專利名稱：誘導(dǎo)組織再生的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過從相同譜系的有絲分裂后分化細(xì)胞中離體和體內(nèi)生產(chǎn)譜系內(nèi)細(xì)胞即譜系限制細(xì)胞誘導(dǎo)組織再生的方法。還提供用于進(jìn)行這些方法的試劑盒。
發(fā)明背景
人類組織再生非常有限且構(gòu)成損傷器官功能修復(fù)的主要難題。許多器官依賴未分化的干細(xì)胞和祖細(xì)胞進(jìn)行組織再生。然而，不清楚駐留的干細(xì)胞能否再生特定損傷所需的組織完整體。此外，許多組織尚未鑒定到干細(xì)胞，而且在那些鑒定到干細(xì)胞的組織中，誘導(dǎo)其增殖和分化以掌握這些組織中細(xì)胞命運(yùn)的因子并沒有完全理解。因此，需要有誘導(dǎo)良好定義的已知特征的分化細(xì)胞的方法來協(xié)助體內(nèi)細(xì)胞替換和組織再生。此外，所述細(xì)胞的離體增殖可在體內(nèi)遞送后用作基于細(xì)胞的治療。所述方法還可用于離體模擬人類疾病(例如骨骼、神經(jīng)元、心臟、胰腺、肝臟疾病等)并闡明潛在缺陷。此外，能改善人類疾病表型的藥物可用所述疾病模型篩選。
發(fā)明概述
提供從相同譜系的有絲分裂后分化細(xì)胞(PMD)中離體和體內(nèi)生產(chǎn)譜系內(nèi)細(xì)胞即譜系限制細(xì)胞(LRC)的方法，其中所述譜系限制細(xì)胞可包括定向?yàn)榧?xì)胞譜系的有絲分裂祖細(xì)胞(MPC)、定向?yàn)樗黾?xì)胞譜系中的具體細(xì)胞類型的有絲分裂后未成熟細(xì)胞(有絲分裂后未成熟細(xì)胞，PMI)、和所述細(xì)胞譜系的有絲分裂后分化細(xì)胞(有絲分裂后分化細(xì)胞， PMD)。還提供通過使用本發(fā)明方法生產(chǎn)的細(xì)胞治療需要組織再生療法的對(duì)象的方法。還提供用于進(jìn)行這些方法的試劑盒。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，有絲分裂后分化細(xì)胞(PMD)與有效量的短暫抑制細(xì)胞周期調(diào)節(jié)劑(即口袋蛋白)的口袋蛋白家族成員活性的試劑，和有效量的短暫抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2A(CDKNA2)讀框替代蛋白(ARF)活性的試劑離體接觸。與這些試劑的接觸在足以誘導(dǎo)PMD細(xì)胞短暫變?yōu)榭蓮?fù)制型細(xì)胞(RCC)并分裂產(chǎn)生非致瘤性后代的條件下發(fā)生，所述后代為與PMD相同譜系的有絲分裂后未成熟細(xì)胞(PMI)。在一些實(shí)施方式中，PMD在變?yōu)镽CC的過程中去分化。在一些實(shí)施方式中，所述PMD為肌細(xì)胞如心肌細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，所述PMD為肝細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，所述PMD為神經(jīng)元如多巴胺能神經(jīng)元。任何包含有絲分裂后細(xì)胞的組織(如肌肉、大腦、皮膚、胰腺、肝臟等)包括在本文中。
在一些實(shí)施方式中，所述口袋蛋白是視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(RB)。在一些實(shí)施方式中，短暫抑制RB活性的試劑暫時(shí)抑制RB蛋白的合成。在一些實(shí)施方式中，短暫抑制ARF的試劑暫時(shí)抑制ARF蛋白的合成。在一些實(shí)施方式中，存在于細(xì)胞群中約10%的PMD被誘導(dǎo)變?yōu)镽CC并分裂。
在一些實(shí)施方式中，后代PMI群以促進(jìn)分化的條件提供，從而產(chǎn)生所需譜系的PMD 群。在某些實(shí)施方式中，通過將所述后代移植到對(duì)象中的靶位置將后代PMI轉(zhuǎn)移到分化條件中。在一些實(shí)施方式中，所述對(duì)象為理想地在移植的靶位置需要組織再生治療的對(duì)象。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，組織中的有絲分裂后分化細(xì)胞(PMD)與有效量的短暫抑制細(xì)胞周期調(diào)節(jié)劑(即口袋蛋白)的口袋蛋白家族成員活性的試劑，和有效量的短暫抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2A(CDKNA2)讀框替代蛋白(ARF)活性的試劑體內(nèi)接觸，其中所述接觸的PMD被誘導(dǎo)短暫變?yōu)榭蓮?fù)制型細(xì)胞(RCC)并原位分裂產(chǎn)生所述組織譜系的有絲分裂后未成熟細(xì)胞(PMI)群。在一些實(shí)施方式中，PMD在變?yōu)镽CC的過程中去分化。在一些實(shí)施方式中，所述有絲分裂后分化細(xì)胞為肌細(xì)胞如心肌細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，所述PMD為肝細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中,所述PMD為神經(jīng)元如多巴胺能神經(jīng)元。任何包含有絲分裂后細(xì)胞的組織(如胰腺)包括在本文中。
在一些實(shí)施方式中，所述口袋蛋白是視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(RB)。在一些實(shí)施方式中，短暫抑制RB活性的試劑暫時(shí)抑制RB蛋白的合成。在一些實(shí)施方式中，短暫抑制ARF的試劑暫時(shí)抑制ARF蛋白的合成。在一些實(shí)施方式中，將短暫抑制口袋蛋白活性的試劑和短暫抑制ARF活性的試劑給予對(duì)象的靶位置。在一些實(shí)施方式中，所述對(duì)象為理想地在給予所述試劑的靶位置需要組織再生治療的對(duì)象。
在一些實(shí)施方式中，所述PMD源自患病個(gè)體以表征該疾病(如阿爾茨海默病患者的皮層神經(jīng)元、帕金森病患者的多巴胺能神經(jīng)元、和遺傳性或獲得性心臟病患者的心肌細(xì)胞等)。在一些實(shí)施方式中，所述PMD源自存活的個(gè)體如來自活組織活檢的PMD。在一些實(shí)施方式中，所述PMD源自已死亡的患者，即PMD來自尸體。
在本發(fā)明的一些方面中，提供根據(jù)對(duì)疾病條件的影響篩選候選試劑的方法。在這些方法中，用上述方法從來自患病個(gè)體的有絲分裂后分化細(xì)胞(PMD)產(chǎn)生譜系限制細(xì)胞 (LRC)。所述LRC轉(zhuǎn)移到促進(jìn)分化的條件產(chǎn)生分化的細(xì)胞群。分化的細(xì)胞與候選試劑接觸， 且分化群中細(xì)胞的活力和/或功能與不接觸所述候選試劑的分化細(xì)胞的活力和/或功能相比較；其中候選試劑接觸的分化群中細(xì)胞的活力和/或功能相較不接觸所述候選試劑的分化群提高，表明所述候選試劑對(duì)所述病情會(huì)有影響。在一些實(shí)施方式中，所述病情是肌肉失調(diào)。在一些實(shí)施方式中，所述肌肉是平滑肌、骨骼肌或心肌。在一些實(shí)施方式中，所述病情是神經(jīng)系統(tǒng)失調(diào)。在一些實(shí)施方式中，所述神經(jīng)系統(tǒng)失調(diào)是帕金森病、阿耳茨海默病、ALS、 嗅覺神經(jīng)元失調(diào)、脊髓神經(jīng)元失調(diào)、或外周神經(jīng)元失調(diào)。在一些實(shí)施方式中，所述PMD來自存活個(gè)體。在一些實(shí)施方式中，所述PMD來自尸體。
在本發(fā)明的一些方面中，提供根據(jù)對(duì)人的毒性篩選候選試劑的方法。在這些方法中，用上述主題方法從來自健康個(gè)體的有絲分裂后分化細(xì)胞(PMD)產(chǎn)生譜系限制細(xì)胞 (LRC)。所述LRC轉(zhuǎn)移到促進(jìn)分化的條件產(chǎn)生分化的細(xì)胞群。分化的細(xì)胞群與候選試劑接觸，且分化群中細(xì)胞的活力和/或功能與不接觸所述候選試劑的分化細(xì)胞的活力和/或功能相比較；其中候選試劑接觸的分化群中細(xì)胞的活力和/或功能相較不接觸所述候選試劑CN 102933702 A書明說3/34 頁的分化群降低，表明所述候選試劑對(duì)人有毒性。在一些實(shí)施方式中，所述PMD為肝細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞的功能通過評(píng)估細(xì)胞色素P450組來評(píng)估。


結(jié)合附圖，通過以下詳述更好地理解本發(fā)明。本發(fā)明或申請(qǐng)文件包括至少一幅彩色的附圖。本專利或?qū)＠暾?qǐng)公開的包括彩色附圖的副本將根據(jù)要求，在支付所需的費(fèi)用之后由政府機(jī)關(guān)提供。需要強(qiáng)調(diào)，按照慣例，附圖的各個(gè)特征不成比例。相反，各種特征的尺寸被任意放大或者縮小以清楚顯示。附圖包括以下圖。
圖I. RB的抑制足夠細(xì)胞周期重新進(jìn)入C2C12肌管。(A) C2C12肌管處理的示意圖。 (B)用mocksi或RBsi處理后數(shù)小時(shí)RB表達(dá)時(shí)程的sqRT-PCR。RNA上樣對(duì)照顯示GAPDH表達(dá)。(C)分化第4天(DM4)，RBsi處理后至少36小時(shí)，BrdU納入肌管的肌核中的柱狀圖。 從各試驗(yàn)的隨機(jī)區(qū)域中計(jì)數(shù)最少500個(gè)核。(D)模擬處理的DM4C2C12肌管以及DM4和DM5 的200nMRBsi處理肌管的免疫熒光圖。肌管用一抗標(biāo)記MHC(紅)和BrdU(綠)，以及用赫斯特33258染料(藍(lán)色)。柱，150 μ m。(E)分別RB-siRNA處理后24小時(shí)和48小時(shí)，C2C12 成肌細(xì)胞(GM)、肌管(DM4)以及010和0114時(shí)肌管中1 (1001^&)蛋白表達(dá)水平的Western 印跡。GAPDH(35kDa)用作加樣對(duì)照。(F)GM、DM4和DM4中RB-siRNA處理48小時(shí)后的RB 水平柱狀圖。樣品對(duì)DM4肌管的蛋白水平歸一化。生長(zhǎng)培養(yǎng)基(GM);分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 或5天的肌管(分別為DM4或DM5)。誤差柱表示至少3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值土SE，P值用t 檢驗(yàn)確定(*P < O. 05, **P < O. 01) ο
圖2. RB和pl6/19的抑制為細(xì)胞周期重新進(jìn)入初級(jí)肌管所需。(A)初級(jí)肌管處理的示意圖。(B)模擬Si-Glo處理的初級(jí)肌管和RBsi處理的肌管的免疫熒光圖。肌管用一抗標(biāo)記MHC (紅)和BrdU (綠)，以及用赫斯特33258染料(藍(lán)色)。柱，50 μ m。(C)模擬處理、TAM 處理或 TAM 和 pl6/19si 處理后 GM 和 DM5 中 RB(IOOkDa)和 pl9ARF (20kDa)的初級(jí)肌管蛋白水平的Western印跡。GAPDH(35kDa)用作加樣對(duì)照。(D)表明BrdU納入TAM 和模擬Si-Glo處理的初級(jí)肌管相較TAM和pl6/19si-RNA處理的初級(jí)肌管的免疫熒光圖。 (E) sqRT-PCR顯示RB和Ink4a (pl6/19)在初級(jí)肌管以及在Mocksi或RBsi處理的兩種不同 C2C12肌管群中的表達(dá)。(F)用引物從初級(jí)成肌細(xì)胞和C2C12成肌細(xì)胞制備的基因組DNA中 sq-PCR擴(kuò)增ink4a基因座共有的外顯子2_3區(qū)域。(G)用siRNA或TAM抑制RB后，DM5時(shí) BrdU納入初級(jí)肌管核的柱狀圖。(H)用TAM和針對(duì)Ink4a基因產(chǎn)物的siRNA處理后，BrdU 納入初級(jí)肌管核的柱狀圖。生長(zhǎng)培養(yǎng)基(GM);分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)4或5天的肌管(分別為 DM4或DM5)。從F和G中各試驗(yàn)的隨機(jī)區(qū)域中計(jì)數(shù)最少500個(gè)核。誤差柱表示至少3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值土SE。ΓΡ < O. 01).
圖3. RB和ρ16/19水平降低導(dǎo)致有絲分裂器的下調(diào)。(A)GM、模擬處理的DM5、含單獨(dú) TAM 或 TAM 和 pl6/19si 的 DM5 中胞環(huán)蛋白(Anillin)、AuroraB 和生存素(Survivin) 的表達(dá)的半定量RT-PCR(sqRT-PCR)分析。(B)DM5中TAM或TAM和pl6/19si處理后 AuroraB (38kDa)和生存素(20kDa)的蛋白水平的Western印跡。GAPDH(35kDa) (C)模擬處理后DM5中以及TAM和pl6/19-siRNA處理后DM5中初級(jí)肌管的免疫熒光圖。肌管用一抗標(biāo)記BrdU (綠)和生存素(紅)，以及用赫斯特33258核染料(藍(lán)色)。柱，50 μ m。⑶BrdU和生存素在TAM和非特異性模擬siRNA雙鏈體處理的初級(jí)肌管核中相較TAM和pl6/19_siRNA6雙鏈體所處理肌管的共定位的柱狀圖。生長(zhǎng)培養(yǎng)基(GM);分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)4或5天的肌管(分別為DM4或DM5)。從各試驗(yàn)的隨機(jī)區(qū)域中計(jì)數(shù)最少500個(gè)核。誤差柱表示至少3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值土SE。(*P < O. 005)
圖4.成熟肌管的去分化。(A)DM中培養(yǎng)指定時(shí)間并用TAM和非特異 siRNA(Mocksi)雙鏈體或pl6/19si在指定時(shí)間點(diǎn)處理的初級(jí)成肌細(xì)胞和肌管的免疫熒光圖。肌管用一抗標(biāo)記MHC(紅)、BrdU(綠)和赫斯特33258(藍(lán))。下圖相位圖像為相同時(shí)間點(diǎn)。柱，150 μ m。(B)初級(jí)成肌細(xì)胞(GM)和DM5PM的Western印跡分析，顯示MHC (220kDa)、 AuroraB (38kDa)和生存素(20kDa)的表達(dá)以及用針對(duì)pl6/19的siRNA雙鏈體、TAM或TAM 和P16/19處理肌管后這些相同蛋白的表達(dá)。(C)MHC蛋白水平對(duì)分化的肌管培養(yǎng)物歸一化。 初級(jí)肌肉細(xì)胞用TAM或TAM和pl6/19si處理。生長(zhǎng)培養(yǎng)基(GM)，分化培養(yǎng)基(DM)。(D)用 EtOH和非特異siRNA雙鏈體或TAM和pl6/19si處理至少48小時(shí)的DM6初級(jí)肌管的免疫熒光圖。肌管用一抗標(biāo)記MHC (紅)、BrdU (綠)和赫斯特33258 (藍(lán))。生長(zhǎng)培養(yǎng)基(GM);分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)4或5天的肌管(分別為DM4或DM5)。(E)用非特異siRNA雙鏈體或TAM 和pl6/19si處理至少48小時(shí)的DM6初級(jí)肌管的免疫熒光圖。肌管用一抗標(biāo)記α微管蛋白(綠)和赫斯特33258核染料(藍(lán))。(F，G)在指定天(微管蛋白)如所述用siRNA雙鏈體和/或TAM處理的初級(jí)成肌細(xì)胞(GM)和DM6 (肌細(xì)胞生成蛋白)中的肌細(xì)胞生成素 (36kDa) (F)和α微管蛋白(50kDa) (G)的Western印跡分析。在各印跡中，GAPDH(35kDa) 是上樣對(duì)照。
圖5.表達(dá)肌細(xì)胞生成素的肌細(xì)胞僅在缺失RB和Ink4a基因后能進(jìn)入S期。(A) pLE-myog3R-GFP感染的成肌細(xì)胞(GM)和肌細(xì)胞(DM3)的免疫熒光圖。細(xì)胞用一抗標(biāo)記 GFP(綠)、肌細(xì)胞生成素(紅)和赫斯特33258(藍(lán))。柱50 μ m。(B.) (i) GFP陽性和肌細(xì)胞生成素陽性細(xì)胞在成肌細(xì)胞(GM)或肌細(xì)胞(DM3)中百分比柱狀圖。從各試驗(yàn)的隨機(jī)區(qū)域中計(jì)數(shù)最少1000個(gè)核。誤差柱表示至少3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值土SE。ΓΡ < O. 005).(ii)還表達(dá)肌細(xì)胞生成素的GFP陽性細(xì)胞的百分比柱狀圖。評(píng)價(jià)個(gè)體細(xì)胞的各標(biāo)記表達(dá)。 從隨機(jī)區(qū)域中計(jì)數(shù)最少250個(gè)細(xì)胞。誤差柱表示3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值土SE。(C)逆轉(zhuǎn)錄病毒pLE-myog3R-GFP構(gòu)建體感染的成肌細(xì)胞(GM)和肌細(xì)胞(DM3)的代表性FACS圖。門控群表示后續(xù)實(shí)驗(yàn)中使用的GFP陽性肌細(xì)胞群。(D) 3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中成肌細(xì)胞(GM)和肌細(xì)胞(DM3)上FACS概況的GPF表達(dá)柱狀圖ΓΡ < O. 001)。(E)在僅條件GM中或含TAM 和pl6/19si-RNA的cGM中培養(yǎng)的GFP陽性FACS分選肌細(xì)胞的免疫熒光圖。細(xì)胞標(biāo)記為 Ki67(紅)和GFP(綠)以及赫斯特33258(藍(lán))。柱50 μ m。(F) Ki67陽性核在cGM、用ΤΑΜ 和pl6/19si處理、或用RBsi和pl6/19si-RNA雙鏈體串聯(lián)處理(DKD)的GFP陽性FACS分選群中比例的柱狀圖。生長(zhǎng)培養(yǎng)基(GM)。從各試驗(yàn)的隨機(jī)區(qū)域中計(jì)數(shù)最少100個(gè)核。誤差柱表示3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值土SE。Cp <0.01, **P < O. 005).
圖6. (A) (i)肌細(xì)胞生成素-GFP+肌細(xì)胞的培養(yǎng)條件、用模擬siRNA處理、并通過激光顯微解剖和彈射而分離的示意圖。圖還顯示分離后72和96小時(shí)分離細(xì)胞的命運(yùn)。(ii) 顯微解剖前、顯微解剖后立即、LPC分離后、分離后72小時(shí)和分離后96小時(shí)模擬處理的肌細(xì)胞(DM4)(從左向右的圖)的代表性圖。比例尺代表50mm和100mm。⑶⑴肌細(xì)胞生成素-GFP+肌細(xì)胞的培養(yǎng)條件、用TAM和pl6/19siRNA處理、并通過激光顯微解剖和彈射而分離的示意圖。圖還顯示分離后72和96小時(shí)分離細(xì)胞的命運(yùn)。(ii)TAM-和pl6/19siRNA處理的肌細(xì)胞(DM4)的代表性圖第一張圖，天然GFP表達(dá)標(biāo)記顯微解剖前的肌細(xì)胞生成素表達(dá)；第二張圖，顯微解剖期間的相同細(xì)胞；第三張圖，LPC分離后；第四張圖，分離后96小時(shí)和觀察擴(kuò)增。比例尺代表50mm和100mm。(C) (i)肌細(xì)胞生成素-GFP+肌細(xì)胞的培養(yǎng)條件、 用Rb和pl6/19siRNA處理、并通過激光顯微解剖和彈射而分離的示意圖。圖還顯示分離后 72和96小時(shí)分離細(xì)胞的命運(yùn)。(ii)DKD處理的肌細(xì)胞的代表性圖第一張圖，GFP表達(dá)標(biāo)記顯微解剖前的肌細(xì)胞生成素表達(dá)；第二張圖，顯微解剖后的相同細(xì)胞；第三張圖，LPC后； 第四張圖，分離后72小時(shí)并觀察擴(kuò)增。比例尺代表50mm和200mm。(D)如圖6A的示意圖所示的PALM LPC細(xì)胞捕獲后的集落形成的百分比柱狀圖。誤差柱表示至少5次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值土 SE，其中各試驗(yàn)中至少捕獲50個(gè)肌細(xì)胞膜，且至少捕獲20個(gè)成肌細(xì)胞膜以證實(shí)細(xì)胞捕獲效率。(E)如圖19的示意圖所示的GFP+肌細(xì)胞群在FACS分離之后的PALM LPC細(xì)胞捕獲后集落形成的百分比柱狀圖。誤差柱表示至少4次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值土SE，其中各試驗(yàn)中至少捕獲50個(gè)肌細(xì)胞膜。肌細(xì)胞培養(yǎng)在分化培養(yǎng)基中4天(DM4)。
圖7.分化的肌細(xì)胞能擴(kuò)增并分化為成熟肌管。(A)DM4時(shí)，在收獲蛋白用于表達(dá)分析前，兩個(gè)DKD捕獲的肌細(xì)胞集落和兩個(gè)TAM+pl6/19si捕獲的肌細(xì)胞集落的相對(duì)比圖。柱 150 μ m。⑶GM和DM中捕獲集落的Western印跡分析，從左到右按照其在DM4中的分化形態(tài)排列；RB (IOOkDa)、pl9ARF(20kDa)、肌細(xì)胞生成素(36kDa)、MHC(220kDa)和生存素(20kDa) 的蛋白水平以及GAPDH(35kDa)作為加樣對(duì)照。(C) DM4中兩個(gè)DKD捕獲的肌細(xì)胞集落的代表性圖，標(biāo)記GFP(綠)和肌細(xì)胞生成蛋白(紅)以及赫斯特33258(藍(lán))。柱25 μ m。(D) DM4中TAMcap2捕獲的肌細(xì)胞集落的代表性圖，標(biāo)記MHC (紅)和赫斯特33258 (藍(lán))，其亞組(下圖)感染有重新引入RB表達(dá)的逆轉(zhuǎn)錄病毒。柱50μπι。(E)所示時(shí)間點(diǎn)和所示處理的GM、DM中肌肉細(xì)胞和增殖的去分化克隆內(nèi)的Pax-7蛋白(57kDa)的Western印跡。(F) 生長(zhǎng)條件(GM)、分化條件(DM6)下指定處理的初級(jí)肌肉細(xì)胞以及GM和DM4 (DM)中分離的去分化克隆(DKDcapl和DKDcap2)中的M-鈣粘蛋白(88kDa)和MyoD(34kDa)水平的Western 印跡分析。
圖8.去分化的肌細(xì)胞體內(nèi)能融合肌肉。(A)注射來自TAMcapl和TAMcapl+RB所捕獲肌細(xì)胞的2. 5X IO5細(xì)胞10天后脛骨前肌的代表性截面圖。去分化肌細(xì)胞納入已有的纖維可通過層連蛋白結(jié)合纖維(紅)、核(藍(lán))的GFP+染色(綠)在合并區(qū)域觀察；為了增加可視性，細(xì)胞在注射前感染有組成型表達(dá)eGFP的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。柱50 μ m。(B)初級(jí)分化肌細(xì)胞和多核肌管中RB和pl9ARF抑制后時(shí)間的示意圖。
圖9. si Importer肌管轉(zhuǎn)染效率。(A)用siGlo-綠(偶聯(lián)alexa-488分子的非特異siRNA雙鏈體)和Fugene(上)或si Importer (下)轉(zhuǎn)染DM5C2C12肌管的代表性圖。肌管標(biāo)記MHC (紅)和赫斯特33258 (藍(lán))。柱50 μ m。(B) siGlo-綠(IOOnM)和Fugene,或不同濃度的siGlo-綠和silmporter的轉(zhuǎn)染效率定量。肌管在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天(DM5)。 誤差柱表示3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值土 SE Γρ < 0.001, **ρ < ο. 005)。
圖10.初級(jí)成肌細(xì)胞TAM和siRNA處理分析。(A)X_gal (半乳糖苷)染色，表明 EtOH或TAM處理24小時(shí)的GM中初級(jí)成肌細(xì)胞的Cre表達(dá)。柱100 μ m。(B)X-gal染色，標(biāo)記EtOH或TAM處理24小時(shí)的DM5中初級(jí)肌管細(xì)胞的Cre表達(dá)。柱200 μ m。(C) TAM處理后 DM5初級(jí)肌管的sqRT-PCR分析。TAM加入DM2肌管培養(yǎng)物中持續(xù)指定時(shí)間。(D) TAM處理24 小時(shí)后初級(jí)肌管中RB和pl9ARF表達(dá)的sqRT-PCR時(shí)程。(E)用siRNA雙鏈體DKD處理的初級(jí)肌管的RBsi或pl6/19si的sqRT-PCR分析，串聯(lián)⑴、協(xié)同⑶或以半劑量IOOnM(hU)協(xié)同遞送。生長(zhǎng)培養(yǎng)基(GM);分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)4或5天的肌管(分別為DM4或DM5)。(F) 具有至少2個(gè)BrdU陽性肌核的肌管百分比。
圖11. pl6單獨(dú)抑制不足以在肌管中再進(jìn)入S期。⑷用針對(duì)僅pl6和pl6/19的 siRNA雙鏈體處理后的TAM處理肌管中pl6、pl9和GAPDH的表達(dá)水平的sqRT-PCR分析。 ⑶用TAM和針對(duì)pl6/19或僅pl6siRNA雙鏈體的siRNA處理后，BrdU納入初級(jí)肌管核的柱狀圖。各試驗(yàn)至少計(jì)數(shù)500個(gè)核。誤差柱表示2次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值土SEfP < O. 001)。
圖12. Rb和Ink4a基因產(chǎn)物抑制后的有絲分裂器上調(diào)。(A)生存素和BrdU在成肌細(xì)胞中的共定位。生長(zhǎng)培養(yǎng)基(GM)中BrdU(綠)生存素(紅)和核染料赫斯特33258染色的初級(jí)成肌細(xì)胞的免疫熒光圖。(B)用非特異siRNA雙鏈體(Mocksi)或TAM和pl6/19si 處理的初級(jí)肌管的免疫熒光圖。肌管標(biāo)記Eg5 (綠)、MHC (紅)和赫斯特33258 (藍(lán))。(C) GM、DM和如所述處理的DM中的初級(jí)成肌細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白D和El以及Emil/FB0X5表達(dá)水平的sqRT-PCR分析。
圖13.失去Rb和pl6/19后的初級(jí)肌管顯示最小的凋亡。如所述處理并用膜聯(lián)蛋白V(綠)和碘化丙錠(PI)標(biāo)記的分化第6天的初級(jí)肌管的代表性免疫熒光圖。
圖14.生長(zhǎng)培養(yǎng)基以及分化培養(yǎng)基第3天(DM3)、第6天(DM6)和如所述處理的 DM6中的分裂成肌細(xì)胞中p53和p21蛋白水平的Western分析。
圖15. TAM和pl6/19siRNA處理后肌管去分化。⑷針對(duì)Rb的siRNA雙鏈體處理后C2C12成肌細(xì)胞(GM)和肌管(DM)中的MHC蛋白(220kDa)的Western分析。(B)用非特異siRNA雙鏈體和Rbsi處理至少48小時(shí)的DM5C2C12肌管的免疫熒光圖。肌管用一抗標(biāo)記 MHC (紅)、BrdU (綠)和赫斯特 33258 (藍(lán))。柱，150 μ m。(C) TAM 或 TAM 和 pl6/19si 處理前后生長(zhǎng)培養(yǎng)基(GM)或分化培養(yǎng)基(DM)內(nèi)晚期分化肌原標(biāo)記表達(dá)的sqRT-PCR分析。 (D)初級(jí)成肌細(xì)胞(GM)和如所述用siRNA雙鏈體和/或TAM處理的DM5中M-CK (50kDa)的 Western印跡分析；M_CK印跡中所見的45_kD條帶可能是由于所述抗體鑒定到的共有表位。 在各Western中，GAPDH (35kDa)是加樣對(duì)照。
圖16.失去Rb和pl6/19后的α微管蛋白水平下降。上圖Mocksi或TAM和 pl6/19si處理后初級(jí)肌管的代表性相圖和免疫熒光圖。肌管用一抗標(biāo)記α微管蛋白(綠) 和赫斯特33258(藍(lán))。下圖定量正?；降摩?微管蛋白。
圖17. FACS分離后缺少RB和ρ16/19的肌細(xì)胞增殖。㈧直接FACS分選到微孔中的pLE-myog3R-GFP肌細(xì)胞在處理前以及DKD處理后72和96小時(shí)成像的代表性圖。放大的圖，突出顯示RBsi和pl6/19si處理后一個(gè)孔的擴(kuò)增。柱150μπι。(B)分選到微孔中的細(xì)胞亞組FACS分離后，還表達(dá)肌細(xì)胞生成素的GFP陽性細(xì)胞的百分比柱狀圖。評(píng)價(jià)個(gè)體細(xì)胞的各標(biāo)記表達(dá)。從隨機(jī)區(qū)域中計(jì)數(shù)最少250個(gè)細(xì)胞。誤差柱表示2次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值土SE。(C)處理后96小時(shí)在微孔中觀察到的集落形成百分比柱狀圖。各試驗(yàn)計(jì)數(shù)最少500 個(gè)孔和處理前至少一個(gè)細(xì)胞。誤差柱表示至少3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值土SE。ΓΡ < O. 005)
圖18.去分化的肌細(xì)胞生成素-GFP肌細(xì)胞的單細(xì)胞分離和擴(kuò)增。(A)顯微解剖前、LPC后、和分離后72小時(shí)的未處理GFP+肌細(xì)胞(DM4)的代表性圖。柱50 μ m。(B)顯微解剖前、LPC后、分離后48小時(shí)、分離后72小時(shí)、分離后96小時(shí)(此時(shí)更換培養(yǎng)基)和分離后120小時(shí)的TAM+pl6/19si處理的GFP+肌細(xì)胞的代表性圖。柱50 μ m，最后的圖中柱為 200 μ m。
圖19. FACS分選的肌細(xì)胞生成素-GFP+肌細(xì)胞的單細(xì)胞分離和克隆擴(kuò)增。㈧肌細(xì)胞FACS分選、處理和PALM LPC分離的示意圖。(B)顯微解剖前、顯微解剖后、LPC后、和分離后72小時(shí)的FACS分選、TAM處理的肌細(xì)胞(DM4)的代表性圖。柱50 μ m。(C)顯微解剖前、顯微解剖后、LPC后、和分離后72-73小時(shí)以及分離后96小時(shí)的用TAM+和16/19si處理的FACS分選肌細(xì)胞(DM4)的代表性圖。柱50 μ m，72小時(shí)的圖中柱為200 μ m。
圖20.初級(jí)成肌細(xì)胞和TAM和pl6/19si處理的肌細(xì)胞的PALM分離、擴(kuò)增和分化。(A)分離后48小時(shí)、分離后96小時(shí)的PALM分離的成肌細(xì)胞。分離后3周，將捕獲的成肌細(xì)胞置于分化培養(yǎng)基(DM)中。圖像顯示DM中3天(DM3)的培養(yǎng)物。(B)顯微解剖前、分離后72小時(shí)用TAM和pl6/19si處理的PALM分離的肌細(xì)胞生成素-啟動(dòng)子-GFP肌細(xì)胞，顯示相圖和天然GFP成像。分離后3周，將擴(kuò)增和去分化的成肌細(xì)胞置于DM中，且圖像顯示 DM中3天后(DM3)以及DM中6天后(DM6)的培養(yǎng)物。生長(zhǎng)培養(yǎng)基(GM)。
圖21.PALM分離的成肌細(xì)胞集落和DKD處理的肌細(xì)胞集落的表達(dá)模式。㈧ GM和DM4中的PALM分離的初級(jí)成肌細(xì)胞集落的Western印跡分析，顯示RB(IOOkDa)、 pl9ARF(20kDa)、MHC(220kDa)、和生存素(20kDa)的蛋白水平。GAPDH(35kDa)為加樣對(duì)照。(B)GM和DM4中PALM分離的初級(jí)成肌細(xì)胞和DKD處理的肌細(xì)胞的sqRT-PCR分析。生長(zhǎng)培養(yǎng)基(GM);分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)4或5天的肌管(分別為DM4或DM5)。
圖22. DKD分化、捕獲和擴(kuò)增的肌細(xì)胞在體內(nèi)與肌肉融合。注射來自DKD捕獲并擴(kuò)增的肌細(xì)胞的I. 5 X IO5細(xì)胞10天后CB17/SCID小鼠的脛骨前肌的代表性截面圖。截面用赫斯特33258(藍(lán))、GFP(綠)和層連蛋白(橙)染色。去分化肌細(xì)胞納入已有纖維可通過層連蛋白所結(jié)合纖維的GFP+染色在合并區(qū)域觀察到；GFP的表達(dá)標(biāo)記纖維中去分化肌細(xì)胞融合部位的肌細(xì)胞生成蛋白的表達(dá)。柱ΙΟΟμπι。
發(fā)明詳述
在描述本方法和組合物之前，應(yīng)理解，本發(fā)明不限于所述的具體方法或組合物，因?yàn)樗鼈儺?dāng)然可能變化。還應(yīng)理解，本文所用術(shù)語的目的僅是描述具體實(shí)施方式
，不用來構(gòu)成限制，因?yàn)楸景l(fā)明的范圍僅受所附權(quán)利要求書的限制。
提供數(shù)值范圍時(shí)，也應(yīng)視作具體公開了該范圍的上限和下限之間以下限單位十分之一為間隔的各中間數(shù)值，除非上下文另有明確說明。本發(fā)明還包括設(shè)定范圍內(nèi)任何設(shè)定數(shù)值或中間數(shù)值和該設(shè)定范圍內(nèi)任何其它設(shè)定數(shù)值或中間數(shù)值之間的較小范圍。取決于設(shè)定范圍內(nèi)任何明確排除的限值，所述范圍可獨(dú)立地包含或排除這些較小范圍的上下限，本發(fā)明也包括這些較小范圍不包含限值、包含任一或兩個(gè)限值的各范圍。設(shè)定范圍包含一個(gè)或兩個(gè)限值時(shí)，本發(fā)明也包括排除這一個(gè)或兩個(gè)所含限值的范圍。
除非另有說明，本文所用的所有科技術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的通常含義相同。雖然也可采用與本文所述類似或等同的任何方法和材料實(shí)施或測(cè)試本發(fā)明，但在此描述一些潛在和優(yōu)選的方法和材料。本文提及的所有出版物均通過引用納入本文，以公開和描述與所引用出版物相關(guān)的方法和/或材料。應(yīng)理解，出現(xiàn)抵觸時(shí)，用本公開內(nèi)容代替任何本文所納出版物的公開內(nèi)容。
必須注意到，本文和所附權(quán)利要求書所用的單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“所述”包括復(fù)數(shù)含義，除非上下文另有明確說明。因此，例如，提到“細(xì)胞”包括多種這類細(xì)胞，提到“肽”包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的一種或多種肽和其等同物如多肽，等等。
提供本文討論的出版物僅針對(duì)其在本申請(qǐng)?zhí)峤蝗罩暗墓_。本文中所有內(nèi)容均不應(yīng)解釋為承認(rèn)本發(fā)明不能憑借在先發(fā)明而先于這些出版物。此外，所提供的出版日期可能與實(shí)際
公開日期不同，這可能需要單獨(dú)確認(rèn)。
定義
提供從相同譜系的有絲分裂后分化細(xì)胞(PMD)中離體和體內(nèi)生產(chǎn)譜系內(nèi)細(xì)胞即譜系限制細(xì)胞(LRC)的方法，其中所述譜系限制細(xì)胞可包括定向?yàn)榧?xì)胞譜系的有絲分裂祖細(xì)胞(MPC)、定向?yàn)樗黾?xì)胞譜系的有絲分裂后未成熟細(xì)胞(有絲分裂后未成熟細(xì)胞, PMI)、和所述細(xì)胞譜系的有絲分裂后分化細(xì)胞(有絲分裂后分化細(xì)胞，PMD)。生產(chǎn)的對(duì)象譜系限制細(xì)胞用于組織再生；用于藥物篩選；用作細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?；用于體外試驗(yàn)篩選以定義生長(zhǎng)和分化因子并表征參與細(xì)胞發(fā)育和調(diào)控的基因；等等。這些細(xì)胞可直接用作這些目的，或其可經(jīng)遺傳修飾以提供改變的能力。閱讀以下更完整描述的組合物和方法細(xì)節(jié)， 本領(lǐng)域技術(shù)人員將明白本發(fā)明的這些和其他目的、優(yōu)點(diǎn)和特征。
本文所用術(shù)語“譜系限制細(xì)胞”或“LRC”表示在限定譜系中的細(xì)胞。LRC包括定向?yàn)橄薅?xì)胞譜系的有絲分裂祖細(xì)胞(MPC)、定向?yàn)樗黾?xì)胞譜系中具體細(xì)胞類型的有絲分裂后未成熟細(xì)胞(有絲分裂后未成熟細(xì)胞，PMI)、和所述細(xì)胞譜系的有絲分裂后分化細(xì)胞 (有絲分裂后分化細(xì)胞，PMD)。譜系限制細(xì)胞不是多能細(xì)胞；換句話說，其不能誘導(dǎo)分化為胚胎中的所有細(xì)胞類型。而是，其僅限制分化為具體譜系的細(xì)胞。譜系的示例為骨骼肌譜系、心肌譜系、神經(jīng)元譜系、胰島細(xì)胞譜系等。
術(shù)語“有絲分裂祖細(xì)胞”或“MPC”用于描述定向?yàn)橄薅?xì)胞譜系的有絲分裂祖細(xì)胞。MPC為能自我再生以及產(chǎn)生其細(xì)胞譜系的子細(xì)胞的細(xì)胞。換句話說，MPC是分裂后產(chǎn)生下述的有絲分裂細(xì)胞a)更多MPC和/或b)定向?yàn)樗黾?xì)胞譜系中具體細(xì)胞類型的有絲分裂后未成熟細(xì)胞(有絲分裂后未成熟細(xì)胞，PMI)。MPC可根據(jù)其表達(dá)一種或多種本領(lǐng)域已知的標(biāo)記即蛋白、RNA等從而具有其細(xì)胞譜系分化的未成熟狀態(tài)的特征來加以識(shí)別。此外， 祖細(xì)胞通常為有絲分裂，且因此將BrdU納入到其DNA和/或表達(dá)一種或多種標(biāo)記如通常在有絲分裂細(xì)胞中表達(dá)的蛋白如Ki67、PCNA、胞環(huán)蛋白、AuroraB、和生存素。MPC的示例為肌肉譜系的祖細(xì)胞，名為成肌細(xì)胞，因?yàn)槠淠墚a(chǎn)生更多成肌細(xì)胞和/或有絲分裂后肌肉前體。
術(shù)語“有絲分裂后未成熟細(xì)胞”或“PMI”指細(xì)胞譜系中定向?yàn)榫唧w細(xì)胞類型的有絲分裂后前體細(xì)胞，即細(xì)胞命運(yùn)確定但尚未分化成該細(xì)胞命運(yùn)的有絲分裂后細(xì)胞。所述PMI 通常不具有所述譜系的完整成熟細(xì)胞的所有定義特征。譜系的PMI可根據(jù)其表達(dá)本領(lǐng)域熟知的一種或多種標(biāo)記和特征形態(tài)學(xué)而識(shí)別。此外，PMI可與MPC區(qū)別，因?yàn)槠錇橛薪z分裂后細(xì)胞且因此沒有將BrdU納入其DNA或表達(dá)通常在有絲分裂細(xì)胞中表達(dá)的標(biāo)記，如Ki67、 PCNA、胞環(huán)蛋白、AuroraB、和生存素。PMI的示例是心肌譜系的前體細(xì)胞，因?yàn)槠錇橛薪z分裂后細(xì)胞但沒有完全分化為心肌細(xì)胞。
本文所用的術(shù)語“有絲分裂后分化的細(xì)胞”或PMD指細(xì)胞譜系中已分化為組織中成熟有功能細(xì)胞的有絲分裂后細(xì)胞。PMD表達(dá)技術(shù)人員熟知的作為成熟細(xì)胞命運(yùn)特征的標(biāo)記。此外，因?yàn)镻MD為有絲分裂后細(xì)胞，所以其沒有將BrdU納入其DNA或表達(dá)通常在增殖細(xì)胞中表達(dá)的標(biāo)記，如Ki67、PCNA、胞環(huán)蛋白、AuroraB、和生存素等。PMD的示例為心肌細(xì)胞、肌纖維、肝細(xì)胞、神經(jīng)元等。
術(shù)語“可復(fù)制細(xì)胞”或“RCC”用于描述能有絲分裂的細(xì)胞。RCC細(xì)胞可表達(dá)有MPC 或PMI特征的標(biāo)記即本領(lǐng)域已知的表現(xiàn)其細(xì)胞譜系分化的未成熟狀態(tài)特征的標(biāo)記。或者， 其可表達(dá)PMD的標(biāo)記，即技術(shù)人員熟知的作為成熟細(xì)胞命運(yùn)特征的標(biāo)記。任何一種情況中， 其將BrdU納入到其DNA和/或表達(dá)一種或多種標(biāo)記如通常在有絲分裂細(xì)胞中表達(dá)的蛋白如Ki67、PCNA、胞環(huán)蛋白、AuroraB、和生存素等。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解如上討論細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)中,所述表達(dá)水平反映所述標(biāo)記的可檢測(cè)量。標(biāo)記蛋白染色為陰性的細(xì)胞(結(jié)合標(biāo)記特異試劑的水平與同型匹配對(duì)照沒有可檢測(cè)的區(qū)別)可能仍表達(dá)少量的所述標(biāo)記。且雖然本領(lǐng)域通常根據(jù)具體標(biāo)記稱細(xì)胞為“陽性”或“陰性”，但實(shí)際表達(dá)水平為數(shù)量性狀。例如，細(xì)胞表面的分子數(shù)可有數(shù)個(gè)數(shù)量級(jí)的不同，但仍表征為“陽性”。細(xì)胞的染色強(qiáng)度可通過流式細(xì)胞術(shù)監(jiān)控，其中激光檢測(cè)熒光團(tuán)的數(shù)量水平(其與特定試劑如抗體所結(jié)合的細(xì)胞表面標(biāo)記的量成比例)。盡管染色的絕對(duì)水平可由于具體熒光團(tuán)和試劑制備而不同，但數(shù)據(jù)可根據(jù)對(duì)照歸一化?；蛘?，細(xì)胞的染色強(qiáng)度可通過免疫組織化學(xué)或免疫熒光監(jiān)控。例如通過流式細(xì)胞術(shù)，細(xì)胞特異標(biāo)記為細(xì)胞表面蛋白可無需固定所述細(xì)胞而觀察，即保持細(xì)胞存活?；蛘?，胞內(nèi)標(biāo)記可在用本領(lǐng)域已知方法固定和制備的所述對(duì)象細(xì)胞的亞群中觀察到。
“去分化”表示細(xì)胞譜系中的細(xì)胞從更加分化的狀態(tài)回復(fù)到分化水平較低的狀態(tài)。 換句話說，所述細(xì)胞失去所述更加分化的細(xì)胞的特征，如形態(tài)學(xué)、表達(dá)某些基因、功能性能等并獲得所述譜系的不太成熟細(xì)胞的特征?！岸虝喝シ只北硎舅鋈シ只癄顟B(tài)是暫時(shí)的， 即給定時(shí)間后和/或某些給定條件下，所述去分化細(xì)胞和/或其后代可分化為更成熟的命運(yùn)，這不同于不能如此的腫瘤細(xì)胞。
“增殖”表示通過有絲分裂而分裂，即經(jīng)歷有絲分裂?！皵U(kuò)增群”是已增殖的細(xì)胞群， 即經(jīng)歷有絲分裂從而所述擴(kuò)增群的細(xì)胞數(shù)量增加，即細(xì)胞數(shù)量多于最初的群體。
術(shù)語“外植體”指器官或其組織的部分從體內(nèi)取出并在人工培養(yǎng)基中培養(yǎng)?！半x體” 生長(zhǎng)的細(xì)胞是以此方法從體內(nèi)取出，暫時(shí)體外培養(yǎng)并放回體內(nèi)的細(xì)胞。
術(shù)語“初級(jí)培養(yǎng)物”表示來自器官或器官內(nèi)組織的細(xì)胞的混合細(xì)胞群。單詞“初級(jí)”使用其在組織培養(yǎng)領(lǐng)域的常用含義。
術(shù)語“組織”指一起實(shí)施某些具體功能的相似專門細(xì)胞的組或?qū)印?br> 術(shù)語“器官”指兩種或更多相鄰的組織層，所述組織層維持一些形式的細(xì)胞之間和 /或細(xì)胞_基質(zhì)之間的相互作用以形成微結(jié)構(gòu)。
“口袋蛋白”是細(xì)胞周期調(diào)控劑的口袋蛋白家族成員的蛋白。口袋蛋白是腫瘤抑制蛋白；換句話說，其為所述細(xì)胞周期的負(fù)調(diào)節(jié)劑。有三種已知的口袋蛋白視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)瘤蛋白(還稱為 RB、RBUpRB, OSRC, ppllO 或 pl05_RB)、pl07 (還稱為 RBLl、CP107)、 和pl30(還稱為RB2)。人RB多肽序列和編碼其的核苷酸序列可參見Genbank參考編號(hào) NM_000321 (SEQ IDNO 1和SEQ ID NO 2)。人pl07多肽序列和編碼其的核苷酸序列可參見 Genbank 參考編號(hào) NM_002895 (變體 I ;SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO 4)、和 NM_183404 (變體 2 ；SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6)。人pl30多肽序列和編碼其的核苷酸序列可參見Genbank 參考編號(hào)NM_005611(SEQ ID NO :7和SEQ ID NO :8)。這些蛋白負(fù)調(diào)控細(xì)胞周期，部分是通過抑制E2F轉(zhuǎn)錄因子活性以限制細(xì)胞周期進(jìn)展所需的基因表達(dá)。在典型的信號(hào)途徑中，所述口袋蛋白家族的成員結(jié)合E2F家族蛋白的成員，阻止介導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞周期的基因的E2F導(dǎo)向轉(zhuǎn)錄。所述口袋蛋白的磷酸化或所述口袋蛋白-E2F相互作用的破壞會(huì)釋放E2F蛋白，其現(xiàn)在可誘導(dǎo)介導(dǎo)進(jìn)入S期的基因的轉(zhuǎn)錄?？诖鞍鬃饔玫倪@個(gè)和其他機(jī)制更詳細(xì)地描述于 Cobrinik(2005)Oncogene 24 :2796_2809，其內(nèi)容通過引用納入本文。
“短暫抑制口袋蛋白活性的試劑”是短暫拮抗、抑制或另外負(fù)調(diào)控所述口袋蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞活性的試劑。短暫抑制口袋蛋白活性的試劑可沿著口袋蛋白信號(hào)途徑的任何位置作用，以拮抗口袋蛋白信號(hào)傳導(dǎo)。因此，例如基于上述口袋蛋白信號(hào)傳導(dǎo)的范例，抑制口袋蛋白調(diào)控細(xì)胞活性的試劑包括阻止所述口袋蛋白合成的試劑(如RB、pl07或pl30的siRNA)、 誘導(dǎo)所述口袋蛋白磷酸化的試劑(如D細(xì)胞周期蛋白肽)；破壞所述口袋蛋白和E2F結(jié)合的試劑(如人乳頭瘤病毒肽E7);克服所述口袋蛋白活性的試劑(如E2F肽)等。
所述“細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2A(⑶KNA2)交讀框替代”(ARF，人類中還稱為pl4ARF，小鼠中為pl9ARF)是由細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2A(CDKNA2，Ink4a， MTS)基因的轉(zhuǎn)錄本變體/同種型4編碼的多肽。ARF多肽序列和編碼其的CDKNA2基因序列可參見Genbank編號(hào)NM_058195 (SEQ ID NO :9和SEQ ID N0:10)。所述變體由定位于剩余基因上游20Kb的替代第一外顯子編碼，這使ARF蛋白結(jié)構(gòu)上與其他⑶KNA2轉(zhuǎn)錄本變體 pl6Ink4a (Genbank 編號(hào) NM_000077)和同種型 3 (NM_058197、NP_478104)編碼的蛋白沒有關(guān)系。ARF作為腫瘤抑制蛋白p53的穩(wěn)定劑，部分是通過與HDM2(MDM2p53結(jié)合蛋白同源物， 還稱為HDMX和MDM2)相互作用并將其隔絕，所述HDM2通常負(fù)責(zé)降解p53。有絲分裂期間， Not dead yet I (NDYl/KDM2b)通過誘導(dǎo)ARF基因座的組蛋白H3K27三甲基化來抑制ARF表達(dá)；沒有ARF蛋白時(shí)，HDM2蛋白可降解p53，從而減少p53介導(dǎo)的有絲分裂抑制。ARF蛋白作用的這個(gè)和其他機(jī)制為本領(lǐng)域熟知。
“短暫抑制ARF活性的試劑”是短暫拮抗、抑制或另外負(fù)調(diào)控ARF調(diào)節(jié)細(xì)胞活性的試劑。抑制ARF活性的試劑可在ARF信號(hào)途徑的任何位置作用以拮抗ARF信號(hào)傳導(dǎo)。因此，例如基于上述ARF信號(hào)傳導(dǎo)的范例，抑制ARG調(diào)節(jié)細(xì)胞活性的試劑包括抑制ARF表達(dá)的試劑(如NDYl肽)、阻止ARF蛋白合成的試劑(如ARF siRNA)、克服ARF蛋白活性的試劑 (如HDM2肽)等。
術(shù)語“個(gè)體”、“對(duì)象”、“宿主”和“患者”在本文中互換使用，指任何需要診斷、處理或治療的哺乳動(dòng)物對(duì)象，尤其是人。
本文所用術(shù)語“療法”、“治療”、“處理”等通常指獲得所需的藥理學(xué)和/或生理學(xué)作用。從完全或部分防止疾病或其癥狀方面來說，這種作用可以是預(yù)防性的，和/或從部分或完全穩(wěn)定或治愈疾病和/或由該疾病產(chǎn)生的不良影響來說，這種作用可以是治療性的。本文所用術(shù)語“治療”包括在哺乳動(dòng)物，特別是人中進(jìn)行的任何疾病治療，包括(a)在可能易患該疾病或癥狀但尚未診斷患有的對(duì)象中防止該疾病或癥狀的發(fā)生；(b)抑制疾病癥狀， 即阻滯其發(fā)展；或(C)緩解疾病癥狀，即引起該疾病或癥狀消退。
分子和細(xì)胞生物化學(xué)中的一般方法可參見標(biāo)準(zhǔn)教科書如Molecular Cloning A Laboratory Manual,(《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》)第三版(Sambrook等,冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(Harbor Laboratory) 2001) ；Short Protocols in Molecular Biology,(《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》)，第4版(Ausubel等編,約翰威利公司(John ffiley&Sons) 1999) ；Protein Methods (《蛋白方法》)(Bollag 等，約翰威利公司 1996) ；Nonviral Vectors for Gene Therapy (《基因治療的非病毒載體》)(Wagner等編,學(xué)術(shù)出版社(Academic Press) 1999)；Viral Vectors (《病毒載體》)(Kaplift 和 Loewy 編，學(xué)術(shù)出版社 1995) ；Immunology Methods Manual (《免疫方法手冊(cè)》)(I. Lefkovits 編，學(xué)術(shù)出版社 1997) ^PICell and Tissue Culture !Laboratory Procedures in Biotechnology (《細(xì)胞和組織培養(yǎng)生物技術(shù)中的實(shí)驗(yàn)室方法》)(Doyle和Griffiths，約翰威利公司1998)，其內(nèi)容通過引用納入本文。本公開中提及的用于遺傳操作的試劑、克隆載體和試劑盒可購(gòu)自商品供應(yīng)商，如伯樂公司(BioRad)、斯查塔基公司(Stratagene)、英杰公司(Invitrogen)、西格瑪-奧德里奇公司 (Sigma-Aldrich)和克隆泰克公司(Clontech)。
如上所述，本發(fā)明提供從相同譜系的有絲分裂后分化細(xì)胞(PMD)中離體和體內(nèi)生產(chǎn)譜系內(nèi)細(xì)胞即譜系限制細(xì)胞(LRC)的方法，其中所述譜系限制細(xì)胞可包括定向?yàn)榧?xì)胞譜系的有絲分裂祖細(xì)胞(有絲分裂祖細(xì)胞，MPC)、定向?yàn)樗黾?xì)胞譜系中具體細(xì)胞類型的有絲分裂后未成熟細(xì)胞(有絲分裂后未成熟細(xì)胞，PMI)、和所述譜系的有絲分裂后分化細(xì)胞 (有絲分裂后分化細(xì)胞，PMD) 0進(jìn)一步描述本發(fā)明中，首先詳細(xì)描述本方法，然后綜述不同代表性應(yīng)用，其中本發(fā)明以及試劑盒用于實(shí)施本發(fā)明。
在實(shí)施本方法中，有絲分裂后分化細(xì)胞(PMD)與短暫抑制細(xì)胞周期調(diào)控劑的一種或多種口袋蛋白家族成員的試劑，和短暫抑制稱為ARF的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑 2A的試劑相接觸。如上所定義，PMD為組織中完全分化變?yōu)槌墒旃δ芗?xì)胞的細(xì)胞，例如，骨骼肌或心肌中的肌細(xì)胞、胰腺中的島細(xì)胞、肝臟中的肝細(xì)胞、CNS組織或外周神經(jīng)組織中的神經(jīng)元、骨中的骨細(xì)胞、血液中的造血細(xì)胞等。PMD可用本領(lǐng)域已知的一種或多種蛋白或 RNA即標(biāo)記物的表達(dá)來鑒定。此外，這些細(xì)胞可表達(dá)本領(lǐng)域已知的一種或多種亞型特異標(biāo)記。在一些實(shí)施方式中，所述對(duì)象PMD細(xì)胞為肌細(xì)胞，其表達(dá)一種或多種肌細(xì)胞生成素、肌球蛋白重鏈(MHC)和肌酸激酶。在某些實(shí)施方式中，所述肌細(xì)胞為心肌細(xì)胞，其在培養(yǎng)物中為桿狀和交叉條紋狀并表達(dá)一種或多種蛋白心臟肌鈣蛋白、eHand轉(zhuǎn)錄因子和心臟特異性肌球蛋白。在某些實(shí)施方式中，所述肌細(xì)胞為平滑肌細(xì)胞，其表達(dá)平滑肌肌動(dòng)蛋白。在某些實(shí)施方式中，所述肌細(xì)胞為骨骼肌細(xì)胞，其表達(dá)一種或多種骨骼肌肌球蛋白、骨骼肌肌鈣蛋白、myoD。
在一些實(shí)施方式中，對(duì)象PMD體內(nèi)接觸試劑，即在其所存在的組織中，即原位。在一些實(shí)施方式中，對(duì)象PMD離體接觸試劑，即其從體內(nèi)收獲并在體外接觸試劑。在所述方法離體實(shí)施的情況中，所述PMD可從外植體如活檢或尸檢材料培養(yǎng)作為原代細(xì)胞的培養(yǎng)物。從外植體培養(yǎng)PMD的方法通常對(duì)培養(yǎng)的原代細(xì)胞類型有特異性，且為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知。作為非限制性示例，所述PMD為肌細(xì)胞的實(shí)施方式中，示例性的方法可參見 Mitcheson, JS 等，(I998)Cardiovascular Research 39 (2) :280_300 (用于心肌細(xì)胞)； Rosenblatt 等(1995) In Vitro Cell Dev. Biol Anim 31 (10) :773_339 (用于人骨骼肌細(xì)胞)；Siow、RCM 和 Pearson, JD (2001)Methods in Molecular Medicine Angiogenesis protocols 46 :237-245(血管平滑肌細(xì)胞);以及 Graham M，和 Willey A. (2003)Methods in Molecular Medicine ffound healing 78 :417_423(腸平滑肌細(xì)胞)，其內(nèi)容通過引用納入本文。
對(duì)象PMD離體或體內(nèi)接觸有效量的短暫抑制RB活性的試劑和有效量的短暫抑制 ARF活性的試劑。如上所述，短暫抑制口袋蛋白家族成員活性的試劑是短暫拮抗、抑制或另外負(fù)調(diào)控所述口袋蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞活性的的試劑；因此短暫抑制口袋蛋白活性的試劑可沿著上述本領(lǐng)域已知的口袋蛋白信號(hào)途徑的任何位置作用以拮抗口袋蛋白信號(hào)傳導(dǎo)。相似地， 短暫抑制ARF活性的試劑是短暫拮抗、抑制或另外負(fù)調(diào)控ARF調(diào)節(jié)細(xì)胞活性的試劑；因此抑制口袋蛋白活性的試劑可沿著上述本領(lǐng)域已知的口袋蛋白信號(hào)途徑的任何位置作用以拮抗口袋蛋白信號(hào)傳導(dǎo)。有效量的試劑指會(huì)短暫降低至少約25%、至少50%、至少60%、至少 70 %、至少80 %、至少90 %、至少95 %、約100 %的對(duì)象途徑總體活性的量，從而所述細(xì)胞現(xiàn)在能進(jìn)入有絲分裂并分裂。換句話說，所述對(duì)象途徑的總體活性相較對(duì)照即未接觸的細(xì)胞會(huì)降低至少約2倍、通常至少約5倍，如10倍、15倍、20倍、50倍、100倍或更多。對(duì)于短暫抑制口袋蛋白活性的試劑，這在生物化學(xué)上可通過例如本領(lǐng)域熟知的使細(xì)胞中口袋蛋白的量降低約10%或50%或更多、70%或更多、90%或更多、或多至100% ;使口袋蛋白磷酸化的量增加約10%或50%或更多、70%或更多、100%或更多、200%或更多、500%或更多；使細(xì)胞中游離E2F的量增加約10%或更多、25%或更多、50%或更多、100%或更多、200%或更多、500%或更多等來實(shí)現(xiàn)。對(duì)于短暫抑制ARF活性的試劑，這在生物化學(xué)上可通過例如本領(lǐng)域熟知的使細(xì)胞中游離NDYl的量增加約10%或更多、25%或更多、50%或更多、100% 或更多、200%或更多、500%或更多；使細(xì)胞中ARF的量降低約10%或30%或更多、50%或更多、70%或更多、約100%;使細(xì)胞中游離HDM2的量增加約10%或更多、25%或更多、50% 或更多、100%或更多、200%或更多、500%或更多等來實(shí)現(xiàn)?！岸虝骸北硎舅鲆种瞥掷m(xù)有限的時(shí)間。在短暫抑制靶向途徑中，有效量的試劑會(huì)拮抗其靶向途徑約12小時(shí)、約I天、約2 天、約3天、約5天、約7天、約10天、約15天、約20天、或約30天。靶向途徑的拮抗可天然停止，如由于所述試劑隨著時(shí)間降解、天然失活，由血液移出對(duì)象體內(nèi)等；或其可被主動(dòng)關(guān)閉如通過提供額外試劑抑制所述對(duì)象試劑表達(dá)或活性。
本發(fā)明中適于短暫抑制口袋蛋白活性和ARF活性的試劑包括小分子化合物。感興趣的天然產(chǎn)生或合成的小分子化合物包括大量化學(xué)種類，例如有機(jī)分子，如分子量大于 50且小于約2500道爾頓的有機(jī)小化合物。候選物質(zhì)包含與蛋白質(zhì)發(fā)生結(jié)構(gòu)相互作用， 特別是形成氫鍵的官能團(tuán)，且通常至少包含胺、羰基、羥基或羧基，優(yōu)選至少兩個(gè)化學(xué)官能團(tuán)。候選物質(zhì)可包含環(huán)狀碳或雜環(huán)結(jié)構(gòu)，和/或用一個(gè)或多個(gè)上述官能團(tuán)取代的芳香或多芳香結(jié)構(gòu)。候選物質(zhì)也可以是生物分子，包括肽、糖、脂肪酸、類固醇、嘌呤、嘧啶，其衍生物、結(jié)構(gòu)類似物或組合。適于本發(fā)明的藥劑的示例描述于"The Pharmacological Basis of Therapeutics "(《治療的藥理學(xué)基礎(chǔ)》)(Goodman和Gilman (1996)麥格勞希爾公司 (McGraw-Hill)紐約州紐約，第9版)。還包括毒素和生物化學(xué)戰(zhàn)劑，例如參見Somani， S. Μ.(編),"Chemical Warfare Agents,"(《化學(xué)戰(zhàn)劑》)學(xué)術(shù)出版社,紐約，1992。小分子化合物可直接提供到培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基中，例如作為DMSO或其他溶劑中的溶液。
本發(fā)明中適于短暫抑制口袋蛋白活性和ARF活性的試劑還包括分別抑制口袋蛋白、ARF蛋白、和/或口袋蛋白或ARF途徑的其他蛋白合成的核酸分子，例如編碼靶向RB、 ρ107、ρ130或CDKNA2/Ink4a基因和轉(zhuǎn)錄本的反義、siRNA或shRNA分子的核酸。
例如，感興趣的核酸試劑包括反義寡核苷酸(ODN)，尤其是含來自天然核酸的化學(xué)修飾的合成0DN，或表達(dá)所述反義分子如RNA的核酸構(gòu)建體。所述反義序列與所述靶向編碼序列互補(bǔ)，并抑制其表達(dá)?？赏ㄟ^在合適的載體中表達(dá)全部或部分所述靶向編碼序列產(chǎn)生反義分子，其中所述轉(zhuǎn)錄起始的方向使反義鏈作為RNA分子生成?；蛘?，所述反義寡核苷酸是合成寡核苷酸。反義寡核苷酸長(zhǎng)度通常為至少約7、通常至少約12、更通常至少約20個(gè)核苷酸，且不多于約25、通常不多于約23-22個(gè)核苷酸，其中所述長(zhǎng)度由抑制效率、特異性、 包括沒有交叉反應(yīng)性等控制。反義寡核苷酸可通過本領(lǐng)域已知的方法化學(xué)合成。優(yōu)選的寡核苷酸從天然磷酸二酯結(jié)構(gòu)中化學(xué)修飾，從而增加其細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性和結(jié)合親和性。這類改變主鏈、糖或雜環(huán)堿基的化學(xué)性質(zhì)的修飾數(shù)量已在文獻(xiàn)中描述。主鏈化學(xué)性質(zhì)中的有用改變?yōu)榱虼姿狨?；兩個(gè)非橋連氧都用硫取代的二硫代磷酸酯；亞磷酰胺；烷基磷酸三酯和硼烷磷酸酯。非手性磷酸酯衍生物包括3' -O' -5' -S-硫代磷酸酯、3' -S-5' -O-硫代磷酸酯、3' -CH2-5' -O-膦酸酯和3' -NH-5' _0_氨基磷酸鹽。肽核酸用肽鍵替代完整核糖磷酸二酯主鏈。糖修飾還用于提高穩(wěn)定性和親和性?？墒褂萌パ鹾缩钡摩?端基異構(gòu)體，其中堿基相對(duì)天然的β-端基異構(gòu)體倒轉(zhuǎn)。核糖的2' -OH可改變形成2' -O-甲基或，-O-烯丙基糖，其提供對(duì)降解的抗性而不影響親和性。雜環(huán)堿基的修飾必需保持合適堿基配對(duì)。一些有用的替換包括用脫氧尿苷取代脫氧胸苷；5-甲基-2'-脫氧胞啶和 5-溴-2' _脫氧胞唳取代脫氧胞唳。顯不5-丙塊基-2' _脫氧尿苷和5-丙塊基-2'-脫氧胞啶分別取代脫氧胸苷和脫氧胞啶時(shí)增加親和性和生物活性。可給予一種反義寡核苷酸或其組合，其中組合可包括多種不同序列。
作為另一示例，感興趣的核酸試劑包括抑制口袋蛋白、ARF蛋白、或這些對(duì)象蛋白激活的途徑中蛋白的合成的RNA試劑。RNA試劑表示通過RNA干擾機(jī)制調(diào)節(jié)靶基因即RB、 ρ107、ρ130、或ARF或其信號(hào)途徑成員表達(dá)的基于核糖核苷酸的試劑。所述RNA試劑可為微小 RNA ;參見例如 Mudhasani 等(2008) J Cell Biol 181 (7) :1055_6，其教授了 miRNA 抑制 ARF表達(dá)。RNA試劑可為RNAi試劑，例如小核糖核酸分子(本文還稱為干擾核糖核酸)，即寡核糖核苷酸，其以雙鏈結(jié)構(gòu)存在如兩個(gè)彼此雜交的不同寡核糖核苷酸(siRNA)或采取小發(fā)夾形式的單核糖寡核糖核苷酸以產(chǎn)生雙鏈結(jié)構(gòu)(shRNA)。寡核糖核苷酸表示長(zhǎng)度不超過約IOOnt的核糖核酸，且通常不超過約75nt長(zhǎng)度，其中所述長(zhǎng)度在某些實(shí)施方式中小于約 70nt。RNA試劑為兩個(gè)彼此雜交的不同核糖核酸的雙鏈結(jié)構(gòu)即siRNA時(shí)，所述雙鏈結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)度范圍通常為約15-30bp，通常為約15-29bp，其中對(duì)某些實(shí)施方式中約20_29bp如21bp、 22bp的長(zhǎng)度特別感興趣。RNA試劑為以發(fā)夾形式存在的單核糖核酸的雙鏈結(jié)構(gòu)即shRNA時(shí)， 所述發(fā)夾的雜交部分的長(zhǎng)度通常與上述siRNA型試劑提供的相同或長(zhǎng)出4-8個(gè)核苷酸。本實(shí)施方式中RNAi試劑的重量范圍通常為約5，000道爾頓-約35，000道爾頓，且在許多實(shí)施方式中為至少約10，000道爾頓且少于約27，500道爾頓，通常少于約25，000道爾頓。
dsRNA可按照本領(lǐng)域已知的許多方法中任一制備，包括體外和體內(nèi)方法，以及通過合成化學(xué)方法。所述方法的示例包括但不限于以下所述方法Sadher等((1987) Biochem. Int. 14 :1015) ；Bhattacharyya((1990)Nature 343:48) ;Livache,等(美國(guó)專利第 5, 795, 715 號(hào));Sambrook,等((1989)Molecular Cloning A Laboratory Manual,(《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》)第二版)！Transcription and Translation (《轉(zhuǎn)錄和翻譯》)((1984) B. D. Hames,S. J. Higgins 編)；DNA Cloning, (((DNA 克隆》，卷 I 和 II ((1985)D. N. Glover 編);和Oligonucleotide Synthesis (《寡核苷酸合成》)((1984)Μ· J. Gait編)，其各自通過引用全文納入本文。單鏈RNA(ssRNA)也可用酶和有機(jī)合成的組合生產(chǎn)或完全通過有機(jī)合成生產(chǎn)。用合成化學(xué)方法可將需要的修飾核苷酸或核苷酸類似物引入dsRNA或ssRNA。 例如，已顯示經(jīng)工程改造具有某些'藥物類似'性質(zhì)如用于穩(wěn)定性和膽固醇偶聯(lián)遞送的化學(xué)修飾的小干擾雙鏈RNA(SiRNA)能實(shí)現(xiàn)體內(nèi)內(nèi)源基因的治療性沉默。為了開發(fā)體內(nèi)沉默靶基因的藥學(xué)方法，與靶基序列互補(bǔ)的化學(xué)修飾、膽固醇偶聯(lián)的單鏈RNA類似物可用標(biāo)準(zhǔn)固相寡核苷酸合成方法合成。所述RNA與膽固醇偶聯(lián)，且還可在一種或多種位置具有硫代磷酸酯主鏈。RNA抑制劑可以終濃度約50nM-500nM提供，更常為100nM_200nM。
在某些實(shí)施方式中，所述RNA試劑可為干擾核糖核酸的轉(zhuǎn)錄模板。在這些實(shí)施方式中，所述轉(zhuǎn)錄模板通常為編碼所述干擾核糖核酸的DNA。所述DNA可存在于載體中，其中各種不同載體為本領(lǐng)域已知，如質(zhì)粒載體、病毒載體等。
本發(fā)明中適于短暫抑制所述口袋蛋白活性和ARF活性的試劑還包括多肽，如本領(lǐng)域理解的通常受到口袋蛋白或ARF活性拮抗的顯性陰性肽或口袋蛋白或ARF的靶標(biāo)肽。所述多肽可任選地融合增加產(chǎn)物溶解性的多肽結(jié)構(gòu)域。所述結(jié)構(gòu)域可通過確定的蛋白酶切割位置如被TEV蛋白酶切割的TEV序列與多肽連接。連接子還可包括一種或多種柔性序列， 如1-10個(gè)甘氨酸殘基。在一些實(shí)施方式中，融合蛋白的切割在維持產(chǎn)物溶解性的緩沖液中進(jìn)行，例如，存在O. 5-2M尿素、存在增加溶解性的多肽和/或多核苷酸等。感興趣的結(jié)構(gòu)域包括內(nèi)吞體裂解結(jié)構(gòu)域(endosomolytic domains),如流感HA結(jié)構(gòu)域；和其他協(xié)助生成的多肽如IF2結(jié)構(gòu)域、GST結(jié)構(gòu)域、GRPE結(jié)構(gòu)域等。
為了促進(jìn)所述多肽遞送到細(xì)胞的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域中，所述多肽可包含融合多肽滲透結(jié)構(gòu)域的感興趣的多肽序列。本領(lǐng)域已知許多滲透結(jié)構(gòu)域并可用于本發(fā)明的非整合多肽， 包括肽、肽模擬物和非肽載體。例如，滲透肽可衍生自稱為穿膜肽(penetratin)的果蠅 (Drosophila melanogaster)轉(zhuǎn)錄因子觸角足蛋白(Antennapaedia)的第三α螺旋，其包含氨基酸序列RQIKIWFQNRRMKWKK。另一個(gè)示例中，所述滲透肽包括HIV-I tat基本區(qū)氨基酸序列，其可包括例如天然產(chǎn)生的tat蛋白的氨基酸49-57。其他滲透結(jié)構(gòu)域包括多精氨酸基序，例如HIV-Irev蛋白的氨基酸34-56區(qū)、九精氨酸、八精氨酸等。(參見例如， Futaki 等(2003) Curr Protein Pept Sci. 2003Apr ；4 (2) :87_96 JPWender 等(2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 2000Nov. 21 ；97(24) : 13003-8 ;公開的美國(guó)專利申請(qǐng) 20030220334 ; 20030083256 ；20030032593 ;和20030022831，通過引用具體納入本文用于教授肽和擬肽的移位)。九精氨酸(R9)序列是已表征的更有效的PTD之一(Wender等2000 ；Uemura等 2002)。本發(fā)明中適于短暫抑制口袋蛋白活性和ARF活性的試劑還包括編碼上述拮抗口袋蛋白活性和ARF活性的多肽的核酸。有許多用于將核酸轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞的載體。所述載體可保持游離，如作為質(zhì)粒，小環(huán)型DNA，病毒衍生的載體如細(xì)胞巨化病毒、腺病毒等，或其可通過同源重組或隨機(jī)整合而整合到靶細(xì)胞基因組中如逆轉(zhuǎn)錄病毒衍生的載體如MMLV、HIV-1、 ALV等。載體可直接提供給對(duì)象細(xì)胞。換句話說，所述有絲分裂后分化細(xì)胞與含感興趣核酸的載體接觸，從而所述載體可被所述細(xì)胞吸收。本領(lǐng)域熟知將細(xì)胞接觸核酸載體的方法如電穿孔、氯化鈣轉(zhuǎn)染和脂質(zhì)轉(zhuǎn)染。
或者，感興趣的核酸可通過病毒提供給對(duì)象細(xì)胞。換句話說，所述有絲分裂后分化細(xì)胞與含感興趣核酸的病毒顆粒接觸。逆轉(zhuǎn)錄病毒例如慢病毒尤其適于本發(fā)明方法。常用的逆轉(zhuǎn)錄載體為“缺陷型”即不能產(chǎn)生生產(chǎn)性感染所需的病毒蛋白。而是，所述載體的復(fù)制需要在包裝細(xì)胞系中生長(zhǎng)。為了生成含感興趣核酸的病毒顆粒，含所述核酸的逆轉(zhuǎn)錄病毒核酸通過包裝細(xì)胞系包裝到病毒衣殼中。不同的包裝細(xì)胞系提供納入到衣殼中的不同包膜蛋白，該包膜蛋白決定所述病毒顆粒對(duì)所述細(xì)胞的特異性。包膜蛋白至少有三種類型，親嗜性、兼嗜性和嗜異性。用親嗜性包膜蛋白如MMLV包裝的逆轉(zhuǎn)錄病毒能感染大多數(shù)鼠和大鼠細(xì)胞類型，且可通過使用親嗜性包裝細(xì)胞系如B0SC23而生成(Pear等(1993) P. N. A. S. 90 :8392-8396)。含兼嗜性包膜蛋白如4070A(Danos等，同上)的逆轉(zhuǎn)錄病毒能感染大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞類型，包括人、狗和小鼠，且可通過使用兼嗜性包裝細(xì)胞系如 PA12(Miller 等(1985)Mol. Cell. Biol.5 :431_437) ；PA317(Miller 等(1986)Mol. Cell. Biol. 6 =2895-2902) ;GRIP(Danos 等(1988)PNAS 85 =6460-6464)而生成。用嗜異性包膜蛋白如AKR env包裝的逆轉(zhuǎn)錄病毒能感染大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞類型，除了鼠細(xì)胞。合適的包裝細(xì)胞系可用于確保所述對(duì)象CD33+分化體細(xì)胞被已包裝病毒顆粒靶向。本領(lǐng)域熟知將含重編程因子編碼核酸的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體引入包裝細(xì)胞系的方法，和收集包裝系生成的病毒顆粒的方法。
用于提供感興趣的核酸給所述對(duì)象細(xì)胞的載體通常包含合適的啟動(dòng)子用于驅(qū)動(dòng)感興趣核酸的短暫表達(dá)，即短暫轉(zhuǎn)錄活化。這些通常為誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如響應(yīng)藥物如四環(huán)素存在的啟動(dòng)子。通過轉(zhuǎn)錄活化，意圖使靶細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄增加到基礎(chǔ)水平之上至少約10倍、 至少約100倍、更通常的至少約1000倍。
可使用短暫抑制一種或多種口袋蛋白活性的一種或多種試劑。同樣，可使用短暫抑制ARF活性的一種或多種試劑。所述試劑可單獨(dú)或作為該試劑的單組合物即預(yù)混組合物提供給有絲分裂后分化的對(duì)象細(xì)胞。單獨(dú)提供時(shí)，所述試劑可同時(shí)或不同時(shí)間依次添加到所述有絲分裂后分化的對(duì)象細(xì)胞中。例如，可先提供短暫抑制口袋蛋白活性的試劑，然后例如24小時(shí)后提供短暫抑制ARF活性的試劑。
在一些實(shí)施方式中，促進(jìn)有絲分裂的其他試劑可在接觸步驟提供給細(xì)胞，例如生長(zhǎng)因子如bFGF、EGF、BMP、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白、造骨特異蛋白等。在一些實(shí)施方式中，還在接觸步驟將促進(jìn)細(xì)胞周期再進(jìn)入的試劑提供給所述細(xì)胞。例如，在所述有絲分裂分化細(xì)胞是骨骼肌細(xì)胞的實(shí)施方式中，可提供破壞微管的試劑如本領(lǐng)域已知的肌基質(zhì)蛋白(Rosania GR 等(2000) Nat Biotechnol. 18(3) 304-8)或小分子(參見例如 Duckmanton A, (2005) Chem Biol. 12(10) :1117-26，其內(nèi)容通過引用納入本文)以打碎多核骨骼肌細(xì)胞。有絲分裂分化的對(duì)象細(xì)胞有形態(tài)學(xué)上的復(fù)合表型如極化所述細(xì)胞的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，例如多核肌肉細(xì)胞、 神經(jīng)元、肝細(xì)胞等的結(jié)構(gòu)時(shí)，通常使用所述試劑。
在PMD被誘導(dǎo)變?yōu)镽CC并體內(nèi)即原位分裂的實(shí)施方式中，局部給予試劑，即直接到對(duì)象的靶位置即組織。可以本領(lǐng)域已知的很多種方式提供所述試劑，如作為液體(如在任何合適的緩沖液中(鹽水、PBS、DMEM、伊可夫氏(Iscove, s)培養(yǎng)基)等)、作為糊料、在基質(zhì)支持物中、偶聯(lián)固體支持物(如珠子、濾器如篩網(wǎng)濾器、膜、線等)等。組織中的條件通常允許PMD的去分化和分裂，且基礎(chǔ)條件不需要改變除了要提供上述的試劑。
在PMD被誘導(dǎo)變?yōu)镽CC并離體分裂的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞與所述試劑在通常用于促進(jìn)對(duì)象譜系的祖細(xì)胞增殖的本領(lǐng)域已知培養(yǎng)基中接觸約30分鐘-約24小時(shí)，如I小時(shí)、I. 5小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、8小時(shí)、12小時(shí)、18小時(shí)、20小時(shí)、或約30分鐘-約24小時(shí)的任何其他時(shí)間段。例如，在有絲分裂后分化的細(xì)胞是肌細(xì)胞的實(shí)施方式中，所述試劑可在補(bǔ)充有高水平血清如15% -20% FBS、1 % Pen-Str印、和I. 25-2. 5ng/mL bFGF的DMEM LG+F10培養(yǎng)基中提供。在一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞與所述試劑重復(fù)接觸，例如與試劑接觸頻率為約每天-約每4天的頻率,如每I. 5天、每2天、每3天、每4天、或約每天_約每4天的任何其他頻率。例如試劑可向?qū)ο蠹?xì)胞提供一次，并將所述細(xì)胞與所述18試劑孵育16-24小時(shí)，之后將培養(yǎng)基換為新鮮培養(yǎng)基并再培養(yǎng)所述細(xì)胞，或所述試劑可向?qū)ο蠹?xì)胞提供兩次，每次提供后與所述試劑孵育16-24小時(shí)，之后將培養(yǎng)基換為新鮮培養(yǎng)基并再培養(yǎng)所述細(xì)胞。
短暫抑制一種或多種口袋蛋白和ARF會(huì)暫時(shí)誘導(dǎo)對(duì)象PMD變?yōu)镽CC并分裂。短暫誘導(dǎo)表示PMD被誘導(dǎo)經(jīng)歷有限時(shí)間的有絲分裂。即12小時(shí)、I天、2天、3天、5天或7天。因此，對(duì)象PMD和其后代可進(jìn)行I輪有絲分裂、多至2輪有絲分裂、多至3輪、多至4輪、多至 5輪、多至6輪、或多至10輪有絲分裂。這些不同于致瘤性細(xì)胞，其經(jīng)歷未調(diào)節(jié)的有絲分裂即繼續(xù)分裂持續(xù)無限制的時(shí)間。RCC積極分裂的時(shí)間段稱為誘導(dǎo)期。誘導(dǎo)期中，短暫誘導(dǎo)而分裂的PMD會(huì)產(chǎn)生后代譜系限制細(xì)胞的群或組。換句話說，PMD可產(chǎn)生2個(gè)或更多細(xì)胞、4 個(gè)或更多細(xì)胞、8個(gè)或更多細(xì)胞、16個(gè)或更多細(xì)胞、32個(gè)或更多細(xì)胞、64個(gè)或更多細(xì)胞、100 個(gè)或更多細(xì)胞、1000個(gè)或更多細(xì)胞、10000個(gè)或更多細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，多種PMD即 PMD群被誘導(dǎo)分裂，產(chǎn)生后代譜系限制細(xì)胞群。群體中至少約1%、約2%、約5%、約8%、更通常約10%、約15%、約20%、或約50%的接觸的有絲分裂后分化細(xì)胞可被誘導(dǎo)分裂。在一些實(shí)施方式中,PMD在變?yōu)镽CC的過程中去分化。在一些情況中，短暫誘導(dǎo)可受到提供試劑如Rb和/或ARF相關(guān)試劑的控制以使細(xì)胞回復(fù)為有絲分裂后狀態(tài)。所述RB和/或ARF 相關(guān)試劑的示例包括RB或ARF多肽或編碼這些多肽或其活性結(jié)構(gòu)域的cDNA。
這些分裂的后代均為具體譜系的細(xì)胞，即譜系限制細(xì)胞(LRC)，所述譜系為開始時(shí)接觸PMD的譜系。雖然抑制口袋蛋白和ARF的試劑是活化的即處于誘導(dǎo)期，但培養(yǎng)物的LRC 可為定向?yàn)镻MD細(xì)胞譜系的有絲分裂祖細(xì)胞(MPC)。一旦抑制口袋蛋白和ARF的試劑不再活化即處于誘導(dǎo)期完成后，培養(yǎng)物的LRC可為定向?yàn)镻MD細(xì)胞譜系的有絲分裂后成熟細(xì)胞 (PMI)。例如，在有絲分裂后分化的細(xì)胞是肌細(xì)胞的實(shí)施方式中，誘導(dǎo)期中的后代LRC可為成肌細(xì)胞(可根據(jù)更多有絲分裂標(biāo)記之一以及一種或多種成肌細(xì)胞標(biāo)記如myf5和pax7的表達(dá)鑒定)且誘導(dǎo)期后的后代LRC可為肌肉前體(可根據(jù)其缺失有絲分裂標(biāo)記的表達(dá)以及包括肌細(xì)胞生成素在內(nèi)的更多標(biāo)記之一的表達(dá)來鑒定)。
在PMD體內(nèi)即原位被誘導(dǎo)變?yōu)镽CC并分裂的實(shí)施方式中，后代可自發(fā)分化為所述譜系的PMD或可對(duì)其提供促進(jìn)分化為所述譜系的PMD的試劑。同樣，在PMD離體被誘導(dǎo)為 RCC并分裂的實(shí)施方式中，后代可自發(fā)分化為所述譜系的PMD，或其可轉(zhuǎn)移到促進(jìn)分化為成熟有絲分裂后分化的細(xì)胞群的條件，其最終變?yōu)樵摷?xì)胞。在某些實(shí)施方式中，離體誘導(dǎo)分化的細(xì)胞向促進(jìn)分化的條件中的轉(zhuǎn)移受到移植后代到對(duì)象組織中的影響。細(xì)胞可由本領(lǐng)域中許多標(biāo)準(zhǔn)方法中的任何一種來移植用于遞送細(xì)胞到組織，如，將其作為合適緩沖液中(鹽水、PBS、DMEM、伊可夫氏培養(yǎng)基等)的懸液注射，將其在固體支持物如珠子、濾器如篩網(wǎng)過濾器、膜等上提供。在某些實(shí)施方式中，如本領(lǐng)域已知，所述轉(zhuǎn)移受到將培養(yǎng)基改變?yōu)榇龠M(jìn)所述譜系細(xì)胞分化的培養(yǎng)基的影響。例如，在有絲分裂后分化的細(xì)胞是肌細(xì)胞的實(shí)施方式中，產(chǎn)生的LRC可在補(bǔ)充有低水平血清如2% HS、I % Pen-Strep的DMEM LG培養(yǎng)基中誘導(dǎo)分化。
體外應(yīng)用
發(fā)現(xiàn)所述方法產(chǎn)生的LRC在體外和體內(nèi)都有許多應(yīng)用。例如，衍生自患病個(gè)體的 PMD具有所需的細(xì)胞特異特性和疾病相關(guān)的異常調(diào)節(jié)程序。通過所述方法產(chǎn)生自這些PMD 的LRC還顯示疾病表型。因此，增殖的LRC可作為鑒定已經(jīng)偏離的調(diào)控機(jī)制的材料。此外，這些細(xì)胞可根據(jù)其改善疾病表型的能力作為篩選治療劑的材料。因此，離體產(chǎn)生的LRC可用于研究導(dǎo)致所述疾病表型的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)或潛在機(jī)制。同樣，來自所述疾病的LRC可根據(jù)其在改善疾病狀態(tài)中已偏離的調(diào)控步驟中的功效和/或毒性用于篩選候選治療劑。
在篩選生物活性劑的試驗(yàn)中，LRC通過上述方法從來自個(gè)體的PMD產(chǎn)生并可分化， 所述個(gè)體如有疾病癥狀的個(gè)體，如活的個(gè)體或尸體。然后分化的細(xì)胞接觸感興趣的候選劑并通過監(jiān)控一種或多種輸出參數(shù)評(píng)估所述候選劑的效果。這些輸出參數(shù)可反映凋亡細(xì)胞狀態(tài)，如DNA片段量、細(xì)胞起泡量、膜聯(lián)蛋白(Annexin) V染色等上述方法觀察到的細(xì)胞表面磷脂酰絲氨酸的量?；蛘呋虼送?，輸出參數(shù)可反映所述培養(yǎng)物活力，如培養(yǎng)中的細(xì)胞數(shù)量、培養(yǎng)的增殖率?；蛘呋虼送?，輸出參數(shù)可反映所述培養(yǎng)物中的細(xì)胞健康，如細(xì)胞在培養(yǎng)物中存活的時(shí)間長(zhǎng)度、培養(yǎng)物中有無泛素相關(guān)puncat等?；蛘呋虼送?，輸出參數(shù)可反映所述培養(yǎng)物中的細(xì)胞功能，如細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子和趨化因子、細(xì)胞趨化速率、所述細(xì)胞的細(xì)胞毒性等。所述參數(shù)為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知。
參數(shù)是理想地高通量系統(tǒng)中細(xì)胞的可定量組分，尤其是可精確測(cè)量的組分。參數(shù)可為任何細(xì)胞組分或細(xì)胞產(chǎn)物，包括細(xì)胞表面決定簇、受體、蛋白或者其構(gòu)象或翻譯后修飾、脂質(zhì)、碳水化合物、有機(jī)或無機(jī)分子、核酸如mRNA、DNA等、或衍生自所述細(xì)胞組分的部分或其組合的蛋白。雖然大多數(shù)參數(shù)會(huì)提供定量讀數(shù)，在一些情況中可接受半定量或定性結(jié)果。讀數(shù)可包括單一確定值，或可包括均值、中值或變化等。各參數(shù)會(huì)從大量相同試驗(yàn)中獲得特征性參數(shù)讀數(shù)值范圍。預(yù)期會(huì)有差異且通過標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)方法和用于提供單一值的常見統(tǒng)計(jì)方法獲得各組測(cè)試參數(shù)的數(shù)值范圍。
用于生產(chǎn)LRC的PMD包括來自含有絲分裂后細(xì)胞的任何組織如肌肉、神經(jīng)系統(tǒng)、胰腺、肝臟等的任何有絲分裂后細(xì)胞，如上述來自患心臟病個(gè)體的心肌細(xì)胞，來自患阿爾茨海默病、帕金森病、ALS等個(gè)體的神經(jīng)元。
用于篩選的感興趣候選試劑包括含許多化學(xué)種類的已知或未知的化合物，主要是有機(jī)分子，其可包括有機(jī)金屬分子、無機(jī)分子、遺傳序列等。本發(fā)明的一個(gè)重要方面是評(píng)估候選藥物，包括毒性測(cè)試等。
候選物質(zhì)包括含發(fā)生結(jié)構(gòu)相互作用，特別是氫鍵必須的官能團(tuán)的有機(jī)分子，且通常至少包括胺、羰基、羥基或羧基，常含有至少兩個(gè)化學(xué)官能團(tuán)。候選物質(zhì)常包含環(huán)狀碳或雜環(huán)結(jié)構(gòu)，和/或用一個(gè)或多個(gè)上述官能團(tuán)取代的芳香或多芳香結(jié)構(gòu)。候選物質(zhì)也可以是生物分子，包括肽、多核苷酸、糖、脂肪酸、類固醇、嘌呤、嘧啶，其衍生物、結(jié)構(gòu)類似物或組合。包括藥學(xué)上的活性藥物、遺傳活性分子等。感興趣的化合物包括化療劑、 激素或激素拮抗劑等。適于本發(fā)明的藥劑示例為"The Pharmacological Basis of Therapeutics "(《治療的藥理學(xué)基礎(chǔ)》)(Goodman和Gilman(1996)麥格勞希爾公司 (McGraw-Hill)紐約州紐約，第9版)所述的那些。還包括毒素和生物化學(xué)戰(zhàn)劑，例如參見 Somani, S. M.(編),"Chemical Warfare Agents,"(《化學(xué)戰(zhàn)劑》)學(xué)術(shù)出版社，紐約， 1992。
可從各種來源包括合成或天然化合物文庫獲得化合物，包括候選試劑。例如，可用許多方法隨機(jī)和定向合成包括生物分子在內(nèi)的各種有機(jī)化合物，所述方法包括表達(dá)隨機(jī)寡核苷酸和寡肽?；蛘?，采用細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物提取物形式的天然化合物文庫可獲得或可容易地產(chǎn)生。此外,天然或合成產(chǎn)生的文庫和化合物容易通過常規(guī)化學(xué)、物理和生化方法CN 102933702 A書明說18/34 頁修飾，且可用于生產(chǎn)組合文庫。已知的藥劑可進(jìn)行定向或隨機(jī)的化學(xué)修飾如酰化、烷化、酯化、胺化等產(chǎn)生結(jié)構(gòu)類似物。
通過將試劑加入至少一種且通常多種細(xì)胞樣品中，根據(jù)生物活性篩選候選劑，通常與缺乏該試劑的細(xì)胞聯(lián)合。測(cè)量響應(yīng)所述試劑的參數(shù)變化，通過對(duì)比例如有或沒有所述試劑時(shí)、與其他試劑一起獲得時(shí)的參考培養(yǎng)物來評(píng)估結(jié)果。
所述試劑可在溶液中或以易溶解形式方便地添加到培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)基中。所述試劑可作為間歇或連續(xù)的流加入流通式系統(tǒng)中，或者將一團(tuán)化合物單一或逐步加入靜態(tài)溶液中。在流通式系統(tǒng)中，使用兩種流體，其中一種是生理中性溶液，另一種是加入測(cè)試化合物的相同溶液。第一種流體通過細(xì)胞，然后是第二種。在單一溶液方法中，將一團(tuán)測(cè)試化合物加入細(xì)胞周圍的培養(yǎng)基體積中。加入所述團(tuán)塊或流通式方法中的兩種溶液之間的培養(yǎng)基組分的總濃度不應(yīng)發(fā)生顯著變化。
用不同的試劑濃度平行進(jìn)行多種試驗(yàn)，以獲得對(duì)不同濃度的差異反應(yīng)。如本領(lǐng)域所知，確定試劑的有效濃度通常使用的濃度范圍來自I : 10或其它對(duì)數(shù)級(jí)別的稀釋液。如需要，所述濃度還可用第二稀釋系列精制。通常，這些濃度之一用作陰性對(duì)照，即零濃度或低于試劑檢測(cè)水平或者處于或低于不產(chǎn)生表型上可檢測(cè)變化的試劑濃度。在一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞還可接觸抑制DSBR的試劑，進(jìn)一步使所述細(xì)胞對(duì)增加的DSB數(shù)量的凋亡效應(yīng)敏感。
可采用各種方法定量所選參數(shù)。例如，可使用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶dUTP切口末端標(biāo)記(TUNEL)測(cè)量DNA片段化?？墒褂昧魇郊?xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)合細(xì)胞表面上磷脂酰絲氨酸的膜聯(lián)蛋白(Annexin)V?？墒褂肂rdU標(biāo)記檢測(cè)增殖率?？墒褂肳estern印跡測(cè)試分泌到培養(yǎng)基中的細(xì)胞因子和趨化因子。遷移試驗(yàn)如博伊登(Boyden)室可用于分析趨化能力?？贵w依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)試驗(yàn)可用于分析細(xì)胞的細(xì)胞毒性。所述方法為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知。
作為另一示例，用所述對(duì)象方法離體產(chǎn)生的LRC可用于研究例如闡明疾病的細(xì)胞機(jī)制。例如，離體產(chǎn)生的LRC可表征為確定疾病狀態(tài)的潛在機(jī)制和已經(jīng)偏離的調(diào)控途徑。作為另一示例，離體產(chǎn)生的LRC的基因組DNA和/或RNA可收獲并概括以更好理解哪些啟動(dòng)子活性更高和哪些基因在哪些細(xì)胞譜系和發(fā)育的哪些階段能更加高度轉(zhuǎn)錄。
用所述對(duì)象方法離體產(chǎn)生的LRC還可用于鑒定藥物新靶標(biāo)從而發(fā)現(xiàn)藥物?？筛鶕?jù)調(diào)控具體信號(hào)途徑來篩選試劑以更好的理解這些信號(hào)途徑在具體譜系的細(xì)胞分化中的作用。所述試劑可構(gòu)成改善疾病狀態(tài)的新療法。
此外，所述對(duì)象方法產(chǎn)生的LRC可用于根據(jù)其毒性篩選化合物。例如，LRC可用所述對(duì)象方法從肝細(xì)胞制備，且這些LRC通過所述對(duì)象方法分化為肝細(xì)胞。然后，新分化的 LRC可用于根據(jù)毒性篩選藥物?？稍谒龊Y選中試驗(yàn)的指示細(xì)胞功能的參數(shù)示例包括如本領(lǐng)域熟知的細(xì)胞色素P450組的成員或“CYP”。
體內(nèi)應(yīng)用
作為另一示例，LRC可能有助于從中獲得起始PMD的組織，因此離體或體內(nèi)產(chǎn)生的 LRC可用于重建或補(bǔ)充受體中的分化或已分化的細(xì)胞即用于組織再生。例如，在有絲分裂后分化細(xì)胞為肌細(xì)胞的上述方法的實(shí)施方式中，移植上述離體方法生成的譜系限制細(xì)胞到肌肉中或通過上述體內(nèi)方法在肌肉中原位產(chǎn)生譜系限制細(xì)胞會(huì)引起患者中新肌肉細(xì)胞的分21化。本文所用的肌肉再生指新肌肉纖維從肌肉祖細(xì)胞或肌肉前體細(xì)胞形成的過程。治療組合物通常會(huì)使新纖維數(shù)量增加至少I %、更優(yōu)選至少20 %、且最優(yōu)選至少50 %。肌肉生長(zhǎng)可通過增加纖維尺寸和/或增加纖維數(shù)量而發(fā)生?？赏ㄟ^濕重的增加、蛋白含量的增加、肌纖維量的增加、肌纖維直徑的增加等來測(cè)量肌肉生長(zhǎng)。肌纖維生長(zhǎng)增加可定義為直徑的增加， 其中所述直徑定義為截面的橢圓短軸。
肌肉再生還可用肌肉的有絲分裂指數(shù)監(jiān)控。例如，細(xì)胞可與標(biāo)記劑接觸，時(shí)間等于兩倍加倍時(shí)間。有絲分裂指數(shù)是培養(yǎng)物中的細(xì)胞分?jǐn)?shù)，其在存在示蹤劑條件下生長(zhǎng)時(shí)具有標(biāo)記的核，所述示蹤劑僅在S期(即BrdU)納入且加倍時(shí)間定義為培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)量增加2 倍所需的平均S時(shí)間。生產(chǎn)性肌肉再生還可通過肌肉強(qiáng)度和靈活性的增加監(jiān)控。
肌肉再生還可通過定量肌生成即成肌細(xì)胞融合產(chǎn)生肌管來測(cè)量。對(duì)肌生成的效應(yīng)導(dǎo)致成肌細(xì)胞融合增加并啟動(dòng)肌肉分化程序。例如，肌生成可用多核細(xì)胞中存在的核組分相比存在的核總數(shù)來測(cè)量。肌生成還可通過分析肌管中每區(qū)域的核數(shù)量或通過Western分析檢測(cè)肌肉特異蛋白水平來測(cè)定。
肌纖維的存活可指阻止由壞死或凋亡表明的肌纖維損失或阻止肌纖維損失的其他機(jī)制。損傷、萎縮等可造成肌肉損失，其中肌肉的萎縮指肌纖維周長(zhǎng)的明顯損失。
通過對(duì)象方法使用譜系限制細(xì)胞的組織再生治療可用于治療患廣泛疾病或失調(diào)的對(duì)象。例如，有絲分裂后分化的細(xì)胞為肌細(xì)胞時(shí)，患肌肉失調(diào)如急性心臟缺血、手術(shù)(如腫瘤切除)引起的損傷或物理創(chuàng)傷(切斷手術(shù)/槍傷)，或退行性心臟病如缺血性心肌病， 傳導(dǎo)疾病和先天性缺陷等的對(duì)象尤其可從用所述對(duì)象方法的譜系限制細(xì)胞的再生組織治療中獲益。
可用所述對(duì)象細(xì)胞治療的肌肉失調(diào)的具體示例包括心肌失調(diào)。所述失調(diào)包括但不限于，心肌梗塞(部分心臟的供血中斷，造成心臟細(xì)胞死亡)；心臟驟停(心臟不能有效收縮)；心力衰竭(心臟逐步無法提供足夠的血流量以滿足身體的需要，常常但不總是由于心肌梗塞或心臟驟停)；心肌缺血再灌注損傷(缺血性病癥后用血液再灌注組織引起的組織損傷)；心肌癥(如缺血、藥物或酒精中毒、某些感染(包括丙型肝炎)、以及各種遺傳或特發(fā)(即未知)的原因引起的肌無力)；手術(shù)造成的損傷，和退行性心臟疾病如傳導(dǎo)疾病和先天缺陷。
可用所述對(duì)象細(xì)胞尤其是同種異體細(xì)胞和/或遺傳修飾的自體細(xì)胞治療的肌肉失調(diào)的其他示例包括肌營(yíng)養(yǎng)不良如杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良和貝克肌營(yíng)養(yǎng)不良。杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良是 X連接的陰性失調(diào)，特征是逐步的近端肌無力和肌纖維的破壞和再生以及被結(jié)締組織替代。 杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良由Xp21基因座的突變引起，導(dǎo)致缺失肌肉細(xì)胞膜內(nèi)發(fā)現(xiàn)的蛋白-抗肌萎縮蛋白。3000活男嬰中有I例。癥狀通常在男孩3-7歲開始。穩(wěn)定進(jìn)展，肢體彎曲攣縮并發(fā)生脊柱側(cè)凸。發(fā)生堅(jiān)硬的假性肥大(脂肪和纖維替代某些腫大的肌肉團(tuán)，尤其是小腿)。多數(shù)患者10或12歲即被限制在輪椅上并在20歲死于呼吸道并發(fā)癥。貝克肌營(yíng)養(yǎng)不良是較不嚴(yán)重的變體，也由Xp21基因座的突變引起?？辜∥s蛋白的數(shù)量或分子量降低?；颊咄ǔＨ圆叫?，且多數(shù)能活到30和40歲。
可用所述對(duì)象細(xì)胞尤其是同種異體細(xì)胞和/或遺傳修飾的自體細(xì)胞治療的肌肉失調(diào)的其他具體示例包括非營(yíng)養(yǎng)不良肌病如先天和代謝肌病，包括糖原貯積癥和線粒體肌病。先天性肌病是引起幼年張力減退或童年晚期虛弱和動(dòng)作發(fā)展指標(biāo)延遲的異類組的失22調(diào)。纖維狀肌病的常染色體顯性形式與染色體I (原肌球蛋白基因)相連，且隱性形式與染色體2相連。染色體19q上的蘭尼堿(ryanodine)受體(肌漿網(wǎng)的鈣釋放通道)基因中的突變引起其他形式。常見骨骼異常和畸形(dysmorphic)特征。通過肌肉樣品的組織化學(xué)和電子顯微鏡檢查進(jìn)行診斷以鑒定特定形態(tài)變化。
線粒體肌病從輕度、緩慢進(jìn)展的眼外肌無力到嚴(yán)重、致命的嬰兒肌病和多系統(tǒng)腦肌病。已鑒定一些癥狀，它們中有一些重疊。影響肌肉的已確定癥狀包括漸進(jìn)性眼外肌麻痹、卡恩斯-塞爾綜合癥(眼肌麻痹、色素性視網(wǎng)膜病變、心臟傳導(dǎo)缺陷、小腦共濟(jì)失調(diào)、和感音神經(jīng)性耳聾)、MELAS綜合征(線粒體腦肌病、乳酸性酸中毒和卒中樣發(fā)作)、MERFF綜合征(肌陣攣性癲癇和破碎紅纖維)、肢帶型分布無力，和嬰兒肌病(良性或嚴(yán)重和致命的)。用改良的網(wǎng)狀纖維(Gomori)三色染色法染色肌肉活檢樣品顯示由于線粒體過度積累造成的破碎紅纖維。可檢測(cè)底物轉(zhuǎn)運(yùn)和利用、克雷布斯循環(huán)、氧化磷酸化、或呼吸鏈中的生化缺陷。已描述以母體、非孟德爾遺傳模式轉(zhuǎn)送的大量線粒體DNA點(diǎn)突變和缺失。核編碼的線粒體酶中發(fā)生突變。
肌肉的糖原貯積癥是罕見的常染色體陰性疾病組，特征為糖代謝中的特定生化缺失導(dǎo)致的骨骼肌中糖原異常積累。這些疾病可為輕度或嚴(yán)重的。在嚴(yán)重形式中，缺少1， 4-葡糖苷酶的酸性麥芽糖酶缺乏癥(龐培氏病)在生命的第一年就很明顯且2歲致死。糖原積累在心臟、肝臟、肌肉和神經(jīng)中。在較不嚴(yán)重的形式中，所述缺陷可產(chǎn)生近肢側(cè)無力和橫隔膜病變導(dǎo)致成人肺換氣不足。肌動(dòng)電流圖中常見脊旁肌中的肌強(qiáng)直放電，但肌強(qiáng)直臨床不發(fā)生。其他酶缺失引起運(yùn)動(dòng)后腹痛，然后是肌紅蛋白尿。沒有適當(dāng)血清乳酸水平上升的缺血運(yùn)動(dòng)測(cè)試支持所述診斷，并通過證明特異酶異常而證實(shí)。
通道病是膜傳導(dǎo)系統(tǒng)破壞引起的功能性異常的神經(jīng)肌肉失調(diào)，由影響離子通道的突變?cè)斐?。肌?qiáng)直失調(diào)的特征是肌膜異常引起的主動(dòng)肌肉收縮后的異常緩慢放松。
強(qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良(斯太內(nèi)爾病)是常染色體顯性多系統(tǒng)失調(diào)，特征為營(yíng)養(yǎng)不良型肌無力和肌強(qiáng)直。所述分子缺陷是染色體19q上肌張力蛋白激酶基因的3'未翻譯區(qū)域中延伸的三核苷酸(CTG)重復(fù)。癥狀可在任何年齡發(fā)生，且臨床嚴(yán)重性范圍較廣。肌強(qiáng)直是在手部肌肉上顯著，且甚至輕度情況中仍常見下垂癥。在嚴(yán)重的情況中，發(fā)生顯著的外周肌無力，常伴有白內(nèi)障、早禿、短柄臉、心律失常、睪丸萎縮和內(nèi)分泌異常。常見智力低下。嚴(yán)重受影響的人在50多歲早期死亡。
肌強(qiáng)直充血(托馬森病)是嬰兒常發(fā)的罕見常染色體顯性肌強(qiáng)直。在嚴(yán)重的家族中，所述失調(diào)與染色體7上含骨骼肌氯通道基因的區(qū)域有關(guān)。無痛肌肉硬變?cè)谑?、腿、和眼瞼中最麻煩，并通過運(yùn)動(dòng)改善。無力通常最小。肌肉可變得肥大。診斷通常由特征性體態(tài)、 不能快速放開握手、和直接肌肉打擊后持續(xù)的肌肉收縮而確定。
家族周期性癱瘓是罕見的常染色體顯性失調(diào)組，特征是松弛性癱瘓發(fā)作和失去深腱反射以及肌肉不能響應(yīng)電刺激。低血鉀性形式是由于染色體Iq上的二氫吡啶受體相關(guān)鈣通道基因中的遺傳突變。高血鉀形式是由于染色體17q上編碼骨骼肌鈉通道(SCN4A)亞基的基因突變。患有肌肉失調(diào)例如急性心肌缺血、退行性心臟疾病如缺血性心肌病、傳導(dǎo)疾病、和先天性缺陷、或由于手術(shù)的損傷等的對(duì)象尤其可受益于組織再生療法。
所述肌肉組織的疾病以外的疾病可用組織再生療法相似治療，所述療法使用所述對(duì)象方法產(chǎn)生的譜系限制細(xì)胞。例如，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)或外周神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)可用所述療法治療。例如，對(duì)于帕金森病的治療，多巴胺能神經(jīng)元可被短暫誘導(dǎo)分裂，產(chǎn)生神經(jīng)元祖細(xì)胞(即神經(jīng)元譜系的有絲分裂細(xì)胞)或神經(jīng)元前體(神經(jīng)元譜系的有絲分裂后細(xì)胞，即退出有絲分裂)，其可轉(zhuǎn)移到帕金森病患者的黑質(zhì)中?；蛘撸錾窠?jīng)元祖細(xì)胞或神經(jīng)元前體可被離體誘導(dǎo)分化為多巴胺能神經(jīng)元，然后轉(zhuǎn)移到帕金森病患者的黑質(zhì)或紋狀體中?；蛘撸两鹕』颊叩暮谫|(zhì)中的多巴胺能神經(jīng)元可被原位誘導(dǎo)短暫分裂。有絲分裂后分化的神經(jīng)元、神經(jīng)元祖細(xì)胞和前體細(xì)胞、以及如何培養(yǎng)這些細(xì)胞的描述在本領(lǐng)域已有描述。可受益于所述對(duì)象方法的其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病和失調(diào)包括阿爾茨海默氏病、ALS、肌萎縮側(cè)索硬化癥、脊髓神經(jīng)元失調(diào)、外周神經(jīng)元失調(diào)、和其他損傷或疾病引起的失調(diào)。
對(duì)于治療多發(fā)性硬化、脊髓損傷、或其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)失調(diào)(其中治療所述失調(diào)需要髓鞘生成增加)，少突細(xì)胞可被短暫誘導(dǎo)分裂，產(chǎn)生少突細(xì)胞祖細(xì)胞(MPC)或少突細(xì)胞前體(PMI)，然后其被轉(zhuǎn)移到患CNS脫髓鞘病癥如多發(fā)硬化癥等或其他需要增加髓鞘生成的病癥如脊髓損傷等的對(duì)象中需要增加髓鞘生成的位置?；蛘?，少突細(xì)胞祖細(xì)胞或少突細(xì)胞前體可離體誘導(dǎo)分化為少突細(xì)胞，然后轉(zhuǎn)移到患MS、脊髓損傷等的對(duì)象中需要增加髓鞘生成的位置?；蛘?，患MS、脊髓損傷等的對(duì)象的少突細(xì)胞可在需要增加髓鞘生成的位置原位誘導(dǎo)短暫分裂。有絲分裂后分化的少突細(xì)胞、少突細(xì)胞祖細(xì)胞和少突細(xì)胞前體、以及如何培養(yǎng)這些細(xì)胞的描述參見Dugas，J.等(2006) JNeuroscL 26 :10967-10983和美國(guó)專利第 20090258423號(hào)，其內(nèi)容通過引用納入本文。
在其他示例中，衍生自有絲分裂后分化的胰島細(xì)胞的胰島細(xì)胞祖細(xì)胞(MPC)或前體細(xì)胞(PMI)可移植到患糖尿病(例如I型糖尿病)的對(duì)象中，參見例如Burns等，(2006) Curr. Stem Cell Res. Ther.，2 :255_266。有絲分裂后分化的胰腺細(xì)胞即島細(xì)胞、所述譜系的祖細(xì)胞和前體細(xì)胞、以及如何培養(yǎng)這些細(xì)胞的描述參見美國(guó)專利第6，326，201號(hào)，其內(nèi)容通過引用納入本文。
將衍生自有絲分裂后分化的肝細(xì)胞的肝臟祖細(xì)胞或有絲分裂后分化的肝細(xì)胞移植到患肝臟疾病如肝炎、硬化或肝衰竭的對(duì)象中。
在一些情況中，例如，病情產(chǎn)生自組織特異細(xì)胞功能的遺傳缺陷時(shí)，需要用從異源組織即不同宿主組織的有絲分裂后分化細(xì)胞產(chǎn)生的譜系限制細(xì)胞來再生組織。功能障礙產(chǎn)生自病癥如外傷時(shí)，對(duì)象細(xì)胞可從自體同源組織中分離，且用于再生功能。自體同源細(xì)胞也可遺傳修飾，從而校正遺傳缺陷引起的病情?；蛘撸δ苷系K產(chǎn)生自病癥如外傷時(shí)，有絲分裂后分化細(xì)胞可原位短暫誘導(dǎo)分裂，產(chǎn)生會(huì)分化并納入受傷組織的譜系限制細(xì)胞。
如上所述，基因可引入離體生產(chǎn)的對(duì)象譜系限制細(xì)胞以用于各種目的，如替代已喪失功能突變的基因、提供標(biāo)記基因等?；蛘?，可引入表達(dá)反義mRNA或核酶的載體，從而阻斷不需要的基因表達(dá)。基因治療的其他方法為引入藥物抗性基因以使正常祖細(xì)胞具有優(yōu)勢(shì)并經(jīng)受選擇壓力，例如多種藥物抗性基因(MDR)或抗凋亡基因如bcl-2。本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)可用于將核酸引入譜系限制細(xì)胞，例如上述的電穿孔、鈣沉淀DNA、融合、轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、感染等。DNA引入的具體方法對(duì)實(shí)施本發(fā)明不重要。
為了證明具有遺傳修飾的對(duì)象譜系限制細(xì)胞，可使用各種技術(shù)。細(xì)胞的基因組可為限制的并可在有或沒有擴(kuò)增的情況下使用?？墒褂镁酆厦告?zhǔn)椒磻?yīng)；凝膠電泳；限制性分析；Southern、Northern和Western印跡；測(cè)序等。細(xì)胞可在各種條件下生長(zhǎng)以確保細(xì)胞能成熟變?yōu)樗泄撬枳V系，同時(shí)保留表達(dá)所引入DNA的能力?？墒褂酶鞣N體外和體內(nèi)測(cè)試以確保保留細(xì)胞分化為具體譜系細(xì)胞的能力。
所述譜系限制細(xì)胞可用作治療疾病(如遺傳缺陷)的療法。所述療法可針對(duì)治療所述疾病的原因；或者，所述療法可治療所述疾病或癥狀的影響。上述方法離體產(chǎn)生的譜系限制細(xì)胞可轉(zhuǎn)至或接近對(duì)象的損傷位置，即局部遞送/給予；或所述細(xì)胞可以細(xì)胞遷移或駐留在損傷位置的方式引入所述對(duì)象。轉(zhuǎn)移的細(xì)胞宜替代受損或受傷細(xì)胞并使對(duì)象的總體病癥改善。在一些情況中，轉(zhuǎn)移的細(xì)胞可刺激組織再生或修復(fù)。
所述譜系限制細(xì)胞可在任何生理上可接受的賦形劑中給予，其中所述細(xì)胞可找到合適的位置再生并分化。所述細(xì)胞可通過注射、導(dǎo)管等導(dǎo)入。所述細(xì)胞可在液氮溫度中冷凍并長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存，解凍后即能使用。若冷凍，所述細(xì)胞通常儲(chǔ)存于10% DMS0,50% FCS,40% RPMI 1640培養(yǎng)基中。一旦解凍，所述細(xì)胞可用有關(guān)祖細(xì)胞增殖和分化的細(xì)胞因子和/或飼養(yǎng)細(xì)胞擴(kuò)增。
本發(fā)明的細(xì)胞可以藥物組合物的形式提供，包含充分滅菌條件下制備的等滲賦形劑用于人給藥。細(xì)胞賦形劑和所述組合物的任何伴隨元件的選擇可根據(jù)用于給藥的途徑和設(shè)備而調(diào)整。所述組合物還可包括或伴有一種或多種有利于細(xì)胞的植入或功能動(dòng)員的其他成分。合適的成分包括支持或促進(jìn)細(xì)胞粘附的基質(zhì)蛋白。
所述對(duì)象方法用于預(yù)防和治療目的。因此，如本文所用，術(shù)語“治療”用于指預(yù)防疾病和治療已有的病癥。穩(wěn)定或改善患者臨床癥狀的的持續(xù)疾病的治療是本發(fā)明提供的尤其重要的益處。所述治療需要在受影響組織失去功能前進(jìn)行；因此，本發(fā)明提供的預(yù)防性治療益處也很重要。治療效果的證據(jù)是嚴(yán)重疾病的任何減弱。治療效果可以臨床結(jié)果的方式測(cè)量或可通過免疫學(xué)或生化測(cè)試確定。
治療制劑的劑量廣泛不同，這取決于病癥特性、給藥頻率、給藥方法、宿主的試劑清除等。起始劑量可較大，然后是較小的維持劑量。劑量可以不很頻繁給予如每周或每?jī)芍?，或更通常分為較小劑量并每天、半周給予或按照維持有效劑量水平所需。
給予對(duì)象的治療數(shù)量可不同。將譜系限制細(xì)胞引入所述對(duì)象可為一次事件；但在某些情況中，所述治療可在有限的時(shí)間引起改善并需要持續(xù)的一系列重復(fù)治療。在其他情況中，獲得效果前可能需要多次給予細(xì)胞。精確的方案取決于疾病或病癥、疾病的階段和治療個(gè)體對(duì)象的參數(shù)，且可容易的由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員確定。
本發(fā)明還提供藥物包裝或藥盒，其包括一個(gè)或多個(gè)裝有一種或多種本發(fā)明組合物的成分的容器，所述成分如短暫抑制口袋蛋白家族成員活性的試劑和短暫抑制ARF活性的試劑。所述容器附有關(guān)于藥品或生物制品的生產(chǎn)、使用或銷售的政府機(jī)構(gòu)頒發(fā)的告知書，該告知書反映出生產(chǎn)、使用或銷售管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)其用于人體。
提供以下實(shí)施例的目的是向本領(lǐng)域普通技術(shù)人員完整地公開和描述如何制備和使用本發(fā)明，這些實(shí)施例不應(yīng)限制發(fā)明人認(rèn)為的發(fā)明范圍，也不用于代表下述實(shí)驗(yàn)是所進(jìn)行的所有和僅有的實(shí)驗(yàn)。努力保證所用數(shù)值(如含量、溫度等)的準(zhǔn)確性，但應(yīng)允許一些實(shí)驗(yàn)誤差和偏差。除非另有說明，份數(shù)是重量份數(shù)，分子量是重量均分子量，溫度是攝氏度，壓力是大氣壓或接近大氣壓。
本說明書引用的所有發(fā)表物和專利申請(qǐng)通過引用納入本文，就好像各發(fā)表物或?qū)＠暾?qǐng)?zhí)貏e和單獨(dú)地通過引用納入本文那樣。實(shí)施例
材料和方法
小鼠和初級(jí)成肌細(xì)胞制備。如(Viatour,P.,等(2008)Cell Stem Cell 3(4) 416-428)所述飼養(yǎng)和維護(hù)的Rosa26-CreERT2RBlox/lox小鼠與含Cre反應(yīng)性β -半乳糖苷酶受體等位基因的小鼠(Ventura, A.，等(2007)Nature 445(7128) :661_665)雜交。制備6-8周齡基因分型的后代小鼠的后腿肌肉用于收獲初級(jí)成肌細(xì)胞，如(Rando, T. A.和 Blau, H. M. (1994) The Journal of Cell Biologyl25(6) :1275_1287)所述。收獲后的初級(jí)成肌細(xì)胞在膠原(西格瑪(Sigma)公司)包被板上的補(bǔ)充有20% FBS (歐米茄科學(xué) (Omega scientific))、2· 5ng/mL bFGF (普洛麥格(Promega))和 I % Pen-Strep (吉布可公司(Gibco))的FlO培養(yǎng)基(吉布可公司)中選擇一周。
細(xì)胞培養(yǎng)。C2C12小鼠成肌細(xì)胞在10% C0237 °C下于補(bǔ)充有20% FBS+1 % Pen-Strep 的 DMEM HG(吉布可公司)中培養(yǎng)。如(Pajcini, K. V.，等(2008)The Journal of Cell Biology 180(5) :1005_1019)所述在低血清條件下于膠原包被板上補(bǔ)充有2% HS 的DMEM中接種成肌細(xì)胞用于融合。DM培養(yǎng)基每24小時(shí)更換。成肌細(xì)胞收獲并選擇后，一旦細(xì)胞在生長(zhǎng)培養(yǎng)基補(bǔ)充有15% FBSU % Pen-Strep和I. 25ng/mL bFGF的DMEM LG+F10 培養(yǎng)基上培養(yǎng)和擴(kuò)增并接種于膠原包被板上，就計(jì)數(shù)傳代數(shù)。初級(jí)成肌細(xì)胞在低血清條件下以6xl05細(xì)胞/6厘米板接種到DMEM LG,2% HS I % Pen-Str印中用于融合，和以5X IO4 細(xì)胞/6厘米板用于稀疏的單細(xì)胞分化。細(xì)胞接種數(shù)量根據(jù)來自上述6cm標(biāo)準(zhǔn)的不同接種平臺(tái)的表面積調(diào)整。
克隆和載體構(gòu)建用鈍克隆(T4 DNA pol和CIP處理)移除CMV-GFP盒后，通過NotI/EcoRO 109消化將肌細(xì)胞生成素啟動(dòng)子元件亞克隆到pLE_GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒主鏈的Xhol/Nael位置來構(gòu)建pLE-myog3R-GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，所述啟動(dòng)子元件驅(qū)動(dòng) peGFPNl-hmyg的GFP表達(dá)。正向和反向插入取向如圖5所述測(cè)試,反向(3R)取向顯示肌細(xì)胞生成素-GFP共表達(dá)有最高保真度。用FuGENE 6 (羅氏公司(Roche))將編碼人RB cDNA 的 pMIG 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(Sage, J.，等(2000) Genes&development 14(23) 3037-3050)以及使用的其他載體轉(zhuǎn)染到親嗜性phoenix細(xì)胞中。細(xì)胞用含聚凝胺的病毒上清(5 μ g ι Γ1) 感染并2，OOOg離心30分鐘。
SiRNA沉默和半定量RT-PCR (sqRT-PCR)。用設(shè)計(jì)的小干擾RNA (siRNA)雙鏈體進(jìn)行RNA干擾，然后根據(jù)靶基因的特異性和有效敲減篩選。本文中所示的實(shí)驗(yàn)使用的雙鏈體設(shè)計(jì)用于P16/19正義序列AGGUGAUGAUGAUGGGCAAUU (SEQ ID NO 11)和 P19ARF 正義序列 GCUCUGGCUUUCGUGAACAUG (SEQ ID NO : 12)或直接作為 0N_TARGETplus siRNA RBl (J-047474-06)，其來自賽默/達(dá)馬可公司(Thermo/Dharmacon)。非革巴向 siRNA#l(D-001810-01-05)和siGlo-綠購(gòu)自賽默/達(dá)馬可公司用于對(duì)照轉(zhuǎn)染。成肌細(xì)胞分化或肌管融合48-72小時(shí)后在含silmporter轉(zhuǎn)染試劑(密理博公司(Millipore))的DM中按照生產(chǎn)商說明進(jìn)行siRNA雙鏈體(重懸于siRNA緩沖液(達(dá)馬可公司))的轉(zhuǎn)染，siRNA 終濃度為100-200nM。補(bǔ)充到分化培養(yǎng)基12小時(shí)后將轉(zhuǎn)染混合物加入細(xì)胞。通過RNeasy 微型試劑盒(凱杰公司(Qiagen))從GM或DM中的C2C12或原代細(xì)胞中收獲RNA，并在用超級(jí)轉(zhuǎn)錄物(Superscript) III 一步RT-PCR(英杰公司)的半定量RT-PCR分析中使用200ng 總RNA。如下列出設(shè)計(jì)用于基因測(cè)試的引物，所有序列為5’ -3’方向
RB 組 I :正向GAGGAGAATTCTGTGGGCCAGGGCTGTG(SEQ ID NO 13)；
反向GTACGAGCTCGAGCCGCTGGGAGATGTT(SEQID NO 14)
產(chǎn)物大小1368bp。
RB 組 2 :正向CAGGCTTGAGTTTGAAGAAATTG(SEQ ID NO 15)
反向ATGCCCCAGAGTTCCTTCTTC(SEQ ID NO 16)
產(chǎn)物大小168bp。
pl6/19 :正向CGCCTTTTTCTTCTTAGCTTCA(SEQ ID NO 17)
反向AGTTTCTCATGCCATTCCTTTC(SEQ ID NO 18)
產(chǎn)物大小220bp。
pl9ARF:正向CCCACTCCAAGAGAGGGTTT(SEQ ID NO 19)
反向AGCTATGCCCGTCGGTCT(SEQ ID NO : 20)
產(chǎn)物大小465bp。
胞環(huán)蛋白正向GCGTACCAGCAACTTTACCC(SEQID NO 21)
反向GGCACCAAAGCCACTAACAT(SEQ ID NO : 22)
產(chǎn)物大小202bp。
AuroraB:正向TCGCTGTTGTTTCCCTCTCT (SEQ ID NO 23)
反向GATCTTGAGTGCCACGATGA(SEQID NO 24)
產(chǎn)物大小388bp。
生存素正向CATCGCCACCTTCAAGAACT(SEQID NO 25)
反向AGCTGCTCAATTGACTGACG(SEQ ID NO 26)
產(chǎn)物大小360bp。
MRF4:正向GGCTGGATCAGCAAGAGAAG (SEQ ID NO 27)
反向CCTGCTGGGTGAAGAATGTT(SEQID NO 28)
產(chǎn)物大小317bp。
肌細(xì)胞生成素正向TCCAGTACATTGAGCGCCTA(SEQID NO 29)
反向GGGCTGGGTGTTAGCCTTAT(SEQID NO 30)
產(chǎn)物大小470bp。
MHC :正向TGAGAAGGAAGCGCTGGTAT(SEQ ID NO 31)
反向TCTGCAATCTGTTCCGTGAG(SEQID NO 32)
產(chǎn)物大小588bp。
M-CK :正向GATCTTCAAGAAGGCTGGTCAC (SEQ ID NO 33)
反向CAATGATTGGACTTCCAGGAG(SEQID NO 34)
產(chǎn)物大小428bp。
GAPDH :正向CACTGAGCATCTCCCTCACA(SEQ ID NO 35)
反向TGGGTGCAGCGAACTTTATT(SEQID NO 36)
產(chǎn)物大小122bp。
退火溫度為58-62°C，循環(huán)數(shù)為23 (肌細(xì)胞生成素)_31 (pl9ARF)，大部分產(chǎn)物在 26-28循環(huán)可見。對(duì)于RNA加樣對(duì)照，用GAPDH引物運(yùn)行50ng總RNA，并在22循環(huán)可見。
BrdU分析。在C2C12肌管和初級(jí)成肌細(xì)胞和肌管上使用5_溴_2’ -脫氧-尿苷(BrdU)標(biāo)記和檢測(cè)試劑盒(羅氏公司)。圖I和圖2的各方案中，治療開始后將BrdU標(biāo)記試劑加入含新鮮DM培養(yǎng)基的細(xì)胞中持續(xù)12小時(shí)。標(biāo)記后固定細(xì)胞并按照生產(chǎn)商說明檢測(cè)免疫熒光，并如下所述共染色其他蛋白。
Western 分析。細(xì)胞在裂解緩沖液(50mM Tris pH 7. 5, IOmM MgC12，O. 3MNaCl， 2% IGEPAL)中室溫裂解。4°C 6000rpm離心5分鐘使裂解物澄清，并通過fcadford試驗(yàn) (伯樂(Bio-Rad))進(jìn)行蛋白定量。用英杰公司的NuPage系統(tǒng)進(jìn)行免疫印跡。樣品加樣于10% Bis-Tris預(yù)制凝膠上，在MES或MOPS SDS緩沖液中跑膠解析，并4°C轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)印 (Immobilon-P)膜上(阿莫山公司(Amersham))。膜在5%牛奶-PBS-T中封閉,然后用以下抗體孵育1/250稀釋的RB抗體(BD公司)或1/1000稀釋的RB抗體(薩革實(shí)驗(yàn)室(Sage lab)) ;1/1000的pl9ARF抗體(阿柏堪穆公司(Abcam)) ; 1/1000的生存素抗體(細(xì)胞骨架公司(Cytoskeleton Inc)) ; 1/500的AuroraB抗體(細(xì)胞骨架公司);1/500的MHC抗體 (開米康公司(Chemicon)) ;1/50的成人MHC抗體(Blau實(shí)驗(yàn)室)；1/500的M-CK抗體(諾瓦斯公司(Novus)) ；1/500的肌細(xì)胞生成素抗體(BD公司)；和稀釋1/10000的GAPDH抗體 (圣克魯茲生物技術(shù)公司(Santa Cruz biotech))作為蛋白加樣對(duì)照。然后膜與HRP偶聯(lián)的二抗(1/5000)(甾酶公司(Zymed))孵育并用ECL或ECL+檢測(cè)試劑(阿莫山公司)檢測(cè)。 需要時(shí)，膜通過在剝離緩沖液(IOOmM 2-巰基乙醇，2% SDS,62mM Tris, pH7)中50°C孵育 45分鐘然后室溫I小時(shí)剝離。
免疫熒光。室溫(RT)與BrdU或I. 5%多聚甲醛共染色15分鐘然后用O. 3%曲通-PBS室溫透化10分鐘時(shí)，按照生產(chǎn)商說明固定如上所述濃密接種用于融合或稀疏接種用于分化的C2C12肌管和初級(jí)成肌細(xì)胞或肌管并透化。所有固定的細(xì)胞用20%羊血清室溫封閉30分鐘或4°C 8小時(shí)。封閉緩沖液中1/75稀釋的肌球蛋白重鏈(MHC)的一抗(開米康公司)或1/20稀釋的成人MHC的一抗室溫孵育30分鐘。1/100稀釋的肌細(xì)胞生成素-RBt 的一抗(圣克魯茲生物技術(shù)公司)或1/250稀釋的肌細(xì)胞生成素-Ms (BD公司)的一抗室溫孵育I小時(shí)。1/500稀釋的GFP-RBt (英杰公司)的一抗室溫孵育I小時(shí)。1/250稀釋的生存素(細(xì)胞骨架公司)的一抗室溫孵育I小時(shí)。1/100稀釋的Ki67(大科公司(Dako)) 的一抗4°C孵育8小時(shí)。1/500稀釋的二抗(英杰公司)Alexa-488 Gt Ms或Gt a RBt和 Alexa-546 Gt a Ms或Gt a RBt和Alexa_546Gt a Rat與合適的一抗組合室溫孵育45分鐘。 BrdU標(biāo)記后共染色時(shí)，BrdU的二抗為1/40稀釋的FITC-a Ms并37°C孵育30分鐘。用赫斯特33258 (西格瑪)核染色的細(xì)胞1/5000稀釋并室溫孵育15分鐘。通過使用40x水浸物鏡的蔡司 Axioplan2、蔡司 Axiovert 200M、或使用 NeoFluar IOx 或 LD Plan NeoFluar20x 物鏡以及ORCA-ER C4742-95的蔡司觀察儀Zl來成像細(xì)胞；用濱松光子學(xué)公司(Hamamatsu Photonics)或 Axiocam MRm 相機(jī)獲取圖像。0penlab5. O. 2> Volocity 3·6·1(改良視覺公司(Improvision))和PALM Robo V4(蔡司公司(Zeiss))是用于獲取圖像的軟件。在 Photoshop CS(Adobe公司)中合成并編輯圖片。用對(duì)比調(diào)節(jié)和顏色平衡降低背景以增強(qiáng)顏色。所有改良都應(yīng)用于完整圖像。
FACS分選。O. 05%胰蛋白酶處理后從培養(yǎng)皿中收獲細(xì)胞，離心并在FACS緩沖液 (PBS+2% GS+2mM EDTA)中重懸，置于冰上直至分析。用FACSVantage SE(BD生物科學(xué)公司)和DIVA分析軟件分析和分選細(xì)胞。通過碘化丙錠(I μ g/ml)染色去除死細(xì)胞，并根據(jù)低壓力下的GFP表達(dá)分選細(xì)胞以保持細(xì)胞活力。進(jìn)行2次分選以獲得純度99%的活細(xì)胞。第二次分選中，細(xì)胞如所述直接在GM或DM中分選然后接種在不同平臺(tái)中(微孔或PALM雙膜培養(yǎng)皿(duplex dishes))。
PALM LPC.初級(jí)成肌細(xì)胞稀疏接種于50mm或35mm層連蛋白(羅氏公司)包被的雙膜培養(yǎng)皿(蔡司公司)中用于分化。DM轉(zhuǎn)換72-96小時(shí)后且直接天然熒光確認(rèn)GFP表達(dá)后，如圖6所示處理肌細(xì)胞。通過在細(xì)胞捕獲前至少24小時(shí)經(jīng)LPC功能透化上層PEN膜使培養(yǎng)基流入膜之間來平衡雙膜培養(yǎng)皿。按照生產(chǎn)商說明階段標(biāo)定、激光聚焦和光聚焦標(biāo)定后在配備PALM微光束(蔡司公司)的蔡司觀察儀Zl倒置顯微鏡中進(jìn)行激光切割。GFP肌細(xì)胞生成素表達(dá)用X-CITE系列120EXF0通過直接免疫熒光所選各肌細(xì)胞來驗(yàn)證。通過20x LD Plan-NeoFluar物鏡進(jìn)行切割，其產(chǎn)生3_5 μ m的激光軌跡，且通過LPC彈射面積50-150 μ m2 的膜，其破裂點(diǎn)選擇為離肌細(xì)胞至少10 μ m。從雙膜培養(yǎng)皿中移除培養(yǎng)基直到僅水膜覆蓋所述板；50_盤中，該條件可通過保留僅500 μ L培養(yǎng)基獲得。切割的膜通過LPC爆裂釋放到含 80 μ L 培養(yǎng)基的 Roboarm 單管捕獲 II 容器(SingleTube Capture II)中(500 μ L EP 管蓋)。捕獲后通過直接觀察捕獲容器確認(rèn)膜/肌細(xì)胞的捕獲。所述容器的所有體積轉(zhuǎn)移到 12或24孔膠原包被板中，其中捕獲的肌細(xì)胞在條件生長(zhǎng)培養(yǎng)基(cGM)中培養(yǎng)，其從積極分裂的成肌細(xì)胞中收獲并通過O. 2 μ m濾器過濾。
免疫細(xì)胞化學(xué)。注射10天后，切出TA肌肉并浸入PBS/0.5% EM級(jí)PFA(多利科學(xué)公司(Polysciences))中室溫持續(xù)2小時(shí)，然后4°C過夜浸入含20%蔗糖的PBS中。如 Pajcini, K. V.,等(2008) The Journal of cell biology 180(5) :1005_1019 所述進(jìn)行切片染色和圖像分析。
時(shí)間間隔顯微分析。將初級(jí)成肌細(xì)胞接種于6孔膠原包被板中用于融合。DM中 72小時(shí)后，用TAM處理初級(jí)成肌細(xì)胞。24小時(shí)后，即DM中96小時(shí)，用200nM pl6/19si處理一組初級(jí)肌管12小時(shí)，此時(shí)清洗轉(zhuǎn)染混合物并將細(xì)胞置于新鮮DM培養(yǎng)基中。12小時(shí)后， 用裝配有時(shí)間間隔設(shè)備CTI-數(shù)字控制器3700 ;數(shù)字溫控儀(TempCOntrol)37-2 ;掃描階段培養(yǎng)箱XL 100/135 (PEC0N公司)的蔡司Axiovert 200M來成像初級(jí)肌管。每10分鐘捕獲框總計(jì)50小時(shí)，包括初級(jí)肌管融合和成熟期間的第5和6天。用Volocity 3. 6. I (改良視覺公司)獲得并分析圖像。生長(zhǎng)培養(yǎng)基(GM);分化培養(yǎng)基(DM)。
結(jié)果
siRNA對(duì)RB的抑制誘導(dǎo)C2C12肌管再進(jìn)入S期。成肌細(xì)胞系C2C12是體外研究肌肉分化的模式系統(tǒng)。在低血清分化培養(yǎng)基(DM)中，匯合的C2C12成肌細(xì)胞離開細(xì)胞周期并與彼此融合形成多核肌細(xì)胞(肌管)，其表達(dá)肌肉蛋白且可收縮。我們用silmporter試劑開發(fā)了在多于60%的肌管中短暫表達(dá)siRNA分子的方案(圖9)。為了確定siRNA治療的持久性和效率，用針對(duì)RB的siRNA雙鏈體(RBsi)處理C2C12肌管(圖1A-B)。RB轉(zhuǎn)錄水平的半定量RT-PCR表明RB mRNA的短暫抑制在轉(zhuǎn)錄后至多48小時(shí)最強(qiáng)，之后RB水平開始恢復(fù)，但沒有達(dá)到96小時(shí)時(shí)用對(duì)照SiRNA(MockSi)處理的肌管中觀察到的相同表達(dá)水平。 (圖1B)。肌管中RB蛋白水平的抑制用western印跡證實(shí)?？偧?xì)胞裂解物從Mocksi或RBsi 處理的增殖成肌細(xì)胞和分化肌管中收獲。用RBsi處理引起RB蛋白的逐步損失(圖1E)到分化肌管中對(duì)照RB水平的50% (圖1F)。
為了確定RB抑制后C2C12肌管中是否發(fā)生S期再進(jìn)入，我們用BrdU標(biāo)記Mocksi 和RBsi處理的肌管，如圖IA方案所示。圖ID顯示代表圖。肌管隨著BrdU就肌球蛋白重鏈(MHC)染色以加強(qiáng)形態(tài)學(xué)鑒定并確認(rèn)分化。BrdU標(biāo)記的肌核僅在RBsi處理后的MHC+肌管中觀察到(中間和下圖)。我們?cè)赗Bsi轉(zhuǎn)染48小時(shí)后的肌管形態(tài)學(xué)中發(fā)現(xiàn)顯著變化(圖 ID下圖)。RB抑制后，肌管喪失了其壓縮伸長(zhǎng)結(jié)構(gòu)并特征性地對(duì)準(zhǔn)肌核。細(xì)胞形狀不再類似肌管且核聚集成簇，其中許多為BrdU陽性。S期再進(jìn)入取決于所用RBsi的劑量且隨著 siRNA濃度從100增加為200nM，BrdU+肌核的百分比從25%加倍為52% (圖1C)。在所有下述實(shí)驗(yàn)中，除非特別說明，使用200nM濃度的siRNA。含任何BrdU陽性核的肌管百分比在單獨(dú)實(shí)驗(yàn)組中分析，發(fā)現(xiàn)其為25% (圖10F)，這可用含Brdu陽性核的肌管通常有大簇經(jīng)歷 DNA合成的核來解釋，可能反映出培養(yǎng)的細(xì)胞組分的成功轉(zhuǎn)染(圖9A)。圖IF顯示BrdU摻入與MHC免疫染色以證實(shí)分化的代表圖。我們發(fā)現(xiàn)Rbsi轉(zhuǎn)染72小時(shí)后肌管形態(tài)上有顯著變化(圖1D，下圖)，從表征線性核排列的壓縮伸長(zhǎng)結(jié)構(gòu)到核聚集成簇的無定形結(jié)構(gòu)，其中很多為BrdU陽性。這些數(shù)據(jù)證實(shí)RB短暫抑制足以誘導(dǎo)分化的C2C12肌管核再進(jìn)入S期， 并表明此效應(yīng)的程度取決于所用RBsi的濃度。
為了初級(jí)肌管再進(jìn)入S期，RB和pl9ARF都必須受到抑制。表明單獨(dú)抑制RB足以使成熟哺乳動(dòng)物肌管再進(jìn)入細(xì)胞周期的大部分?jǐn)?shù)據(jù)已在用C2C12細(xì)胞系的實(shí)驗(yàn)中獲得。盡管對(duì)研究各種肌肉細(xì)胞分化和融合有用，C2C12細(xì)胞和其他細(xì)胞系一樣獲得了使其永生的突變。因此，我們認(rèn)為用原代細(xì)胞評(píng)估RB在維持有絲分裂后狀態(tài)上的作用至關(guān)重要。如前所述(Rando, T. A.和 Blau，H. Μ. (1994)The Journal of Cell Biology 125(6) 1275-1287)，我們收獲來自與含Cre反應(yīng)性β -半乳糖苷酶受體等位基因的小鼠雜交的 Rosa26-CreERT2RBlox/lox小鼠后腿肌肉的培養(yǎng)物中能分化的初級(jí)成肌細(xì)胞。在這些小鼠中， Cre表達(dá)和RB切割取決于三苯氧胺(TAM)誘導(dǎo)(圖10A-B)。使用低傳代的初級(jí)成肌細(xì)胞， 期間細(xì)胞形狀保持壓縮和統(tǒng)一。在初級(jí)肌管培養(yǎng)物中，用I μΜ TAM單獨(dú)處理24小時(shí)足以降低RB表達(dá)(圖10C)。RB表達(dá)的時(shí)程表明TAM處理后96小時(shí)轉(zhuǎn)錄和蛋白水平都顯著下降(圖2C和圖10D)。
我們根據(jù)圖2Α中的方案通過BrdU標(biāo)記分析喪失RB表達(dá)后初級(jí)肌管培養(yǎng)物中的S 期再進(jìn)入。與C2C12肌管相反，不論RB是被RBsi敲減(圖2Β)或被Cre表達(dá)切割(圖2D 上圖)，初級(jí)肌管中肌核的BrdU標(biāo)記都極少(圖2G)。分析了隨機(jī)選擇區(qū)域的超過1500核中MHC+肌管的BrdU標(biāo)記。顯然，圖2Β和2D的代表性圖中，BrdU+核明顯存在且可檢測(cè)， 但如合并的IF圖所示這些核不在MHC+肌管中。因此，無論何種RB抑制方法，初級(jí)肌管中 RB的損失不足以產(chǎn)生細(xì)胞周期再進(jìn)入。
響應(yīng)促有絲分裂信號(hào)的突變或高度磷酸化對(duì)RB功能的破壞導(dǎo)致E2F轉(zhuǎn)錄因子活性的積累和 ARF 的激活(DeGregori, J.，等(1997) Proceedings of theNational Academy of Sciences USA 94(14) 7245-7250 ；Lowe, S. ff.和 Sherr，C. J. (2003)Current Opinion in Genetics & Development 13(1) :77_83)。ARF進(jìn)而用于阻止不當(dāng)循環(huán)。ARF的誘導(dǎo)伴隨著凋亡的基線水平適度增長(zhǎng)，但多數(shù)肌管仍穩(wěn)健且有活力。siRNA處理的細(xì)胞中罕見凋亡，其中pl6/pl9被降低(圖13)。
相反，C2C12肌管并不響應(yīng)RB抑制而表達(dá)pl9ARF，這在永生化中通過Ink4a基因座的旁路細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的細(xì)胞系中預(yù)期發(fā)生(圖2E)。PCR證實(shí)基因組缺失ink4a基因座共有的外顯子2區(qū)域(圖2F)。為了檢測(cè)RB缺陷的初級(jí)肌管中Ink4a基因產(chǎn)物的抑制是否允許細(xì)胞周期再進(jìn)入，我們?cè)O(shè)計(jì)了靶向ink4a mRNA的共有外顯子2區(qū)域的siRNA雙鏈體(pl6/19si)，和ARF特異性外顯子1β區(qū)域用于敲減pl9ARF(pl9ARFsi)。用TAM或RBsi處理初級(jí)肌管，然后24小時(shí)后用pl6/19si、pl9ARFsi或二者轉(zhuǎn)染。肌管中RB和pl9ARF的缺失通過western分析確認(rèn)(圖2C)。如圖2A方案所述的TAM和pl6/19si處理后用BrdU 標(biāo)記時(shí)，MHC陽性肌管中肌核摻入BrdU (圖2D)。BrdU標(biāo)記的定量表明TAM和pl6/19si處理的肌管中，45. 7±7. 2%的肌核進(jìn)入S期，比僅TAM或pl6/19si分別處理的肌管中觀察到的基線值顯著增加(圖2H)。專一性敲減TAM處理細(xì)胞中pl9ARF或兩種Ink4a基因產(chǎn)物的不同siRNA組合沒有產(chǎn)生顯著不同結(jié)果(圖2H)。隨后的實(shí)驗(yàn)我們用pl6/19si (外顯子 2)，因?yàn)槠洚a(chǎn)生P19ARF的最強(qiáng)抑制。我們的數(shù)據(jù)顯示分化的初級(jí)哺乳動(dòng)物肌管中僅在RB 和pl9ARF的組合抑制后發(fā)生穩(wěn)健的S期再進(jìn)入。
RB和pl6/19缺陷型肌核中有絲分裂和細(xì)胞動(dòng)力學(xué)組分的上調(diào)。為了確定PM肌核中的S期再進(jìn)入是否表明分化的多核肌管中有絲分裂過程開始，我們分析了對(duì)照或TAM和 pl6/19si處理的初級(jí)肌管核中有絲分裂和細(xì)胞動(dòng)力學(xué)蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)。我們研究了染色體移動(dòng)復(fù)合物(CPC)的兩種重要組分AuroraB和生存素的表達(dá)形式和定位，其控制染色體和紡錘體結(jié)構(gòu)、著絲粒連接和染色體分離。我們還分析了胞質(zhì)分裂期間對(duì)分裂溝結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定重要的結(jié)構(gòu)蛋白胞環(huán)蛋白的mRNA表達(dá)。
上述胞環(huán)蛋白和各CPC組分在初級(jí)增殖單核成肌細(xì)胞中有效表達(dá)，但一旦肌管形成其mRNA和蛋白水平陡然下降(圖3A-B)。TAM處理后的分化初級(jí)多核肌管中一旦RB被切割，胞環(huán)蛋白、AuroraB和生存素mRNA水平都上升，盡管pl9ARF高水平表達(dá)(圖3A)。然而，AuroraB和生存素的蛋白水平僅在RB和pl9ARF伴隨抑制后達(dá)到與生長(zhǎng)成肌細(xì)胞相當(dāng)?shù)乃?圖3B)。為了檢驗(yàn)已進(jìn)入S期的肌核中特異性發(fā)生的CPC組分上調(diào)，用BrdU標(biāo)記成肌細(xì)胞12小時(shí)，然后固定并針對(duì)BrdU和生存素染色。生長(zhǎng)培養(yǎng)基中分裂的初級(jí)成肌細(xì)胞對(duì)BrdU和生存素都是陽性，后者顯示兩個(gè)分裂細(xì)胞之間的分裂溝(圖12箭頭所示)。分化、對(duì)照處理的肌管沒有表達(dá)生存素的肌核，但用TAM和pl6/19si處理的那些顯示出成簇的BrdU+肌核，且正是這些相同的肌核上調(diào)生存素表達(dá)(圖3C下圖)。染色結(jié)果的定量表明已再進(jìn)入S期的肌核中近80%還上調(diào)生長(zhǎng)素(圖3D)。在絕大多數(shù)BrdU+肌核中，生存素染色沒有定位在分裂溝或任何具體的核組分上，而是擴(kuò)散分布在整個(gè)核中?？傊?，我們的數(shù)據(jù)顯示RB和ARF雙重缺陷的初級(jí)多核肌管中，參與染色體分離和胞質(zhì)分裂的蛋白上調(diào)后合成DNA。
初級(jí)肌肉細(xì)胞中去分化伴隨S期再進(jìn)入。分化的肌肉細(xì)胞展示出伴隨其形態(tài)學(xué)和有絲分裂后狀態(tài)中觀察到的顯著變化的表型標(biāo)記表達(dá)的特征變化，如MHC和肌氨酸激酶 (M-CK);參見例如 Charge, S. B.和 Rudnicki, Μ. A. (2004)Physiological Reviews 84(1) 209-238。通過分析分化標(biāo)記的形態(tài)和表達(dá)，我們研究了 RB和Ink4a基因產(chǎn)物在維持分化表型表達(dá)中的作用。在保持于生長(zhǎng)培養(yǎng)基中或經(jīng)歷分化(DM)的初級(jí)成肌細(xì)胞中，在不同時(shí)間點(diǎn)分析細(xì)胞形態(tài)學(xué)和MHC的表達(dá)，所述細(xì)胞缺失或不缺失RB和抑制或不抑制pl6/19。數(shù)據(jù)顯示隨著時(shí)間，TAM處理的細(xì)胞首先經(jīng)歷成熟肌管的形成和MHC的強(qiáng)表達(dá)，然后于稍后的時(shí)間點(diǎn)上在失去RB表達(dá)且僅當(dāng)ARF也抑制后MHC的表達(dá)顯著下降(圖4A)。僅用TAM處理的細(xì)胞中，不僅形態(tài)學(xué)與對(duì)照肌管保持相似，而且MHC染色仍較強(qiáng)(圖4A)。
在初級(jí)肌管中，細(xì)胞裂解物的蛋白分析說明一些肌原性蛋白水平對(duì)單獨(dú)RB缺失適度敏感。僅TAM處理后的初級(jí)肌管中觀察到MHC和肌細(xì)胞生成素水平適度下降(圖4B)。然而，RBsi處理僅造成初級(jí)肌管中肌細(xì)胞生成素蛋白水平的稍稍下降(圖4D第3道)。RB 和P19ARF的抑制一致地引起所有測(cè)試的肌原性蛋白水平下降。例如，在肌肉細(xì)胞分化中具有特定作用的另一蛋白α微管的情況中，RB和Ρ16/19的組合抑制引起蛋白水平的顯著下降(圖4F)。這與有絲分裂蛋白AuroraB和生存素的表達(dá)上升平行發(fā)生(圖4Β)。MHC水平的定量顯示RB和P19ARF抑制后此蛋白的表達(dá)在根據(jù)同一時(shí)期DM中對(duì)照細(xì)胞的水平歸一化時(shí)顯著下降(圖4C)。這些發(fā)現(xiàn)，以及另一后分化的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑MRF4的表達(dá)水平的下降得到半定量RT-PCR分析的支持(圖15C)。
與C2C12肌管一樣，初級(jí)肌管中肌管結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)退化與BrdU+染色相關(guān)，然而， 這僅發(fā)生在RB和ρ16/19都受到抑制時(shí)。圖4D表明TAM和pl6/19si處理后初級(jí)肌管的結(jié)構(gòu)瓦解。雖然對(duì)照初級(jí)肌管保留其伸長(zhǎng)的形態(tài)和核結(jié)構(gòu)，但BrdU+的肌管破裂為由肌核聚類所突顯的無定型多核合胞體結(jié)構(gòu)。雖然不是所有的肌核在S期中，但所述肌管的結(jié)構(gòu)完整性已喪失，這可能是由于缺少肌管核蛋白結(jié)構(gòu)域的維持。TAM和Mocksi (視頻I)或TAM 和pl6/19si處理后用時(shí)間間隔顯微鏡觀察肌管。時(shí)間間隔對(duì)比顯示肌管結(jié)構(gòu)的完整形態(tài)瓦解僅發(fā)生在缺失RB以及Ink4a基因產(chǎn)物后。盡管存在廣泛的結(jié)構(gòu)差異，但RB和ink4a 缺陷的初級(jí)肌管與Mocksi處理的肌管相比沒有死亡或更快速的分離，且保留其運(yùn)動(dòng)性和膜活性，如絲狀偽足和板層形偽足突起。
有絲分裂后分化的肌細(xì)胞能在RB和pl6/19抑制后增殖。肌肉分化的程度可基于肌肉調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的連續(xù)表達(dá)來鑒定。MyoD和Myf5為周期中成肌細(xì)胞的早期特征，而晚期轉(zhuǎn)錄因子包括肌細(xì)胞生成素和MRF4，其在有絲分裂后分化的肌細(xì)胞和肌管中表達(dá)?；诖宿D(zhuǎn)錄因子時(shí)程，我們?cè)噲D開發(fā)可在衍生自個(gè)體分化肌細(xì)胞的預(yù)期分離的群體中用于研究周期和去分化的系統(tǒng)。我們用逆轉(zhuǎn)錄表達(dá)載體感染低傳代RosaZe-CreEI^RB11^1 初級(jí)成肌細(xì)胞，所述載體中GFP在肌細(xì)胞生成素啟動(dòng)子的控制下表達(dá)(pLE-my0g3R-GFP)。為了檢驗(yàn)肌細(xì)胞生成素和GFP共表達(dá)的保真度，pLE-myog3R-GFP成肌細(xì)胞稀疏接種于生長(zhǎng)培養(yǎng)基或分化培養(yǎng)基中72小時(shí)并染色肌細(xì)胞生成素和GFP。IF分析清楚顯示GFP和肌細(xì)胞生成素表達(dá)在分化(DM3)肌細(xì)胞群中下調(diào)(圖5A)。IF數(shù)據(jù)的定量表明生長(zhǎng)條件下僅O. 9%的細(xì)胞為GFP陽性，可能代表由物理接觸引起的自發(fā)分化。在分化培養(yǎng)基中，27±2.0%的細(xì)胞發(fā)生GFP表達(dá)(圖5Bi)。當(dāng)用顯微鏡分析個(gè)體細(xì)胞時(shí)，98. 4%的含可檢測(cè)GFP的細(xì)胞還表達(dá)可檢測(cè)水平的肌細(xì)胞生成素。還通過熒光活化細(xì)胞分選(FACS)進(jìn)行成肌細(xì)胞和肌細(xì)胞中 GFP表達(dá)的高通量分析，其顯示分化培養(yǎng)基中3天后35 %的細(xì)胞群表達(dá)GFP，而生長(zhǎng)培養(yǎng)基中僅I. 8 %的細(xì)胞為GFP+(圖5D)。因此初級(jí)成肌細(xì)胞的pLE-myog3R-GFP感染可通過GFP 表達(dá)的方法可靠鑒定表達(dá)肌細(xì)胞生成素的細(xì)胞群體。
以低密度接種的成肌細(xì)胞在未融合時(shí)會(huì)表達(dá)肌細(xì)胞生成素并經(jīng)歷終末分化。我們利用此體外肌細(xì)胞性質(zhì)研究在分化的單核肌細(xì)胞中抑制RB和pl9ARF后，分化的多核肌管中觀察到的去分化和細(xì)胞周期再進(jìn)入是否能導(dǎo)致增殖。用個(gè)體pLE-myog3R-GFP肌細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，從而跟蹤單細(xì)胞命運(yùn)。首先，圖5C中，在DM中維持72小時(shí)的稀疏接種的初級(jí)肌細(xì)胞基于門控群所示的GFP表達(dá)來分選。為了確定分化的肌細(xì)胞能否增殖，F(xiàn)ACS分選群在條件生長(zhǎng)培養(yǎng)基(cGM)中培養(yǎng)至多48小時(shí)然后染色(圖5E上圖)GFP和細(xì)胞增殖的核標(biāo)記Ki67 (Scholzen和Gerdes 2000)。僅2. 3 %的分選群有Ki67陽性核。相反，F(xiàn)ACS 分選前用TAM處理24小時(shí)和FACS分選后pl6/19si處理12小時(shí)的分選群細(xì)胞(圖5E下圖)表現(xiàn)出cGM培養(yǎng)48小時(shí)后25%的分選群有Ki67核染色(圖5F)。其次，作為抑制RB 和P16/19的替代方法，針對(duì)RB和pl6/19的siRNA雙鏈體用于短暫敲減二者表達(dá)。確定理想劑量和siRNA應(yīng)用方法的分析顯示大多數(shù)有效的敲減在初級(jí)肌細(xì)胞用RBsi處理、12小時(shí)恢復(fù)期、然后用Pl6/19si處理的串聯(lián)處理后發(fā)生。該雙敲減(DKD)處理方案產(chǎn)生與TAM 和pl6/19si處理相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果，而同時(shí)應(yīng)用的siRNA雙鏈體組合沒有沉默任一基因的表達(dá)有效(圖10E)。FACS分選的GFP+細(xì)胞的DKD處理產(chǎn)生8. 6%的Ki67+核。DKD處理細(xì)胞的 DNA合成頻率低于TAM的那些，且鑒于RB抑制的敲減效率低于TAM處理，可預(yù)期pl6/19si 值。這兩種類型的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示在單細(xì)胞水平，分化的表達(dá)肌細(xì)胞生成素的肌細(xì)胞與肌管一樣，僅在RB和Ink4a基因表達(dá)都抑制后有效進(jìn)入S期。
由于RB和pl6/19沉默后單核的分化肌細(xì)胞進(jìn)入S期，我們分析這些細(xì)胞能否完成細(xì)胞周期和增殖。我們推論若肌細(xì)胞能分裂，則其會(huì)產(chǎn)生克隆。然而，為了排除細(xì)胞遷移并確定顯示有絲分裂后肌細(xì)胞分裂，單細(xì)胞分辨和克隆分析至關(guān)重要。因此，為了評(píng)估肌細(xì)胞的增殖能力，我們先FACS純化細(xì)胞兩次以分離個(gè)體的分化GFP+肌細(xì)胞，然后將其直接分選到水凝膠孔的微陣列中。肌細(xì)胞分選到微孔中后先成像12小時(shí)，此時(shí)其用Mocksi處理或首次應(yīng)用DKD處理(圖17A左圖)。DKD處理完成后48、72和96小時(shí)捕獲微孔圖像。增殖的肌細(xì)胞以處理后96小時(shí)最少8個(gè)細(xì)胞的微孔百分比分選。盡管由于用于RNAi遞送且不能從微孔中充分除去的slmportter的毒性，細(xì)胞的總體活力受損，但肌細(xì)胞產(chǎn)生的克隆百分比有清楚的差異。6. 8%的DKD處理肌細(xì)胞產(chǎn)生克隆，而僅O. 6%的Mocksi處理細(xì)胞產(chǎn)生克隆(圖17B)。原始數(shù)據(jù)顯示DKD處理的肌細(xì)胞產(chǎn)生總計(jì)109個(gè)克隆，而模擬處理的肌細(xì)胞群僅產(chǎn)生10個(gè)克隆?？傊?，這些數(shù)據(jù)支持肌細(xì)胞生成素陽性的肌細(xì)胞在RB和pl6/19 表達(dá)抑制后獲得增殖能力的結(jié)論。
激光微切割和激光壓力彈射后的單獨(dú)純化肌細(xì)胞的克隆擴(kuò)增和增殖。我們?cè)噲D通過在捕獲前評(píng)估各單獨(dú)肌細(xì)胞的分化來增加所有我們預(yù)期分離的細(xì)胞的純度。如上所述與水凝膠微孔平臺(tái)結(jié)合的FACS分選可容易地用于監(jiān)控單細(xì)胞增殖能力。然而，數(shù)種不足妨礙了后續(xù)分析分選群的異質(zhì)性，從所述板上分離后細(xì)胞形態(tài)學(xué)的破壞，和缺少處理后分子分析。這些阻礙可通過使用光活化的激光微切割(PALM)和激光壓力彈射(LPC)來克服， 這可得到純化的同質(zhì)單獨(dú)細(xì)胞樣品制備而不破壞細(xì)胞粘附和形態(tài)學(xué)，并可在集落建立后進(jìn)行擴(kuò)增和分子分析。參見例如，Stich, M.,等(2003)Pathology, research and practice 199(6) :405-409 ;Schutze，Κ·，等(2007)Methods in cell biology 82:649-673)。
肌細(xì)胞進(jìn)行激光微切割和壓力彈射分析。為了此目的，表達(dá)pLE-myog3R-GFP+的初級(jí)成肌細(xì)胞稀疏接種并分化為GFP+肌細(xì)胞，然后用模擬siRNA (圖6A)或Rb和ARF抑制處理(圖5Bi和5Ci)?；诜只硇瓦x擇個(gè)體肌細(xì)胞，所述表型包括相位顯微鏡觀察到的伸長(zhǎng)的形態(tài)學(xué)(圖6Ai，左)和明亮的GFP表達(dá)(圖6Bii和6Cii，左)。用激光微切割標(biāo)記并切割包圍預(yù)期鑒定的單肌細(xì)胞的膜(圖6Bii和6Cii的綠線)。標(biāo)記并記錄的膜形狀可在各膜和分離的細(xì)胞表面示蹤。產(chǎn)生彈射的LPC破裂位置用圖6Bii中的藍(lán)點(diǎn)表示，其還是鑒定膜的方法。PALM和LPC分離過程步驟中獲得的典型圖像示于圖6Bii和6Cii。膜切除前后的肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)沒有顯著差異。示例中的標(biāo)注顯示捕獲后72小時(shí)，模擬處理的肌細(xì)胞仍與膜相關(guān)聯(lián)(圖6Aii，第4圖)，且96小時(shí)時(shí)其離開膜但仍作為單粘附細(xì)胞存在，盡管其自捕獲時(shí)間后培養(yǎng)在條件生長(zhǎng)培養(yǎng)基中(圖6Aii，第5圖)。相似地，Rb和ARF降低處理的個(gè)體肌細(xì)胞中，切割和彈射期間形態(tài)學(xué)保持完整(圖6Bii和6Cii，左3圖)。然而，與模擬處理的肌細(xì)胞相反，Rb (TAM或siRNA)和ARF(siRNA)的下降引起細(xì)胞分裂并在膜毗鄰處形成集落(圖6Bii，左起第4圖，圖6Cii，左起第4圖)。單GFP+肌細(xì)胞激光捕獲的其他示例示于圖18。在5次獨(dú)立的PALM LPC分離實(shí)驗(yàn)中，總計(jì)250張膜的分析檢驗(yàn)了無RB和pl6/19抑制時(shí)，沒有捕獲到單一肌細(xì)胞生成素-GFP+肌細(xì)胞分裂產(chǎn)生集落。相反，TAM和pl6/19si處理的肌細(xì)胞產(chǎn)生34個(gè)集落，14%的集落形成頻率(圖6C)。短暫DKD處理的肌細(xì)胞以8%的頻率形成集落，盡管其低于上述FACS和微孔擴(kuò)增獲得的肌細(xì)胞中觀察到的集落形成頻率(圖13B)。PALM LPC的活細(xì)胞捕獲的一個(gè)技術(shù)問題是細(xì)胞分離的LPC期的細(xì)胞脫水，其可降低活力。用顯微鏡發(fā)現(xiàn)和證明表達(dá)GFP的肌細(xì)胞很耗時(shí)間。為了克服此問題，我們用FACS鑒定并分選表達(dá)GFP的肌細(xì)胞，然后如圖19A方案所示處理。顯示捕獲的對(duì)照或TAM和pl6/19si處理的肌細(xì)胞圖像，其提供進(jìn)一步證據(jù)證明對(duì)照處理肌細(xì)胞不能在條件生長(zhǎng)培養(yǎng)基中產(chǎn)生集落(圖19B)，而RB和Ink4a基因沉默的肌細(xì)胞中(圖19C)，表現(xiàn)出28%的集落形成頻率(圖19D)?？傊@些結(jié)果強(qiáng)有力的支持RB和Ink4a在維持肌原性分化中的作用，因?yàn)槠湟种茖?dǎo)致表達(dá)肌細(xì)胞生成素的分化肌細(xì)胞的分裂和擴(kuò)增。接觸低血清后捕獲的肌細(xì)胞集落的再分化。蠑螈中肌細(xì)胞的去分化被認(rèn)為能增殖并有助于肌肉再生。為了確定去分化、有效分裂的哺乳動(dòng)物肌細(xì)胞擴(kuò)增后能否再分化，我們用捕獲的細(xì)胞接觸分化條件。LPC捕獲后，TAM和pl6/19si處理的肌細(xì)胞在GM培養(yǎng)中快速增殖，且缺少GFP證明了大多數(shù)細(xì)胞72小時(shí)后喪失肌細(xì)胞生成素表達(dá)(圖20B)。然而，與未處理的LPC捕獲成肌細(xì)胞相比，即使接觸DM3天時(shí)這些去分化肌細(xì)胞仍繼續(xù)增殖，前者此時(shí)已開始融合(圖20A)。實(shí)際上，TAM和pl6/19si處理群不融合，而是在分化培養(yǎng)基中的第6天觀察到繼續(xù)分裂直到細(xì)胞聚集(圖20B下圖)。預(yù)期未發(fā)生分化，因?yàn)樗黾?xì)胞遺傳上缺失分化所必須的RB表達(dá)。與TAM處理的捕獲肌細(xì)胞相比，DKD捕獲肌細(xì)胞中的RB抑制是短暫的(圖1B)。衍生自單一 DKD處理的捕獲肌細(xì)胞的4個(gè)集落經(jīng)擴(kuò)增、分離、接觸DM持續(xù)4天，然后通過顯微鏡或生化分析其肌肉標(biāo)記(參見圖6的方案)。DKD集落橫跨分化能力的范圍，其兩個(gè)極端示于圖7A和圖7C的上圖。一個(gè)集落(DKDcapl)盡管在DM中仍繼續(xù)增殖，而另一(DKDcap2)分化并融合。預(yù)期短暫敲減后捕獲細(xì)胞行為有異質(zhì)性，因?yàn)槠涓髯匝苌詮V泛的增殖。DKD捕獲集落的蛋白分析支持RB在成功再分化中的作用，因?yàn)镈KDcapl細(xì)胞已缺失RB表達(dá)，而容易融合并分化的集落(DKDcap4和DKDcap2)在DM中表達(dá)高水平的RB (圖7B)。不管何種培養(yǎng)基條件，DKDcapl中的pl9ARF表達(dá)較高，如缺失RB的高度增殖細(xì)胞所預(yù)期。相反，融合產(chǎn)生大肌管的集落中，DM中觀察到預(yù)期的pl9ARF下調(diào)。肌細(xì)胞生成素和MHC的表達(dá)進(jìn)一步證實(shí)再分化肌細(xì)胞的肌原性能力。DKDcap4和DKDcap2與DM接觸后肌細(xì)胞生成素和MHC的蛋白水平上升(圖7B)，而捕獲時(shí)細(xì)胞標(biāo)記-肌細(xì)胞生成素和GFP表達(dá)僅在再分化DKDcap2肌管中上調(diào)(圖7C)。DKDcap2集落和捕獲的成肌細(xì)胞中RB、Ink4a和肌原性蛋白的表達(dá)形式的相對(duì)變化類似(圖21B)?；谶@些發(fā)現(xiàn)，我們推論若RB再引入TAM和pl6/19si捕獲的細(xì)胞，會(huì)發(fā)生再分化和融合。因此，我們用表達(dá)人RB cDNA的pMIG逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染所捕獲集落的亞組。我們監(jiān)控了 pMIG-RB或?qū)φ誴MIG逆轉(zhuǎn)錄病毒感染后的TAMcap成肌細(xì)胞集落并確定分化和融合發(fā)生在再表達(dá)RB的集落中(圖7A下圖)。盡管去分化肌管不再激活Pax-7的表達(dá)(可能是由于培養(yǎng)物中有限的活力時(shí)間)，但如Western分析所示分離的去分化克隆可再激活，因而滿足增殖初級(jí)成肌細(xì)胞的所述標(biāo)準(zhǔn)(圖7E)。從生長(zhǎng)和分化培養(yǎng)基中從對(duì)照或pMIG-RB感染的TAMcap集落中收獲的RB蛋白水平的分析顯示pMIG-RB逆轉(zhuǎn)錄病毒感染后預(yù)期的RB蛋白增加，這與肌原性蛋白肌細(xì)胞生成素和MHC的上調(diào)平行發(fā)生(圖7B)。雖然pl9ARF水平未獲得DKDcap集落中觀察到的表達(dá)模式，pMIG-RB感染后TAMcapl集落中的生存素水平下降(圖7B，第6道)。pMIG-RB感染的TAMcap集落的肌原性能力還通過MHC的IF檢驗(yàn)(圖7D)。總之，這些數(shù)據(jù)證明捕獲和擴(kuò)增后的去分化肌細(xì)胞能成功體外再分化，且該過程取決于RB的表達(dá)(圖8B)。捕獲和擴(kuò)增的肌細(xì)胞體內(nèi)能有助于肌肉。最終，我們測(cè)試PALM LPC分離、擴(kuò)增的肌細(xì)胞體內(nèi)能否有助于現(xiàn)存肌肉。I. 5X105DKD衍生的去分化肌細(xì)胞(DKDcapl和DKDcap2)注射到N0D/SCID小鼠的脛骨前肌(TA)中。細(xì)胞生成素-GFP表達(dá)用于示蹤所述注射細(xì)胞，因?yàn)榉只笤隗w外能可靠檢測(cè)此標(biāo)記(圖7C)。注射十天后，體外沒有表現(xiàn)融合的DKDcapl細(xì)胞在體內(nèi)過度增殖，造成注射位置的肌肉層連蛋白網(wǎng)的嚴(yán)重破壞(圖22，上圖)。另一方面，DKDcap2細(xì)胞容易與現(xiàn)有肌肉纖維融合且不引起層連蛋白網(wǎng)的破壞(圖22，下圖)。由于GFP表達(dá)較弱，其中DKDcap2細(xì)胞融合的肌纖維的觀察較困難。雖然再分化肌管中GFP+體外成像由多個(gè)肌細(xì)胞生成素-GFP細(xì)胞融合協(xié)助，但體內(nèi)少數(shù)注射細(xì)胞對(duì)非GFP肌纖維的貢獻(xiàn)顯著大于培養(yǎng)物衍生的肌管解釋了體內(nèi)觀察到的弱GFP信號(hào)。為了克服此問題，我們用pMIG-RB和pLE-GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒共感染TAMcap集落，因此給這些細(xì)胞提供了 RB拷貝以及明亮的組成型GFP表達(dá)。接受對(duì)照pMIG和pLE-GFP感染的對(duì)照TAMcapl細(xì)胞體內(nèi)過度增殖(圖8A上圖)。相反，再引入RB表達(dá)的TAMcapl細(xì)胞有效融合已有的肌纖維，用GFP明亮標(biāo)記，沒有明顯的增殖且沒有破壞已有層連蛋白網(wǎng)(圖8A下圖)。我們的結(jié)論是若RB表達(dá)充分恢復(fù)，則去分化的肌細(xì)胞能再分化并通過融合體內(nèi)現(xiàn)有肌肉而納入。討論哺乳動(dòng)物和某些低等脊椎動(dòng)物如蠑螈、美西螈和斑馬魚之間再生損傷或截?cái)嘟M織的能力中的巨大差異的分子基礎(chǔ)仍是主要的未解決的生物問題。哺乳動(dòng)物的肌肉再生僅在切碎或移植小肌肉后替代所述肌肉或化學(xué)試劑分出干細(xì)胞時(shí)發(fā)生。此類實(shí)驗(yàn)表明重要的結(jié)構(gòu)重塑能代替瘢痕，但再生程度受到替代或存活的肌肉量的限制。盡管肌肉肝細(xì)胞能解決一定程度的再生，其似乎不足夠。實(shí)際上，目前沒有證據(jù)證明大量組織去除且沒有替代時(shí)，有尾目中觀察到的完整肌肉的廣泛再生能由任何已知的哺乳動(dòng)物機(jī)制實(shí)現(xiàn)。這種受限的再生能力部分是由于損傷位置過多需要細(xì)胞增殖以替代損失的組織與纖維化對(duì)結(jié)構(gòu)重塑抑制的組合。科學(xué)家著迷幾個(gè)世紀(jì)的哺乳動(dòng)物中不能再生的可能基礎(chǔ)是蠑螈保留且哺乳動(dòng)物已經(jīng)喪失的去分化能力。是去分化賦予有尾目哺乳動(dòng)物所沒有的再生能力嗎？這個(gè)問題需要對(duì)去分化的分子機(jī)制有新的認(rèn)識(shí)從而發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物中缺少什么。有尾目中，骨骼肌研究的有力證據(jù)說明去分化是組織再生的主要模式。去分化涉及兩個(gè)可分開且獨(dú)立的過程肌肉細(xì)胞分裂為單獨(dú)的單核細(xì)胞，和細(xì)胞周期再進(jìn)入后的增殖。用永生細(xì)胞系C2C12產(chǎn)生的哺乳動(dòng)物肌管中，已報(bào)道芽基中轉(zhuǎn)錄因子如msxl或twist的過表達(dá)或與破壞細(xì)胞骨架的小分子如肌基質(zhì)蛋白接觸會(huì)引起肌管破裂。在本文報(bào)道的去分化研究中，沒有發(fā)現(xiàn)肌細(xì)胞破裂，這與顯示蠑螈中破裂過程獨(dú)立于細(xì)胞周期再進(jìn)入的報(bào)道良好一致(Velloso，C.P.，等(2000)Differentiation ；research in biological diversity 66(4-5) :239-246)。此外，由于有尾目中肌肉破裂和細(xì)胞化的觸發(fā)和機(jī)制仍然未知，目前不可能確定哺乳動(dòng)物中是否存在相似途徑。理解破裂如何發(fā)生并描繪去分化機(jī)制是肌肉再生生物學(xué)中互補(bǔ)且不同的目的。RB和ARF對(duì)去分化的分子調(diào)控。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中決定抑制RB旨在說明肌肉去分化的潛在機(jī)制，這是基于蠑螈中RB響應(yīng)損傷調(diào)整肌細(xì)胞周期進(jìn)入的證據(jù)。哺乳動(dòng)物如蠑螈中，RB對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控是動(dòng)態(tài)的且主要由其磷酸化狀態(tài)控制。還有大量數(shù)據(jù)強(qiáng)有力地表明腫瘤抑制子RB在哺乳動(dòng)物肌細(xì)胞分化的協(xié)調(diào)中起必要作用，包括在肌細(xì)胞周期進(jìn)展和離開中的雙重作用的證據(jù)。實(shí)際上，無RB的小鼠在出生前死亡且缺少分化的肌肉。此外，已顯示RB不僅作為細(xì)胞周期調(diào)控劑，還通過結(jié)合組蛋白脫乙?；窱 (HDACl)和促進(jìn)肌肉基因如MyoD的活化而直接影響分化和組織特異性基因表達(dá)。至少在哺乳動(dòng)物中，一旦發(fā)生分化，此狀態(tài)穩(wěn)定維持。僅通過在初級(jí)分化的哺乳動(dòng)物肌肉細(xì)胞中滅活RB而不能反轉(zhuǎn)分化來強(qiáng)調(diào)這種穩(wěn)定性。實(shí)際上，研究報(bào)告已被永生細(xì)胞系如C2C12的應(yīng)用所混淆，這里我們顯示所述細(xì)胞系不表達(dá)ink4a產(chǎn)物。肌細(xì)胞生成素和MHC的積累降低證明，失去或抑制RB僅引起適度的去分化(圖4)。事實(shí)上，如本報(bào)告所示，值得注意的是RB抑制時(shí)初級(jí)分化骨骼肌細(xì)胞中發(fā)生的表型變化有多小。單獨(dú)缺失RB對(duì)肌肉去分化的最小影響說明哺乳動(dòng)物分化的維持由單獨(dú)機(jī)制確保。既然RB途徑在低等脊椎動(dòng)物中完整，我們推斷能再生的脊椎動(dòng)物中缺少的另一組分是哺乳動(dòng)物中再生抑制劑的良好候選物。這條思路使我們特別注意ink4a基因座和ARF。不同于RB，敲除小鼠中單獨(dú)ARF的失活對(duì)分化沒有明顯的影響。與這些報(bào)告抑制，我們發(fā)現(xiàn)單獨(dú)ARF對(duì)肌肉分化或去分化沒有影響。然而，伴隨的RB和ARF失活引起廣泛的去分化。分化的肌管顯示RB和pl9ARF的急性缺失后穩(wěn)健的DNA合成和有絲分裂蛋白的活化，表明這些蛋白是肌肉細(xì)胞周期再進(jìn)入的內(nèi)在控制的節(jié)點(diǎn)。RB和pl9ARF抑制后，結(jié)構(gòu)完整性的顯著缺失和肌細(xì)胞生成素、MRF-4、MHC和M-CK的下調(diào)進(jìn)一步表明二者一起是分化狀態(tài)的有效穩(wěn)定劑。顯然，與再生有尾目肌肉相比，哺乳動(dòng)物心肌細(xì)胞中通過改變生長(zhǎng)因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來誘導(dǎo)循環(huán)的替代方法和再生產(chǎn)生非常適度的影響。我們推測(cè)ARF同樣可抑制這些設(shè)定中的穩(wěn)健循環(huán)和再生。我們的發(fā)現(xiàn)支持再生受損時(shí)發(fā)生RB和ink4a基因座介導(dǎo)的腫瘤抑制的假說。近期顯示年齡增長(zhǎng)時(shí)Pl6ink4a和pl9ARF通過影響干細(xì)胞自我更新在多種組織再生能力的下降中起作用。我們的研究說明ink4a基因座對(duì)組織再生有額外的負(fù)面影響，即抑制細(xì)胞周期再進(jìn)入和去分化。急性RB和ARF缺失的顯著組合效應(yīng)強(qiáng)有力的說明(i)RB自身的持續(xù)表達(dá)在維持分化狀態(tài)中有重要功能和(ii)維持哺乳動(dòng)物中的分化狀態(tài)取決于RB和ARF的互補(bǔ)活性。根據(jù)對(duì)分化的連續(xù)調(diào)控的已知需求以及RB和ARF作為腫瘤抑制劑在阻止不當(dāng)循環(huán)中已報(bào)道的作用可解釋這些發(fā)現(xiàn)。去分化的單細(xì)胞分析。大量培養(yǎng)物無法對(duì)分裂的特定細(xì)胞進(jìn)行確定評(píng)估。芽基中觀察到的細(xì)胞復(fù)雜性和快速發(fā)育變化阻礙了有尾目再生中單細(xì)胞水平的去分化分析。觀察到S期再進(jìn)入的哺乳動(dòng)物肌肉培養(yǎng)系統(tǒng)中，不能排除分化早期的細(xì)胞持久性；參見例如 Gu，W·，等(1993) Cell 72(3) :309-324 ;Schneider，J. W.，等(1994) Science (New York,NY 264(5164) :1467-1471 ;和 Blais，A.，等(2007)The Journal ofcell biology 179(7)
361399-1412)。此外，連續(xù)時(shí)程監(jiān)控和單細(xì)胞分析很關(guān)鍵，因?yàn)榉只∪饧?xì)胞分裂的報(bào)道不是細(xì)胞遷移的結(jié)果。為了克服這些問題我們使用(i)通過時(shí)程顯微鏡的微孔分離的肌細(xì)胞的動(dòng)態(tài)單細(xì)胞示蹤和(ii)通過PALM激光捕獲顯微鏡的單一肌細(xì)胞分離。這些單細(xì)胞研究清楚證明RB和pl9ARF缺失后發(fā)生單獨(dú)分化的有絲分裂后肌細(xì)胞的細(xì)胞周期再進(jìn)入和擴(kuò)增。我們進(jìn)一步通過誘導(dǎo)再分化證明去分化肌細(xì)胞的再生能力。通過短暫滅活RB和pl9ARF產(chǎn)生的捕獲集落亞組與培養(yǎng)物中的分化培養(yǎng)基接觸并融合形成肌管。此外，在Cre介導(dǎo)的切割造成不可逆轉(zhuǎn)地缺失RB表達(dá)的肌細(xì)胞中，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒遞送進(jìn)行的RB再引入不僅誘導(dǎo)體外肌管形成和肌肉基因表達(dá)，還引起體內(nèi)有具體結(jié)構(gòu)的受傷肌纖維的融合和再生且沒有跡象顯示未接受RB的細(xì)胞的致瘤性特征。如圖SB所示，這些發(fā)現(xiàn)表明兩種腫瘤抑制劑的短暫失活可產(chǎn)生有廣泛再生能力的去分化細(xì)胞。我們利用發(fā)育差異遺傳修飾哺乳動(dòng)物細(xì)胞周期調(diào)控途徑使之更接近地模擬低等脊髓動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的途徑。我們的結(jié)果說明除了傳統(tǒng)定義的干細(xì)胞，可從分化的有絲分裂后肌細(xì)胞中衍生再生細(xì)胞。骨骼肌細(xì)胞可在分化的有絲分裂后狀態(tài)和增殖的再生狀態(tài)之間變換，再生循環(huán)期間保留了其原始細(xì)胞類型的主要特征。我們的實(shí)驗(yàn)表明ARF通過阻止去分化參與哺乳動(dòng)物細(xì)胞的再生抑制。因此，用生理學(xué)方法對(duì)短暫滅活RB途徑的干擾和同時(shí)抑制ARF的組合可用于最大化哺乳動(dòng)物再生響應(yīng)。前述內(nèi)容只是說明本發(fā)明的原理。應(yīng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠設(shè)計(jì)各種安排，雖然本文沒有明確描述或顯示這些安排，但它們均體現(xiàn)本發(fā)明的原理并包含在本發(fā)明構(gòu)思和范圍內(nèi)。而且，本文所述的所有實(shí)施例和條件語言主要旨在輔助讀者理解本發(fā)明的原理和本發(fā)明對(duì)發(fā)展現(xiàn)有技術(shù)作出的貢獻(xiàn)，且不對(duì)這些具體引用的實(shí)施例和條件構(gòu)成限制。而且，本文有關(guān)本發(fā)明原理、方面、實(shí)施方式以及具體實(shí)施例的所有陳述都應(yīng)包括其結(jié)構(gòu)和功能等同物。此外，這些等同物應(yīng)包括目前已知的等同物和將來開發(fā)的等同物，即新開發(fā)的具有相同功能的任何元件，無論其是何種結(jié)構(gòu)。因此，本發(fā)明的范圍不應(yīng)僅限于本文所示和所述的示范性實(shí)施方式。而是，本發(fā)明的范圍和構(gòu)思由所附權(quán)利要求書限定。
權(quán)利要求
1.一種從相同譜系的有絲分裂后分化細(xì)胞(PMD)中產(chǎn)生譜系限制細(xì)胞(LRC)的方法， 所述方法包括將PMD和有效量的短暫抑制口袋蛋白活性的試劑和有效量的短暫抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2A讀框替代蛋白(ARF)活性的試劑在足以使所述PMD短暫分裂產(chǎn)生后代的條件下接觸，其中所述后代為與所述PMD相同譜系的LRC。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述PMD在分裂前去分化。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述PMD是肌細(xì)胞。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述肌細(xì)胞選自下組心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞和肌纖維。
5.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述口袋蛋白是視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(RB)。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述短暫抑制RB活性的試劑是核酸、多肽或小分子。
7.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述短暫抑制ARF活性的試劑是核酸、多肽或小分子。
8.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述接觸的PMD群中約10%被誘導(dǎo)短暫分m ο
9.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述PMD來自患病個(gè)體。
10.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述個(gè)體存活。
11.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述個(gè)體是尸體。
12.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述方法體內(nèi)實(shí)現(xiàn)。
13.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述方法離體實(shí)現(xiàn)。
14.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述方法還包括轉(zhuǎn)移所述后代LRC到促進(jìn)分化的條件中，其中產(chǎn)生的群是與所述接觸步驟中接觸的PMD相同譜系的PMD群。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)移通過移植所述后代到對(duì)象中實(shí)現(xiàn)。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述對(duì)象需要組織再生治療。
17.一種根據(jù)對(duì)病情的效果篩選候選試劑的方法，所述方法包括用權(quán)利要求I所述的方法從來自有所述病情的個(gè)體的有絲分裂后分化細(xì)胞(PMD)產(chǎn)生譜系限制細(xì)胞(LRC)，轉(zhuǎn)移所述LRC到促進(jìn)分化的條件以產(chǎn)生分化的細(xì)胞群，將所述分化的細(xì)胞群與候選試劑接觸，和將所述分化群中的細(xì)胞的活力和/或功能與沒有接觸所述候選試劑的分化細(xì)胞的活力和/或功能作比較；其中與所述候選試劑接觸的分化群中細(xì)胞的活力和/或功能相較不接觸所述候選試劑的分化群提高表明所述候選試劑對(duì)所述病情會(huì)有影響。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述病情是肌肉失調(diào)。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述肌肉是平滑肌、骨骼肌或心肌。
20.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述病情是神經(jīng)系統(tǒng)失調(diào)。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述神經(jīng)系統(tǒng)失調(diào)是帕金森病、阿耳茨海默病、ALS、嗅覺神經(jīng)元失調(diào)、脊髓神經(jīng)元失調(diào)、或外周神經(jīng)元失調(diào)。
22.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述個(gè)體存活。
23.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述個(gè)體是尸體。
24.—種根據(jù)對(duì)人的毒性篩選候選試劑的方法,所述方法包括用權(quán)利要求I所述的方法從來自健康個(gè)體的有絲分裂后分化細(xì)胞(PMD)產(chǎn)生譜系限制細(xì)胞(LRC)，轉(zhuǎn)移所述LRC到促進(jìn)分化的條件以產(chǎn)生分化的細(xì)胞群，將所述分化的細(xì)胞群與候選試劑接觸，和將所述分化群中的細(xì)胞的活力和/或功能與沒有接觸所述候選試劑的分化細(xì)胞的活力和/或功能作比較；其中與所述候選試劑接觸的分化群中細(xì)胞的活力和/或功能相較不接觸所述候選試劑的分化群下降表明所述候選試劑對(duì)人有毒性。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述PMD是肝細(xì)胞。
26.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞的功能通過評(píng)估細(xì)胞色素P450 組來評(píng)估。
27.一種從對(duì)象組織的有絲分裂后分化細(xì)胞(PMD)中產(chǎn)生譜系限制細(xì)胞(LRC)的方法， 所述方法包括將所述組織的PMD和有效量的短暫抑制口袋蛋白活性的試劑和有效量的短暫抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2A讀框替代蛋白(ARF)活性的試劑體內(nèi)接觸，其中所述接觸的細(xì)胞被誘導(dǎo)原位短暫分裂從而產(chǎn)生所述PMD譜系的譜系LRC。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述PMD在分裂前去分化。
29.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述PMD是肌細(xì)胞。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述肌細(xì)胞選自下組心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞和肌纖維。
31.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述口袋蛋白是視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白 (RB)。
32.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述短暫抑制RB活性的試劑是核酸、多肽或小分子。
33.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述短暫抑制ARF活性的試劑是核酸、多肽或小分子。
34.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述短暫抑制RB活性的試劑和所述短暫抑制ARF活性的試劑局部給予所述組織。
35.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述對(duì)象是需要組織再生治療的對(duì)象。
36.一種用于短暫誘導(dǎo)有絲分裂后分化細(xì)胞暫時(shí)分裂的試劑盒，所述試劑盒包括短暫抑制口袋蛋白活性的試劑和短暫抑制ARF活性的試劑。
全文摘要
提供用于從相同譜系的有絲分裂后分化細(xì)胞中離體和體內(nèi)生產(chǎn)譜系內(nèi)細(xì)胞(譜系限制細(xì)胞)的方法，和通過使用這些譜系限制細(xì)胞治療需要組織再生治療的對(duì)象的方法。此外，從源自疾病患者的有絲分裂后組織中生產(chǎn)譜系限制細(xì)胞可鑒定這些疾病中已經(jīng)偏離的途徑，并可作為一種發(fā)現(xiàn)新藥的方式用于篩選會(huì)改善或校正所述缺陷的藥物。還提供用于進(jìn)行這些方法的試劑盒。
文檔編號(hào)C12N5/00GK102933702SQ201080053185
公開日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2010年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月18日
發(fā)明者H·M·布勞, K·帕西尼, J·波梅蘭茨 申請(qǐng)人:小利蘭·斯坦福大學(xué)托管委員會(huì)