用于在植物中誘導揮發(fā)性有機化合物生產(chǎn)的包含芽孢桿菌屬（bacillus）細菌的接種劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了接種劑，其包含芽孢桿菌屬（Bacillus）細菌，并誘導用所述接種劑處理過的植物產(chǎn)生揮發(fā)性有機化合物（VOC）。
【專利說明】用于在植物中誘導揮發(fā)性有機化合物生產(chǎn)的包含芽孢桿菌屬(BACILLUS)細菌的接種劑
【技術領域】
[0001]本發(fā)明的主題內(nèi)容涉及植物根際促生菌(PGPR)的領域。具體來說，本發(fā)明的主題內(nèi)容涉及PGPR，其誘導用所述細菌處理過的植物產(chǎn)生揮發(fā)性有機化合物。
【背景技術】
[0002]事實上，植物中揮發(fā)性有機化合物(VOC)的誘導尚未經(jīng)過調(diào)查，盡管有證據(jù)表明植物揮發(fā)性物質(zhì)的誘導依賴于生物性因素例如植物激素(de Bruxelles和Roberts，2001 ；Ament等，2004)、草食性動物來源的激發(fā)子(Spiteller和Boland，2003)和伴生微生物包括病原體(Preston等，1999 ；Cardoza等,2002)以及非生物性因素例如創(chuàng)傷(Mithofer等，2005)、重金屬(Mithofer等，2004)以及溫度和光(Takabayashi等，1994)的相互作用。植物根際促生菌(PGPR)代表了一大類移生根部的細菌，其應用通常與提高植物生長速度(Kloepper, 1992 ；Zehnder 等，1997)、抑制土壤病原體(Schippers 等，1987)和誘導針對昆蟲害蟲的系統(tǒng)抗性(Klo印per等，1999 ;Ryu等，2004)相關。考慮到在世界上的某些地區(qū)PGPR正被越來越多地應用于幾種大田作物的生產(chǎn)(Backman等，1997 ;Cleyet_Marcel等，2001)，對植物中VOC的誘導和PGPR是否能夠影響植物中VOC的產(chǎn)生的研究之缺乏是令人吃驚的。Backman等(1997)報道了 60-75%的美國棉花作物用PGPR產(chǎn)品Kodkk?進行處理，這是一種用于抑制鐮刀菌屬(Fusarium)和絲核菌屬(Rhizoctonia) 土壤病原體的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)產(chǎn)品。在該文獻中，研究了 PGPR對棉花揮發(fā)性物質(zhì)的誘導的潛在影響以及吸引棉花草食性動物和它們的擬寄生物的結(jié)果。令人吃驚的是，觀察到PGPR以重要影響力引起植物VOC的變化。關于PGPR對植物揮發(fā)性物質(zhì)誘導和昆蟲-植物相互作用的影響的知識，可能有助于提高PGPR產(chǎn)品的采用率和更好產(chǎn)品的開發(fā)，并且也有助于減輕這些產(chǎn)品的潛在負面影響。
[0003]發(fā)明概述
[0004]本發(fā)明公開了分離的植物根際促生菌(PGPR)及其接種劑，其誘導用所述PGPR處理過的植物產(chǎn)生一種或多種揮發(fā)性有機化合物(VOC)。適合的PGPR可以包括芽孢桿菌屬菌種。
[0005]所述由植物產(chǎn)生的VOC可以包括但不限于選自α -菔烯、β -菔烯、β -月桂烯、乙酸順-3-己烯酯、檸檬烯、羅勒烯、芳樟醇、(Ε)-4，8-二甲基-1，3，7-壬三烯、水楊酸甲酯、癸醛、順-茉莉酮、石 竹烯、α -蛇麻烯、β -法呢烯的化合物及其混合物。由PGPR處理過的植物產(chǎn)生的VOC優(yōu)選改變暴露于所述VOC的昆蟲的行為。在某些實施方式中，所述昆蟲是草食性動物，并且所述VOC減少所述昆蟲在植物上產(chǎn)卵或昆蟲以植物為食。在其他實施方式中，所述昆蟲是肉食性動物或擬寄生物，并且所述VOC將所述肉食性動物或擬寄生物吸引到植物。
[0006]PGPR可以是細菌的單一菌株、菌種或菌屬，或者可以包含多種菌株、菌種或菌屬的混合物。例如，PGPR可以選自包括但不限于下列的屬:放線菌屬(Actinobacter),產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes),芽孢桿菌屬，伯克氏菌屬(Burkholderia),布丘氏菌屬(Buttiauxella),腸桿菌屬(Enterobacter),克雷伯氏菌屬(Klebsiella),克魯維菌屬(Kluyvera),假單胞菌屬(Pseudomonas),拉恩氏菌屬(Rahnella),羅爾斯通菌屬(Ralstonia),根瘤菌屬(Rhizobium),沙雷氏菌屬(Serratia),寡養(yǎng)食單胞菌屬(Stenotrophomonas),類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)和賴氨酸芽孢桿菌屬(LysinibaciIIus)ο
[0007]所述PGPR可以包括芽孢桿菌屬細菌。所述芽孢桿菌屬細菌可以具有包含SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3 或 SEQ ID NO: 4 的 16S rDNA 核酸序列，或者可以包含與 SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4 和 SEQ ID NO:5 中的一個或多個具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的16S rDNA核酸序列。具體的芽孢桿菌屬細菌可以包括解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)(例如解淀粉芽孢桿菌菌株AP-136,其于2011年12月2日在登記號NRRL B-50614 下保藏于美國農(nóng)業(yè)部(United States Department of Agriculture);例如解淀粉芽孢桿菌菌株AP-188，其于2011年12月2日在登記號NRRL B-50615下保藏于美國農(nóng)業(yè)部；解淀粉芽孢桿菌菌株AP-218，其于2011年12月2日在登記號NRRL B-50618下保藏于美國農(nóng)業(yè)部；解淀粉芽孢桿菌菌株AP-219，其于2011年12月2日在登記號NRRLB-50619下保藏于美國農(nóng)業(yè)部；以及解淀粉芽孢桿菌菌株AP-295，其于2011年12月2日在登記號NRRL B-50620下保藏于美國農(nóng)業(yè)部)；莫哈韋芽孢桿菌(Bacillus mojavensis)(例如莫哈韋芽孢桿菌菌株AP-209，其于2011年12月2日在登記號NRRL B-50616下保藏于美國農(nóng)業(yè)部)；鹽土芽孢桿菌(例如鹽土芽孢桿菌菌株AP-217，其于2011年12月2日在登記號NRRL B-50617下保藏于美國農(nóng)業(yè)部)；短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)(例如短小芽孢桿菌菌株INR-7(也被稱為BU F-22，其于2008年7月23日在登記號NRRL B-50153下保藏于美國農(nóng)業(yè)部；以及 BU-F33，其于2008年10月15日在登記號NRRL B-50185下保藏于美國農(nóng)業(yè)部))；簡單芽孢桿菌(Bacillus simplex)(例如簡單芽孢桿菌菌株ABU288,其于2010年I月19日在登記號NRRL B-50340下保藏于美國農(nóng)業(yè)部)；以及枯草芽孢桿菌(枯草芽孢桿菌菌株MBI600，其于2011年11月10日在登記號NRRL B-50595下保藏于美國農(nóng)業(yè)部)，及其混合物或摻混物。
[0008]還公開了包含本文公開的PGPR并任選包含載體的接種劑。所述接種劑可以包含其他活性成分，例如植物激素(如3-羥基丁酮、2，3-丁二醇和吲哚乙酸)以及抗微生物化合物(如苯乙醇和4-羥基苯甲酸鹽)。
[0009]可將所公開的PGPR及其接種劑用在改變昆蟲對植物的行為的方法中。在某些實施方式中，所述方法包括向植物、植物的種子、塊莖或根狀莖或植物周圍的土壤或環(huán)境施用包含所述PGPR的接種劑。所述方法可以減少草食性動物在植物上產(chǎn)卵或以所述植物為食，和/或可以將肉食性動物或擬寄生物吸引到植物。適用于所述方法的植物包括但不限于苜蓿、水稻、大麥、黑麥、棉花、向日葵、花生、玉米、馬鈴薯、甘薯、菜豆、豌豆、小扁豆菊苣、生菜、苦苣、卷心菜、抱子甘藍、甜菜、歐洲防風草、蕪菁、花椰菜、西蘭花、蕪菁、小蘿卜、菠菜、洋蔥、大蒜、爺子辣椒、療菜、胡蘿卜、南瓜(squash)、倭瓜(pumpkin)、西葫蘆、黃瓜、蘋果、梨、甜瓜、柑橘、草莓、葡萄、覆盆子、菠蘿、大豆、低芥酸油菜、油菜、春小麥、冬小麥、煙草、番茄、高粱和甘蔗。[0010]附圖簡述
[0011]圖1.未處理的(對照)棉花植物與用PGPR菌株INR-7、PGPR摻混物8，或PGPR摻混物9處理的棉花植物相比，頂部空間揮發(fā)物的色譜圖。鑒定到的化合物:(1) α-菔烯；(2) β-菔烯；(3) β-月桂烯；(4)乙酸順-3-己烯酯；(5)檸檬烯；(6) β-羅勒烯；(7)芳樟醇；(8)未知；(9)石竹烯；(10) α-蛇麻烯；(11) β-法呢烯。
[0012]圖2.從未處理的未被毛蟲侵襲的(對照I)棉花植物、未處理的被毛蟲侵襲的(對照2)棉花植物、PGPR摻混物9處理的未被毛蟲侵襲的棉花植物和PGPR摻混物9處理的被毛蟲侵襲的棉花植物收集到的頂部空間揮發(fā)物的色譜圖。鑒定到的化合物:(I)順式-3-己烯醛；(2)反式-2-己烯醛；(3)順式-3-己烯-1-醇；(4)反式-2-己烯-1-醇；(5) α -菔烯；(6)β-菔烯；(7)月桂烯；(8)乙酸順-3-己烯酯；(9)乙酸反-2-己烯酯；(10)檸檬烯；
(11)β-羅勒烯；(12)芳樟醇；(13)未知；(14) (E)-4，8-二甲基-1,3，7-壬三烯;(15)丁酸順-3-己烯酯；(16) 丁酸反-2-己烯酯；(17)正癸醛；(18) 2-甲基丁酸順-3-己烯酯；
(19)2-甲基丁酸反-2-己烯酯；(20)吲哚；(21)惕各酸異丁酯；(22)惕各酸(E)-2-己烯酯；(23)順-茉莉酮；(24)石竹烯；(25) α -反式香柑油烯；(26) α -法呢烯；(27) α -蛇麻烯；(28) β -法呢烯。
[0013]圖3.未處理的(對照)棉花植物與用PGPR菌株INR-7、PGPR摻混物8或PGPR摻混物9處理的棉花植物相比的根表面積(cm2)。用不同字母指示的平均值具有 顯著差異(P〈0.05，ANOVA, Tukey-Kramer HSD 多重比較檢驗，n=8)。
[0014]圖4.未處理的(對照)棉花植物與用PGPR菌株INR-7、PGPR摻混物8或PGPR摻混物9處理的棉花植物相比的根體積(cm3)。用不同字母指示的平均值具有顯著差異(P〈0.05，ANOVA, Tukey-Kramer HSD 多重比較檢驗，n=8)。
[0015]圖5.未處理的(對照)棉花植物與用PGPR菌株INR-7、PGPR摻混物8或PGPR摻混物9處理的棉花植物相比的根干重(g)。用不同字母指示的平均值具有顯著差異(P〈0.05，ANOVA, Tukey-Kramer HSD 多重比較檢驗，n=8)。
[0016]圖6.在四選嗅覺計中無經(jīng)驗的雌性紅足側(cè)溝苗蜂(M.croceipes)對未處理的(對照)棉花植物與用PGPR菌株INR-7、PGPR摻混物9處理的棉花植物或空白對照(空倉室)的反應的比較。每天試驗32只擬寄生物并重復5次。用不同字母指示的平均值具有顯著差異(Ρ〈0.05，ANOVA, Tukey-Kramer HSD 多重比較檢驗，η=5)。
[0017]圖7.在四選嗅覺計中無經(jīng)驗的雌性紅足側(cè)溝繭蜂對未處理的被侵襲的(對照)棉花植物與用PGPR摻混物9處理的被侵襲的、用PGPR摻混物9處理的未被侵襲的棉花植物或空白對照(空倉室)的反應的比較。用30只煙芽夜蛾(H.virescens)毛蟲對植物進行侵襲。每天試驗32只擬寄生物并重復4次。用不同字母指示的平均值具有顯著差異(Ρ〈0.05，ANOVA, Tukey-Kramer HSD 多重比較檢驗，η=4)。
[0018]圖8.在四選嗅覺計中無經(jīng)驗的雌性紅足側(cè)溝繭蜂對未處理的被侵襲的(對照)棉花植物與用PGPR摻混物9處理的被侵襲的、用PGPR摻混物9處理的未被侵襲的棉花植物或空白對照(空倉室)的反應的比較。用2只煙芽夜蛾毛蟲對植物進行侵襲。每天試驗32只擬寄生物并重復4次。用不同字母指示的平均值具有顯著差異(P〈0.05, ANOVA, Tukey-KramerHSD多重比較檢驗，η=4)。
[0019]圖9.PGPR對產(chǎn)卵批次數(shù)(A)和產(chǎn)卵總數(shù)(B)的影響。[0020]圖10.未處理的(對照)棉花植物與用PGPR菌株MBI600或PGPR菌株ABU288處理的棉花植物相比，頂部空間揮發(fā)物的色譜圖。箭頭表示在PGPR處理過的植物中檢測到但是在未處理的(對照)植物中沒有檢測到的揮發(fā)物峰。
[0021]詳細描述
[0022]下面進一步描述本公開的主題內(nèi)容。
[0023]除非另有說明或通過上下文指明，否則沒有具體數(shù)量的指稱是指“一個或多個”。例如，除非另有說明或通過上下文指明，否則“肽”應該被解釋為“一種或多種肽”。
[0024]當在本文中使用時，“約”、“大約”、“基本上”和“顯著地”將為本領域的普通技術人員所理解，并且根據(jù)它們所使用的上下文可以有一定程度的差異。如果所述術語的使用使本領域的普通技術人員不能根據(jù)它所使用的上下文做出清楚理解時，“約”和“大約”將意味著特定項加上或減去< 10%，“基本上”和“顯著地”將意味著特定項加上或減去>10%。
[0025]當在本文中使用時，術語“包括”與術語“包含”具有相同意義。
[0026]本文中使用的術語“植物”應該被寬泛地解釋，并可以包括被子植物和裸子植物、雙子葉植物和單子葉植物以及喬木。雙子葉被子植物的實例可以包括但不限于番茄、煙草、棉花、油菜籽，蠶豆、大豆、胡椒、生菜、豌豆、苜蓿、三葉草、卷心菜、西蘭花、花椰菜、抱子甘藍、小蘿卜、胡蘿卜、甜菜、茄子、菠菜、黃瓜、南瓜、甜瓜、哈密瓜和向日葵。單子葉被子植物的實例可以包括但不限于蘆筍、飼料玉米和甜玉米、大麥、小麥、水稻、高粱、洋蔥、珍珠粟、黑麥、燕麥和甘鹿O木本植物可以包括但不限于果樹、金合歡、棺木、山楊、櫸木、樺木、香楓、美國梧桐、白楊、柳樹、冷杉、松樹、云杉、落葉松、雪松、鐵杉。
[0027]術語“植物根際促生菌”或“PGPR”是指移生在植物根部并同時促進植物生長和/或減少疾病或來自于肉食性動物的損傷的一類細菌。作為PGPR的細菌可以屬于包括但不限于下列的屬:放線菌屬(Actinobacter),產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes),芽孢桿菌屬，伯克氏菌屬(Burkholderia),布丘氏菌屬(Buttiauxella),腸桿菌屬(Enterobacter),克雷伯氏菌屬(Klebsiella),克魯維菌屬(Kluy vera),假單胞菌屬(Pseudomonas),拉恩氏菌屬(Rahnella),羅爾斯通菌屬(Ralstonia),根瘤菌屬(Rhizobium),沙雷氏菌屬(Serratia),寡養(yǎng)食單胞菌屬(Stenotrophomonas),類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)和賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus)。
[0028]術語“揮發(fā)性有機化合物”或“V0C”是指在環(huán)境條件下一般為氣態(tài)的有機化合物。當在本文中使用時，VOC可以包括但不限于α-菔烯、β-菔烯、β-月桂烯、乙酸順-3-己烯酯、檸檬烯、羅勒烯、芳樟醇、(Ε)_4，8-二甲基-1，3，7-壬三烯、水楊酸甲酯、癸醛、順-茉莉酮、石竹烯、α -蛇麻烯、β -法呢烯及其混合物。正如在本文中所公開的，已鑒定到誘導植物發(fā)出VOC的PGPR。
[0029]本文公開的PGPR可以被配制成用于植物的接種劑。術語“接種劑”是指包括PGPR的分離培養(yǎng)物并任選包括載體的制劑，所述載體可以包括生物可接受的介質(zhì)。
[0030]本文公開的PGPR可以是分離的或基本上純化的。術語“分離的”或“基本上純化的”是指PGPR已經(jīng)從天然環(huán)境中取出并已被分離或分開，并且至少60%不含、優(yōu)選地至少75%不含、更優(yōu)選地至少90%不含、甚至更優(yōu)選地至少95%不含、并且最優(yōu)選至少100%不含與它們天然相伴的其他組分?！胺蛛x培 養(yǎng)物”是指PGPR的培養(yǎng)物不包含顯著量的其他材料，例如在其中生長PGPR和/或一般 可以從其獲得PGPR的土壤中通常存在的其他材料?！胺蛛x培養(yǎng)物”可以是不包含其量足以干擾“分離培養(yǎng)物”的復制的任何其他生物、微生物和/或細菌物種的培養(yǎng)物。可以將PGPR的分離培養(yǎng)物合并以制備PGPR的混合培養(yǎng)物。
[0031]當在本文中使用時，芽孢桿菌屬是指一類革蘭氏陽性的桿狀細菌，其是厚壁菌門(Firmicutes)的成員。在脅迫性環(huán)境條件下，芽孢桿菌屬細菌產(chǎn)生橢圓形內(nèi)生孢子，其可以長時間保持休眠狀態(tài)。芽孢桿菌屬細菌可以根據(jù)它們的16S rRNA或其片段的核苷酸序列(例如 16S rRNA 或 rDNA 核苷酸序列的約 lOOOnt、llOOnt、1200nt、1300nt、1400nt、或1500nt的片段)來表征或鑒定。芽孢桿菌屬細菌可以包括但不限于酸快生芽孢桿菌(B.acidiceler)、酸居芽抱桿菌(B.acidicola)、產(chǎn)酸芽抱桿菌(B.acidiproducens)、B.aeolius、空氣芽孢桿菌(B.aerius)、嗜氣芽孢桿菌(B.aerophilus)、黏瓊脂芽孢桿菌(B.agaradhaerens)、艾丁湖芽孢桿菌(B.aidingensis)、秋葉氏芽孢桿菌(B.akibai)、嗜堿芽孢桿菌(B.alcalophilus)、藻居芽孢桿菌(B.algicola)、B.alkalinitrilicus、B.alkalisediminis、減土芽抱桿菌(B.alkalitelluris)、高地芽孢桿菌(B.altitudinis)、香魚海槽芽孢桿菌(B.alveayuensis)、解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)λ 炭疽芽抱桿菌(B.anthracis)、海水芽抱桿菌(B.aquimaris)、砷芽抱桿菌(B.arsenicus)、B.aryabhatta1、風井氏芽抱桿菌(B.asahii)、深褐芽抱桿菌(B.atrophaeus)、金禮色芽抱桿菌(B.aurantiacus)、產(chǎn)氮芽抱桿菌(B.azotoformans)、栗褐芽孢桿菌(B.badius)、罕見芽孢桿菌(B.barbaricus)、巴達維亞芽孢桿菌(B.bataviensis)、北京芽抱桿菌(B.bei jingensis)、食苯芽抱桿菌(B.benzoevorans)、B.beveridge1、博戈里亞芽孢桿菌(B.bogoriensis)、嗜硼芽孢桿菌(B.boroniphilus)、食丁酸芽抱桿菌(B.butanolivorans)λ B.canaveralius、嗜碳芽抱桿菌(B.carboniphilus)、科研中心芽抱桿菌(B.cecembensis)、解纖維芽抱桿菌(B.ceIlulosiIyticus)、錯樣芽孢桿菌(B.cereus)、恰甘諾湖芽孢桿菌(B.chagannorensis)、長安芽孢桿菌(B.chungangensis)、食物芽孢桿菌(B.cibi)、環(huán)狀芽孢桿菌(B.circulans)、克氏芽孢桿菌(B.claridi)、克勞氏芽孢桿菌(B.clausii)、凝結(jié)芽孢桿菌(B.coagulans)、考卉那芽抱桿菌(B.coahuilensis)、科氏芽抱桿菌(B.cohnii)、腐葉芽抱桿菌(B.decisifrondis)、脫色芽孢桿菌(B.decolorationis)、鉆特省芽孢桿菌(B.drentensis)、混料芽孢桿菌(B.farraginis)、苛求芽抱桿菌(B.fastidiosus)、堅強芽抱桿菌(B.f irmus)、彎曲芽孢桿菌(B.flexus)、小孔芽孢桿菌(B.foraminis)、福氏芽孢桿菌(B.fordii)、強壯芽孢桿菌(B.fortis)、氣孔芽孢桿菌(B.fumarioli)、繩索狀芽孢桿菌(B.funiculus)、解半乳糖苷芽孢桿菌(B.galactosidilyticus)、B.galliciensis、明膠芽孢桿菌(B.gelatini)、吉氏芽孢桿菌(B.gibsonii)、人參芽孢桿菌(B.ginsengi)、人參土芽孢桿菌(B.ginsengihumi)、B.graminis、鹽敏芽抱桿菌(B.halmapalus)、B.halochares、耐鹽芽孢桿菌(B.halodurans)、解半纖維素芽孢桿菌(B.hemicellulosiIyticus)、黑布施泰因芽抱桿菌(B.herbertsteinensis)、崛越氏芽抱桿菌(B.horikoshi )、B.horneckiae、花園芽孢桿菌(B.horti)、土地芽孢桿菌(B.humi)、花津灘芽孢桿菌(B.hwajinpoensis)、病研所芽孢桿菌(B.1driensis)、印度芽孢桿菌(B.1ndicus)、嬰兒芽孢桿菌(B.1nfantis)、深層芽孢桿菌(B.1nfernus)、伊氏芽孢桿菌(B.1sabeliae)、B.1sronensis、咸海鮮芽孢桿菌(B.jeotgali),韓國芽孢桿菌(B.koreensis)、B.korlensis、韓研所芽孢桿菌(B.kribbensis)、克魯氏芽抱桿菌(B.krulwichiae)、列城芽抱桿菌(B.1ehensis)、遲緩芽孢桿菌(B.lentus)、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)、岸濱芽孢桿菌(B.litoralis)、B.1ocisalis、坎德瑪斯島芽抱桿菌(B.1uciferensis)、B.1uteoIus、澳門芽抱桿菌(B.macauensis)、馬氏芽抱桿菌(B.macyae)、解甘露糖醇芽抱桿菌(B.mannanilyticus)、黃海芽抱桿菌(B.marisf Iavi )、B.marmarensis、馬賽芽抱桿菌(B.massiliensis)、巨獸芽孢桿菌(B.megaterium)、甲醇芽孢桿菌(B.methanol icus)、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(B.methylotrophicus)、莫哈韋芽孢桿菌、壁芽孢桿菌(B.mural is )Λ馬丁教堂芽孢桿菌(B.murimartini)、蕈狀芽抱桿菌(B.mycoides)、B.nanhaiensis、B.nanhaiisediminis、尼氏芽抱桿菌(B.nealsonii)、B.neizhouensis、農(nóng)研所芽抱桿菌(B.niabensis)、煙酸芽抱桿菌(B.niacini)、休閑地芽抱桿菌(B.novalis)、B.0ceanisediminis、奧德賽芽孢桿菌(B.0dysseyi)、奧哈芽孢桿菌(B.0khensis)、奧飛蟬溫泉芽孢桿菌(B.0kuhidensis)、蔬菜芽抱桿菌(B.0leronius)、大島芽抱桿菌(B.0shimensis)、人參地塊芽孢桿菌(B.panaciterrae)、巴塔哥尼亞芽孢桿菌(B.patagoniensis)、B.persepolensis、海綿芽抱桿菌(B.plakortidis)、抱川芽抱桿菌(B.pocheonensis)、蓼屬植物芽孢桿菌(B.polygoni)、假嗜堿芽孢桿菌(B.pseudoalcaliphilus)、假堅強芽孢桿菌(B.pseudofirmus)、假真菌樣芽孢桿菌(B.pseudomycoides)、冷解糖芽孢桿菌(B.psychrosaccharoIyticus)、短小芽抱桿菌、青島芽抱桿菌(B.qingdaonensis)、B.rigu1、農(nóng)莊芽孢桿菌(B.ruris)、沙福芽孢桿菌(B.safensis)、鹽芽孢桿菌(B.salarius)、喜鹽芽孢桿菌(B.saliphilus)、施氏芽孢桿菌(B.schlegelii)、砸砷芽抱桿菌(B.selenatarsenatis)、還原砸酸鹽芽抱桿菌(B.selenitireducens)、西 岸芽抱桿菌(B.seohaeanensis)、沙氏芽抱桿菌(B.shackletonii)、B.siamensis、簡單芽孢桿菌、青貯窖芽孢桿菌(B.siralis)、史氏芽孢桿菌(B.smithii)、土壤芽孢桿菌(B.soli)、B.solisals1、索諾拉沙漠芽孢桿菌(B.sonorensis)、耐熱芽孢芽孢桿菌(B.sporothermodurans)Λ平流層芽抱桿菌(B.stratosphericus)、地下芽抱桿菌(B.subterraneus)、枯草芽孢桿菌、大安芽孢桿菌(B.taeansis)、特基拉芽孢桿菌(B.tequilensis)、熱南極芽孢桿菌(B.thermantarcticus)、熱嗷淀粉芽孢桿菌(B.thermoamylovorans)、熱陰溝芽抱桿菌(B.thermocloacae)、B.thermolactis、產(chǎn)硫芽抱桿菌(B.thioparans)、蘇云金芽抱桿菌(B.thuringiensis)、B.tripoxylicola、多斯加尼芽孢桿菌(B.tusciae)、死谷芽孢桿菌(B.vallismortis)、威氏芽孢桿菌(B.vedderi)、越南芽孢桿菌(B.vietnamensis)、原野芽孢桿菌(B.vireti)、和光芽孢桿菌(B.wakoensis)、韋施泰凡芽孢桿菌(B.weihenstephanensis)、B.xiaoxiensis，及其混合物或摻混物。
[0032]本文公開的PGPR及其接種劑可以包含解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)或與解淀粉芽孢桿菌近緣的芽孢桿菌屬菌種。解淀粉芽孢桿菌菌株Chill1-ι的16S核糖體ri)NA的部分序列(GenBank登記號HQ021420.1)在本文中提供為SEQ ID N0:1。與解淀粉芽孢桿菌近緣的芽孢桿菌屬菌種可以被定義為:具有包含SEQ ID NO:1的16S rDNA序列、或者包含與SEQ ID NO:1具有至少約98%或99%的序列同一性的16S rDNA序列的菌種。
[0033]本文公開的PGPR及其接種劑可以包含莫哈韋芽孢桿菌或與莫哈韋芽孢桿菌近緣的芽孢桿菌屬菌種。莫哈韋芽孢桿菌菌株NBSL51的16S核糖體ri)NA的部分序列(GenBank登記號JN624928.1)在本文中提供為SEQ ID NO:2。與莫哈韋芽孢桿菌近緣的芽孢桿菌屬菌種可以被定義為:具有包含SEQ ID NO:2的16S rDNA序列、或者包含與SEQ ID NO:2具有至少約98%或99%的序列同一性的16S rDNA序列的菌種。
[0034]本文公開的PGPR及其接種劑可以包含鹽土芽孢桿菌或與鹽土芽孢桿菌近緣的芽孢桿菌屬菌種。鹽土芽孢桿菌菌株YCl的16S核糖體rDNA的部分序列(GenBank登記號NR_044387)在本文中提供為SEQ ID NO:3。與鹽土芽孢桿菌近緣的芽孢桿菌屬菌種可以被定義為:具有包含SEQ ID NO:3的16S rDNA序列、或者包含與SEQ ID NO:3具有至少約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的序列同一性的 16S rDNA 序列的菌種。
[0035]本文公開的PGPR及其接種劑可以包含短小芽孢桿菌或與短小芽孢桿菌近緣的芽孢桿菌屬菌種。短小芽孢桿菌菌株TUBl的16S核糖體rDNA的部分序列(GenBank登記號HE613653.1)在本文中提供為SEQ ID NO:4。與短小芽孢桿菌近緣的芽孢桿菌屬菌種可以被定義為:具有包含SEQ ID NO:4的16S rDNA序列、或者包含與SEQ ID NO:4具有至少約96%、97%、98%或99%的序列同一性的16S rDNA序列的菌種。
[0036]本文公開的PGPR及其接種劑可以包含簡單芽孢桿菌或與簡單芽孢桿菌近緣的芽孢桿菌屬菌種。簡單芽孢桿菌菌株NH.259的16S核糖體rDNA的部分序列(GenBank登記號EU627171.1)在本文中提供為SEQ ID NO:5。與簡單芽孢桿菌近緣的芽孢桿菌屬菌種可以被定義為:具有包含SEQ ID NO:5的16S rDNA序列、或者包含與SEQ ID NO:5具有至少約93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的16S rDNA序列的菌種。
[0037]本文公開的PGPR及其接種劑可以包含枯草芽孢桿菌或與枯草芽孢桿菌近緣的芽孢桿菌屬菌種。枯草芽孢桿菌菌株NH.259的16S核糖體rDNA的部分序列(GenBank登記號EU627171.1)在本文中提供為SEQ ID NO:6。與枯草芽孢桿菌近緣的芽孢桿菌屬菌種可以被定義為:具有包含SEQ ID NO:5的16S rDNA序列、或者包含與SEQ ID NO:6具有至少約98%或99%的序列同一性的16S rDNA序列的菌種。
[0038]在本文公開的包含芽孢桿菌屬細菌的接種劑的某些實施方式中，芽孢桿菌屬菌種不是枯草芽孢桿菌，并且不是與枯草芽孢桿菌近緣的芽孢桿菌屬菌種。不與枯草芽孢桿菌近緣的芽孢桿菌屬菌種可以被定義為:具有與SEQ ID NO:5具有不超過99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%或91%的序列同一性的16S rDNA序列的菌種。
[0039]“序列同一性百分率”，可以使用可在國家生物技術信息中心(National Centerfor Biotechnology Information)(NCBI)網(wǎng)站獲得的基本局部比對搜索工具(Basic LocalAlignment Search Tool) (BLAST),通過將兩個相等長度的序列比對來確定(即“bl2seq”，
其描述在 Tatiana A.Tatusova, Thomas L.Madden (1999), “兩個序列的 Blast-用于比
較蛋白質(zhì)和核苷酸序列的新工具”(Blast2sequences_a new tool for comparing proteinand nucleotidesequences), FEMS Microbiol Lett.174:247-250,在此以其全文引為參考)。例如，SEQ ID NO:1與SEQ ID NO:5之間的序列同一性百分率，可以使用在NCBI網(wǎng)站提供的在線BLAST軟件，通過將這兩個序列進行比對來確定。
[0040] 兩個脫氧核糖核苷酸序列之間的“序列同一性百分率”，也可以使用Kimura雙參數(shù)距離模型來確定，所述模型對多次命中進行校正，考慮到了轉(zhuǎn)換和顛換取代率，同時假設四種核苷酸的頻率相同并且位點之間的取代率沒有差別(Nei和Kumar，2000)，該模型在MEGA4 (Tamura K, Dudley J, Nei M&Kumar S (2007) “MEGA4:分子進化遺傳學分析(MEGA)軟件 4.0 版”(MEGA4:Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) softwareversion4.0.),Molecular Biology and Evolution24:1596-1599)、優(yōu)選為 4.0.2或更晚的版本中實施?？瘴婚_放罰分和空位延伸罰分分別被設定在15和6.66。末端空位不罰分。延遲趨異序列切換被設定在30。轉(zhuǎn)變權重分值為35被設為0.5，作為完全錯配與匹配對分值之間的平衡。所使用的DNA權重矩陣是IUB計分矩陣，其中X和η匹配于任何IUB歧義符號，全部匹配分值為1.9，全部錯配分值為O。
[0041]當在本文中使用時，“摻混物8”是指包括解淀粉芽孢桿菌菌株ΑΡ-188、莫哈韋芽孢桿菌菌株ΑΡ-209、鹽土芽孢桿菌菌株ΑΡ-217和解淀粉芽孢桿菌菌株ΑΡ-218的芽孢桿菌屬細菌的混合物(參見表1)。當在本文中使用時，“摻混物9”是指包括解淀粉芽孢桿菌菌株ΑΡ-136、莫哈韋芽孢桿菌菌株ΑΡ-188、鹽土芽孢桿菌菌株ΑΡ-219和解淀粉芽孢桿菌菌株ΑΡ-295的芽孢桿菌屬細菌的混合物。
[0042]本文公開的PGPR可用于處理植物并在處理過的植物中誘導VOC生產(chǎn)。例如，本文公開的PGPR可以配制成用于處理植物的接種劑。本文中設想的處理方法可以包括直接處理植物，包括直接處理植物的葉、莖或根。本文設想的處理方法可以包括例如在種植種子之前處理植物的種子以產(chǎn)生處理過的植物。本文設想的方法還可以包括間接處理植物，例如通過處理植物周圍的土壤或環(huán)境(例如在犁溝中施用顆粒或液體)。適合的處理方法可以包括通過高壓或低壓噴霧、浸潤和/或注射施用包含PGPR的接種劑?？梢酝ㄟ^低壓或高壓噴霧、包衣、浸泡和/或注射施用來處理植物種子。在植物種子已經(jīng)此處理后，可以將種子種植和栽培以產(chǎn)生植物。從這樣的種子繁殖的植物可以用一種或多種施用方式進一步處理。適合的施用濃度可以憑經(jīng)驗確定。在PGPR作為噴霧劑施用到植物的某些實施方式中，適合的施用濃度可以包括每公頃植物噴灑IO6-1O18菌落形成單位(cfu)，更通常為每公頃107-1015cfu。對于包衣種子來說，在某些實施方式中，適合的施用濃度可以在每顆種子IO2-1O8Cfu之間，優(yōu)選在每顆種子IO4-1O7Cfu之間。在其他實施方式中，PGPR可以作為秧苗浸根液或作為土壤浸潤液，以約12-1oi2Cfvmiuo4-1o1ciCfVml或約106-108cfu/ml的濃度施用。
[0043]PGPR可以與適合的載體一起在組合物(例如接種劑)中施用。適合的載體可以包括但不限于水或其他水性溶液、漿 液、固體(例如泥煤、小麥、麩皮、蛭石和巴氏消毒的土壤)或干粉。在某些實施方式中，組合物包含每毫升載體IO2-1O12Cfu或每毫升載體IO4-1OiciCfu或每毫升載體106-108cfu。組合物可以包含其他添加劑，包括緩沖劑、表面活性劑、佐劑或涂層劑。
[0044]本文公開的方法可用于改變昆蟲對處理過的植物的行為。當在本文中使用時，“改變”昆蟲的行為可以包括減少或阻止昆蟲的負面行為和/或增加昆蟲的正面行為。減少或阻止昆蟲的負面行為可以包括減少或阻止來自于昆蟲的損傷。例如，可以實施方法以減少或阻止草食性昆蟲以處理過的植物為食。優(yōu)選地，與未處理的植物相比，所述方法以在處理過的植物為食減少至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。為食的減少可以通過在一段時間內(nèi)對以處理過的植物和未處理過的植物為食的幼蟲的體重進行比較來測量。為食的減少也可以通過比較由昆蟲每次以植物為食造成的植物質(zhì)量的損失來測量。還可以實施方法以減少或阻止草食性昆蟲在處理過的植物上產(chǎn)卵。優(yōu)選地，與未處理的植物相比，所述方法將在處理過的植物上的產(chǎn)卵(即，下卵)減少至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。產(chǎn)卵的減少可以通過比較處理過的植物和未處理的植物上每只昆蟲的產(chǎn)卵(例如卵的總數(shù)和/或卵的批次總數(shù))來測量。行為可以通過本文公開的方法改變的草食性昆蟲可以包括但不限于甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)和菜青蟲(Pierisrapae)。還可以實施方法以將昆蟲的天敵吸引到處理過的植物，包括但不限于捕食性昆蟲或昆蟲擬寄生物。捕食性昆蟲可以包括但不限于瓢蟲(即瓢蟲科(Coccinelidae))、獵蝽(SP獵疇科(Reduviidae))、大眼蟲(即大眼疇科(Geocoridae))、小花疇(即Antrocoridae)、姬蝽(即姬蝽科(Nabidae ))、草蜻蛉(即脈翅目(Neuroptera))和捕食性螨(即植纓螨科(Phytoseiidae))。昆蟲擬寄生物可以包括但不限于Brachonid蜂(例如緣腹絨苗蜂(Cotesia marginiventris)、紅足側(cè)溝苗蜂(Microplitis croceipes)、粉蝶盤絨苗蜂(Cotesia rubecula)和科曼尼姆苗蜂(Aphidius colemani))、Ichneumonid 蜂、小蜂(例如獎角姆小蜂屬物種(Eretmocerus spp.)和_姆小蜂(Encarsia formosa))和寄妮。
[0045]示例性實施方式
[0046]下面的實施方式是示例性的，不打算限制所宣稱的主題內(nèi)容。
[0047]實施方式1.分離的植物根際促生菌(PGPR)，其誘導用所述PGPR處理過的植物產(chǎn)生一種或多種揮發(fā)性有機化合物(V0C)，并且任選地所述PGPR選自下列的屬:放線菌屬，產(chǎn)堿桿菌屬，芽孢桿菌屬，伯克氏菌屬，布丘氏菌屬，腸桿菌屬，克雷伯氏菌屬，克魯維菌屬，假單胞菌屬，拉恩氏菌屬，羅爾斯通菌屬，根瘤菌屬，沙雷氏菌屬，寡養(yǎng)食單胞菌屬，類芽孢桿菌屬和賴氨酸芽孢桿菌屬。
[0048]實施方式2.實施方式I的PGPR，其中所述一種或多種VOC包含選自PGPR及其接種劑的一種或多種化合物。
[0049]實施方式3.前述實施方式任一項的PGPR,其中所述一種或多種VOC改變暴露于所述一種或多種VOC的昆蟲的行為。
[0050]實施方式4.前述實施方式任一項的PGPR，其中所述昆蟲是草食性動物，并且所述一種或多種VOC減少所述昆蟲在植物上產(chǎn)卵。
[0051]實施方式5.前述實施方式任一項的PGPR，其中所述昆蟲是草食性動物，并且所述一種或多種VOC減少所述昆蟲以植物為食。
[0052]實施方式6.前述實施方式任一項的PGPR，其中所述昆蟲是肉食性動物或擬寄生物，并且所述一種或多種VOC將所述肉食性動物或擬寄生物吸引到植物。
[0053]實施方式7.前述實施方式任一項的PGPR，其中所述PGPR是選自下列的芽孢桿菌屬細菌:酸快生芽孢桿菌(B.acidiceler)、酸居芽孢桿菌(B.acidicola)、產(chǎn)酸芽抱桿菌(B.acidiproducens)、B.aeolius、空氣芽抱桿菌(B.aerius)、嗜氣芽孢桿菌(B.aerophilus)、黏瓊脂芽孢桿菌(B.agaradhaerens)>艾丁湖芽孢桿菌(B.aidingensis)、秋葉氏芽抱桿菌(B.akibai)、嗜喊芽抱桿菌(B.alcalophilus)、藻居芽抱桿菌(B.algicola)、B.alkalinitrilicus、B.alkalisediminis、喊土芽孢桿菌(B.alkalitelluris)、高地芽孢桿菌(B.altitudinis)、香魚海槽芽孢桿菌(B.alveayuensis)、解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)、炭疽芽孢桿菌(B.anthracis)、海水芽抱桿菌(B.aquimaris)、砷芽抱桿菌(B.arsenicus)、B.aryabhatta1、風井氏芽抱桿菌(B.asahii)、深褐芽抱桿菌(B.atrophaeus)、金橙色芽孢桿菌(B.aurantiacus)、產(chǎn)氮芽孢桿菌(B.azotoformans)、栗褐芽孢桿菌(B.badius)、罕見芽抱桿菌(B.barbaricus)、巴達維亞芽抱桿菌(B.bataviensis)、北京芽抱桿菌(B.bei jingensis)、食苯芽抱桿菌(B.benzoevorans)、B.beveridge1、博戈里亞芽孢桿菌(B.bogoriensis)、嗜硼芽孢桿菌(B.boroniphilus)、食丁酸芽孢桿菌(B.butanol ivorans) λ B.canaveralius、嗜碳芽抱桿菌(B.carboniphilus)、科研中心芽孢桿菌(B.cecembensis)、解纖維芽孢桿菌(B.cel lulosi Iyt icus)、錯樣芽孢桿菌(B.cereus)、恰甘諾湖芽抱桿菌(B.chagannorensis)、長安芽抱桿菌(B.chungangensis)、食物芽孢桿菌(B.cibi)、環(huán)狀芽孢桿菌(B.circulans)、克氏芽孢桿菌(B.clarkii)、克勞氏芽孢桿菌(B.clausii)、凝結(jié)芽孢桿菌(B.coagulans)、考丼那芽孢桿菌(B.coahuilensis)、科氏芽抱桿菌(B.cohnii)、腐葉芽抱桿菌(B.decisifrondis)、脫色芽孢桿菌(B.decolorationis)、鉆特省芽孢桿菌(B.drentensis)、混料芽孢桿菌(B.farraginis)、苛求芽抱桿菌(B.fastidiosus)、堅強芽抱桿菌(B.firmus)、彎曲芽孢桿菌(B.flexus)、小孔芽孢桿菌(B.foraminis)、福氏芽孢桿菌(B.fordii)、強壯芽孢桿菌(B.fortis)、氣孔芽孢桿菌(B.fumarioli)、繩索狀芽孢桿菌(B.funiculus)、解半乳糖苷芽孢桿菌(B.galactosidilyticus)、B.galliciensis、明膠芽孢桿菌(B.gelatini)、吉氏芽孢桿菌(B.gibsonii)、人參芽孢桿菌(B.ginsengi)、人參土芽孢桿菌(B.ginsengihumi)、B.graminis、鹽敏芽抱桿菌(B.halmapalus)、B.halochares、耐鹽芽孢桿菌(B.halodurans)、解半纖維素芽孢桿菌(B.hemicel lulosi Iyt icus)、黑布施泰因芽抱桿菌(B.herbertsteinensis)、崛越氏芽抱桿菌(B.horikoshi )、B.horneckiae、花園芽孢桿菌(B.horti)、土地芽孢桿菌(B.humi)、花津灘芽孢桿菌(B.hwajinpoensis)、病研所芽孢桿菌(B.1driensis)、印度芽孢桿菌(B.1ndicus)、嬰兒芽孢桿菌(B.1nfantis)、深層芽孢桿菌(B.1nfernus)、伊氏芽孢桿菌(B.1sabeliae)、B.1sronensis、咸海鮮芽孢桿菌(B.jeotgali)、韓國芽孢桿菌(B.koreensis)、B.korlensis、韓研所芽孢桿菌(B.kribbensis)、克魯氏芽抱桿菌(B.krulwichiae)、列城芽抱桿菌(B.1ehensis)、遲緩芽孢桿菌(B.lentus)、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)、岸濱芽孢桿菌(B.litoralis)、B.1ocisalis、坎德瑪斯島芽抱桿菌(B.1uciferensis)、B.1uteoIus、澳門芽抱桿菌(B.macauensis)、馬氏芽抱桿菌(B.macyae)、解甘露糖醇芽抱桿菌(B.mannanilyticus)、黃海芽抱桿菌(B.marisf Iavi )、B.marmarensis、馬賽芽抱桿菌(B.massiliensis)、巨獸芽孢桿菌(B.megaterium)、甲醇芽孢桿菌(B.methanol icus)、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(B.methylotrophicus)、莫哈韋芽孢桿菌、壁芽孢桿菌(B.mural is)、馬丁教堂芽孢桿菌(B.murimartini)、蕈狀芽抱 桿菌(B.mycoides)、B.nanhaiensis、B.nanhaiisediminis、尼氏芽抱桿菌(B.nealsonii)、B.neizhouensis、農(nóng)研所芽抱桿菌(B.niabensis)、煙酸芽抱桿菌(B.niacini)、休閑地芽抱桿菌(B.novalis)、B.0ceanisediminis、奧德賽芽孢桿菌(B.0dysseyi)、奧哈芽孢桿菌(B.0khensis)、奧飛蟬溫泉芽孢桿菌(B.0kuhidensis)、蔬菜芽抱桿菌(B.0leronius)、大島芽抱桿菌(B.0shimensis)、人參地塊芽孢桿菌(B.panaciterrae)、巴塔哥尼亞芽孢桿菌(B.patagoniensis)、B.persepolensis、海綿芽抱桿菌(B.p lakort idis)、抱川芽抱桿菌(B.pocheonensis)、蓼屬植物芽孢桿菌(B.polygoni)、假嗜堿芽孢桿菌(B.pseudoalcaliphilus)、假堅強芽孢桿菌(B.pseudofirmus)、假真菌樣芽孢桿菌(B.pseudomycoides)、冷解糖芽孢桿菌(B.psychrosaccharoIyticus)λ 短小芽抱桿菌、青島芽抱桿菌(B.qingdaonensis)、
B.rigu1、農(nóng)莊芽孢桿菌(B.ruris)、沙福芽孢 桿菌(B.safensis)、鹽芽孢桿菌(B.salarius)、喜鹽芽孢桿菌(B.saliphilus)、施氏芽孢桿菌(B.schlegelii)、砸砷芽抱桿菌(B.selenatarsenatis)、還原硒酸鹽芽抱桿菌(B.selenitireducens)、西岸芽抱桿菌(B.seohaeanensis)、沙氏芽抱桿菌(B.shackletonii)、B.siamensis、簡單芽孢桿菌、青貯窖芽孢桿菌(B.siralis)、史氏芽孢桿菌(B.smithii)、土壤芽孢桿菌(B.soli)、B.solisals1、索諾拉沙漠芽孢桿菌(B.sonorensis)、耐熱芽孢芽孢桿菌(B.sporothermodurans)>平流層芽抱桿菌(B.stratosphericus)、地下芽抱桿菌(B.subterraneus)>枯草芽孢桿菌、大安芽孢桿菌(B.taeansis)、特基拉芽孢桿菌(B.tequilensis)、熱南極芽孢桿菌(B.thermantarcticus)、熱曬淀粉芽孢桿菌(B.thermoamylovorans)、熱陰溝芽抱桿菌(B.thermocloacae)、B.thermolactis、產(chǎn)硫芽抱桿菌(B.thioparans)、蘇云金芽抱桿菌(B.thuringiensis)、B.tripoxylicola、多斯加尼芽孢桿菌(B.tusciae)、死谷芽孢桿菌(B.vallismortis)、威氏芽孢桿菌(B.vedderi)、越南芽孢桿菌(B.vietnamensis)、原野芽孢桿菌(B.vireti)、和光芽孢桿菌(B.wakoensis)、韋施泰凡芽孢桿菌(B.weihenstephanensis)、B.xiaoxiensis,及其混合物或摻混物。
[0054]實施方式8.實施方式7的芽孢桿菌屬細菌，其中所述細菌具有的16S rDNA核酸序列包含 SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5 或 SEQID NO:6。
[0055]實施方式9.實施方式7的芽孢桿菌屬細菌，其中所述細菌具有的16S rDNA核酸序列與SEQ ID NO:1具有至少98%的同一性。
[0056]實施方式10.實施方式7-9任一項的芽孢桿菌屬細菌，其中所述細菌具有的16SrDNA核酸序列與SEQ ID NO:2具有至少98%的同一性。
[0057]實施方式11.實施方式7-10任一項的芽孢桿菌屬細菌，其中所述細菌具有的16SrDNA核酸序列與SEQ ID NO:3具有至少91%的同一性。
[0058]實施方式12.實施方式7-11任一項的芽孢桿菌屬細菌，其中所述細菌具有的16SrDNA核酸序列與SEQ ID NO:4具有至少96%的同一性。
[0059]實施方式13.實施方式7-12任一項的芽孢桿菌屬細菌，其中所述細菌具有的16SrDNA核酸序列與SEQ ID NO:5具有至少93%的同一性。
[0060]實施方式14.實施方式7-13任一項的芽孢桿菌屬細菌，其中所述細菌具有的16SrDNA核酸序列與SEQ ID NO:6具有至少98%的同一性。
[0061]實施方式14.實施方式7的芽孢桿菌屬細菌，其中所述細菌選自解淀粉芽孢桿菌、莫哈韋芽孢桿菌、鹽土芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、簡單芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌及其混合物。
[0062]實施方式15.實施方式7的芽孢桿菌屬細菌，其中所述細菌是解淀粉芽孢桿菌。
[0063]實施方式16.實施方式15的芽孢桿菌屬細菌，其中所述細菌選自解淀粉芽孢桿菌菌株AP-136、解淀粉芽孢桿菌菌株AP-188、解淀粉芽孢桿菌菌株AP-218、解淀粉芽孢桿菌菌株AP-219和解淀粉芽孢桿菌菌株AP-295。
[0064]實施方式17.實施方式7的芽孢桿菌屬細菌，其中所述細菌是莫哈韋芽孢桿菌。
[0065]實施方式18.實施方式17的芽孢桿菌屬細菌，其中所述細菌是莫哈韋芽孢桿菌菌株AP-209。
[0066]實施方式19.實施方式7的芽孢桿菌屬細菌，其中所述細菌是鹽土芽孢桿菌。
[0067]實施方式20.實施方式19 的芽孢桿菌屬細菌，其中所述細菌是鹽土芽孢桿菌菌株AP-217。[0068]實施方式21.實施方式7的芽孢桿菌屬細菌，其中所述細菌是短小芽孢桿菌。
[0069]實施方式22.實施方式21的芽孢桿菌屬細菌，其中所述細菌是短小芽孢桿菌菌株INR-70
[0070]實施方式23.實施方式7的芽孢桿菌屬細菌，其中所述細菌是簡單芽孢桿菌。
[0071]實施方式24.實施方式23的芽孢桿菌屬細菌，其中所述細菌是簡單芽孢桿菌菌株ABU288。
[0072]實施方式25.實施方式7的芽孢桿菌屬細菌，其中所述細菌是枯草芽孢桿菌菌株MBI600。
[0073]實施方式26.實施方式7的芽孢桿菌屬細菌，其中所述細菌包含芽孢桿菌屬菌種的混合物。
[0074]實施方式27.—種用于植物的接種劑，其包含前述實施方式任一項的PGPR以及載體。
[0075]實施方式28.實施方式27的接種劑，其還包含植物激素、抗微生物化合物或兩者。
[0076]實施方式29.實施方式28的接種劑，其中所述植物激素選自3_羥基丁酮、2，3_ 丁二醇和吲哚乙酸，并且所述抗微生物化合物選自苯乙醇和4-羥基苯甲酸鹽。
[0077]實施方式30.—種改變昆蟲對植物的行為的方法，所述方法包括向植物、植物的種子或植物周圍的土壤施用實施方式27-29任一項的接種劑。
[0078]實施方式31.實施方式30的方法，其中所述昆蟲是草食性動物，并且所述方法減少所述昆蟲在所述植物上產(chǎn)卵。
[0079]實施方式32.實施方式30或31的方法，其中所述昆蟲是草食性動物，并且所述方法減少所述昆蟲以所述植物為食。
[0080]實施方式33.實施方式30-32任一項的方法，其中所述昆蟲是肉食性動物或擬寄生物，并且所述方法將所述肉食性動物或擬寄生物吸引到所述植物。
[0081]實施方式34.實施方式30-33任一項的方法,其中所述植物選自苜猜、水稻、大麥、黑麥、棉花、向日葵、花生、玉米、馬鈴薯、甘薯、菜豆、豌豆、小扁豆、菊苣、生菜、苦苣、卷心菜、抱子甘藍、甜菜、歐洲防風草、蕪菁、花椰菜、西蘭花、蕪菁、小蘿卜、菠菜、洋蔥、大蒜、茄子辣椒、芹菜、胡蘿卜、南瓜、倭瓜、西葫蘆、黃瓜、蘋果、梨、甜瓜、柑橘、草莓、葡萄、覆盆子、菠蘿、大豆、低芥酸油菜、油菜、春小麥、冬小麥、煙草、番茄、高粱和甘蔗。
實施例
[0082]下面的實施例是示例性的，并且不打算限制所宣稱的主題內(nèi)容的范圍。
[0083]實施例1 -植物根際促生菌對棉花植物揮發(fā)物誘導和擬寄生物吸引的影響
[0084]適要
[0085]已知寄生蜂(擬寄生物 )利用各種類型的寄主相關的揮發(fā)性信號作為寄主位置的線索。這些揮發(fā)性信號可以是基于植物的、源自于草食性動物寄主的、或產(chǎn)生自草食性動物及其植物寄主之間的相互作用的。擬寄生物抑制害蟲數(shù)量的成功，取決于它們在復雜的嗅覺和視覺環(huán)境中定位寄主的能力。盡管寄主-擬寄生物的相互作用極受關注，但在該類昆蟲中嗅覺通訊的某些方面尚未得到很好地理解。
[0086]在這里，進行了研究以評估植物根際促生菌(PGPR)誘導棉花揮發(fā)物的潛力以及擬寄生物的響應結(jié)果。評估了三種PGPR處理:i)短小芽孢桿菌菌株INR-7，以及芽孢桿菌屬細菌的兩種摻混物。還測試了未處理的(水)對照。在從PGPR處理的和未處理的棉花植物收集的頂部空間揮發(fā)物中存在定量和定性差別。從PGPR處理的棉花植物的頂部空間檢測到總共11個表示VOC的峰，但是在未處理的棉花植物中僅僅檢測到3個峰。記錄了 PGPR處理的與未處理的植物之間的根系生長的差異。
[0087]簡介
[0088]植物根際促生菌(PGPR)代表了一大類移生根部的細菌，其應用通常與提高植物生長速度(Kloepper, 1992 ；Zehnder 等，1997 ；Kloepper 等，2004)、抑制土壤病原體(Schippers等，1987 ；Burkett-Cadena等,2008)和誘導針對昆蟲害蟲的系統(tǒng)抗性(vanLoon 等，1998 ；Kloepper 等，1999 ；Ramamoorthy 等，2001 ；Zehnder 等，2001 ；Ryu 等，2004 ；Ji等，2006)相關?；赑GPR的接種劑包括含有單一菌株、兩種菌株的混合物或芽孢桿菌屬菌種(Bacillus spp.)的復雜混合物的制劑(Lucy等，2004 ；Kloepper和Ryu, 2006)。事實上，PGPR的施用對處理過的植物中揮發(fā)性有機化合物(VOC)的誘導的影響尚未經(jīng)過調(diào)查，盡管有證據(jù)表明植物揮發(fā)物的誘導依賴于許多因素。相互作用的因素包括植物激素(de Bruxelles 和 Roberts, 2001 ；Thaler 等,2002 ；Farmer 等,2003 ；Ament 等,2004)、草食性動物來源的激發(fā)子(Mattiaci 等，1995 ；Alborn 等，1997 ；Spiteller 和 Boland, 2003)和伴生微生物包括病原體(Preston等，1999 ;Cardoza等，2002)以及非生物性因素包括倉 1J傷(Mithofer 等,2005)、重金屬(Mithofer 等，2004)以及溫度和光(Takabayashi 等，1994 ;Gouinguene和Turlings，2002)?？紤]到在美國和印度，PGPR正被越來越多地應用于幾種大田作物包括棉花(Gossypium hirsutum L.)、番爺(Solanum lycopersicum L.)、西瓜(Citrullus lanatus Thunb.)和珍珠粟(Pennisetum glaucum)的生產(chǎn)(Glickl995 ;Backman 等，1997 ；Cleyet-Marcel 等，2001 ;Kokalis_Burelle 等，2003 ；Niranjan Raj 等，2003 ；Burkett-Cadena等，2008)，與PGPR對植物揮發(fā)物的誘導的影響相關的研究之缺乏是令人吃驚的。1997年，Backman等報道了 60-75%的美國棉花作物用PGPR產(chǎn)品Kodiak?進行處理，這是一種用于抑制鐮刀菌屬和絲核菌屬土壤病原體的枯草芽孢桿菌產(chǎn)品。PGPR以前已被用于大規(guī)模處理農(nóng)作物。
[0089]與在尋找適合的寄主植物中使用VOC的草食性動物相同(Dicke等，2000)，已知寄生性昆蟲也使用VOC的摻混物搜尋食物和它們的草食性動物寄主的寄主位置(Turlings等，1990 ;McCall等，1993 ;De Moraes等，1998)。這些VOC可以源自于植物、草食性動物寄主或者是草食性動物與植物的相互作用的結(jié)果(McCall等，1994 ；Cortesero等，1997)。基于植物的VOC被進一步分類為綠葉揮發(fā)物(GLV)，其在對機械損傷作出響應或草食性動物進食開始時立即被釋放，以及草食性動物誘導的植物揮發(fā)物(HIPV)，其散發(fā)是對草食性動物進食損傷的延遲響應。這些對棉花草食性動物的擬寄生物包括紅足側(cè)溝苗蜂(Cresson)和緣腹絨繭蜂(CreSSOn)(膜翅目:繭蜂科)具有高度吸引力的VOC摻混物，作為對毛蟲進食的響應而被釋放(De Moraes 等，1998 ；Chen 和 Fadamiro2007 ；Ngumbi 等，2009，2010)?？赡躊GPR能夠影響棉花中VOC的產(chǎn)生，從而對覓食的擬寄生物和其他化學介導的昆蟲-植物和三營養(yǎng)相互作用具有重要影響。
[0090]在這里，檢驗了 PGPR能夠引發(fā)棉花植物VOC的變化并改變棉花根的生長的假說。此外，假設通過改變VOC的釋放，棉花草食性動物的擬寄生物將對PGPR處理的棉花植物顯示出比未處理的棉花植物更高的興趣。使PGPR處理和未處理的棉花植物在溫室條件下生長，并在種植后4-6周收集頂部空間揮發(fā)物。使用偶聯(lián)的氣相色譜-質(zhì)譜儀(GC-MS)鑒定并分析來自于PGPR處理和未處理的棉花植物的頂部空間揮發(fā)物。使用四選嗅覺計比較性研究紅足側(cè)溝繭蜂在存在PGPR處理和未處理的植物時的行為。據(jù)本發(fā)明人了解，這是PGPR影響棉花植物的VOC產(chǎn)生的第一篇報道。
[0091]材料和方法
[0092]PGPR菌株。如表1中所示，使用了總共8株芽孢桿菌屬菌株(Bacillus spp.)(都來自于Auburn University)來開發(fā)所研究的三種PGPR處理:i)短小芽孢桿菌菌株INR-7(AP18)，ii)摻混物8，其含有四株芽孢桿菌屬菌株(AP188、209、217、218)，以及iii)摻混物9，其含有四株芽孢桿菌屬菌株(么?136、188、219、295)。
[0093]表1.PGPR 制劑
[0094]
【權利要求】
1.一種用于植物的接種劑，其包含分離的芽孢桿菌屬(Bacillus)細菌和載體，所述接種劑誘導用所述接種劑處理過的植物產(chǎn)生一種或多種揮發(fā)性有機化合物(VOC)。
2.權利要求1的接種劑，其中所述細菌選自解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、莫哈韋芽抱桿菌(Bacillus mojavensis)、鹽土芽抱桿菌(Bacillussoli sal si )、短小芽抱桿菌(Bacillus pumilus)、簡單芽抱桿菌(Bacillus simp I ex)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)及其混合物。
3.權利要求1的接種劑，其中所述細菌是植物根際促生菌(PGPR)。
4.權利要求1的接種劑，其中所述一種或多種VOC包括選自^-菔烯、0-菔烯、0-月桂烯、乙酸順_3_己烯酯、朽1橡烯、β -羅勒烯、芳樟醇、(E) -4, 8- 二甲基-1，3, 7-壬二烯、水楊酸甲酯、癸醛、順-茉莉酮、石竹烯、α -蛇麻烯、β -法呢烯的一種或多種化合物及其混合物。
5.權利要求1的接種劑，其中所述一種或多種VOC改變暴露于所述一種或多種VOC的昆蟲的行為。
6.權利要求5的接種劑，其中所述昆蟲是草食性動物，并且所述一種或多種VOC減少所述昆蟲在所述植物上產(chǎn)卵。
7.權利要求5的接種劑，其中所述昆蟲是草食性動物，并且所述一種或多種VOC減少所述昆蟲以所述植物為食。
8.權利要求5的接種劑，其中所述昆蟲是肉食性動物或擬寄生物，并且所述一種或多種VOC將所述肉食性動物或所述擬寄生物吸引到所述植物。
9.權利要求1的接種劑，其中所述細菌的16SrDNA核酸序列包含SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5 或 SEQ ID NO:6。
10.權利要求1的接種劑，其中所述細菌的16SrDNA核酸序列與SEQ ID NO:1具有至少98%的同一性。
11.權利要求1的接種劑，其中所述細菌的16SrDNA核酸序列與SEQ ID NO:2具有至少98%的同一性。
12.權利要求1的接種劑，其中所述細菌的16SrDNA核酸序列與SEQ ID NO:3具有至少91%的同一性。
13.權利要求1的接種劑，其中所述細菌的16SrDNA核酸序列與SEQ ID NO:4具有至少96%的同一性。
14.權利要求1的接種劑，其中所述細菌的16SrDNA核酸序列與SEQ ID NO:5具有至少93%的同一性。
15.權利要求1的接種劑，其中所述細菌的16SrDNA核酸序列與SEQ ID NO:6具有至少93%的同一性。
16.權利要求1的接種劑，其中所述細菌是解淀粉芽孢桿菌或包含解淀粉芽孢桿菌的混合物。
17.權利要求16的接種劑，其中所述細菌選自解淀粉芽孢桿菌菌株AP-136、解淀粉芽孢桿菌菌株AP-188、解淀粉芽孢桿菌菌株AP-218、解淀粉芽孢桿菌菌株AP-219和解淀粉芽孢桿菌菌株AP-295。
18.權利要求1的接種劑，其中所述細菌是莫哈韋芽孢桿菌或包含莫哈韋芽孢桿菌的混合物。
19.權利要求18的接種劑，其中所述細菌是莫哈韋芽孢桿菌菌株AP-209。
20.權利要求1的接種劑，其中所述細菌是鹽土芽孢桿菌或包含鹽土芽孢桿菌的混合物。
21.權利要求20的接種劑，其中所述細菌是鹽土芽孢桿菌菌株AP-217。
22.權利要求1的接種劑，其中所述細菌是短小芽孢桿菌或包含短小芽孢桿菌的混合物。
23.權利要求22的接種劑，其中所述細菌是短小芽孢桿菌菌株INR-7。
24.權利要求1的接種劑，其中所述細菌是簡單芽孢桿菌或包含簡單芽孢桿菌的混合物。
25.權利要求1的接種劑，其中所述細菌是簡單芽孢桿菌菌株ABU288。
26.權利要求1的接種劑，其中所述細菌是枯草芽孢桿菌菌株MBI600。
27.權利要求1的芽孢桿菌屬細菌，其中所述細菌包含芽孢桿菌屬菌種的混合物。
28.權利要求1的接種劑，其還包含植物激素、抗微生物化合物或兩者。
29.權利要求28的接種劑 ，其中所述植物激素選自3-羥基丁酮、2，3-丁二醇和吲哚乙酸，并且所述抗微生物化合物選自苯乙醇和4-羥基苯甲酸鹽。
30.一種改變昆蟲對植物的行為的方法，所述方法包括向植物、植物的種子或植物周圍的土壤施用權利要求1的接種劑。
31.權利要求30的方法，其中所述昆蟲是草食性動物，并且所述方法減少所述昆蟲在所述植物上產(chǎn)卵。
32.權利要求30的方法，其中所述昆蟲是草食性動物，并且所述方法減少所述昆蟲以所述植物為食。
33.權利要求30的方法，其中所述昆蟲是肉食性動物或擬寄生物，并且所述方法將所述肉食性動物或擬寄生物吸引到所述植物。
34.權利要求30的方法，其中所述植物選自苜蓿、水稻、大麥、黑麥、棉花、向日葵、花生、玉米、馬鈴薯、甘薯、菜豆、豌豆、小扁豆、菊苣、生菜、苦苣、卷心菜、抱子甘藍、甜菜、歐洲防風草、蕪菁、花椰菜、西蘭花、蕪菁、小蘿卜、菠菜、洋蔥、大蒜、茄子辣椒、芹菜、胡蘿卜、南瓜、倭瓜、西葫蘆、黃瓜、蘋果、梨、甜瓜、柑橘、草莓、葡萄、覆盆子、菠蘿、大豆、低芥酸油菜、油菜、春小麥、冬小麥、煙草、番茄 、高粱和甘蔗。
【文檔編號】C12R1/07GK103889235SQ201180066750
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2011年12月12日 優(yōu)先權日:2010年12月10日
【發(fā)明者】約瑟夫·W·克洛佩爾, 亨利·Y·法達米洛, 埃斯特·N·英居姆比, 凱特·W·南格爾 申請人:奧本大學