一種通過體外小分子誘導培養(yǎng)尿源性多潛能干細胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種通過體外小分子誘導培養(yǎng)尿源性多潛能干細胞的方法，包括從人尿液樣品中獲得尿源性細胞，對得到的原代細胞進行體外小分子誘導和培養(yǎng)獲得貼壁生長的P1代hUSCs克隆，挑取生長狀態(tài)良好的hUSCs克隆進行接種，并繼續(xù)傳代培養(yǎng)，獲得細胞呈現(xiàn)長梭形，狀態(tài)良好的hllSCso采用本方法制備的hUSCs經誘導可定向分化為成骨細胞、脂肪細胞、骨骼肌細胞、神經細胞、成纖維細胞或平滑肌細胞，對糖尿病下肢缺血模型進行體內移植hUSCs，研究結果表明其能顯著增強缺血部位的血流恢復和血管新生。本方法制備的hUSCs可應用于治療和修復糖尿病及并發(fā)癥、心腦腎血管疾病、阿爾茲海默癥、骨質疏松、關節(jié)炎等病變組織與器官的修復，以及泌尿系統(tǒng)腫瘤預警與細胞藥物的篩選。
【專利說明】一種通過體外小分子誘導培養(yǎng)尿源性多潛能干細胞的方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種多潛能干細胞的制備方法，特別涉及一種通過體外小分子誘導培 養(yǎng)尿源性多潛能干細胞（Human Urine-Derived Stem Cells, hUSCs)的方法。本發(fā)明屬于 細胞生物學【技術領域】，

【背景技術】
[0002] 組織、器官的喪失或功能障礙是人類健康所面臨的主要危害之一，也是人類疾病 和死亡的最主要原因。據(jù)美國的一份資料顯示，每年有數(shù)以百萬計的美國人患有各種組織、 器官的喪失或功能障礙，每年需進行800萬次手術進行修復，年住院日在4000- 9000萬之 間，年耗資超過400億美元。近年來，干細胞領域所取得的一系列重大突破燃起了人類尋找 組織器官再生修復的希望。
[0003] 干細胞是一類具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的細胞。在胚胎和成年組 織中均存在著具有高度更新能力和多向分化潛能的干細胞，可分為胚胎干細胞和成體干細 胞兩大類。目前發(fā)現(xiàn)的成體干細胞主要有造血干細胞、間充質干細胞、神經干細胞、肝臟干 細胞、肌肉干細胞、皮膚干細胞、腸上皮干細胞、視網(wǎng)膜干細胞等。隨著對干細胞可塑性認識 的深入，其在多組織器官損傷性疾病治療中的應用潛能進一步加大。與胚胎干細胞不同，成 體干細胞不存在胚胎干細胞有的移植排斥反應、致瘤性及倫理等問題。在體外理想的培養(yǎng) 條件下，將人體多種組織來源的成體干細胞從組織中提取分離出來，并在體外人工增殖擴 增至治療劑量，經合適途徑移植給受者，通過參與受者組織細胞的替代和再生，修復病變或 衰老的器官組織結構并重建功能，從而用于治療多種目前尚不能用傳統(tǒng)治療手段治愈的相 關疾?。禾悄虿〖安l(fā)癥、心腦腎血管疾病、阿爾茲海默癥、骨質疏松、關節(jié)炎等。從目前完 成的干細胞臨床試驗表明，成體干細胞移植在安全性、有效性、穩(wěn)定性等各方面均非常適合 臨床治療的要求，將是未來相當一段時期內有希望首先從實驗室研究真正走向臨床應用的 治療性干細胞。
[0004] 能夠利用病人自身的干細胞用于治療具有不發(fā)生誘導免疫反應或排斥的優(yōu)勢，然 而，因為組織特異性的干細胞數(shù)量稀少，所以很難將它們從器官和組織中分離出來。近來已 有研究利用小分子化合物成功誘導多潛能干細胞定向分化，包括5-氮雜胞苷（5- &2&-2-de〇XyCytidine5-AZA)，DNA甲基化化酶抑制劑以及作為S-腺苷同型半胱氨酸水解酶 (S-adenosylhomocysteine hydrolase)競爭性抑制劑的腺苷類似物；研究還發(fā)現(xiàn)通過在培 養(yǎng)過程中添加維生素C可使誘導多潛能干細胞（induced pluripotent stem cells, iPS cells)的誘導效率提高10倍。
[0005] 目前國內關于hUSCs的研究基本處于空白階段，本發(fā)明利用一種非侵入式的簡單 低成本的方法而非外科手術，通過體外化學小分子組合誘導重編程培養(yǎng)獲得尿液源性多潛 能干細胞。通過體外增殖培養(yǎng)并證實這些干細胞具有多潛能性，并且通過細胞移植發(fā)現(xiàn)這 些hUSCs能有效促進糖尿病大鼠缺血下肢的血管新生與血流恢復。此外，在植入體內后未 觀測到腫瘤形成，其安全性與有效性hUSCs可轉化于未來臨床應用。


【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種通過體外小分子誘導培養(yǎng)尿源性多潛能干細胞的方 法以及由該方法得到的尿源性多潛能干細胞，研究發(fā)現(xiàn)這些干細胞具有多潛能性，并且通 過細胞移植發(fā)現(xiàn)這些hUSCs能有效促進糖尿病大鼠缺血下肢的血管新生與血流恢復。
[0007] 為了達到以上目的，本發(fā)明采用了以下技術手段：
[0008] 本發(fā)明的一種通過體外小分子誘導培養(yǎng)尿源性多潛能干細胞的方法，其特征在 于，包括以下步驟：
[0009] (1)尿源性細胞的分離
[0010] 將獲取的人尿液樣品進行離心，沉淀用PBS洗1-3遍后，離心，棄上清，用培養(yǎng)液重 懸細胞，得到尿源性細胞；
[0011] (2)尿源性細胞的原代培養(yǎng)
[0012] 將得到的尿源性細胞接種于含有培養(yǎng)液的24孔板中，置于細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，洗 棄未貼壁的細胞，更換新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)貼壁細胞，獲得貼壁生長的PO代圓形細胞；
[0013] (3)化學小分子誘導重編程獲得Pl代尿源性多潛能干細胞
[0014] 選擇步驟（2)培養(yǎng)的得到的狀態(tài)佳的細胞接種于含有培養(yǎng)液的六孔板中，細胞 貼壁生長后，采用兩步誘導法，第一步，向培養(yǎng)液中添加5-氮雜-2' -脫氧胞嘧啶核苷 (5-AZA)誘導培養(yǎng)1-3天；第二步，向含有5-氮雜-2' -脫氧胞嘧啶核苷的培養(yǎng)液中添加 3-Deazaneplanocin A(DZNeP)以及維生素C進行誘導，每4天換一次誘導培養(yǎng)液，10-14天 完成化學小分子誘導細胞重編程，獲得貼壁生長的圓形或短梭形且具有無限增殖和多向分 化潛能的細胞，即為Pl代尿源性多潛能干細胞克??；
[0015] 其中，5-氮雜-2'-脫氧胞啼陡核苷（5-AZA)、3_Deazaneplanocin A(DZNeP)以及 維生素C的化學結構式分別如下所示：
[0016]

【權利要求】
1. 一種通過體外小分子誘導培養(yǎng)尿源性多潛能干細胞的方法，其特征在于， 包括以下步驟： (1) 尿源性細胞的分離 將獲取的人尿液樣品進行離心，沉淀用PBS洗1-3遍后，離心，棄上清，用培養(yǎng)液重懸細 胞，得到尿源性細胞； (2) 尿源性細胞的原代培養(yǎng) 將得到的尿源性細胞接種于含有培養(yǎng)液的24孔板中，置于細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，洗棄未 貼壁的細胞，更換新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)貼壁細胞，獲得貼壁生長的PO代圓形細胞； (3) 化學小分子誘導重編程獲得Pl代尿源性多潛能干細胞 選擇步驟（2)培養(yǎng)的得到的狀態(tài)佳的細胞接種于含有培養(yǎng)液的六孔板中，細胞 貼壁生長后，采用兩步誘導法，第一步，向培養(yǎng)液中添加5-氮雜-2' -脫氧胞嘧啶核苷 (5-AZA)誘導培養(yǎng)1-3天；第二步，向含有5-氮雜-2' -脫氧胞嘧啶核苷的培養(yǎng)液中添加 3-Deazaneplanocin A(DZNeP)以及維生素C進行誘導，每4天換一次誘導培養(yǎng)液，10-14天 完成化學小分子誘導細胞重編程，獲得貼壁生長的圓形或短梭形且具有無限增殖和多向分 化潛能的細胞，即為Pl代尿源性多潛能干細胞克隆； (4) PO代尿源性多潛能干細胞的傳代培養(yǎng) 挑選小分子誘導獲得的Pl代尿源性多潛能干細胞克隆，接種轉移至含有培養(yǎng)液的6孔 板中繼續(xù)培養(yǎng)，細胞生長至90 %融合轉移至含有相同培養(yǎng)液的9cm平皿中進行傳代培養(yǎng)， 通過連續(xù)傳代之后，獲得呈現(xiàn)長梭形，狀態(tài)良好的細胞，即為尿源性多潛能干細胞。
2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于步驟（1)中所述的培養(yǎng)液為含有15% FBS的 KSFM培養(yǎng)液。
3. 如權利要求1所述的方法，其特征在于步驟（2)中所述的培養(yǎng)液為含有10% FBS、 100U/ml青霉素以及100mg/ml鏈霉素的KSFM培養(yǎng)液。
4. 如權利要求1所述的方法，其特征在于步驟（2)中將得到的細胞按照500個細胞/ 孔的密度接種于24孔板中，置于37°C，5 % CO2及飽和濕度細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，接種24h后， 洗棄未貼壁的細胞，更換新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)貼壁細胞，獲得貼壁生長的圓形細胞。
5. 如權利要求1所述的方法，其特征在于步驟（3)中所述的培養(yǎng)液為含有5% FBS的 KSFM以及EFM按照等體積混合的培養(yǎng)液，所述的誘導培養(yǎng)液為含有3-Deazaneplanocin A(DZNeP)、維生素C以及5% FBS的KSFM以及EFM按照等體積混合的培養(yǎng)液。
6. 如權利要求1所述的方法，其特征在于步驟（3)中添加5-氮雜-2'-脫氧胞嘧啶核 苷使其終濃度達到2-10 μ mol/L，添加3-Deazan印lanocin A (DZNeP)以及維生素C使其終 濃度分別達到1-5 μ mol/L以及10-40 μ g/ml。
7. 如權利要求1所述的方法，其特征在于步驟（4)中初次傳代時間為6-8天，初次傳代 后，按照1 :3的比例轉移至含有相同培養(yǎng)液的9cm平皿中進行傳代培養(yǎng)，3-4天傳代一次， 通過連續(xù)傳代5-7代之后，獲得呈現(xiàn)長梭形，狀態(tài)良好的細胞，即為尿源性多潛能干細胞， 其中所述培養(yǎng)液為含有5% FBS的KSFM以及EFM按照等體積混合的培養(yǎng)液。
8. 按照權利要求1-7任一項所述的方法制備得到的尿源性多潛能干細胞，其特征在 于，所述的尿源性多潛能干細胞為表達間質標志⑶29、⑶44、⑶73、⑶90和SSEA-4,不表達 成熟造血細胞標志⑶45及內皮標志⑶31和⑶133的多潛能干細胞。
9. 權利要求8所述的尿源性多潛能干細胞在定向誘導細胞分化中的應用，所述細胞為 脂肪細胞，成骨細胞，平滑肌細胞，骨骼肌細胞，神經細胞或成纖維細胞。
10. 根據(jù)權利要求8所述的尿源性多潛能干細胞在制備治療糖尿病引起的遠端血管閉 塞和糖尿病足的藥物中的用途。
【文檔編號】C12N5/079GK104212762SQ201410421813
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年8月25日 優(yōu)先權日:2014年8月25日
【發(fā)明者】曾強, 陳海旭, 楊超 申請人:中國人民解放軍總醫(yī)院