專利名稱：Mthfr基因擴(kuò)增用引物對、含有其的mthfr基因擴(kuò)增用試劑及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于擴(kuò)增MTHFR基因的引物對、含有其的MTHFR基因擴(kuò)增用試劑及其用途。
背景技術(shù)：
同型半胱氨酸是蛋氨酸的代謝途徑中的中間產(chǎn)物，一部分代謝成半胱氨酸，一部分再次代謝成蛋氨酸。報告了同型半胱氨酸在生物體內(nèi)増加，則導(dǎo)致動脈硬化、冠狀動脈疾病、心臟疾病等心血管疾病、高同型半胱氨酸血癥。同型半胱氨酸的產(chǎn)生與亞甲基四氫葉酸還原酶(methylene tetrahydrofolic reductase, MTHFR)有關(guān)，也報告了 MTHFR 基因中的多態(tài)性與前述疾病的關(guān)聯(lián)性(例如參見非專利文獻(xiàn)I)。具體而言，認(rèn)為起因于MTHFR基因的多態(tài)性的MTHFR活性降低使得血中同型半胱氨酸增加，引起前述疾病的發(fā)病。MTHFR基因的多態(tài)性已知例如MTHFR*677、MTHFR*1298等。前者M(jìn)THFR*677是MTHFR基因中的第8747位的堿基的野生型為胞嘧啶(c)，突變型為胸腺嘧啶(t)。后者M(jìn)THFR*1298是MTHFR基因中的第10649位的堿基的野生型為腺嘌呤(a)，突變型為胞嘧啶(C)。例如，報告了 MTHFR基因中產(chǎn)生純合子的變異MTHFR*677(T/T)，則MTHFR活性降低，血中同型半胱氨酸量上升。另一方面，報告了雖然機(jī)理并不清楚，但是MTHFR基因中雜合子的突變MTHFR*1298(A/C)或者純合子的突變MTHFR*1298 (C/C)產(chǎn)生時，MTHFR活性降低，例如，甲氨蝶呤等類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療藥必要劑量減少(例如參見非專利文獻(xiàn)2)。因此，研究MTHFR基因的多種多態(tài)性在預(yù)測血中同型半胱氨酸量的上升而引起的心血管疾病等疾病的發(fā)病、以及類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等的治療藥劑量方面是極其重要的。另一方面，作為在基因水平分析所有疾病的原因、個體間疾病易感性即易患疾病、個體間的藥效差異等的方法，廣泛進(jìn)行了多態(tài)性檢測。所述多態(tài)性例如有點(diǎn)突變、所謂單核苷酸多態(tài)性(SNP)等。多態(tài)性的一般的檢測方法例如有直接測序法、RFLP(RestrictionFragment Length Polymorphism,限制性片段長度多態(tài)性)分析、ASP-PCR法等。所述直接測序法例如是針對試樣的目標(biāo)DNA通過PCR(Polymerase chain reaction,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增相當(dāng)于檢測對象序列的區(qū)域，分析其全部基因序列的方法。上述RFLP法例如是，首先，利用PCR擴(kuò)增試樣的目標(biāo)DNA的相當(dāng)于檢測對象序列的區(qū)域。再通過根據(jù)上述檢測對象序列有無目標(biāo)突變而切斷作用不同的限制酶，將該擴(kuò)增產(chǎn)物切斷，進(jìn)行電泳從而進(jìn)行分型的方法。ASP-PCR法例如是使用目的突變位于3’末端區(qū)域的引物進(jìn)行PCR，通過有無擴(kuò)增判斷突變的方法。但是，這些方法例如必須進(jìn)行由試樣提取出的DNA的精制、電泳、限制酶處理等，因此需要工夫和成本。另外，進(jìn)行PCR后，有必要暫時開啟反應(yīng)容器。因此有上述擴(kuò)增產(chǎn)物混入到之后的反應(yīng)體系內(nèi)、分析精度降低的顧慮。而且，由于自動化困難，因此無法分析大量的試樣。另外，上述ASP-PCR法還存在特異性低的問題。由該問題出發(fā)，近年來作為多態(tài)性的檢測方法，正在實(shí)施Tm (MeltingTemperature)分析。這種方法是分析雙鏈核酸的熔解溫度(Tm)的方法，由于通過上述雙鏈的熔解曲線的分析來進(jìn)行，因此也稱作熔解曲線分析。Tm分析例如為如下的方法。首先使用與含有檢測目的多態(tài)性的區(qū)域互補(bǔ)的探針，形成被檢核酸與上述探針的雜交體(雙鏈核酸)。接著，對得到的雜交體實(shí)施加熱處理，通過吸光度等信號的變動來檢測隨著溫度上升的上述雜交體解離(熔解)成單鏈核酸。根據(jù)該檢測結(jié)果確定Tm值，從而判斷多態(tài)性。在雜交體中兩個單鏈核酸的互補(bǔ)性越高則Tm值越高，互補(bǔ)性越低則Tm值越低。因此，在檢測對象位點(diǎn)的多態(tài)性為X或者Y的情況下，對于含有目的多態(tài)性(例如，Y)的核酸和與其100%互補(bǔ)的探針形成的雜交體，預(yù)先求得Tm值(評價基準(zhǔn)值)。接著測定被檢核酸和上述探針的Tm值(測定值)。并且，若上述測定值與所述評價基準(zhǔn)值相同，則可以判斷上述被檢核酸與上述探針為完全匹配(perfect match)，即上述被檢核酸的檢測對象位點(diǎn)為目的多態(tài)性(Y)。另ー方面，若上述測定值低于上述評價基準(zhǔn)值，則可以判斷上述被檢核酸與上述探針為錯配，即上述被檢核酸的檢測對象位點(diǎn)為另ー種多態(tài)性(X)。根據(jù)這樣的方法，例如，僅通過對添加了上述探針的PCR反應(yīng)液實(shí)施溫度處理，進(jìn)行信號測定，即可檢測多態(tài)性。因此，也可以實(shí)現(xiàn)檢測裝置的自動化。但是，對于利用此類Tm分析的檢測方法而言，例如存在PCR中必須特異且高效地擴(kuò)增含有檢測目的多態(tài)性的區(qū)域的問題。特別是，在具有多種基因多態(tài)性的情況下，分析一·種樣品即需要大量的勞動力，因此也存在分析大量的樣品并不實(shí)用的問題?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)I :福澤等《特集高血壓最新研究動向基礎(chǔ)編》，日本臨床，株式會社日本臨床社，2006年7月，64卷増刊5,173 ~ 176頁非專利文獻(xiàn)2:Urano 等“ Polymorphisms in the methy lenetetrahydrof o latereductase gene were associated with both the efficacy and the toxicity ofmethotrexate used for the treatment of rheumatoid arthritis， as evidenced bysingle locus and haplotype analyses.，，，Pharmacogenetics，2002 年 4 月，12 (3)，183 190 頁。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的在于提供用于通過核酸擴(kuò)增法特異性地擴(kuò)增MTHFR基因的目的區(qū)域的引物和引物對。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明的引物為用于擴(kuò)增MTHFR基因的引物，其特征在于，是含有下述(Fl)寡核苷酸的引物、含有下述(Rl)寡核苷酸的引物、含有下述(F2)寡核苷酸的引物或者含有下述(R2)寡核苷酸的引物。(Fl):喊基長為20 28喊基長，以序列編號I所不的喊基序列中的喊基編號8715的鳥嘌呤(g)為3’末端的寡核苷酸(Rl):喊基長為18 26喊基長,與以序列編號I所不的喊基序列中的喊基編號8817的胞嘧啶(c)為5’末端的寡核苷酸互補(bǔ)的寡核苷酸
(F2):喊基長為26 36喊基長，以序列編號I所不的喊基序列中的喊基編號10590的鳥嘌呤(g)為3’末端的寡核苷酸(R2):喊基長為22 34喊基長,與以序列編號I所不的喊基序列中的喊基編號10695的胞嘧啶(c)為5’末端的寡核苷酸互補(bǔ)的寡核苷酸本發(fā)明的引物對為用于擴(kuò)增MTHFR基因的引物對，其特征在于，包括引物對(I)以及引物對(2)中的至少一者，所述引物對(I)包括含有上述(Fl)寡核苷酸的引 物和含有上述(Rl)寡核苷酸的引物中的至少一者，所述引物對(2)包括含有上述(F2)寡核苷酸的引物和含有上述(R2)寡核苷酸的引物中的至少一者。本發(fā)明的基因擴(kuò)增用試劑是MTHFR基因擴(kuò)增用試劑，其特征在于，包括本發(fā)明的MTHFR基因擴(kuò)增用引物或者引物對。本發(fā)明的擴(kuò)增方法為MTHFR基因的擴(kuò)增方法，其特征在于，包括在反應(yīng)體系中，以試樣中的核酸為模板，使用本發(fā)明的MTHFR基因擴(kuò)增用引物或者引物對，進(jìn)行MTHFR基因的擴(kuò)增的步驟。本發(fā)明的擴(kuò)增產(chǎn)物檢測方法為檢測MTHFR基因的擴(kuò)增產(chǎn)物的擴(kuò)增產(chǎn)物檢測方法，其特征在于，包括下述(A)步驟，(A)通過本發(fā)明的擴(kuò)增方法，擴(kuò)增MTHFR基因的擴(kuò)增步驟。本發(fā)明的多態(tài)性檢測方法為MTHFR基因的多態(tài)性檢測方法，其特征在于，包括下述(A)工序。(A)通過本發(fā)明的擴(kuò)增方法，擴(kuò)增MTHFR基因的擴(kuò)增步驟發(fā)明效果通過本發(fā)明的引物和弓丨物對，能夠特異性地擴(kuò)增包括MTHFR基因中的檢測對象位點(diǎn)(例如，MTHFR*677或者M(jìn)THFR*1298)的目的區(qū)域。


圖I是示出本發(fā)明的實(shí)施例I中的Tm分析的結(jié)果的圖；圖2是示出本發(fā)明的實(shí)施例2中的Tm分析的結(jié)果的圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明中，MTHFR基因中的檢測目標(biāo)多態(tài)性例如是序列編號I所示的MTHFR基因堿基序列中的堿基編號8747和堿基編號10649的至少一者的堿基的多態(tài)性。序列編號I的堿基序列中，堿基編號8747的堿基(y)的野生型為胞嘧啶(C)，突變型為胸腺嘧啶(t)。以下，將該多態(tài)性稱為MTHFR*677，野生型的純合子稱為MTHFR*677 (C/C)或者8747 (C/C)、突變型的純合子稱為MTHFR*677 (T/T)或者8747 (T/T)、雜合子稱為MTHFR*677 (C/T)或者8747 (C/T)。另外，在序列編號I的堿基序列中，堿基編號10649的堿基(m)的野生型為腺嘌呤(a)，突變型為胞嘧啶(c)。以下，將該多態(tài)性稱為MTHFR*1298，野生型的純合子稱為MTHFR*1298 (A/A)或 10649 (A/A)，突變型的純合子稱為 MTHFR*1298 (C/C)或者 10649 (C/C)，雜合子稱為MTHFR*1298 (A/C)或者10649 (A/C)。野生型也可稱為正常型。
MTHFR基因的堿基序列例如登錄在NCBI登錄No. AY338232。序列編號I的堿基序列是上述登錄號的堿基序列中的MTHFR基因的全長序列。本發(fā)明中，將所述多態(tài)性發(fā)生的位點(diǎn)、例如序列編號I的序列(正義鏈)中堿基編號8747和堿基編號10649的堿基，或者其互補(bǔ)序列(反義鏈)中與所述正義鏈的堿基編號8747和堿基編號10649對應(yīng)的堿基稱為“檢測對象位點(diǎn)”。另外，本發(fā)明中，將由本發(fā)明的引物和引物對擴(kuò)增的區(qū)域稱為“目標(biāo)區(qū)域或擴(kuò)增區(qū)域”。所述目標(biāo)區(qū)域包含所述檢測對象位點(diǎn)。所述目標(biāo)區(qū)域例如可以是MTHFR基因的正義鏈中的區(qū)域，也可以是反義鏈中的區(qū)域，還可以是它們兩者。本發(fā)明中，正義鏈和反義鏈也包含例如正義鏈的擴(kuò)增產(chǎn)物、反義鏈的擴(kuò)增產(chǎn)物的意思。本發(fā)明中，將MTHFR基因中的、包括上述檢測對象位點(diǎn)、能夠與后述的多態(tài)性檢測用的探針雜交的區(qū)域稱作“檢測對象序列或者雜交區(qū)域”。上述檢測對象序列中，將與上述探針完全匹配的檢測對象序列稱為“完全匹配序列”，將與上述探針錯配的檢測對象序列稱為“錯配序列”。本發(fā)明中，完全匹配是指上述檢測對象位點(diǎn)的堿基與上述探針中的對應(yīng)堿基互補(bǔ)，優(yōu)選的是指上述檢測對象序列和上述探針完全互補(bǔ)。本發(fā)明中，錯配是指上述檢測對象位點(diǎn)的堿基與上述探針中的對應(yīng)堿基非互補(bǔ)，優(yōu)選的是指上述檢測對象序列和上述探針在上述檢測對象位點(diǎn)以外完全互補(bǔ)。本發(fā)明中，喊基序列的末端是指喊基序列中5’側(cè)和3’側(cè)的最端部的喊基。另外，5’末端區(qū)域是指堿基序列中從5’末端起數(shù)個堿基的區(qū)域，3’末端區(qū)域是指從堿基序列的3’末端起數(shù)個堿基的區(qū)域。上述數(shù)個堿基是指例如，包括上述末端堿基的I 10個堿基、I 4堿基、I 3個堿基、I 2個堿基。本發(fā)明中，從堿基序列的末端起第Z位的堿基(Z為正整數(shù))是指，按末端的堿基為第I位的順序，例如，從末端起第I位的堿基是指末端的堿基，從末端起第2位的堿基是指末端的相鄰的堿基。〈MTHFR基因擴(kuò)增用弓丨物和弓丨物對>如前文所述，本發(fā)明的引物是用于擴(kuò)增MTHFR基因的引物，其特征在于，是含有下述(Fl)寡核苷酸的引物、含有下述(Rl)寡核苷酸的引物、含有下述(F2)寡核苷酸的引物或者含有下述(R2)寡核苷酸的引物。(Fl):喊基長為20 28喊基長，以序列編號I所不的喊基序列中的喊基編號8715的鳥嘌呤(g)為3’末端的寡核苷酸(Rl):喊基長為18 26喊基長,與以序列編號I所不的喊基序列中的喊基編號8817的胞嘧啶(c)為5’末端的寡核苷酸互補(bǔ)的寡核苷酸(F2):喊基長為26 36喊基長，以序列編號I所不的喊基序列中的喊基編號10590的鳥嘌呤(g)為3’末端的寡核苷酸(R2):喊基長為22 34喊基長,與以序列編號I所不的喊基序列中的喊基編號 10695的胞嘧啶(c)為5’末端的寡核苷酸互補(bǔ)的寡核苷酸如前文所述，本發(fā)明的MTHFR基因擴(kuò)增用引物對的特征在于，含有上述引物對(I)和上述引物對(2)中的至少ー者。通過上述本發(fā)明的引物或者含有其的引物對，例如能夠特異性地擴(kuò)增MTHFR基因中的目標(biāo)區(qū)域。本發(fā)明的MTHFR基因擴(kuò)增用弓丨物和引物對也可以稱為MTHFR基因擴(kuò)增用弓丨物試劑。如前文所述，通過本發(fā)明的引物和引物對，能夠特異性地擴(kuò)增包含例如MTHFR*677或者M(jìn)THFR*1298作為MTHFR基因的檢測對象位點(diǎn)的目標(biāo)區(qū)域，并能夠高效擴(kuò)增。這樣，由于能夠特異性地擴(kuò)增MTHFR基因的上述目標(biāo)區(qū)域，因此例如能夠高精度檢測多態(tài)性。具體而言，例如通過對得到的擴(kuò)增產(chǎn)物，再進(jìn)行使用了能夠與上述檢測對象位點(diǎn)雜交的探針的Tm分析，能夠更高精度地檢測上述檢測對象位點(diǎn)的多態(tài)性，判定多態(tài)性的合子類型。另外，例如，由于能夠在一個反應(yīng)體系中進(jìn)行上述目標(biāo)區(qū)域的擴(kuò)增和多態(tài)性的檢測，因此能夠使操作自動化。再者，若使用本發(fā)明的引物和引物對，即使是例如全血和口腔粘膜等含有雜質(zhì)的試樣，也可以省略除去雜質(zhì)的前處理，因此能夠更迅速且簡便地進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。另外，如果使用本發(fā)明的引物和引物對，由于能夠以較之從前更優(yōu)良的擴(kuò)增效率來進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，因此能夠縮短擴(kuò)增反應(yīng)。因此，通過本發(fā)明的引物、引物對、含有其的試劑、以及使用其的擴(kuò)增方法、擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測方法以及多態(tài)性檢測方法，能夠迅速并且簡便地分析MTHFR基因、的多態(tài)性，因此可以說在醫(yī)療領(lǐng)域是極其有效的。本發(fā)明的MTHFR基因擴(kuò)增用引物對可以僅含有例如上述引物對(I)和上述引物對
(2)中的任一者，也可以含有上述引物對(I)和上述引物對⑵兩者。后面將會敘述，能夠利用上述引物對(I)特異性地擴(kuò)增的目標(biāo)區(qū)域是MTHFR基因中包含多態(tài)性MTHFR*677發(fā)生的位點(diǎn)的區(qū)域，能夠利用上述引物對⑵特異性地擴(kuò)增的目標(biāo)區(qū)域是MTHFR基因中包含多態(tài)性MTHFR*1298發(fā)生的位點(diǎn)的區(qū)域。本發(fā)明的MTHFR基因擴(kuò)增用引物對例如在含有上述引物對(I)和上述引物對(2)兩者的情況下，可以在同一反應(yīng)體系中，分別同時擴(kuò)增MTHFR基因中的、含有多態(tài)性MTHFR*677發(fā)生的位點(diǎn)的目標(biāo)區(qū)域和含有多態(tài)性MTHFR*1298發(fā)生的位點(diǎn)的目標(biāo)區(qū)域。如前文所述，已知MTHFR基因的這兩種多態(tài)性對生物體內(nèi)的同型半胱氨酸量會產(chǎn)生影響。因此，不僅僅重視任何一種多態(tài)性，而且重視調(diào)查兩種二者的多態(tài)性。但是，現(xiàn)有的方法存在一個反應(yīng)體系中難以檢測多種序列的問題。因此,調(diào)查MTHFR基因的兩種多態(tài)性，即調(diào)查MTHFR*677和MTHFR*1298兩者時，需要在個別的反應(yīng)體系中分別擴(kuò)增含有各自的多態(tài)性產(chǎn)生的位點(diǎn)的區(qū)域，個別分析得到的擴(kuò)增產(chǎn)物。這樣，在以往的方法中，僅將MTHFR基因作為模板，并且在MTHFR基因中，特異性地擴(kuò)增分別含有產(chǎn)生上述多態(tài)性的位點(diǎn)的兩種目標(biāo)區(qū)域是極其困難的。并且，這樣，存在由于分析一個樣品也要花費(fèi)大量勞動力，因此分析多個樣品不現(xiàn)實(shí)的問題。與此相對，通過本發(fā)明的引物對，即使在含有上述引物對(I)和上述引物對(2)兩者的情況下，也能夠在同一反應(yīng)體系中同時并且特異性地擴(kuò)增各自的目標(biāo)區(qū)域。因此，與前述的以往的方法不同，能夠減輕工夫和成本。另外，這樣，由于在同一反應(yīng)體系中特異性地擴(kuò)增兩個目標(biāo)區(qū)域，因此，例如使用能夠與各自的目標(biāo)區(qū)域中的檢測對象位點(diǎn)雜交的探針，進(jìn)行Tm分析，能夠分別檢測上述兩種多態(tài)性，另外，能夠判別合子類型。這樣，由于能夠在同一反應(yīng)體系中分析MTHFR基因中的兩種多態(tài)性，因此，對本發(fā)明的引物對來說，例如含有上述引物對(I)和上述引物對(2)中的任意ー種的情況自不用說，優(yōu)選含有兩種。使用這樣的本發(fā)明的引物對，擴(kuò)增一個目標(biāo)區(qū)域自不用說，就是同時擴(kuò)增兩個目標(biāo)區(qū)域，也能夠較之從前更高效地檢測MTHFR基因的多態(tài)性。以下有時將正向引物稱為F引物，將反向引物稱為R引物。
如前述，所述引物對⑴是包括含有下述(Fl)寡核苷酸的引物和含有下述(Rl)寡核苷酸的引物中的至少一者的弓I物對。(Fl):喊基長為20 28喊基長，以序列編號I所不的喊基序列中的喊基編號8715的鳥嘌呤(g)為3’末端的寡核苷酸(Rl):與堿基長為18 26堿基長，以序列編號I所示的堿基序列中的堿基編號8817的胞嘧啶(c)為5’末端的寡核苷酸互補(bǔ)的寡核苷酸含有上述(Fl)寡核苷酸的引物是正向引物，以下也稱Fl引物。上述Fl引物與序列編號I所示的堿基序列中的部分序列相同。即，與MTHFR基因的正義鏈中的部分序列相同，能夠與反義鏈退火。含有上述(Rl)寡核苷酸的引物是反向引物，以下也稱Rl引物。上述Rl引物是與
序列編號I所示的堿基序列中的部分序列互補(bǔ)的。即，與MTHFR基因的反義鏈中的部分序列相同，能夠與正義鏈退火。上述引物對(I)例如可以僅含有上述Fl引物，也可以僅含有上述Rl引物，優(yōu)選含
有兩者。上述引物對(I)是用于擴(kuò)增含有序列編號I中的堿基編號8716 8816的區(qū)域的核酸序列以及其互補(bǔ)鏈的引物對。該區(qū)域內(nèi)的堿基編號8747的堿基，即序列編號I中的堿基編號8747的堿基是前述的多態(tài)性MTHFR*677產(chǎn)生的位點(diǎn)。以下，也將該引物對(I)稱作“MTHFR*677用引物對”。在僅分析MTHFR*677的多態(tài)性的情況下，可以僅使用MTHFR*677用引物對。在上述引物對(I)中，上述Fl引物和上述Rl引物，只要起決定DNA聚合酶的擴(kuò)增起始點(diǎn)的作用的3’末端的堿基滿足上述條件即可。如此通過固定各引物的3’末端的堿基，就能充分防止所述引物對(I)例如與其它類似的序列結(jié)合。如此，由于只需要固定Fl引物和Rl引物的3’末端的堿基即可，因此對上述各引物的長度本身并沒有特殊的限定，可以適當(dāng)調(diào)整為一般的長度。上述各引物的長度，例如為13 50堿基長的范圍，優(yōu)選14 45堿基長，更優(yōu)選15 40堿基長。作為具體例子，上述Fl引物為以序列編號I所示的堿基序列中的第8715位的鳥嘌呤(g)為3’末端的寡核苷酸，其堿基長例如為20 28堿基長，優(yōu)選的是21 26堿基長，更優(yōu)選的是22 24堿基長。上述Rl引物為與以序列編號I所不的喊基序列中的喊基編號8817的胞卩密唳(c)為5’末端的寡核苷酸互補(bǔ)的寡核苷酸，其堿基長例如為18 26堿基長，優(yōu)選的是19 25堿基長，更優(yōu)選的是21 23堿基長。由于上述Fl引物和上述Rl引物的3’末端分別被固定，因此從引物延伸出的區(qū)域例如是前述序列編號I中的堿基編號8716 8816的區(qū)域，但所獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的總長度根據(jù)使用的引物的長度而變化。上述Fl引物例如可以與序列編號I所示的堿基序列中的部分序列完全相同，也可以不完全相同。即，可以與MTHFR基因的正義鏈的部分序列完全相同，也可以不完全相同。作為后者的具體例，在上述Fl引物例如與上述正義鏈的部分序列對應(yīng)的情況下，在除3’末端的堿基之外的部分中，與上述部分序列可以有I個 5個堿基不同。上述Rl引物例如可以與序列編號I所示的堿基序列中的部分序列完全互補(bǔ)，也可以不完全互補(bǔ)。即，可以與MTHFR基因的反義鏈的部分序列完全相同，也可以不完全相同。作為后者的具體例，在上述Rl引物例如與上述反義鏈的部分序列對應(yīng)的情況下，在除3’末端的堿基之外的部分中，與上述部分序列可以有I個 5個堿基不同。以下，示出所述Fl引物和Rl引物的具體例子，但是本發(fā)明不限定于此。表I
權(quán)利要求
1.一種MTHFR基因擴(kuò)增用引物對，其特征在于，包括引物對(1)以及引物對⑵中的至 少一者，所述引物對(1)包括含有下述(F1)寡核苷酸的引物和含有下述(R1)寡核苷酸的引物 中的至少一者，所述引物對(2)包括含有下述(F2)寡核苷酸的引物和含有下述(R2)寡核苷酸的引物 中的至少一者，其中，(F1):喊基長為20 28喊基長，以序列編號1所不的喊基序列中的喊基編號8715的 鳥嘌呤(g)為3’末端的寡核苷酸，(R1):喊基長為18 26喊基長,與以序列編號1所不的喊基序列中的喊基編號8817 的胞嘧啶(c)為5’末端的寡核苷酸互補(bǔ)的寡核苷酸，(F2):喊基長為26 36喊基長，以序列編號1所不的喊基序列中的喊基編號10590的 鳥嘌呤(g)為3’末端的寡核苷酸，(R2):喊基長為22 34喊基長,與以序列編號1所不的喊基序列中的喊基編號10695 的胞嘧啶(c)為5’末端的寡核苷酸互補(bǔ)的寡核苷酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的MTHFR基因擴(kuò)增用引物對，所述(FI)、(Rl)、(F2)和(R2)寡 核苷酸分別為下述(Fl-1)、(Rl-1)、(F2-1)和(R2-1)寡核苷酸，其中，(F1-1):含有序列編號7所示的堿基序列的寡核苷酸，(R1-1):含有序列編號15所示的堿基序列的寡核苷酸，(F2-1):含有序列編號25所示的堿基序列的寡核苷酸，(R2-1):含有序列編號38所示的堿基序列的寡核苷酸。
3.—種基因擴(kuò)增用試劑，其特征在于，含有權(quán)利要求1所述的MTHFR基因擴(kuò)增用引物對 和能夠與MTHFR基因的擴(kuò)增產(chǎn)物雜交的探針。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的擴(kuò)增用試劑，所述探針為含有下述(P1)寡核苷酸、(P1’)寡 核苷酸、(P2)寡核苷酸和(P2’ )寡核苷酸中的至少一者的探針,其中，(P1):堿基長為17 50堿基長，包括與含有序列編號1中的堿基編號8744 8760的 喊基序列互補(bǔ)的喊基序列，并且在3’末端區(qū)域具有與所述喊基編號8744的喊基互補(bǔ)的喊 基的寡核苷酸，(pr ):包括與所述(pi)寡核苷酸互補(bǔ)的堿基序列的寡核苷酸，(P2):堿基長為14 50堿基長，包括與含有序列編號1中的堿基編號10643 10656 的喊基序列互補(bǔ)的喊基序列，并且在3’末端區(qū)域具有與所述喊基編號10643的喊基互補(bǔ)的 堿基的寡核苷酸，(P2’ ):含有與所述(P2)寡核苷酸互補(bǔ)的堿基序列的寡核苷酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的擴(kuò)增用試劑，所述(P1)寡核苷酸在從3’末端起數(shù)第1 4 位的位置具有與所述堿基編號8744的堿基互補(bǔ)的堿基，所述(P2)寡核苷酸在從3’末端起數(shù)第1 4位的位置具有與所述堿基編號10643的 堿基互補(bǔ)的堿基。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的擴(kuò)增用試劑，所述(P1)寡核苷酸和(P2)寡核苷酸分別是下 述(P1-1)和(P2-1)寡核苷酸，(P1-1):含有序列編號46所示的堿基序列的寡核苷酸，(P2-1):含有序列編號52所示的堿基序列的寡核苷酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的擴(kuò)增用試劑，所述探針是具有標(biāo)記物質(zhì)的標(biāo)記探針。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的擴(kuò)增用試劑，所述(P1)寡核苷酸和(P2)寡核苷酸在3’末端 區(qū)域具有所述標(biāo)記物質(zhì)，所述(P1’)寡核苷酸和(P2’)寡核苷酸在5末端區(qū)域具有所述標(biāo) 記物質(zhì)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的擴(kuò)增用試劑，所述(P1)寡核苷酸和(P2)寡核苷酸在從3’末 端起數(shù)第1 4位的堿基的位置具有所述標(biāo)記物質(zhì)，所述(P1’ )寡核苷酸和(P2’ )寡核苷酸在從5’末端起數(shù)第1 4位的堿基的位置具 有所述標(biāo)記物質(zhì)。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的擴(kuò)增用試劑，所述(P1)寡核苷酸在與所述堿基編號8744的 喊基互補(bǔ)的喊基上具有所述標(biāo)記物質(zhì)，所述(P1’ )寡核苷酸在序列編號1中的堿基編號8744的堿基上具有所述標(biāo)記物質(zhì)，所述(P2)募核昔酸在與所述喊基編號10643的喊基互補(bǔ)的喊基上具有所述標(biāo)記物質(zhì)，所述(P2’ )寡核苷酸在序列編號1中的堿基編號10643的堿基上具有所述標(biāo)記物質(zhì)。
11.根據(jù)權(quán)利要求4所述的擴(kuò)增用試劑，包括含有所述(P1)寡核苷酸的探針和含有所 述(P2)寡核苷酸的探針。
12.—種擴(kuò)增產(chǎn)物檢測方法，用于檢測MTHFR基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，其特征在于，包括下述 (A)步驟，(A)在反應(yīng)體系中，以試樣中的核酸為模板，使用權(quán)利要求1所述的MTHFR基因擴(kuò)增用 引物對，擴(kuò)增MTHFR基因的擴(kuò)增步驟。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的擴(kuò)增產(chǎn)物檢測方法，包括下述(A)、(B)和(C)步驟，(A)在反應(yīng)體系中，以試樣中的核酸為模板，使用權(quán)利要求1所述的MTHFR基因擴(kuò)增用 弓丨物對，擴(kuò)增MTHFR基因的擴(kuò)增步驟，(B)改變含有所述(A)步驟中的擴(kuò)增產(chǎn)物和能夠與所述MTHFR基因的擴(kuò)增產(chǎn)物雜交的 探針的反應(yīng)體系的溫度，測定表示所述擴(kuò)增產(chǎn)物和所述探針的雜交體的熔解狀態(tài)的信號值 的測定步驟，(C)基于伴隨所述溫度變化的所述信號值的變動，檢測所述MTHFR基因的擴(kuò)增產(chǎn)物的 檢測步驟。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的增產(chǎn)物檢測方法，在所述(A)步驟中，在含有所述探針的所 述反應(yīng)體系中，進(jìn)行MTHFR基因的擴(kuò)增，在所述(B)步驟中，改變所述(A)步驟的所述反應(yīng)體系的溫度。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的擴(kuò)增產(chǎn)物檢測方法，所述探針為含有下述(P1)寡核苷酸、 (P1’ )寡核苷酸、(P2)寡核苷酸和(P2’ )寡核苷酸中的至少一者的探針，(P1):堿基長為17 50堿基長，包括與含有序列編號1中的堿基編號8744 8760的 喊基序列互補(bǔ)的喊基序列，并且在3’末端區(qū)域具有與所述喊基編號8744的喊基互補(bǔ)的喊 基的寡核苷酸，(P1’ ):含有與所述(P1)寡核苷酸互補(bǔ)的堿基序列的寡核苷酸，(P2):堿基長為14 50堿基長，包括與含有序列編號1中的堿基編號10643 10656的喊基序列互補(bǔ)的喊基序列，并且在3’末端區(qū)域具有與所述喊基編號10643的喊基互補(bǔ)的 堿基的寡核苷酸，(P2’ ):含有與所述(P2)寡核苷酸互補(bǔ)的堿基序列的寡核苷酸。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的擴(kuò)增產(chǎn)物檢測方法，所述(Pl)寡核苷酸和(P2)寡核苷酸 分別為下述(Pl-I)和(P2-1)寡核苷酸，(Pl-I):含有序列編號46所示的堿基序列的寡核苷酸，(P2-1):含有序列編號52所示的堿基序列的寡核苷酸。
17.根據(jù)權(quán)利要求13所述的擴(kuò)增產(chǎn)物檢測方法，所述探針為具有標(biāo)記物質(zhì)的標(biāo)記探針。
18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的擴(kuò)增產(chǎn)物檢測方法，所述反應(yīng)體系包括含有所述(Pl)寡核 苷酸的探針和含有所述(P2)寡核苷酸的探針。
19.一種多態(tài)性檢測方法，其特征在于，包括下述(A)、(B)和(D)步驟，(A)在反應(yīng)體系中，以試樣中的核酸為模板，使用權(quán)利要求I所述的MTHFR基因擴(kuò)增用 弓I物對，擴(kuò)增MTHFR基因的擴(kuò)增步驟，(B)改變含有所述(A)步驟中的擴(kuò)增產(chǎn)物和能夠與MTHR基因的檢測對象位點(diǎn)雜交的探 針的反應(yīng)體系的溫度，測定表示所述擴(kuò)增產(chǎn)物和所述探針的雜交體的熔解狀態(tài)的信號值的 測定步驟，(D)基于伴隨所述溫度變化的所述信號值的變動，檢測所述檢測對象位點(diǎn)的所述多態(tài) 性的檢測步驟。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的多態(tài)性檢測方法，在所述(A)步驟中，在含有所述探針的所 述反應(yīng)體系中進(jìn)行MTHFR基因的擴(kuò)增，在所述(B)步驟中，改變所述(A)步驟的所述反應(yīng)體系的溫度。
21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的多態(tài)性檢測方法，所述探針為含有下述(Pl)寡核苷酸、 (P1’ )寡核苷酸、(P2)寡核苷酸和(P2’ )寡核苷酸中的至少一者的探針，(PD :堿基長為17 50堿基長，包括與含有序列編號I中的堿基編號8744 8760的 喊基序列互補(bǔ)的喊基序列，并且在3’末端區(qū)域具有與所述喊基編號8744的喊基互補(bǔ)的喊 基的寡核苷酸，(pr ):含有與所述(pi)寡核苷酸互補(bǔ)的堿基序列的寡核苷酸，(P2):堿基長為14 50堿基長，包括與含有序列編號I中的堿基編號10643 10656 的喊基序列互補(bǔ)的喊基序列，并且在3’末端區(qū)域具有與所述喊基編號10643的喊基互補(bǔ)的 堿基的寡核苷酸，(P2’ ):含有與所述(P2)寡核苷酸互補(bǔ)的堿基序列的寡核苷酸。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的多態(tài)性檢測方法，所述(Pl)寡核苷酸和(P2)寡核苷酸分 別為下述(Pl-I)和(P2-1)寡核苷酸，(Pl-I):含有序列編號46所示的堿基序列的寡核苷酸，(P2-1):含有序列編號52所示的堿基序列的寡核苷酸。
23.根據(jù)權(quán)利要求19所述的多態(tài)性檢測方法，所述探針是具有標(biāo)記物質(zhì)的標(biāo)記探針。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于通過核酸擴(kuò)增法特異性地擴(kuò)增MTHFR基因的目標(biāo)區(qū)域的引物對。使用包括含有F1引物和R1引物的引物對(1)、以及含有F2引物和R2引物的引物對(2)的引物對。由此，例如能夠在同一反應(yīng)液中同時擴(kuò)增分別含有產(chǎn)生MTHFR基因的兩種多態(tài)性的部分的兩個目標(biāo)區(qū)域。(F1)堿基長為20～28堿基長，以序列編號1所示的堿基序列中的堿基編號8715的鳥嘌呤(g)為3’末端的寡核苷酸，(R1)堿基長為18～26堿基長，與以序列編號1所示的堿基序列中的堿基編號8817的胞嘧啶(c)為5’末端的寡核苷酸互補(bǔ)的寡核苷酸，(F2)堿基長為26～36堿基長，以序列編號1所示的堿基序列中的堿基編號10590的鳥嘌呤(g)為3’末端的寡核苷酸，(R2)堿基長為22～34堿基長，與以序列編號1所示的堿基序列中的堿基編號10695的胞嘧啶(c)為5’末端的寡核苷酸互補(bǔ)的寡核苷酸。
文檔編號C12N15/09GK102666852SQ20108005277
公開日2012年9月12日 申請日期2010年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月19日
發(fā)明者小塚昌弘, 平井光春 申請人:愛科來株式會社