專利名稱：應(yīng)用真菌誘導(dǎo)龍血樹產(chǎn)生血竭的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及一種利用真菌誘導(dǎo)龍血樹產(chǎn)生血竭
的方法。
背景技術(shù)：
血竭(dragon' s blood)是一種深紅色樹脂，自古代已作為著名的傳統(tǒng)藥材用于 許多國家。在臨床上主要用于促進血液循環(huán)，治療創(chuàng)傷、炎癥、痢疾和糖尿病。據(jù)文獻報 道，目前市場上的血竭主要來源于4科5屬23種植物。在中國，上世紀70年代，蔡希陶先 生在云南省發(fā)現(xiàn)了劍葉龍血樹[Dracaena cochinchinensis (Lour.) S. C. Chen]的紅色樹 脂可替代進口血竭使用，徹底改變了血竭長期進口的歷史。后續(xù)又在海南省發(fā)現(xiàn)了國產(chǎn)龍 血竭(Chinesedragon， s blood)的另一基源植物小花龍血樹(D. c咖bodi, Pierre ex Gagn印.)。 近年來，對國產(chǎn)血竭的需求量劇增，使得劍葉龍血樹和小花龍血樹野生資源的蘊 藏量急劇下降，已被列為國家珍稀瀕危保護植物。使得血竭的開發(fā)利用受到限制，因此廣辟 生產(chǎn)途徑，解決血竭資源貧乏問題變得十分迫切。 目前研究表明血竭的形成與樹體的損傷及鐮刀菌屬真菌的侵染有密切的關(guān)系。由 此可見，真菌在血竭的產(chǎn)生過程中有舉足輕重的作用。在自然環(huán)境條件下，血竭的產(chǎn)量不僅 低，而且生產(chǎn)周期長。因此，人為的接種特定微生物有望提高血竭的產(chǎn)量，并大幅度縮短產(chǎn) 生血竭的時間，也許是最有應(yīng)用前景的途徑之一 。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供1株能夠誘導(dǎo)龍血樹產(chǎn)生血竭的真菌，該真菌是從龍血樹 的莖部分離得到的，它能促進活體龍血樹樹干和離體龍血樹樹干產(chǎn)生與血竭化學(xué)成分相似 的紅色物質(zhì)。 本發(fā)明的又一 目的在于提供一種應(yīng)用真菌誘導(dǎo)龍血樹產(chǎn)生血竭的方法，該方法工 藝簡單，生產(chǎn)成本低廉，生產(chǎn)周期短，充分地利用和保護了龍血樹資源，便于推廣應(yīng)用，解決 血竭藥用資源緊張的問題。 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)是先培養(yǎng)真菌，再將真菌接種到龍血樹的樹 干上。經(jīng)過一段時間后，在接種孔的周圍會產(chǎn)生與血竭化學(xué)成分相似的紅色物質(zhì)。本發(fā)明 采用的l株真菌經(jīng)鑒定為鐮孢屬真菌D-22(Fusarium sp.)，保藏編號CGMCC No. 2598，該菌 株于2008年7月16日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏單位 地址北京市朝陽區(qū)大屯路甲3號，中國科學(xué)院微生物研究所。菌株的保藏和存活證明見附 件。 真菌D-22的培養(yǎng)特性為在PDA培養(yǎng)基上菌落為粉色，氣生菌絲絲狀，菌落背面為 紅褐色，分泌紅褐色物質(zhì)，生長1周菌落直徑為5. 2cm ;小型分生孢子單胞，橢圓形，有時兩 端略彎曲，3. 4-12. 1 X 1. 4-3. 4 ii m ;大型分生孢子，多胞，鐮刀形，37. 6 X 4. 0 y m，少見。
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具體地說，本發(fā)明所述的技術(shù)步驟方法如下
1.真菌的培養(yǎng) 將由龍血樹莖部分離得到的保藏編號為CGMCC No. 2598的真菌D-22自低溫保藏 的斜面試管菌種活化后，轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基的平皿中，恒溫培養(yǎng)15-20天；或轉(zhuǎn)接于PDA液 體培養(yǎng)基或麥麩液體培養(yǎng)基中，恒溫震蕩培養(yǎng)5-15天，或轉(zhuǎn)接于鋸末麥麩固體培養(yǎng)基中， 恒溫培養(yǎng)20-50天；培養(yǎng)溫度均為22-28°C。 將上述培養(yǎng)的菌種接種到含有鋸末、樹葉和麥麩的鋸末復(fù)合固體培養(yǎng)基中進行培 養(yǎng)，待菌絲長滿培養(yǎng)基后直接使用。鋸末復(fù)合固體培養(yǎng)基中鋸末、樹葉和麥麩的重量比為 2:1: 0.5 ;或?qū)DA平皿培養(yǎng)的菌種，在菌落邊緣打孔成菌片，接入PDA液體培養(yǎng)基或麥 麩液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5-15天后取發(fā)酵物使用。
2.真菌的接種 選取樹齡5年以上的劍葉龍血樹或小花龍血樹的樹干或離體樹干，通過鉆孔的方 式在樹干形成直徑O. 5-3cm，深2-15cm的接種孔，或通過橫向切割、或縱向切割、或從上向 下斜向切割的方式，在樹干形成長l-6cm，寬l-6cm，深1-6cm的接種槽。接種孔或接種槽的 間隔是縱向間隔5-15cm，橫向間隔3-10cm。在接種孔中接入鋸末復(fù)合固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌 種或液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的發(fā)酵物，在接種槽中接入鋸末復(fù)合固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌種。接種后 用聚丙烯薄膜包扎接菌孔。經(jīng)過3-10個月后，接種孔周圍能產(chǎn)生與血竭化學(xué)成分相似的紅 色物質(zhì)。
具體實施方式

實施例1 PDA培養(yǎng)基平皿中培養(yǎng)的真菌D-22接種在鋸末復(fù)合固體培養(yǎng)基上生長30天，備 用。 選取樹齡為10年的小花龍血樹，用直徑為lcm的鉆頭在樹干上鉆孔9個，孔深為 5-6cm，各個孔洞間的間隔均為10cm，其中3個孔洞中接入滅菌后的鋸末復(fù)合固體培養(yǎng)基作 為對照，其它6個孔洞中接入上述培養(yǎng)30天的真菌D-22，聚丙烯薄膜包扎接菌孔。
6個月后進行觀察，對照的孔洞周圍均無紅色物質(zhì)分泌產(chǎn)生，接入真菌D-22的孔 洞周圍均有紅色物質(zhì)分泌產(chǎn)生。收集孔洞周圍呈現(xiàn)紅色的木質(zhì)部，提取后檢測，證實其與血 竭的化學(xué)成分相似。觀察后在原接種部位再次接入真菌D-22。
實施例2 PDA培養(yǎng)基平皿中培養(yǎng)的真菌D-22接種在PDA液體培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)10天，收集 發(fā)酵物，滅菌后備用。 選取樹齡為8年的小花龍血樹，用直徑為0. 2cm的鉆頭在樹干上鉆孔9個，孔深為
7-8cm，各個孔洞間的間隔均為10cm，其中3個孔洞中接入滅菌后的PDA液體培養(yǎng)基作為對
照，其它6個孔洞中接入上述滅菌后的真菌D-22發(fā)酵物，聚丙烯薄膜包扎接菌孔。 6個月后進行觀察對照的孔洞周圍均無紅色物質(zhì)分泌產(chǎn)生，接入真菌D-22發(fā)酵
物的孔洞周圍均有紅色物質(zhì)分泌產(chǎn)生。收集孔洞周圍呈現(xiàn)紅色的木質(zhì)部，提取后檢測，證實
其與血竭的化學(xué)成分相似。 實施例3
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麥麩液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的真菌D-22接種在鋸末復(fù)合固體培養(yǎng)基上生長30天，備用。
選取直徑為10-25cm的劍葉龍血樹木段，對木段進行滅活處理。用直徑為1cm的 鉆頭在木段上鉆孔9個，孔深為5-6cm，各個孔洞間的間隔均為10cm，其中3個孔洞中接入 滅菌后的鋸末復(fù)合固體培養(yǎng)基作為對照，其它6個孔洞中接入上述培養(yǎng)30天的真菌D-22， 聚丙烯薄膜包扎接菌孔。 木段于24-26t:環(huán)境中放置6個月后進行觀察，對照的孔洞周圍均無紅色物質(zhì)分 泌產(chǎn)生，接入真菌D-22發(fā)酵物的孔洞周圍均有紅色物質(zhì)分泌產(chǎn)生。收集孔洞周圍呈現(xiàn)紅色 的木質(zhì)部，提取后檢測，證實其與血竭的化學(xué)成分相似。
實施例4 PDA培養(yǎng)基平皿中培養(yǎng)的真菌D-22接種在PDA液體培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)10天，收集 發(fā)酵物，滅菌后備用。 選取直徑為10-25cm的劍葉龍血樹木段，對木段進行滅活處理。用直徑為0. 2cm的 鉆頭在木段上鉆孔9個，孔深為7-8cm，各個孔洞間的間隔均為10cm，其中3個孔洞中接入 滅菌后的PDA液體培養(yǎng)基作為對照，其它6個孔洞中接入上述滅菌后的真菌D-22發(fā)酵物， 聚丙烯薄膜包扎接菌孔。 木段于24-26t:環(huán)境中放置6個月后進行觀察，對照的孔洞周圍均無紅色物質(zhì)分 泌產(chǎn)生，接入真菌D-22發(fā)酵液的孔洞周圍均有紅色物質(zhì)分泌產(chǎn)生。收集孔洞周圍呈現(xiàn)紅色 的木質(zhì)部，提取后檢測，證實其與血竭的化學(xué)成分相似。
實施例5 鋸末麥麩固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的真菌D-22接種在鋸末復(fù)合固體培養(yǎng)基上生長30天， 備用。 選取樹齡為8年的劍葉龍血樹，在樹干上采用以下4種方式形成接種孔或接菌槽 (1)鉆孔，接種孔直徑lcm，深6cm ; (2)橫向切割，形成長5cm，寬2cm，深3cm的凹槽；(3)縱 向切割，形成長2cm，寬5cm，深3cm的凹槽；(4)從上向下斜向內(nèi)切割，形成長5cm，寬0. 5cm， 深3cm的凹槽。每個接種孔或接種槽的間隔均為10cm。在方式(1)-(4)的接種孔或接種槽 中接入上述培養(yǎng)30天的真菌D-22，聚丙烯薄膜包扎接菌部位。以上每種方式重復(fù)3次。
6個月后進行觀察接入真菌D-22的接種孔或接種槽周圍均有紅色物質(zhì)分泌產(chǎn) 生。收集孔洞周圍呈現(xiàn)紅色的木質(zhì)部，提取后檢測，證實其與血竭的化學(xué)成分相似。
權(quán)利要求
一種應(yīng)用真菌誘導(dǎo)龍血樹產(chǎn)生血竭的方法，包括步驟(1)真菌的培養(yǎng)將由龍血樹分離得到的保藏編號為CGMCC No.2598的真菌D-22自低溫保藏的斜面試管菌種活化后，轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基的平皿中，恒溫培養(yǎng)15-20天；或轉(zhuǎn)接于PDA液體培養(yǎng)基或麥麩液體培養(yǎng)基中，恒溫震蕩培養(yǎng)5-15天，或轉(zhuǎn)接于鋸末麥麩固體培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)20-50天；將上述培養(yǎng)的菌種接種到鋸末復(fù)合固體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，待菌絲長滿培養(yǎng)基后直接使用；鋸末復(fù)合固體培養(yǎng)基含有鋸末、樹葉和麥麩，它們的重量比為2∶1∶0.5；或PDA平皿培養(yǎng)的菌種，在菌落邊緣打孔成菌片，接入PDA液體培養(yǎng)基或麥麩液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5-15天后取發(fā)酵物使用；(2)真菌的培養(yǎng)特性保藏編號為CGMCC No.2598的菌株D-22為鐮孢屬(Fusarium sp.)真菌，在PDA培養(yǎng)基上菌落為粉色，氣生菌絲絲狀，菌落背面為紅褐色，分泌紅褐色物質(zhì)，生長1周菌落直徑為5.2cm；小型分生孢子單胞，橢圓形，有時兩端略彎曲，3.4-12.1×1.4-3.4μm；大型分生孢子，多胞，鐮刀形，37.6×4.0μm，少見；(3)真菌的接種接種真菌的方法為選取樹齡5年以上的龍血樹樹干，通過鉆孔或挖槽的方式在樹干形成直徑0.5-3cm，深2-15cm的接種孔或長1-6cm，寬1-6cm，深1-6cm的接種槽；在接種孔或接種槽中接入鋸末復(fù)合固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌種，或接入液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的發(fā)酵物；接種后用聚丙烯薄膜包扎接菌孔或接種槽；用上述方法在龍血樹的樹干上接種真菌一次，或在第一次接種真菌后，在接種孔周圍形成血竭樣紅色物質(zhì)的初期或中期，在原接種部位或在紅色物質(zhì)形成區(qū)域中，用上述方法重復(fù)接種真菌。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于該方法適用的樹種為百合科龍血樹屬小 花龍血樹和劍葉龍血樹。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于用于打孔或挖槽，接種真菌D-22的龍血 樹樹干為樹齡5年以上的活體龍血樹樹干或樹齡5年以上的離體龍血樹樹干。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在樹干挖接種槽的方式包括橫向切割形 成凹槽，縱向切割形成凹槽，或從上向下斜向形成凹槽。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于龍血樹樹干上接種孔或接種槽的間隔是縱向間隔5-15cm，橫向間隔3-10cm。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于接種真菌D-22后，龍血樹樹干上的接種 孔或接種槽周圍能產(chǎn)生與血竭化學(xué)成分相似的紅色物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種利用真菌誘導(dǎo)龍血樹產(chǎn)生血竭的技術(shù)方法，所用的1株真菌為鐮孢屬(Fusarium sp.)真菌D-22，內(nèi)容包括真菌的培養(yǎng)方法和真菌的接種方法。應(yīng)用該項技術(shù)，可以誘導(dǎo)龍血樹的樹干分泌產(chǎn)生與血竭化學(xué)成分相似的紅色物質(zhì)。該項技術(shù)工藝簡便，生產(chǎn)成本低，周期短，充分地利用和保護了龍血樹資源，便于推廣應(yīng)用。
文檔編號A01G7/06GK101779578SQ20091000025
公開日2010年7月21日 申請日期2009年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月15日
發(fā)明者孟志霞, 王春蘭, 郭順星, 陳曉梅, 龔利娟 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所