專利名稱：一種β-葡聚糖酶的產(chǎn)生菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種e -葡聚糖酶的產(chǎn)生菌。
技術(shù)背景e-葡聚糖酶(e-glucanase)是一種結(jié)構(gòu)性非淀粉多糖(NSP)是自然合成的多聚糖含量最多的糖類。由右旋葡萄糖(D型)以混合的e- (1， 3)， e- (1， 4)糖苷鍵隨機(jī)排列的線性連接而成的葡萄糖聚合物。谷物類中所含有的卩-葡聚糖有獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)，賦予 了其獨(dú)特的性質(zhì)以高分子量的形式溶于水，且形成溶液的黏度很高給工業(yè)生產(chǎn)帶來了諸 多的不便。如高分子量的大麥P-葡聚糖可引起麥汁和啤酒粘度增加，致使麥汁過濾困難， 得率降低，影響啤酒的穩(wěn)定性和質(zhì)量；以大麥等谷物做能量飼料，(3-葡聚糖能引起畜禽胃 液黏度增加，阻礙單胃動(dòng)物對養(yǎng)份的吸收，谷物的詞價(jià)值降低。然而啤酒的制備工藝及飼 料生產(chǎn)過程中添加P-葡聚糖酶，利用P-葡聚糖酶分解P-葡聚糖，就能夠有效的改善p-葡 聚糖所帶來的負(fù)面影響。因此，近年來對p-葡聚糖酶的研究受到廣泛的重視并取得了一定 的進(jìn)展，P-葡聚糖酶來源廣泛，其中以細(xì)菌為主要酶源，在真菌，放線菌，藻類，軟體動(dòng) 物和高等植物中也存在。1942年，Hrmova等首次從燕麥中分離得到e-葡聚糖。20世紀(jì)90年代中期，M. Hahn 和T. Keite通過質(zhì)譜結(jié)合X-射線結(jié)晶體學(xué)的方法對e-葡聚糖酶進(jìn)行了大量研究，其結(jié)果表明e-葡聚糖酶為一反向平行的e-折疊體系，每出現(xiàn)一處折疊就劇增大量的蛋白質(zhì)。0-葡聚糖酶也可由微生物產(chǎn)生，如細(xì)菌(芽孢桿菌)、真菌(曲霉、毛霉等)和瘤胃微生物等。微生物產(chǎn)e-葡聚糖酶系對e-葡聚糖多無特異性，只分解由e-i，2-， e-i，3-, e-1,4-和0-1,6-鍵構(gòu)成的纖維素及昆布聚搪等。這些產(chǎn)酶菌廣泛存在于青霉屬、木霉屬、曲霉屬、鐮刀菌屬、毛霉屬和纖維素諾卡氏菌屬中，如婁地青霉和木素木霉等。而能特異分解e-葡聚糖的酶主要來源于芽孢桿菌屬和曲霉屬，包括枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、浸麻芽孢桿菌(Bacillus macerans),解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulars)、地衣芽孢桿菌(Bacillus Licheniformis)、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、臭 曲霉(Aspergillusfoetidus)、凍土毛霉(Mucor hiemalis)禾口米曲霉(Aspergillus oryzae)，溶黃質(zhì)厄氏菌(Qerskoviaxanthineolytica)。
0 -葡聚糖酶最早應(yīng)用于啤酒工業(yè)，國外一些酶制劑公司如丹麥Novo公司、荷蘭Gist 公司和美國Miles公司都推出自己的產(chǎn)品，這些產(chǎn)品有的是單純含e-葡聚糖酶制劑，也 有的產(chǎn)品是混合酶性質(zhì)，如含有a-淀粉酶、0-淀粉酶和朊酶等等。我國在八十年代初， 啤酒工業(yè)的糖化和釀造工藝中添加外源e —葡聚糖酶也逐^ 為啤酒生產(chǎn)廠家所重視并且應(yīng)用在啤酒的制備工藝中。e-葡聚糖酶的生產(chǎn)及研究，被列入"六五"和"七五"攻關(guān) 項(xiàng)目的子專題，在獲得工業(yè)化生產(chǎn)菌后，又列入國家"火炬計(jì)劃"。p-葡聚糖酶是重要的工業(yè)用酶，可有效消除谷物p-葡聚糖在釀造和飼料工業(yè)中產(chǎn)生的負(fù)面影響，但熱穩(wěn)定性和酶活力普遍較低已成為影響(3-葡聚糖酶應(yīng)用效果的重要因素。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種能有效的解決現(xiàn)階段p-葡聚糖酶工業(yè)用酶熱穩(wěn)定性差的問 題，耐熱性能良好的e-葡聚糖酶的產(chǎn)生菌。本發(fā)明的e-葡聚糖酶的產(chǎn)生菌分類命名為枯草芽孢桿菌(fi"C!7/M S"&船)，其保藏登記號為CGMCC No.2077，保藏日期為2007年6月8日，保藏單位中國微生物 菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱CGMCC)。其16SrRNA基因見基因序列表。 制備方法1、 菌株的分離采集小麥田中的土樣直接涂布初篩培養(yǎng)基平板50°C培養(yǎng)3-5天,觀察透明圈生長情況， 選出H/C比值較大的菌株(H/C為透明圈直徑H和菌落直徑C之比)，分離得純培養(yǎng)，得到 產(chǎn)耐熱P -葡聚糖酶菌株W-9 (自命名)。2、 菌株的發(fā)酵將種子培養(yǎng)液倒入裝有250ml發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，置于回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜中 進(jìn)行好氧發(fā)酵，轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分，37'C發(fā)酵2天，發(fā)酵液離心，上清液即為e-葡聚糖酶 酶液，置于4'C保存。本發(fā)明的e -葡聚糖酶的產(chǎn)生菌所產(chǎn)e -葡聚糖酶酶液的最適pH6.o左右，最適溫度為70°C，在溫度50。C-70'C的范圍內(nèi)，酶活性變化不大，經(jīng)60'C下處理30min后，其酶活性 沒有明顯變化；經(jīng)60'C保溫1小時(shí)，剩余酶活為70%，經(jīng)6(TC保溫5小時(shí)，剩余酶活為 20%，可以在釀酒工藝中所要求的溫度6(TC下更好的發(fā)揮作用。該酶的耐酸性能良好，在 pH 5.0-6.5之間均有較高酶活，在pH6.0范圍內(nèi)處理lh后酶活性維持在70%以上。這使得 該酶可以在飼料工藝中更好的應(yīng)用。所以該菌株W—9具有較好的耐熱性能和研究價(jià)值。


圖l是本發(fā)明的菌株W9電鏡照片(X15000)圖；圖2是本發(fā)明的0 -葡聚糖酶粗酶的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖； 圖3是本發(fā)明的0 -葡聚糖酶粗酶的pH曲線圖；圖4是本發(fā)明的e -葡聚糖酶粗酶的溫度曲線圖；圖5是本發(fā)明的0 -葡聚糖酶粗酶的pH耐受性曲線圖；圖6是本發(fā)明的e -葡聚糖酶粗酶的溫度耐受性曲線圖；本發(fā)明的微生物保藏日期為2007年6月8日，保藏單位簡稱CGMCC，保藏編號 CGMCC No. 2077。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1、 從(安寧)小麥土壤中分離得到菌株W9，直接涂布初篩培養(yǎng)基平板50'C培養(yǎng)3-5 天，觀察透明圈生長情況，選出H/C比值較大的菌株(H/C為透明圈直徑H和菌落直徑C 之比)，分離得純培養(yǎng)e-葡聚糖酶菌株W—9。所用篩選培養(yǎng)基0-葡聚糖2.5，剛果紅 溶液8mL，瓊脂2.0， PH自然。2、 菌株的鑒定根據(jù)形態(tài)特征、培養(yǎng)特征，生理生化測定，16S rDNA序列分析進(jìn)行系統(tǒng)的分類研究。 菌株W-9為革蘭氏陽性芽孢桿菌，具有中生芽孢。在LB瓊脂平板上菌落白色，邊緣波狀，呈不規(guī)則形，表面具有皺褶，不透明。W9生長溫度范圍是40 6(TC，能水解淀粉、酪素、明膠，過氧化氫酶、卵磷脂酶、硝酸鹽還原結(jié)果為陽性，形成吲哚、V.P實(shí)驗(yàn)、檸檬酸鹽及丙酸鹽利用、苯丙氨酸脫氨酶、酪氨酸分解結(jié)果為陰性。W-9和其參照菌株Bacillus subtilis中某些菌株的16S rRNA序列相似性為99%。所以結(jié)合Bacillus subtilis的菌落特征、生理生化特性，確定菌株W9為枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)。菌株立體形態(tài)如圖l所示。3. 菌株的發(fā)酵將種子培養(yǎng)液倒入裝有250ml發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，置于回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜中 進(jìn)行好氧發(fā)酵，轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分，37'C發(fā)酵2天，發(fā)酵液離心，取上清液即為e-葡聚糖 酶酶液，置于4'C保存。所用發(fā)酵培養(yǎng)基燕麥1.5g，酵母膏0.5g， pH6.0，裝液量20°/0。4. 酶活測定方法和粗酶酶學(xué)性質(zhì)
4. 1原理在一定溫度和PH條件下P -葡聚糖酶水解e -葡聚糖，產(chǎn)生的還原糖可將3， 5 — 二硝基水揚(yáng)酸還原成橙色的氨基化合物，反應(yīng)液顏色強(qiáng)度與酶活力大小成正比，而還 原糖的生成量又與待測酶液的酶活力大小成正比。通過測定反應(yīng)液的吸光度，從而算出待測液的e-葡聚糖酶活力。4. 2試劑和溶液① 10. 0mg/mLr葡萄糖溶液取無水葡萄糖1. 000g加水溶解后定容至100mL。② 0. 05molA檸檬酸溶液鹽酸性緩沖液0. 5mo1/1的擰檬酸溶液準(zhǔn)確稱取105. 0g 檸檬酸完全溶于800ml蒸餾水中，定容至1000ml，標(biāo)記為A試液；0. 5mo1/1的檸檬酸三 鈉溶液準(zhǔn)確稱取147.0g檸檬酸三鈉完全溶于800ml蒸餾水中，定容至1000ml，標(biāo)記為 B試液。③ 0. 5mo1/1的檸檬酸鈉緩沖液取600ml的A試液與1000ml的B試液充分混勻， 標(biāo)記為C試液。
0. 5mo1/1的擰檬酸鹽酸性緩沖液取C試液1000ml加放到8000ml的蒸餾水中。 用PH計(jì)檢測其ra值，必要時(shí)用3rao1/1的鹽酸溶液或3mo1/1的氫氧化鈉溶液調(diào)ffl值為 4.80，再定容至1000ml，混勻后標(biāo)記為0. 05mol/l檸檬酸鹽酸性緩沖液。同時(shí)標(biāo)記PH為 4.80，配制日期在4。C冰箱內(nèi)保存。⑤ i. o% e -葡聚糖底物精密稱取e -葡聚糖i. ooog加入適量的乙醇再加入lOOtnlO. 05mol/l的酸性緩沖液中，加熱溶解直至e—葡聚糖完全溶解，待乙醇完全蒸發(fā)出 后，用3mo1/1鹽酸溶液或3mo1/1氫氧化鈉溶液調(diào)PH值為4. 80，再用0. 05mol/l的酸性 緩沖液定容在100ml的容量瓶中。標(biāo)記為1. 0% {3 -葡聚糖酸性溶液，同時(shí)標(biāo)記PH為4. 80， 配制日期，并保存在4。C冰箱內(nèi)。有效期為三天，使用前恢復(fù)到室溫并搖勻。⑥ DNS試劑溶解10.0g 3，5-二硝基水揚(yáng)酸，16. 0—?dú)溲趸c300. 0g酒石酸鉀鈉 于約700蒸餾水中，加熱攪拌使完全溶解至澄清，放至常溫并用蒸餾水定容至1000mL，置 于棕色試劑瓶中，暗處保存一個(gè)星期后使用。4. 3測定步驟①標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取8支試管按下表加入試劑，稀釋葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，再加入3mlDNS 試劑，充分混勻置沸水中煮5min，水浴冷卻后，用0號試管作對歸在540nm下測其他試液 的吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所 示。
試管號01234567緩沖液加入量(y l)500490480475470465460455葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液(ul)010202530354045葡萄量含量(！ig)0100200250300350400450② 待測酶液的制備(1) 液體酶用緩沖液稀釋原酶液，使其吸光度(0D值)在0.20 — 0.25之間。(2) 固體酶精密稱取固體原酶粉1.000g溶于80ml蒸餾水中(稀釋倍數(shù)蕓100倍 的直接用緩沖液溶解)，室溫下磁力攪拌15min以上，用100ml容量瓶定容，離心后取清 液用緩沖液稀釋，使其吸光度在0.20—0.25之間。③ 活力的測定(1) 取三支試管各加入0.5ml酸性(或中性)e—葡聚糖底物，與待測酶液一起在 5CTC水浴中預(yù)熱5min。(2) 在第一，二支試管中加入0. 5ml待測酶液。40。C水浴中反應(yīng)15min。(3) 在三支試管中各加入3ml的DNS試劑，然后在第三支試管中加入0. 5ml的待測酶液。(4) 搖勻三支試管后，在沸水浴中煮5min。(5) 水浴冷卻至室溫后，以第三支試管為對照在540nm條件下測第一，二支試管樣 的吸光度。吸光度以在0.20—0.25之間為宜，若不在此范圍內(nèi)可改變稀釋倍數(shù)重做。④酶活力的計(jì)算酶活力(IU/ml或IU/g):(葡萄糖等量值/180/10/0.5)*11 式中180指葡萄糖從微克量換算成微克分子數(shù)15指待測液與底物的反應(yīng)時(shí)間0. 5指與底物反應(yīng)的稀釋倍數(shù)n指原酶液(或固體原酶)的稀釋倍數(shù) 4. 4粗酶酶學(xué)性質(zhì)① W-9菌株產(chǎn)e-葡聚糖酶的最適作用pH為6，如圖3所示。② W-9菌株產(chǎn)e-葡聚糖酶的最適作用溫度為7(TC，如圖4所示。③ W-9菌株產(chǎn)P -葡聚糖酶有良好的pH耐受性，在pH 5.0-6.5之間均有較高酶活，在pH6.0范圍內(nèi)處理lh后酶活性維持在70%以上，如圖5所示。
④在溫度5(TC-7(TC的范圍內(nèi)，酶活性變化不大，經(jīng)60。C下處理30min后，其酶活性 沒有明顯變化；經(jīng)60。C保溫1小時(shí)，剩余酶活為70%，經(jīng)6(TC保溫5小時(shí)，剩余酶活為 20%。如圖6所示。
基因序列表該菌株的16SrRNA基因?yàn)? GCTATACATG CAGTCGAGCG GACAGATGGG AGCTTGCTCC CTGATGTTAG CGGCGGACGG GTGAGTAACA 70CGTGGGTAAC CCGCATGGTT TGGTGAGGTA TGAGACACGG AGCMCGCCG TCGAATAGGG AATACGTAGG ATGTGAAAGC TGGAATTCCA GTCTGTAACT GTAMCGATG GCCTGGGGAG GTGGTTTAAT ACGTCCCCTT TMGTCCCGC CGGTGACAAA TGCTACMTG TCGGATCGCA TGAATACGTTCTGCCTGTM CMACATAM ACGGCTCACC CCCAGACTCC CGTGAGTGAT CGGTACCTTG TGGCMGCGT CCCCGGCTCA CGTGTAGCGG GACGCTGAGG AGTGCTMGT TACGGTCGCA TCGMGCMC CGGGGGCAGA MCGAGCGCA CCGGAGGMG GACAGMCM GTCTGCAACT CCCGGGCCTTGACTGGGATA AGGTGGCTTN AAGGCNACGA TACGGGAGGC GAAGGTTTTC ACGGTACCTA TGTCCGGMT ACCGGGGAGG TGAMTGCGT AGCGAAAGCG GTTAGGGGGT AGACTGAMC GCGMGAACCACTCCGGGAA GGCTACCACT TGCGTAGCCG AGCAGTAGGG GGATCGTAAA ACCAGAAAGC TATTGGGCGT GTCATTGGM AGAGATGTGG TGGGGAGCGA TTCCGCCCCT TCAMGGMT TTACCAGGTCACCGGGGCTA TACAGATGGA ACCTGAGAGG AATCTTCCGC GCTCTGTTGT CACGGCTAAC 雄GGGCTCG ACTGGGGMC AGGMCACCA ACAGGATTAG TAGTGCTGCA TGACGGGGGC TTGACATCCTATACCGGATG CCCGCGGCGC GTGATCGGCC AATGGACGAA TAGGGMGM TACGTGCCAG CAGGCGGTTT TTGAGTGCAG GTGGCGMGG ATACCCTGGT GCTAACGCAT CCGCACMGC CTGACAATCCGTGACAGGTG GTGCATGGTT GTCGTCAGCT CGTGTCGTGAACCCTTGATC TTAGTTGCCA GCATTCAGTT GGGCACTCTAGTGGGGATGA CGTCAAATCA TCATGCCCCT TATGACCTGGAGGGCAGCGA MCCGCGAGG TTMGCCMT CCCACMATCCGACTGCGTG AAGCTGGMT CGCTAGTAAT CGCGGATCAGGTACACACCG CCCGTCACAC CACGAGAGTT TGTMCACCCGTTGTTTGM 141ATTAGCTAGT 211ACACTGGGAC 281AGTCTGACGG 351CMGTACCGT 421CAGCCGCGGT 491CTTMGTCTG 561AAGAGGAGAG 631CGACTCTCTG 701AGTCCACGCC 771TAAGCACTCC 841GGTGGAGCAT 911TAGAGATAGG 981GATGTTGGGT 1051AGGTGACTGC 1121GCTACACACG 1191TGTTCTCAGT 1261CATGCCGCGG 1331GAAGTCGGTG 1401AGGTMCCTT TTAGGAGCCA GCCGCCGMG GTGGGACAGA TGATTGGGGT GAAGTCGTAA CAAG
權(quán)利要求
1、一種β-葡聚糖酶的產(chǎn)生菌，其特征在于β-葡聚糖酶的產(chǎn)生菌分類命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，其保藏登記號為CGMCC No.2077。
全文摘要
本發(fā)明是一種β-葡聚糖酶的產(chǎn)生菌。β-葡聚糖酶的產(chǎn)生菌分類命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，其保藏登記號為CGMCC No.2077。本發(fā)明的β-葡聚糖酶的產(chǎn)生菌所產(chǎn)葡聚糖酶最適pH6.0左右，最適溫度為70℃，在溫度50℃-70℃的范圍內(nèi)，酶活性變化不大，經(jīng)60℃保溫5小時(shí)，剩余酶活為20％，具有較好的耐熱性能和研究價(jià)值。
文檔編號C12N1/20GK101157904SQ20071006621
公開日2008年4月9日 申請日期2007年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月21日
發(fā)明者王麗麗, 黃遵錫 申請人:云南師范大學(xué)