干擾素誘導(dǎo)蛋白p204在制備抗肺癌轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種干擾素誘導(dǎo)蛋白p204在制備抗肺癌轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用。利用小鼠的體外淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)與體內(nèi)荷瘤實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明所述干擾素誘導(dǎo)蛋白p204可以顯著抑制肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，預(yù)示該干擾素誘導(dǎo)蛋白有望成為抗肺癌轉(zhuǎn)移研究的重要靶點(diǎn)，為制備抗肺癌轉(zhuǎn)移藥物提供了基礎(chǔ)，具有良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。
【專(zhuān)利說(shuō)明】干擾素誘導(dǎo)蛋白P204在制備抗肺癌轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種干擾素誘導(dǎo)蛋白的應(yīng)用，尤其涉及一種干擾素誘導(dǎo)蛋白P204在 制備抗肺癌轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用，屬于腫瘤生物學(xué)領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 干擾素誘導(dǎo)蛋白p204(如下簡(jiǎn)稱(chēng)p204)是一種核蛋白，是干擾素（IFN)誘導(dǎo)產(chǎn) 生的P200蛋白家族（IFI-200) -員。該蛋白含有640個(gè)氨基酸殘基（詳見(jiàn)UniProtKB/ Swiss-Prot :P15092. 2)，分子量為72kDa，其N(xiāo)末端（aa 1-216)有核定位信號(hào)（NLS)和核輸 出信號(hào)（NES) ;C末端含有兩個(gè)保守的HIN-200結(jié)構(gòu)域，Rb蛋白的結(jié)合基序定位其上。p204 在心臟、胸腺、脾臟、骨髓等器官中有大量表達(dá)。
[0003] 實(shí)驗(yàn)證明p204參與多種重要信號(hào)通路，它可以通過(guò)與下游轉(zhuǎn)錄因子、信號(hào)蛋白的 結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)其活性，并在組織分化中起重要作用，如P204具有調(diào)節(jié)骨骼和肌肉發(fā)育以及巨 噬細(xì)胞活性的功能。劉等研究發(fā)現(xiàn)，在成骨分化過(guò)程中，P204依靠其蛋白上的兩個(gè)非重疊 片段與Cbfal蛋白協(xié)同作用，這一過(guò)程需要pRb蛋白作為兩者的連接橋梁，p204通過(guò)C末 端LXCXE基序與pRb蛋白結(jié)合，最終與Cbfal和pRb蛋白組成了一個(gè)三元復(fù)合體共同參與 成骨細(xì)胞發(fā)育。
[0004] 2010年Unterholzner報(bào)道人類(lèi)IFI16及其鼠源蛋白p204是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)病毒DNA的 感受器，P204可以通過(guò)HIN-200結(jié)構(gòu)域探知胞質(zhì)內(nèi)非AT豐富的dsDNA，并在探測(cè)到DNA存 在后與STING蛋白相互作用，激活TBKI所介導(dǎo)的IRF3磷酸化途徑并直接活化NF-κ B(含 有p65和p60兩個(gè)亞基）。上述被激活的轉(zhuǎn)錄因子會(huì)入核誘導(dǎo)IFN- α / β的表達(dá)。但P204 在抗腫瘤轉(zhuǎn)移方面的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。
[0005]目前癌癥是威脅人類(lèi)健康的頭號(hào)殺手，全球因癌癥死亡的人數(shù)正逐年上升，據(jù)世 界衛(wèi)生組織估計(jì)，隨著世界人口日趨老齡化，預(yù)計(jì)到2030年可能將超過(guò)1310萬(wàn)。這其中大 多數(shù)患者并非死于原發(fā)性癌，而是死于轉(zhuǎn)移性癌。因此，研究和開(kāi)發(fā)抗腫瘤轉(zhuǎn)移的生物藥物 具有極其重要的意義。經(jīng)檢索，有關(guān)干擾素誘導(dǎo)蛋白P204在制備抗肺癌轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用 未見(jiàn)報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種干擾素誘導(dǎo)蛋白p204在制備 抗肺癌轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明所述干擾素誘導(dǎo)蛋白p204在制備抗肺癌轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明利用C57BL6野生型小鼠與p204敲除型小鼠為模型，研究了 p204分子的生 物學(xué)作用，實(shí)驗(yàn)證實(shí)：該分子能夠顯著抑制肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，為制備抗肺癌轉(zhuǎn)移藥物的研究 奠定了基礎(chǔ)。
[0009] 為了更好的證明本發(fā)明所述分子的作用效果，下面結(jié)合小鼠（野生型小鼠與p204 敲除型小鼠）的體外淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)與體內(nèi)荷瘤實(shí)驗(yàn)和結(jié)果，來(lái)進(jìn)一步闡述本發(fā)明所述 干擾素誘導(dǎo)蛋白P204在抗肺癌轉(zhuǎn)移中所具有的作用。
[0010] 1.小鼠脾臟淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)
[0011] 獲得野生型小鼠與P204敲除型小鼠的脾臟淋巴細(xì)胞，對(duì)其分別進(jìn)行ConA/LPS刺 激，培養(yǎng)48h后，加入CCK-8檢測(cè)液，然后檢測(cè)OD值并按照公式：刺激指數(shù)=[(實(shí)驗(yàn)孔（0D 值）-空白孔（0D值））八對(duì)照孔（0D值）-空白孔（0D值））]計(jì)算淋巴細(xì)胞的刺激指數(shù)（轉(zhuǎn) 化率）。
[0012] 結(jié)果顯示在三組平行實(shí)驗(yàn)中：對(duì)于ConA與LPS的刺激，野生型小鼠的淋巴細(xì) 胞轉(zhuǎn)化率均高于P204基因敲除小鼠，且結(jié)果經(jīng)過(guò)spss軟件分析，兩者具有顯著性差異 (p〈0. 05)，表明p204基因的敲除導(dǎo)致了小鼠免疫功能的下降（見(jiàn)圖1)。
[0013] 2.荷瘤小鼠模型構(gòu)建
[0014] 取Lewis肺癌細(xì)胞，分別接種于野生型小鼠與p204敲除型小鼠的左側(cè)腋窩下，對(duì) 照組注射〇. 9%滅菌生理鹽水。接種7天后能用手觸摸到左側(cè)腋窩處有隆起的腫瘤組織，說(shuō) 明荷瘤模型構(gòu)建成功。
[0015] 3.荷瘤小鼠體重與腫瘤體積記錄。
[0016] 對(duì)荷瘤模型構(gòu)建成功的小鼠跟蹤觀(guān)察，記錄體重?cái)?shù)據(jù)并按照公式計(jì)算體重變化 率：體重變化率=(檢測(cè)時(shí)體重-腫瘤接種時(shí)體重）/腫瘤接種時(shí)體重。
[0017] 結(jié)果顯示，a.兩種基因型小鼠在注射腫瘤細(xì)胞后，體重較對(duì)照組（只注射生理鹽 水）均有明顯增加（荷瘤實(shí)驗(yàn)組小鼠體重為22?26g，體重增加約為4?7g ;對(duì)照組小 鼠體重為22?25g,體重增加約為1?2. 5g),且荷瘤實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組體重增加值相比具 有極顯著差異（P〈〇. 01) ;b.荷瘤實(shí)驗(yàn)組小鼠的體重變化率在第15d開(kāi)始具有顯著性差異 (p〈0. 05)并在第24d開(kāi)始具有極顯著性差異，而同一時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組小鼠體重變化率無(wú)顯著 性差異（P>〇.〇5) ;c.p204敲除小鼠在第22d體重下降。以上三點(diǎn)暗示了 p204敲除后小鼠 體內(nèi)腫瘤重量增幅雖小，但其惡化情況卻更為嚴(yán)重，影響了小鼠正常生理功能（飲食、排泄 等），使其體重迅速下降（見(jiàn)圖2)。
[0018] 試驗(yàn)期間，每周處死荷瘤小鼠后，將腫瘤塊剝離，使用游標(biāo)卡尺對(duì)腫瘤的長(zhǎng)徑（a) 與短徑（b)進(jìn)行記錄，并按照公式V = (ab2)/2計(jì)算腫瘤體積。
[0019] 結(jié)果顯示，無(wú)論野生型還是p204敲除型小鼠，其腫瘤體積均隨接種時(shí)間增長(zhǎng)而增 大，但野生型小鼠腫瘤體積明顯大于同時(shí)間點(diǎn)的P204敲除型小鼠，且在腫瘤細(xì)胞接種后的 第三周和第四周具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Ρ〈〇· 05)(見(jiàn)圖3A);
[0020] 在第四周預(yù)計(jì)處死的10只實(shí)驗(yàn)組小鼠中，野生型小鼠僅有一只提前死亡，死亡率 為10%,而ρ204敲除型小鼠有四只提前死亡,死亡率為40% (見(jiàn)圖3Β)。
[0021] 實(shí)驗(yàn)組的ρ204敲除型小鼠其腫瘤體積小于實(shí)驗(yàn)組的野生型小鼠，卻具有更高的 死亡率，暗示了由于與野生型小鼠相比， Ρ204敲除型小鼠體內(nèi)環(huán)境更適合腫瘤的浸潤(rùn)。所 以野生型小鼠體內(nèi)腫瘤基本在注射部位（腋下）生長(zhǎng)，而Ρ204敲除型小鼠腫瘤細(xì)胞更多的 去浸潤(rùn)其它組織，導(dǎo)致小鼠飲水?dāng)z食等出現(xiàn)障礙，并最終死亡。
[0022] 4.小鼠肺部組織石蠟切片與HE染色觀(guān)察
[0023] 處死小鼠后，取小鼠的左側(cè)肺葉進(jìn)行石蠟切片，并將切片進(jìn)行HE染色，在倒置顯 微鏡下進(jìn)行觀(guān)察并拍照。
[0024] 結(jié)果表明：無(wú)論是野生型還是p204敲除型，其對(duì)照組小鼠的肺部切片（圖4C、4D) 均顯示無(wú)炎癥情況和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡形態(tài)正常，無(wú)腫瘤灶。對(duì)比荷瘤實(shí)驗(yàn)組小鼠的肺部 切片可以清楚觀(guān)察到P204敲除型小鼠其肺部出現(xiàn)明顯淋巴細(xì)胞聚集和腫瘤浸潤(rùn)情況（圖 4B圖中箭頭所示部位為肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移浸潤(rùn)），而野生型實(shí)驗(yàn)組小鼠僅出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，無(wú)腫 瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)（圖4A)。
[0025] 上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理（spss軟件分析），實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差 表不。
[0026] 通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)及其結(jié)果，可以得到以下結(jié)論：
[0027] p204敲除小鼠相比野生型小鼠其免疫力降低，但其腫瘤塊體積卻小于相同時(shí)間點(diǎn) 的野生型小鼠（具有顯著性差異），再結(jié)合石蠟切片所顯示的結(jié)果說(shuō)明：干擾素誘導(dǎo)蛋白 P204其全身性敲除導(dǎo)致小鼠免疫力降低，并有利于肺癌細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)移與浸潤(rùn)，表 明干擾素誘導(dǎo)蛋白P204可以抑制肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。
[0028] 本發(fā)明公開(kāi)的干擾素誘導(dǎo)蛋白p204在抗肺癌轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用，預(yù)示該干擾素誘導(dǎo) 蛋白P204有望成為抗肺癌轉(zhuǎn)移研究的重要靶點(diǎn)，為制備抗肺癌轉(zhuǎn)移藥物提供了基礎(chǔ)，具有 良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0029] 圖1野生型小鼠與p204敲除小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化結(jié)果（刺激指數(shù)）
[0030] 其中：圖中A代表三組平行實(shí)驗(yàn)（WT1與K01、WT2與K02、WT3與K03)中兩種基因 型小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化結(jié)果（刺激指數(shù)），圖B是將圖A中結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析后得出的柱狀 圖。
[0031] 圖2小鼠體重變化趨勢(shì)圖
[0032] 其中：圖中實(shí)線(xiàn)代表荷瘤實(shí)驗(yàn)組（圓點(diǎn)表示野生型小鼠，方塊表示p204敲除型小 鼠）；虛線(xiàn)代表對(duì)照組（正三角代表野生型小鼠，倒三角代表P204敲除型小鼠）；橫坐標(biāo) 表示實(shí)驗(yàn)組小鼠腫瘤接種的時(shí)間，縱坐標(biāo)表示小鼠體重變化率（體重變化率=(檢測(cè)時(shí)體 重-腫瘤接種時(shí)體重）/腫瘤接種時(shí)體重）。
[0033] 圖3荷瘤實(shí)驗(yàn)組小鼠腫瘤體積及死亡率統(tǒng)計(jì)
[0034] 其中：圖A表示在接種腫瘤細(xì)胞后，不同時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組小鼠腫瘤體積，橫坐標(biāo)代表 腫瘤接種后時(shí)間（分別為接種后第2周、第3周、第4周）；縱坐標(biāo)代表腫瘤體積大小。圖B 表示荷瘤實(shí)驗(yàn)組小鼠死亡率。
[0035] 圖4小鼠肺部組織石蠟切片HE染色圖（20 X 40)
[0036] 其中：圖A:荷瘤組野生型小鼠肺部切片；圖B :荷瘤組p204敲除型小鼠肺部切片； 圖C :對(duì)照組野生型小鼠肺部切片；圖D:對(duì)照組p204敲除型小鼠肺部切片。圖中箭頭所示 部位為肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移浸潤(rùn)。

【具體實(shí)施方式】
[0037] 實(shí)施例1
[0038] 小鼠脾臟淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)
[0039] 1)取野生型（WT)和p204基因敲除型（KO)小鼠各3只并隨機(jī)編號(hào)為WT1/WT2/WT3 與K01/K02/K03,斷頸處死后，在75%酒精中浸泡5min ;
[0040] 2)將小鼠在超凈工作臺(tái)內(nèi)解剖，取出脾臟，經(jīng)200目細(xì)胞篩研磨成單細(xì)胞懸液；
[0041]3)使用PBS(PH 7. 4)洗滌并離心（1000g，5min)，重復(fù)一次，并用PBS重懸細(xì)胞；
[0042] 4)將細(xì)胞懸液按照1:1的比例小心疊加在淋巴細(xì)胞分離液上層（保證兩種液體分 界面不被破壞），然后離心（500g，20min);
[0043] 5)離心完畢后，將離心管中第二層（從上向下數(shù)）--乳白色的淋巴細(xì)胞層小心 地分離出來(lái)，按照1:2比例加入細(xì)胞洗滌液，充分混勻后離心（500g，20min);
[0044] 6)用PBS (PH 7. 4)重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，將細(xì)胞濃度調(diào)整為IX 106/ml，取出18 μ 1，加 入2 μ 1臺(tái)盼藍(lán)染液，染色3min后，在顯微鏡下用計(jì)數(shù)板分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞（拒染）和死細(xì)胞 (呈淡藍(lán)色）數(shù)目，按照公式計(jì)算細(xì)胞存活率：
[0045] 細(xì)胞存活率（％)=活細(xì)胞總數(shù)/(活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù)）X 100%
[0046] 存活率在95%以上的細(xì)胞可用于淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。
[0047]7)將符合條件的淋巴細(xì)胞懸液離心（1000g，5min)，棄上清，加入1640培養(yǎng)液（已 加入10%胎牛血清、10(^/1111青霉素和10(^8/1111鏈霉素）重懸細(xì)胞，并將細(xì)胞濃度調(diào)整為 IXlO fVml，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100μ 1(即IXlO5個(gè)細(xì)胞/孔）；
[0048] 8)實(shí)驗(yàn)設(shè)5組（每只小鼠均設(shè)5組），按照下表所示處理方法與平行孔數(shù)對(duì)樣品 進(jìn)行處理：
[0049]

【權(quán)利要求】
1.干擾素誘導(dǎo)蛋白P204在制備抗肺癌轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK104399061SQ201410620500
【公開(kāi)日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年11月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月6日
【發(fā)明者】時(shí)永香, 劉傳聚, 楊楨, 魏偉, 尹郭偉, 閆曉桐 申請(qǐng)人:山東大學(xué)