)基稍少些。凝固后，在皿蓋中心接入5μ I的芳香頂孢霉CEF-193菌液(查彼液體培養(yǎng)7d)，在皿底中心接種5 μ I的黃萎病病原菌菌液(查彼液體培養(yǎng)7d)。放入25°C恒溫培養(yǎng)箱中，倒置培養(yǎng)，以僅接種病原菌的培養(yǎng)皿為對照，每個處理重復(fù)4次。每天觀察病原菌及芳香頂孢霉菌絲的生長狀況，對扣培養(yǎng)7d后采用十字交叉法測量病原菌的菌落直徑，計算芳香頂孢霉CEF-193揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對病原菌生長的抑制率。
[0038]圓盤濾膜法。在直徑為9cm的PDA平板上，平鋪上直徑略大于9cm的雙層玻璃紙(硝酸纖維素膜)，在平板中央接種5 μ I的芳香頂孢霉CEF-193菌液(查彼液體培養(yǎng)7d)，每個處理重復(fù)4次，25°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7d后去玻璃紙，再在平板中央接種接種5 μ I的黃萎病病原菌菌液(查彼液體培養(yǎng)7d)，25°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7d。以不含供試菌株代謝產(chǎn)物的PDA平板接種黃瓜枯萎菌為對照。用十字法測定菌落直徑，計算抑制率。
[0039]2、試驗結(jié)果
[0040]對扣培養(yǎng)結(jié)果表明，經(jīng)CEF-193處理的棉花黃萎病菌菌落直徑為0.9cm,未經(jīng)CEF-193處理的菌落直徑為5.7cm, CEF-193揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對病原菌生長的抑制率為84.2% (表 I)。
[0041]圓盤濾膜法培養(yǎng)結(jié)果表明，經(jīng)CEF-193處理的棉花黃萎病菌菌落直徑為1.2cm,未經(jīng)CEF-193處理的菌落直徑為6.2cm, CEF-193分泌的代謝產(chǎn)物對病原菌生長的抑制率為80.6% (表 1，圖 2)。
[0042]表1CEF-193對棉花黃萎病菌的抑制作用
【權(quán)利要求】
1.棉花的內(nèi)生真菌CEF-193，其特征在于，其保藏編號為:CGMCCN0.8302。
2.權(quán)利要求1所述棉花的內(nèi)生真菌CEF-193用于抑制棉花黃萎病菌的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述棉花的內(nèi)生真菌CEF-193用于免疫誘導(dǎo)棉花黃萎病抗性的應(yīng)用
4.權(quán)利要求1 所述內(nèi)生真菌CEF-193的培養(yǎng)方法，其特征在于，在PDA培養(yǎng)基、查彼液體培養(yǎng)基或棉籽培養(yǎng)基28 °C黑暗培養(yǎng)15天。
【文檔編號】A01P3/00GK103897992SQ201410179156
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年4月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月30日
【發(fā)明者】馮自力, 朱荷琴, 李志芳, 黃殿成, 王玲飛, 師勇強(qiáng), 趙麗紅 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所