專利名稱：阿糖核酸的合成與聚肌胞的制作方法
技術領域：
本發(fā)明提出了阿糖核酸(Arabinonucleic Acid，ANA)新概念、人工合成的Poly rIPoly aC屬于高效干擾素誘導劑，具有抗病毒、抗腫瘤功能。
早在1935年Hoskins就發(fā)現(xiàn)了病毒間相互干擾現(xiàn)象。1957年Issacs確認了干擾素的存在，凡是能誘導細胞或生物體產(chǎn)生干擾素的物質，便叫做干擾素誘導劑。人們相繼發(fā)現(xiàn)一些細菌、立克次體、原蟲、真菌提取物(雙鏈RNA)和植物凝集素以及化學合成的小分子(如太洛龍)等均能誘導產(chǎn)生干擾素。值得特別強調提出的，1967年Field等發(fā)現(xiàn)人工合成的Poly rIrC具有很強的誘導產(chǎn)生干擾素的能力。
國內外研究證明，Poly rIrC不僅具有抗病毒作用，而且能刺激吞噬作用，增強抗體的產(chǎn)生，具有抗腫瘤作用。其抗腫瘤作用具有廣譜性。細胞培養(yǎng)和動物試驗顯示，Poly rIrC對多種病毒如皰疹性口腔炎病毒、副流感病毒、肝炎病毒和腦心肌病毒等的感染均有良好的保護作用。此外，對若干種轉移性腫瘤也具有抗性，如L1210腹水瘤、網(wǎng)狀細胞肉瘤、S91瘤、乳腺癌和纖維肉瘤等均有不同程度的抑制作用。有關Poly rIrC臨床應用，70年代國內外均做了大量工作(ScientificAmerican 1971，22526；中國藥物雜志1982，1898)。在治療單純皰疹角膜炎、帶狀皰疹和水痘和若干腫瘤病方面均顯示了較好效果。
由于干擾素誘導劑比外源性干擾素具有多方面的生物效應和安全性較好的特點，因此在重組干擾素大量進入市場的今天，干擾素誘導劑的研究仍具有一定的意義。
已有的Poly rIrC結構與功能關系研究資料揭示(FEBSLetter，1972，24137，Antimicrob Agents chemother 1977，11299)Poly rIrC作為干擾素誘導劑具備以下條件(1)足夠高的分子量，大于106道爾頓，(2)具有雙螺旋結構，Tm值大于60℃，(3)兩條鏈上的糖環(huán)上的2’位必須是羥基，(4)保持嘌呤環(huán)的完整性，(5)嘧啶環(huán)上的C-5不可取代，(6)對RNase有相當?shù)目剐?。在研究人工合成核酸干擾素誘導物的過程中，為了提高其誘導能力，主要注意力放在鹼基和磷酸基團修飾上，雖已取得了若干有意義的結果，然而并沒有使其干擾素誘導能力有很大的提高，在臨床應用上沒有實際意義。人們對糖環(huán)上的2’位羥基關心較少，也有人作了2’-OH的甲基化和乙酰化報道，其結果證明2’-OH是其誘導干擾素不可缺少的。本發(fā)明在于對其糖環(huán)上的2’-OH不增加任何化學基團的情況下，僅改變2’-OH空間位置，把構成核糖核酸中的核糖換成阿糖，由阿糖核苷酸人工合成的多聚體，即所謂阿糖核酸。阿糖核苷在治療白血病方面取得了較好的療效(Nature，1976，264／5587679)，其缺點在于體內半衰期短，由于脫氨酶的作用將ara-C脫氨轉化成無效的ara-U。本發(fā)明人工合成多聚阿糖胞嘧啶核酸(pcly aC)與Poly rI構成Poly rIaC雙螺旋，作為干擾素誘導劑，它可能具有抗RNase作用，結構穩(wěn)定和高效誘導的優(yōu)點。即使Poly rIaC經(jīng)受RNase水解產(chǎn)生的aCMp或a-C，仍具有抗病毒抗腫瘤作用。
本發(fā)明主要內容包括大腸桿菌PNpase酶的制備，rIDP和aCDP的合成，酶促合成Poly rI和Poly aC，雙螺旋核酸Poly rIaC的制備。
實施例(一)大腸桿菌PNpase酶的制備以自己篩選得到的PNpase酶高產(chǎn)大腸桿菌菌株為PNpase酶生產(chǎn)菌，采用蛋白胨-葡萄糖培養(yǎng)基，將菌種單個菌落挑出，經(jīng)二級搖瓶(50m／250ml)，37度培養(yǎng)12小時，接入500ml培養(yǎng)液(裝在3000ml三角瓶中)，31度振蕩培養(yǎng)24小時，離心8000 rpm 10 min收集菌體(約14g)。
1、細胞裂解將菌體懸浮在30ml STE緩沖液(10mM Tris-HCl，pH8．0--1mM EDTA--100mM NaCl)，加入溶菌酶約80mg(溶在適量的STE中)，室溫放置約20min，在攪拌下加入1．5mlTriton-100(以15ml STE稀釋)和1／20體積的25mM PMSF，最后加入冷蒸餾水50ml，離心9000rpm 20min收集上清液95ml。
2、硫酸鏈霉素處理去除核酸類酸性物質在攪拌下加入5ml 10％硫酸鏈霉素(溶在*TE 溶液中)，邊滴加邊攪拌約20min加完，加完后繼續(xù)攪拌10min，9000rpm 離心20min去除沉淀。
3、(NH4)2SO4分部沉淀加固體(NH4)2SO4于鏈霉素處理的上清液中，邊攪拌邊加(NH4)2SO4使之達到35％飽和液，并以4N KOH調pH7．0，9000rpm離心20min去沉淀，上清液繼續(xù)加(NH4)2SO4飽和度達60％，室溫(22℃)放置過夜，離心收集沉淀，以TE-溶解，對TE攪動透析，換TE4次，離心去沉淀，上清液即為粗酶液。
4、TEAE柱層析TEAE(Serva公司出品)經(jīng)預處理，裝柱，TE緩沖液平衡，將上述粗酶液上柱。淋洗分別以0．1M NaCl inTE和0．2M NaCl in TE 淋洗。洗脫以0．35M NaCl洗脫，分部收集，將活性高的部分合并。平均酶活性達30u／ml，20℃保存?zhèn)溆谩?br> *TE20mM Tris-HCl，pH 8．2和1mM EDTA。
(二)rIDP和aCDP的制備rIDP的制備按靳傳富等人的方法(生物化學與生物物理進展，1975，425)。
aCDP的合成以aCMP為起始原料，以啤酒酵母細胞為酶源，在高濃度無機磷條件下，進行磷酸化反應，獲得aCDP。反應條件每毫升含葡萄糖145mg，aCMP 6．5mg，KH2PO428mg，MnCl213mg，和啤酒酵母0．5g，pH 6．5。盛于小三角瓶中，28℃搖蕩15小時終止反應。100℃水浴5min，8000rpm離心20min去沉淀。分離純化將上述上清液，以0．1M NH4HCO3溶液稀釋10倍，上TEAE(Serva)柱。以0．3M--1．5M NH4HCO3溶液進行線型梯度洗脫。收集aCDP部分，減壓濃縮。以4N HCl調pH2．5，加3倍體積95％乙醇，4℃過夜，10000rpm離心20min，收集沉淀，以無水乙醇脫水處理2-3次，減壓干燥。
(三)Poly rI和Poly aC的酶促合成Poly rl的酶促合成參照靳傳富等人的條件(生物化學與生物物理進展，1975，425)。
酶促反應液的組成Tris-HCL(pH8．5)，150mM，MgCL26mM，EDTA1mM和尿素300mM。
反應條件每毫升反應液中加入30mg rDIp和pNpase 2單位，35℃保溫16小時。
加入等體積苯酶(150mM Tris-HCL，pH8．5飽和)振蕩處理約10min，分層后吸取水相，以二分之一體積150mM Tris-HCL(pH8．5)反抽提一次，兩次合并，在低溫下，對10mM檸檬酸鈉-50mM NaCL溶液攪拌透析，經(jīng)檢測，透析外液基本上無紫外吸收值(0．D248＜0．05)，10000rpm離心除去沉淀，加入3倍體積95％乙醇，-10℃放置3-4小時，10000rpm離心收集沉淀，無水乙醇洗三次。最后，置真空干燥器。產(chǎn)率為50％左右，平均分子量約18S(約合106道爾頓)。
Poly aC的酶促合成酶合成液的組成Tris-HCL(pH9．0)100mM，MnCL230mM，CuSO44mM和尿素300mM。
反應條件每毫升合成反應液中加入aCDP 20mg和pNpase 2單位，37℃保溫12小時。加等體積苯酶終止反應，其它操作條件與PolyrI相同。
(四)人工合成核酸雙螺旋Poly rIaC的制備將rIDP和aCDP按等量配制在pH7．2，6mM PBS-5mM MgCl2-100mMNaCl溶液中，預熱至40℃，然后按等體積混合，40℃水浴保溫20min，取出室溫冷卻后，-20℃保存。經(jīng)分析減色效應一般＞30％，Tm值約60℃。
權利要求
1. 一種具有如下結構式的阿糖核酸(ANA)，其特征在于構成核酸的基本單元是核苷酸，它是由堿基、核糖和磷酸根組成，其糖環(huán)結構上與脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的區(qū)別為，DNA為2-脫氧核糖(D)，RNA為核糖(R)，ANA為阿糖(A)。注B堿基；P磷酸基團
2. 一種根據(jù)權利要求1人工合成ANA的方法，其特征在于(1) 以多核苷酸磷酸化酶(PNpase)分別以rIDP和aCDP合成多聚黃嘌呤核苷酸(Poly rI)和多聚阿糖胞嘧啶核苷酸(PolyaC)；(2) 按適當?shù)谋壤?，在一定條件下使Poly rI和Poly aC形成雙鏈。
3. 根據(jù)要求2所述的方法，其中Poly rI平均分子量控制在106道爾頓以上，Poly aC平均分子量控制在104-105范圍內。
全文摘要
本發(fā)明提出了阿糖核酸的概念和人工合成的方法以及對干擾素誘導劑聚肌胞研究的意義。
文檔編號C07H21/00GK1292381SQ99121719
公開日2001年4月25日 申請日期1999年10月9日 優(yōu)先權日1999年10月9日
發(fā)明者張其玖 申請人:張其玖