專利名稱：用于向脊髓遞送siRNA的方法和由此產(chǎn)生的療法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請至少部分涉及向人或動物患者的脊髓施用小干擾RNA(SiRNA)的方法，并且還涉及治療脊髓損傷和神經(jīng)性疼痛的方法。具體地，本申請公開了預(yù)防和治療神經(jīng)性疼痛和異常性疼痛的方法和治療受損傷的脊髓以促進CNS功能恢復(fù)的方法。背景siRNA代表有希望的治療技術(shù)，然而在向患者施用siRNA中還存在待克服的障礙。已采用各種技術(shù)來將siRNA引入細胞中，包括陽離子脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、病毒遞送和核轉(zhuǎn)染。使用陽離子脂質(zhì)的遞送看來是最簡單的轉(zhuǎn)染方法，然而其效率通常是低的并限制于特定細胞類型。雖然病毒遞送很好地用于一些困難的細胞、細胞系和用于體內(nèi)遞送(Garraway等，2007，J Pharmacol Exp Ther. 322 :982-8)，其具有增加的安全顧慮。未修飾的siRNA單鏈或雙鏈體在血清中極不穩(wěn)定，單鏈的半衰期小于I分鐘，而雙鏈體的半衰期為3. 3到5 分鐘(Sioud,2005. Curr Drug Targets. 6 :647-53 ；Sioud 和 Iversen, 2005. Curr DrugTargets. 6 :647-53)。然而,siRNA的化學(xué)修飾已展現(xiàn)出穩(wěn)定性顯著改善；修飾的siRNA比未修飾的 siRNA 穩(wěn)定性增加大約 900 倍(Morrissey 等，2005. Nat Biotechnol. 23 :1002-7)。轉(zhuǎn)讓給本發(fā)明申請人的PCT專利公布WO 2008/050329和WO 2009/044392公開了某些穩(wěn)定的和活性的siRNA化合物，所述專利公布通過引用整體并入本文。由于血腦屏障(BBB)，siRNA向中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的遞送是成問題的，并且最成功的策略是使用鞘內(nèi)路徑。經(jīng)由微泵向嚙齒類動物大腦中腦室內(nèi)輸注高濃度的裸露的siRNA已成功抑制了靶基因表達，然而，在遠離輸注位點的區(qū)域，靶基因表達的敲低顯著下降(Thakker 等，2004. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 :17270-5)。使用連接至微型滲透泵的腰椎留置插管，在脊髓中鞘內(nèi)應(yīng)用高劑量(400 y g/天)siRNA沉默了 ATP-門控的陽離子通道P2X3，并緩解了慢性神經(jīng)性疼痛(Dorn等，2004. Nucleic Acids Res. 32 :e49)。其他研究在鞘內(nèi)遞送后實現(xiàn)了治療作用以顯著較低的劑量在ALS進展的慢性小鼠模型中使用植入的Alzet泵(Wang等，2008. J Biol Chem. 283 :15845-52)以及在急性疼痛模型中采用預(yù)治療(Christoph 等，2006. Biochem Biophys Res Commun. 350 :238-43 ;Luo 等，2005.Mol Pain. I 29)。Rohl 和 Kerreck 綜述了疼痛模型中的各種 RNAi 方法(J. Neurochem. 99 371-380)。Inoue 暗示神經(jīng)性疼痛中 RhoA 的活化(Inoue 等，2004. Nat Med 10(7) :712-8)。對脊髓的挫傷性損傷產(chǎn)生對組織的初級損害，并啟動稱為次級損傷的級聯(lián)事件，次級損傷經(jīng)數(shù)天至數(shù)周以幾個階段進展(Beattie等,2000. J Neurotrauma. 17 :915-25)。脊髓內(nèi)的小膠質(zhì)細胞在損傷后被快速活化。在大鼠中，活化的巨噬細胞在脊髓損傷后3天 開始積累(Schwab等，2004. Glia. 47 :377-86)。在SCI后的前幾天，損傷位點中和周圍存在大量細胞死亡，以及神經(jīng)元的軸突過程從損傷位點死亡。這些過程伴有復(fù)雜的分子變化，包括在神經(jīng)細胞(D' Alessandri 等，1995. Curr. Eye Res. 14 :911-926 ;Dubreuil 等，2003. J Cell Biol. 162 :233-43 ；Erschbamer 等，2005. J Comp Neurol. 484 :224-33 ；Yune等，2007. J Neurosci. 27 :7751-61)和免疫細胞(Fu 等，2007. J Neurosci. 27 :4154-64 ；Pixley 等，2005J Cell Sci. 118 :1873-83 ;Schwab 等，2004) 二者中 RhoA 的上調(diào)和活化，這被認為促成了次級損害以及限制軸突再生和功能恢復(fù)。細胞穿透性Rho拮抗劑(如BA-210)，其抑制磷酸化的包括RhoA在內(nèi)的Rho家族蛋白的活性，顯示在嚙齒類動物中改善脊髓損傷后的恢復(fù)(Lord-Fontaine 等，2008. J Neurotrauma. 25 :1309-22)，并正在臨床測試中測試以促進軸突再生和功能恢復(fù)(Baptiste等,2009. Expert Opin InvestigDrugs. 18 :663-73)。RhoA蛋白水平上調(diào)數(shù)倍，在脊髓挫傷后 7天在大鼠脊髓中達到其最高水平，提供了用于SCI后治療干預(yù)的窗口(Erschbamer等,2005同上)。然而,發(fā)現(xiàn)RhoA的BA-210抑制最多僅至急性治療后4天而不是一周(Lord-Fontaine等，2008)，此時RhoA表達是穩(wěn)健的(Erschbamer等,2005)。祀向遞送siRNA至CNS的方法和祀細胞中增強的活性將是期望的。疼痛是疾病最常見的癥狀，并且是患者向醫(yī)師呈現(xiàn)的最經(jīng)常的不適。不適當(dāng)?shù)奶弁垂芾砣允谴蟮墓步】祮栴}。異常性疼痛/SCI相關(guān)的疼痛的目前可用的治療選擇是有·限的，并且因為許多SCI疼痛病癥不易于治療，特別是處于損傷水平(at-level)和損傷水平以下(below-level)神經(jīng)性疼痛，管理變得主要是針對癥狀的。因此需要用于治療異常性疼痛/SCI相關(guān)的疼痛的解決方案。發(fā)明概述本文提供了治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、疾患和損傷的方法。本申請公開了在不存在轉(zhuǎn)導(dǎo)載體(transduction vehicle)、遞送載體(delivery carrier)或遞送系統(tǒng)下向受治療者中的受損或病態(tài)脊髓遞送siRNA的方法，并提供了治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疾病、疾患和損傷(包括脊髓損傷、神經(jīng)變性和神經(jīng)性疼痛)的方法。在一方面，提供了治療患有與靶基因的表達有關(guān)的CNS疾病、疾患或損傷的受治療者的方法，包括以有效治療受治療者的量局部地向受治療者的脊髓施用定向至靶基因的雙鏈RNA化合物。在一些實施方案中，實質(zhì)內(nèi)施用和/或通過腰椎注射施用雙鏈RNA化合物。在一些實施方案中，實質(zhì)內(nèi)施用雙鏈RNA化合物。在優(yōu)選的實施方案中，通過腰椎注射施用雙鏈RNA化合物。在一些實施方案中，通過在損傷或疾病發(fā)作后0至48小時腰椎穿刺向受治療者施用雙鏈RNA。在一些實施方案中，通過在損傷或疾病發(fā)作后0至42小時、0至36小時、0至30小時或0至24小時腰椎穿刺向受治療者施用雙鏈RNA。在一些實施方案中，受治療者患有疼痛。在不同的實施方案中，疼痛是神經(jīng)性疼痛。在特定的實施方案中，提供了治療或預(yù)防受治療者中的神經(jīng)性疼痛的方法，包括以有效治療或預(yù)防受治療者中的神經(jīng)性疼痛的量向受治療者施用定向至選自RhoA或TLR4的革巴基因的雙鏈RNA化合物。在優(yōu)選的實施方案中，雙鏈RNA化合物通過腰椎注射施用。在一些實施方案中，神經(jīng)性疼痛是皰疹后神經(jīng)痛、三叉神經(jīng)痛和與選自由以下組成的組的病癥有關(guān)的神經(jīng)性疼痛皰疹、HIV、外傷性神經(jīng)損傷、中風(fēng)、缺血后(post-ischemia)、纖維肌痛、反射性交感神經(jīng)營養(yǎng)不良、復(fù)雜區(qū)域性疼痛綜合征、脊髓損傷、坐骨神經(jīng)痛、幻肢痛、糖尿病性神經(jīng)病變和癌癥化療誘導(dǎo)的神經(jīng)性疼痛。
在一些實施方案中，雙鏈RNA是siRNA。在優(yōu)選的實施方案中，siRNA化合物作為裸露的siRNA施用。在一些實施方案中，siRNA是合成的、化學(xué)修飾的siRNA。在一些實施方案中，CNS疾病、疾患或損傷與選自以下的基因的表達有關(guān)傷害性感受器特異基因或傷害性感受神經(jīng)元中表達的基因。在一些實施方案中，CNS疾病、疾患或損傷與選自以下的基因的表達有關(guān)APP、MAPT, S0D1、BACE1、CASP3、TGM2、NFE2L3、TARDBP, ADRBl、CAMK2A、CBLNl、CDK5R1、GABRAl、MAPKlO、N0S1、NPTX2、NRGN、NTS、PDCD2、PDE4D、PENK, SYTl、TTR、FUS, LRDD, CYBA,ATF3、ATF6、CASP2、CASP1、CASP7、CASP8、CASP9、HRK、ClQBP, BNIP3、MAPK8、MAPK14、RacI、GSK3B、P2RX7、TRPM2、PARG、CD38、STEAP4、BMP2、GJAI、TYROBP、CTGF、ANXA2、RHOA、DUOXl、RTP801、RTP801L、N0X4、N0X1、N0X2 (gp91pho、CYBB)、N0X5、DU0X2、N0X01、N0X02 (p47phox、NCF I)、NOXAl、N0XA2 (p67phox、NCF2)、p53 (TP53)、HTRA2、KEAPl、SHCl、ZNHITl、LGALS3、HI95、S0X9、ASPP1、ASPP2、CTSD, CAPNSl、FAS 和 FASLG、NOGO 和 NOGO-R ;TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、ILlbR、MYD88、TICAM、TIRAP, HSP47。在一些實施方案中，本文公開的方法導(dǎo)致具有SCI的受治療者中某些喪失的功能(包括運動功能)的恢復(fù)。運動功能包括使用臂和腿，包括重新獲得行走功能。在一些實施方案中，該方法導(dǎo)致患有CNS的疾病、疾患或損傷的受治療者中白質(zhì)的保留。在一些實施方案中，該方法阻抑SCI誘導(dǎo)的神經(jīng)性疼痛或異常性疼痛。在一些實施方案中，該方法預(yù)防具有SCI的受治療者中的異常性疼痛。不希望受理論束縛，當(dāng)根據(jù)本方法施用時，siRNA在CNS組織中快速擴散，并被包括神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、巨噬細胞和內(nèi)皮細胞的多種細胞類型攝取，并在治療后一周時降低SCI誘導(dǎo)的靶蛋白(即表A中的靶基因)的增加。本發(fā)明的其他目標(biāo)、特征和優(yōu)點將從以下描述和實施例中是清楚的。附圖簡述

圖1A-1F =SCI中的siRNA攝取。SCI和在3個位點(沖擊位點中央以及2mm嘴側(cè)(rostral)和尾側(cè)(caudal))以liil的liig/iil Cy3. 5-siRNA實質(zhì)內(nèi)注射后3天拍攝的顯微照片(圖1A)，每個實質(zhì)內(nèi)注射均在Imm深度。攝取是廣泛的，在遠至距注射位點5mm嘴側(cè)和尾側(cè)鑒定到標(biāo)記的細胞。顯微照片顯示分析的不同細胞類型的實例，包括運動神經(jīng)元(圖1B)、巨噬細胞(圖1C)、軸突(圖1D)和內(nèi)皮細胞(圖1E)。比例尺=20um(微米)。圖IF中的表格總結(jié)了不同孵育時間時每種標(biāo)記的細胞類型的相對發(fā)生率(罕見，+至頻繁， ++++)。圖2A-2B. SiRhoA在體外的活性和穩(wěn)定性。在使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染到HeLa和REF52細胞后使用qPCR定量siGFP和siRhoA對RhoA mRNA的效應(yīng)。垂直軸顯示作為對照模擬轉(zhuǎn)染細胞的百分比的RhoA mRNA量(圖2A)。將I y g siRhoA的等份在20L完全大鼠CSF中在37°C孵育不同時間間隔，然后非變性20%聚丙烯酰胺凝膠電泳上分析(圖2B)。使用溶解在PBS中的相似量的siRhoA用于體積控制。圖3A-3C. siRNA治療對RhoA蛋白和SCI后功能恢復(fù)的效應(yīng)。在3個位點將三(3)y g的siRhoA或siGFP注射到實質(zhì)組織中，然后在SCI的大鼠MASCIS模型中使用12. 5重物墜落(weight drop)挫傷脊髓。在SCI和治療后一周，siRhoA治療的大鼠顯示用針對RhoA的抗體的降低的免疫印跡；同一泳道的GAPDH的免疫印跡證實相等的蛋白上樣(圖3A)。使用12. 5和25mm重物墜落檢驗了與siGFP對照相比3ug siRhoA脊髓內(nèi)注射的治療效應(yīng)。當(dāng)通過ANOVA事后重復(fù)測量來分析時，siRhoA治療的大鼠顯示在12. 5mm挫傷損傷(圖3B)中與siGFP對照相比顯著的(p-值=.0098)運動器BBB改善(n = 6)。對于更嚴(yán)重的25_挫傷損傷(圖3C)觀察到了運動器改善的相似趨勢，但是觀察到的差異不是統(tǒng)計學(xué)顯著的(n = 6)。圖4.在中央5mm SCI位點通過免疫印跡測量的siRNA治療對RhoA蛋白的效應(yīng)。在SCI的MASCIS模型中使用12. 5重物墜落的挫傷后立即將3 ii g的siRhoA或siGFP注射到實質(zhì)組織(如圖3中的在3個位點I ii g/ ill的I ill脊髓內(nèi)注射。在SCI和治療后一周，siRhoA治療的大鼠顯示當(dāng)歸一化為同一泳道中的GAPDH的強度時降低的用針對RhoA蛋白 的抗體免疫印跡后的平均強度。圖5.在中央5mm SCI位點通過ELISA測量的siRNA治療對RhoA蛋白的效應(yīng)。在SCI的MASCIS模型中使用12. 5重物墜落的挫傷后立即將3 ii g的siRhoA或siGFP注射到實質(zhì)組織(在3個位點I ii g/ ill的I ill脊髓內(nèi)注射。在SCI和治療后一周，siRhoA治療的大鼠顯示當(dāng)歸一化為用僅SCI治療的大鼠中的平均信號時降低的ELISA后的平均強度。通過與GFP siRNA對照比較，在RhoA siRNA治療后檢測到較低水平的RhoA蛋白。圖6A-6G.通過腰椎穿刺遞送后一天Cy3. 5-標(biāo)記的siRNA的分布。在T9-10在12. 5mm MASCIS挫傷后約24h，將Cy3. 5-標(biāo)記的siRNA以L3/4水平注射。熒光解剖顯微鏡下完整脊髓的背視圖(圖6A);箭頭顯示腰椎穿刺的位置。在固定和低溫切片后，在損傷中央(I)和在損傷位點的近端位置(P)(包括圖6B中的頸區(qū))(位置未在圖6A中顯示)，和遠端位置(D-)拍攝橫切片，如所示的(圖6B-6G)。在損傷位點的灰質(zhì)中觀察到標(biāo)記的siRNA，并在近端區(qū)域非常微弱地觀察到標(biāo)記的siRNA (圖6B)。在遠端區(qū)域(圖6E-6G)，Cy3. 5-標(biāo)記的siRNA主要在脊髓的表面周圍、在中央管中和在灰質(zhì)中定位。圖7A-7B.經(jīng)由腰椎穿刺注射siRNA后3天RhoA mRNA的抑制。用MASCIS沖擊、使用12. 5mm重物墜落(Hasegawa等,2005)使大鼠受損傷，并在一天后經(jīng)由腰椎穿刺注射siRNA。圖7A顯示在中度挫傷損傷后第4天損傷位點⑴的RhoA的基因表達水平(如通過q-RTPCR測量的)被使用腰椎穿刺施用時的SiRhoA治療顯著降低(僅SCI n = 5 ;對照siRNA n = 8 ；30ug siRhoA :n = 5 和 IOOug siRhoA :n = 5)。圖 7B 顯不，在中度挫傷損傷后第4天損傷位點(I)的通過ELISA測量的RhoA蛋白水平也被使用腰椎穿刺施用的IOOugsiRhoA顯著阻抑。圖8.腰椎穿刺(L3/4)注射后大鼠后肢行走的功能恢復(fù)(BBB)。在SCI的MASCIS模型中12. 5mm挫傷損傷挫傷后，siRhoA治療顯示在8周時與siGFP對照相比的改善(菱形對比三角)。圖9A-9B. SCI后腰椎施用siRhoA對異常性疼痛的效應(yīng)。(圖9A)在12. 5mm MASCIS挫傷后一天，在腰椎管中注射siRNA，并且測量由用von Frye纖維絲的在后肢光潔表面上的壓力回縮閾值(PffT)構(gòu)成(siGFP n = 7，siRhoA n = 7) ;AN0VA、p = 0. 0023。(圖 9B)在圖9A中包括的同一組大鼠上進行側(cè)后肢測試；敏感性更高，但是變化模式與對光潔爪測試觀察到的變化模式平行(siGFP n = 7, siRhoA n = 7) ；ANOVA, p = 0. 0001。圖10. SCI和用siRNA治療后脊髓中節(jié)約的組織的測量。在用MASCIS沖擊器12. 5mm挫傷并注射siRNA后，來自脊髓所示區(qū)域的橫切片用LFB染色，并計算具有超閾值染色的總面積的部分。匯集來自兩個8-周實驗(包括用于圖9中測試的大鼠中的4只大鼠)的組織。與在SCI后24小施用siGFP (n = 8)的對照相比，siRhoA組(n = 8)顯示更高的 LFB 染色面積；AN0VA，p = 0. 0006。圖11A-11D. SCI后腰椎施用SiRhoA對活化的巨噬細胞和背CST的效應(yīng)。在來自圖9和10中分析的相同大鼠的切片上進行EDl (圖11AU1B)和PKC Y (圖11CU1D)的免疫染色。識別活化的巨噬細胞和小膠質(zhì)細胞的EDl染色在挫傷位點四周是最強健的，與siGFP相比被SiRhoA治療降低；顯示的切片是在挫傷震中的2mm嘴側(cè)(+2)。閾值后EDl-陽性面積的定量顯示與用siGFP相比,在延伸至2mm嘴側(cè)的損傷震中用siRhoA的平均面積顯著更低(ANOVA, p = 0. 018)。在用EDl對PKC y染色進行雙重免疫染色后，對應(yīng)于背CST的面積被圈出和放大。閾值化后，測量PKC Y面積并顯示平均值(圖11D)。結(jié)果顯示與siGFP(n = 8)相比，在損傷震中嘴側(cè)區(qū)域數(shù)毫米內(nèi)siRhoA組(n = 8)的PKCy信號的顯著(p = 0. 028) 保留。來自損傷位點8mm嘴側(cè)(+8)的切片對應(yīng)于背CST的區(qū)域表現(xiàn)正常水平的PKC Y免疫染色。板II中的PKC Y免疫染色顯示沒有差異。比例尺= 500iim。圖12A-12E. SiRhoA促進更高的損傷位點尾側(cè)血清素能纖維反應(yīng)性。病損遠端12mm處的脊髓橫切片顯示siRhoA-治療的大鼠(圖12B)中比siGFP治療的對照(圖12A)中多個區(qū)域血清素能纖維的更高的強度。測量的八個區(qū)域(每個區(qū)域是167. 41um X167. 41um)的位置(圖12C)。血清素能染色的代表性更高功率共聚焦顯微圖像顯示纖維染色(圖12D)。定量所示區(qū)域(圖12C)的血清素纖維長度，發(fā)現(xiàn)與siGFP(n = 8)對照相比，siRhoA組(n = 8)中區(qū)域1_4、5_8和1_8中的平均值全部顯著= 0. 018)更高(圖12E)，比例尺=50 u m。圖13A-13B.顯示siRhoA或siTLR4在治療(圖13A)或預(yù)防(圖13B)中的效應(yīng)所進行的實驗的方案。SCI誘導(dǎo)的異常性疼痛。結(jié)果顯示在圖14A-14B。圖14A-14B. SCI后施用siRhoA和siTLR4對異常性疼痛的效應(yīng)。⑷⑶12. 5mmMASCIS挫傷后一天，在腰椎管中注射siRNA，并且測量由用von Frye纖維絲的在后肢光潔表面上的壓力回縮閾值(PWT)構(gòu)成。發(fā)明詳述本發(fā)明的代表性遞送方法包括I)在穩(wěn)定受損害椎骨的手術(shù)時實質(zhì)內(nèi)注射(Lenehan B等，2010)或在脊髓上的任何其他手術(shù)，例如用于減壓、腫瘤等的手術(shù)時實質(zhì)內(nèi)注射；和2)經(jīng)由腰椎穿刺遞送的推注。定義為方便起見，這里描述了說明書、實施例和權(quán)利要求中采用的某些術(shù)語。應(yīng)注意，如本文所用，除非內(nèi)容另外清楚指明，否則單數(shù)形式“一(a)、“一(an)”和“該(the)”包括復(fù)數(shù)形式。當(dāng)以Markush組或替代的其他分組描述本發(fā)明的方面或?qū)嵤┓桨笗r，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到，也由此以該組的任何單個成員或成員的亞組描述本發(fā)明?！耙种苿笔悄軌蚪档突虻谋磉_或該基因的產(chǎn)物的活性至足以實現(xiàn)期望的生物學(xué)或生理學(xué)效應(yīng)的程度的化合物。如本文所用的術(shù)語“抑制劑”指一種或多種寡核苷酸抑制劑，包括雙鏈RNA和反義化合物。雙鏈RNA包括siRNA、shRNA和miRNA。本申請包括例如針對RhoA、TLR4和其他靶基因諸如表A中公開的靶基因的反義和siRNA寡核苷酸。抑制還可稱為下調(diào)，或?qū)τ赗NAi，稱為沉默。如本文所用的術(shù)語”抑制”指降低基因的表達或該基因的產(chǎn)物的活性至足以實現(xiàn)期望的 生物學(xué)或生理學(xué)效應(yīng)的程度。抑制可以是完全的或部分的?！凹顾钃p傷”或“SCI”或脊髓病是造成感覺和/或運動性損失的脊髓失調(diào)。脊髓損傷的兩種常見類型是由于外傷和疾病。外傷性損傷可由以下造成汽車事故、跌倒、槍擊、潛水事故及其他外傷，和可影響脊髓的疾病，包括脊髓灰質(zhì)炎、脊柱裂、腫瘤、肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)、多發(fā)性硬化(MS)、脊髓空洞癥、橫貫性脊髓炎和弗里德賴希氏共濟失調(diào)。SCI指由壓迫、向脊髓神經(jīng)的血液供應(yīng)中斷、或脊髓的斷開造成的脊髓損害。SCI包括為由對脊髓本身的直接損傷造成的脊髓傷害或間接地來自對周圍骨、組織、或血管的傷害的脊髓外傷?！皞π愿惺芷鳌敝疙憫?yīng)于疼痛或壓力、溫度或化學(xué)品的感覺感受器。傷害性感受器通常根據(jù)其響應(yīng)的環(huán)境刺激分類。一些傷害性感受器響應(yīng)于多于一種刺激，并被稱為多覺型的(polymodal)。與本公開特定相關(guān)的傷害性感受器是GABA能神經(jīng)元中表達的傷害性感受器。(例如，參見 Pharmacological Management Of Neuropathic Pain FollowingSpinal Cord Injury. Baastrup C, Finnerup NB. CNS Drugs. 2008 ；22 (6) :455-75)。神經(jīng)性疼痛的特征在于不同的癥狀集合，癥狀可包括對無害的熱-機械刺激增強的敏感性、對有害的刺激的異常敏感性、壓痛和自發(fā)的灼燒性疼痛。神經(jīng)性疼痛還是進展性的，并通常隨時間而惡化。神經(jīng)性疼痛由對周圍神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)或中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的損害或其中的病理學(xué)變化產(chǎn)生。病理學(xué)變化的實例包括延長的周圍或中樞神經(jīng)致敏作用、中樞致敏作用相關(guān)的對神經(jīng)系統(tǒng)抑制功能的損害以及軀體和交感神經(jīng)系統(tǒng)之間的異常相互作用。神經(jīng)性疼痛的實例包括單一神經(jīng)根病(monoradiculopathies)、三叉神經(jīng)痛、皰疫后神經(jīng)痛、幻肢痛、復(fù)雜區(qū)域性疼痛綜合征和各種周圍神經(jīng)病變。在一些實施方案中，神經(jīng)性疼痛是皰疹后神經(jīng)痛、或與選自以下的病癥有關(guān)的神經(jīng)性疼痛皰疹、HIV、外傷性神經(jīng)損傷、中風(fēng)、缺血后、纖維肌痛、反射性交感神經(jīng)營養(yǎng)不良、復(fù)雜區(qū)域性疼痛綜合征、脊髓損傷、坐骨神經(jīng)痛、幻肢痛、糖尿病性神經(jīng)病變、和癌癥化療誘導(dǎo)的神經(jīng)性疼痛。如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述神經(jīng)性疼痛與選自由以下組成的組的病癥有關(guān)外傷性神經(jīng)損傷、缺血后、纖維肌痛、反射性交感神經(jīng)營養(yǎng)不良、復(fù)雜區(qū)域性疼痛綜合征、坐骨神經(jīng)痛、幻肢痛、糖尿病性神經(jīng)病變、和癌癥化療誘導(dǎo)的神經(jīng)性疼痛。在一些實施方案中，神經(jīng)性疼痛由以下引起惡性腫瘤、中風(fēng)、皰疫后神經(jīng)痛、具有單克隆蛋白的神經(jīng)病變(neuropathy with monoclonal protein)、血管炎性神經(jīng)病變、與格-巴二氏綜合征有關(guān)的神經(jīng)病變、與法布里病有關(guān)的神經(jīng)病變、炎性病癥、包括多發(fā)性硬化在內(nèi)的自身免疫性疾患、毒素、藥物、遺傳性異常、乳房切除術(shù)、或截肢術(shù)。神經(jīng)性疼痛的標(biāo)志是慢性異常性疼痛和痛覺過敏。異常性疼痛指由通常不會引發(fā)疼痛響應(yīng)的刺激例如輕壓力造成的疼痛。痛覺過敏指對正常的疼痛刺激的增加的敏感性。C-纖維的致敏作用引起的初級痛覺過敏立即發(fā)生于損傷區(qū)域內(nèi)。由背角神經(jīng)元的致敏作用引起的次級痛覺過敏發(fā)生于損傷周圍未受損害的區(qū)域。痛覺缺失或疼痛知覺的降低可受沿傷害通路傳遞降低的影響。CNS-介導(dǎo)的痛覺缺失導(dǎo)致疼痛傳遞的整體抑制。
疼痛是疾病最常見的癥狀，并且是患者向醫(yī)師呈現(xiàn)的最經(jīng)常的不適。短語“疼痛管理藥物治療”包括施用以整體預(yù)防、緩解或消除疼痛的一種或多種治療劑。根據(jù)本申請，疼痛管理藥物治療包括抑制或下調(diào)選自表A的靶基因的雙鏈RNA分子，包括siRNA分子?！皊iRNA抑制劑”是能夠降低基因的表達或該基因的產(chǎn)物的活性至足以實現(xiàn)期望的生物學(xué)或生理學(xué)效應(yīng)的程度的化合物。如本文所用的術(shù)語“siRNA抑制劑”指siRNA、siNA、shRNA、合成shRNA ;miRNA中的一種或多種。抑制還可稱為下調(diào)，或?qū)τ赗NA干擾(RNAi)，稱為沉默。如本文所用的術(shù)語“抑制”指降低或下調(diào)基因的表達或該基因的產(chǎn)物的活性至足以實現(xiàn)期望的生物學(xué)或生理學(xué)效應(yīng)的程度。抑制可以是完全的或部分的。如本文所用，術(shù)語靶基因的“抑制”意指基因表達(轉(zhuǎn)錄或翻譯)或多肽活性的抑制。靶mRNA序列的多核苷酸序列指mRNA序列、或其任何同源序列，優(yōu)選同源序列與靶mRNA具有至少70%同一性、更優(yōu)選80%同一性、甚至更優(yōu)選90%或95%同一性，靶基因mRNA序列的非限制性實例列于SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2。因此，經(jīng)歷如本文所述的突變、變化或修飾的多核苷酸序列涵蓋在本發(fā)明內(nèi)。術(shù)語“mRNA多核苷酸序列”和” mRNA”可互換使用。RhoA是調(diào)節(jié)肌動蛋白細胞骨架的GTP酶，其在脊髓損傷后被上調(diào)，并顯示在眼的小梁網(wǎng)中表達。如本文所用，術(shù)語“多核苷酸”和”核酸”可互換使用，并指包含脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的核苷酸序列。該術(shù)語應(yīng)理解為包括由核苷酸類似物構(gòu)成的RNA或DNA類似物作為等同物。貫穿本申請，mRNA序列列為代表對應(yīng)的基因?！肮押塑账帷被颉肮丫垠w”指約2至約50個核苷酸的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸序列。每個DNA或RNA核苷酸可以獨立地是天然的或合成的，和或修飾的或未修飾的。修飾包括改變寡核苷酸中的糖部分、堿基部分和或核苷酸之間的連接。本文公開的化合物涵蓋包含脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修飾的脫氧核糖核苷酸、修飾的核糖核苷酸和其組合的分子?！昂塑账帷币庥w脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸，其可以是天然的或合成的，和或修飾的或未修飾的。修飾包括改變寡核糖核苷酸中的糖部分、堿基部分和或核糖核苷酸之間的連接。如本文所用，術(shù)語“核糖核苷酸”涵蓋天然的和合成的、未修飾的和修飾的核糖核苷酸。修飾包括改變寡核苷酸中的糖部分、堿基部分和/或核糖核苷酸之間的連接。RNA干擾和siNA核酸分子RNA干擾(RNAi)指由短干擾RNA(siRNA)介導(dǎo)的動物中的序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默過程(Zamore 等，2000，Cell, 101, 25-33 ；Fire 等，1998，Nature, 391,806 ； Hami I ton等，1999，Science, 286，950-951 ；Lin 等，1999，Nature, 402,128-129 ；Sharp, 1999，Genes &Dev. , 13 :139-141 ;和 Strauss，1999，Science，286，886)。植物中對應(yīng)的過程(Heifetz 等，PCT國際公布第WO 99/61631號)通常稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)或RNA沉默。細胞中長dsRNA的存在刺激稱為Dicer的核糖核酸酶III酶的活性(Bass，2000，Cell,101,235 ；Zamore 等，2000，Cell,101, 25-33;Hammond 等，2000，Nature，404，293)。Dicer參與將dsRNA加工成稱為短干擾RNA (siRNA)的短dsRNA區(qū)段(Zamore等，2000，CelI，、101,25-33 ；Bass, 2000, Cell, 101,235 ;Berstein 等，2001，Nature，409，363)。來源于Dicer活性的短干擾RNA通常為約21至約23個核苷酸長并包括約19堿基對雙鏈體(Zamore等，2000，Cell, 101,25-33 ；Elbashir 等，2001, Genes Dev.，15，188)。細胞質(zhì) RNAi 響應(yīng)的特征在于內(nèi)切核酸酶復(fù)合體,通常稱為RISC，即RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-inducedsilencing complex)，其介導(dǎo)對具有與siRNA雙鏈體的反義鏈互補的序列的單鏈RNA的切害I]。靶RNA的切割發(fā)生在與siRNA雙鏈體的反義鏈互補的區(qū)域的中部(Elbashir等，2001，Genes Dev. ， 15，188)。本文公開的抑制劑或治療劑包含核酸分子。如本文所用，術(shù)語“核酸分子”或“核酸”可互換使用，并指寡核苷酸，核苷酸或多核苷酸。此處更詳細地描述“核酸分子”的變化。核酸分子涵蓋修飾的核酸分子和未修飾的核酸分子二者，如本文所述。核酸分子可包括任何組合的脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修飾的核苷酸或核苷酸類似物。
在一些實施方案中，提供了具有結(jié)構(gòu)(A)的雙鏈核酸分子(A)’5 (N) X-Z 3’(反義鏈)3，V -(N，)y_z”5’ (有義鏈)其中N和N’中的每一個是可以為未修飾的或修飾的、或非常規(guī)的部分的核苷酸；其中(N)X和(N’)y中的每一個是其中每個連續(xù)的N或N’通過共價鍵連接至下一個N或N’的寡核苷酸；其中Z和V中的每一個獨立地存在或不存在，但是如果存在，則獨立地包括連接在其所存在的鏈的3’末端的1-5個連續(xù)的核苷酸或非核苷酸部分或其組合；其中z”可存在或不存在，但是如果存在則是連接在(N’)y的5’末端的加帽部分；X和y中的每一個獨立地是18至40的整數(shù)；其中(N’ )y的序列具有與(N)X的序列的互補性；且其中(N)X包括脊髓損傷、疾病或疾患中上調(diào)的基因的mRNA的反義序列。在一些實施方案中，連接每個連續(xù)的N或N’的共價鍵是磷酸二酯鍵。在一些實施方案中，X = y且X和y中的每一個是19、20、21、22或23。在不同的實施方案中，X = y = 19。在一些實施方案中，反義和有義鏈通過堿基配對形成雙鏈體。在一些實施方案中，反義鏈的5’末端核苷酸(反義鏈的位置I)是與靶mRNA錯配的。在一些實施方案中，反義鏈的5’末端核苷酸是修飾的核糖腺苷或修飾的核糖尿苷。在一些實施方案中，Z和V不存在。在其他實施方案中，Z或Z’中的一個存在。如本文所用，術(shù)語“核苷酸”指具有糖(或其類似物、或修飾的糖)、核苷酸堿基(或其類似物、或修飾的堿基)、和磷酸基團(或其類似物、或修飾的磷酸基團)的化學(xué)部分。核苷酸涵蓋修飾的核苷酸或未修飾的核苷酸二者，如本文所述。如本文所用的，核苷酸可包括脫氧核糖核苷酸(如，未修飾的脫氧核糖核苷酸)、核糖核苷酸(如，未修飾的核糖核苷酸)、和修飾的核苷酸類似物(包括，尤其是，鎖核酸和非鎖核酸)、肽核酸、L-核苷酸(也稱為鏡像核苷酸)、乙烯橋接核酸(ENA)、阿糖胞苷、PACE、具有6碳糖的核苷酸、以及經(jīng)常被視為非核苷酸的核苷酸類似物(包括無堿基核苷酸)。在一些實施方案中，核苷酸可以是在糖、核苷酸堿基和/或在磷酸基團中用本領(lǐng)域已知的任何修飾，諸如本文描述的修飾來修飾的。如本文所用的“多核苷酸”或“寡核苷酸”指連接的核苷酸鏈；多核苷酸和寡核苷酸可同樣地具有在核苷酸糖、核苷酸堿基和磷酸骨架中的修飾，如本領(lǐng)域所熟知的和/或本文所公開的。如本文所用，術(shù)語“短干擾核酸”、“siNA”、或“短干擾核酸分子”指能夠調(diào)控基因表達或病毒復(fù)制的任何核酸分子。優(yōu)選地，siNA抑制或下調(diào)基因表達或病毒復(fù)制。siNA包括且不限于能夠介導(dǎo)序列特異性RNAi的核酸分子，例如短干擾RNA(SiRNA)、雙鏈RNA (dsRNA)、微-RNA (miRNA)、短發(fā)夾RNA (shRNA)、短干擾寡核苷酸、短干擾核酸、短干擾修飾的寡核苷酸、化學(xué)修飾的siRNA、轉(zhuǎn)錄后基因沉默RNA (ptgsRNA)、和其他。如本文所用的，“短干擾核酸”、“siNA”、或“短干擾核酸分子”具有在本文其他地方更詳細地描述的含義。如本文所用，術(shù)語“互補”意指核酸可通過傳統(tǒng)的Watson-Crick或其他非傳統(tǒng)的類型與另一核酸序列形成氫鍵。百分比互補性指示核酸分子中可與第二核酸序列形成氫鍵(如，Watson-Crick堿基配對)的連續(xù)殘基的百分比(如，第一寡核苷酸中總共10個核苷酸中的5、6、7、8、9、或10個核苷酸與具有10個核苷酸的第二核酸序列堿基配對分別代表50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、和100 %互補)?！巴耆パa”意指核酸序列的所有連續(xù)殘基將與第二核酸序列中相同數(shù)目的連續(xù)殘基形成氫鍵。在一個實施方案中，本文公開的核酸分
子包括與一種或多種靶核酸分子或其部分互補的約15至約35個或更多(如，約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34 或 35 個或更多)核苷酸。如本文所用，術(shù)語“有義區(qū)”指與siNA分子的反義區(qū)互補(部分地或完全地)的siNA分子的核苷酸序列。siNA分子的有義鏈可包括與靶核酸序列具有同源性的核酸序列。如本文所用的，“有義鏈”指包括有義區(qū)并且還可包括另外的核苷酸的核酸分子。有義鏈還被稱為乘客鏈。如本文所用，術(shù)語“反義區(qū)”指與靶核酸序列互補(部分地或完全地)的SiNA分子的核苷酸序列。siNA分子的反義鏈可任選地包括與siNA分子的有義區(qū)互補的核酸序列。如本文所用的，”反義鏈”指包括反義區(qū)并且還可包括另外的核苷酸的核酸分子。反義鏈還被稱為引導(dǎo)鏈。如本文所用，術(shù)語“RNA”指包括至少一個核糖核苷酸殘基的分子。如本文所用，術(shù)語“雙鏈體區(qū)”指通過Watson-Crick堿基配對或允許互補的或大致互補的寡核苷酸鏈之間的雙鏈體的任何其他方式彼此形成堿基對的兩個互補的或大致互補的寡核苷酸中的區(qū)域。例如，具有21個核苷酸單元的寡核苷酸鏈可以具有21個核苷酸單元的另一寡核苷酸堿基配對，但是每條鏈上僅有19個堿基是互補的或大致互補的，使得“雙鏈體區(qū)”由19個堿基對組成。剩余的堿基對可，例如，作為5’和3’突出部分存在。此外，在雙鏈體區(qū)內(nèi)，不要求100%互補性；大致互補性在雙鏈體區(qū)內(nèi)是允許的。大致互補性指鏈之間的互補性使得它們能夠在生物學(xué)條件下退火。根據(jù)經(jīng)驗確定兩條鏈?zhǔn)欠衲軌蛟谏飳W(xué)條件下退火的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的?？蛇x擇地，可合成兩條鏈并在生物學(xué)條件下將它們添加在一起以確定它們是否彼此退火。如本文所用，術(shù)語“非配對核苷酸類似物”意指包括非堿基配對部分的核苷酸類似物，非堿基配對部分包括但不限于6脫氨基腺苷(ebularine)、4_Me_吲哚、3_硝基吡咯、5-硝基吲哚、Ds、Pa、N3-Me 核糖 U、N3_Me 核糖 T、N3_Me dC、N3-Me-dT、Nl-Me-dG、Nl-Me_dA、N3-乙基-dC、N3-Me dC。在一些實施方案中，非堿基配對核苷酸類似物是核糖核苷酸。在其他實施方案中，其為脫氧核糖核苷酸。如本文所用，術(shù)語”末端官能團”包括且不限于齒素、醇、胺、羧酸、酯、酰胺、醛、酮、
醚基團。如本文所用的“無堿基部分”或“無堿基核苷酸類似物”在本文和本領(lǐng)域也稱為假核苷酸或非常規(guī)部分。核苷酸是核酸的單體單元，通常由核糖或脫氧核糖、磷酸、和堿基(DNA中為腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、或胞嘧啶；RNA中為腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶、或胞嘧啶)。而無堿基或假核苷酸缺乏堿基，并因此不是嚴(yán)格意義上的本領(lǐng)域通常使用的術(shù)語核苷酸。無堿基脫氧核糖部分包括例如，無堿基脫氧核糖_3’_磷酸；1，2-二脫氧-D-呋喃核糖-3-磷酸；1，4-脫水-2-脫氧-D-核糖醇-3-磷酸。反向無堿基脫氧核糖部分包括反向脫氧核糖無堿基；3’，5’反向脫氧無堿基5’ -磷酸。如本文所用的術(shù)語”加帽部分”(或結(jié)構(gòu)(A)中的” z”)包括可共價連接至(N’ )y的5’末端的部分，并包括無堿基核糖部分、無堿基脫氧核糖部分、修飾無堿基核糖和無喊基脫氧核糖部分包括2’ 0燒基修飾；反向無喊基核糖和無喊基脫氧核糖部分和其修飾；C6-亞氨基-Pi ;鏡像核苷酸(包括L-DNA和L-RNA) ;5’ OMe核苷酸；和核苷酸類似物(包括4’，5’ -亞甲基核苷酸)；I-( P-D-赤蘚呋喃糖基)核苷酸；4’ -硫代核苷酸、碳環(huán)核苷 酸；5’ -氨基-烷基磷酸；1，3- 二氨基-2-丙基磷酸、3-氨基丙基磷酸；6_氨基己基磷酸；12-氨基十二烷基磷酸；羥丙基磷酸；1，5_脫水己糖醇核苷酸；a -核苷酸；蘇-呋喃核糖核苷酸；無環(huán)3’，4’ -開環(huán)核苷酸；3，4- 二羥基丁基苷酸；3，5- 二羥基戊基核苷酸、5’ -5’ -反向無堿基部分；1，4_ 丁二醇磷酸；5’ -氨基；和橋接或非橋接甲基膦酸和5’ -巰基部分。某些加帽部分可以是無堿基核糖或無堿基脫氧核糖部分；反向無堿基核糖或無堿基脫氧核糖部分；C6-氨基-Pi ;鏡像核苷酸(包括L-DNA和L-RNA)。如本文公開的核酸分子可使用一種或多種反向核苷酸例如反向胸苷或反向腺嘌呤合成(例如參見Takei等，2002. JBC277(26) :23800-06)。如本文所用的術(shù)語”非常規(guī)部分”指非核苷酸部分(包括無堿基部分、反向無堿基部分、烴(烷基)部分和其衍生物)，且還包括脫氧核糖核苷酸、修飾的脫氧核糖核苷酸、鏡像核苷酸(L-DNA或L-RNA)、非堿基配對核苷酸類似物和通過2’ -5’核苷酸間磷酸鍵連接至相鄰核苷酸的核苷酸；橋接核酸包括LNA和乙烯橋接的核酸、連接修飾的(如PACE)和堿基修飾的核苷酸以及本文明確公開為非常規(guī)部分的其他部分。如本文所用，對于基因表達，術(shù)語“抑制”、“下調(diào)”、或“降低”意指基因的表達、或、編碼一種或多種蛋白或蛋白亞基的RNA分子或等同RNA分子(如，mRNA)的水平、或一種或多種蛋白或蛋白亞基的活性被降低到低于在不存在抑制因子(諸如核酸分子，如siNA，例如具有如本文所述的結(jié)構(gòu)特征的)下所觀察的；例如表達可被降低至比在不存在抑制劑下觀察到的低 90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%或更小。SiNA核酸分子可從兩條單獨的多核苷酸鏈組裝，其中一條鏈?zhǔn)怯辛x鏈而另一條是反義鏈，其中反義和有義鏈?zhǔn)亲陨砘パa的(即每條鏈包括與另一條鏈中的核苷酸序列互補的核苷酸序列)；諸如其中反義鏈和有義鏈形成具有如本文對所提供的核酸分子所述的任何長度和結(jié)構(gòu)的雙鏈體或雙鏈結(jié)構(gòu)，例如其中所述雙鏈區(qū)(雙鏈體區(qū))是約17至約40(如，約17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40個堿基對)；反義鏈包括與靶核酸分子(即，RhoA或TLR4mRNA)中的核苷酸序列或其部分互補的核苷酸序列，而有義鏈包括對應(yīng)于靶核酸序列或其部分(如，本文的核酸分子的約17至約49或更多核苷酸與靶核酸或其部分互補)的核苷酸序列。在某些方面和實施方案中，本文提供的核酸分子(如，siNA分子)可以是“RISC長度”分子或可以是如下文更詳細地描述的Dicer底物。
siNA核酸分子可包括單獨的有義和反義序列或區(qū)域，其中有義和反義區(qū)可通過如本領(lǐng)域已知的核苷酸或非核苷酸連接體分子共價連接，或可選地通過離子相互作用、氫鍵鍵合、van der Waals相互作用、疏水相互作用、和/或堆疊相互作用非共價地連接。核酸分子可包括與靶基因的核苷酸序列互補的核苷酸序列。核酸分子可以導(dǎo)致靶基因表達的抑制的方式與靶基因的核苷酸序列相互作用?？蛇x地，siNA核酸分子從單一多核苷酸組裝，其中核酸分子的自身互補的有義和反義區(qū)借助基于核酸的或非基于核酸的連接體連接，例如形成本領(lǐng)域熟知的“發(fā)夾”結(jié)構(gòu))。此類siNA核酸分子可以是具有雙鏈體、非對稱雙鏈體、發(fā)夾或非對稱發(fā)夾二級結(jié)構(gòu)、具有自身互補的有義和反義區(qū)的多核苷酸，其中所述反義區(qū)包括與單獨的靶核酸分子或其部分的核苷酸序列互補的核苷酸序列，而有義區(qū)具有對應(yīng)于靶核酸序列(如，RhoA和TLR4mRNA序列)的核苷酸序列。此類siNA核酸分子可以是具有兩個或更多個環(huán)結(jié)構(gòu)和包含自身互補的有義和反義區(qū)的莖的環(huán)狀單鏈多核苷酸，其中所述反義區(qū)包括與靶核酸分子或其部分中的核苷酸序列互補的核苷酸序列，而有義區(qū)具有對應(yīng)于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列，且其中所述環(huán)狀多核苷酸可在體內(nèi)或在體外被加工以產(chǎn)生能夠介導(dǎo)RNAi的活性核酸 分子。以下命名在本領(lǐng)域中經(jīng)常用于描述SiNA分子的長度和突出部分，并可貫穿說明書和實施例使用。給予雙鏈體的名稱指示寡聚體的長度和突出部分的存在或不存在。核酸分子的化學(xué)修飾在某些方面和實施方案中，本文所提供的核酸分子(如，SiNA分子)包括一種或多種修飾(或化學(xué)修飾)。在某些實施方案中，此類修飾包括對核酸分子或多核苷酸的任何改變，該改變將使得該分子不同于標(biāo)準(zhǔn)核糖核苷酸或RNA分子(即，包括標(biāo)準(zhǔn)腺嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、或鳥嘌呤部分)；其可被稱為“未修飾的”核糖核苷酸或未修飾的核糖核酸。由腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或鳥嘌呤部分表示的具有2’-脫氧糖的傳統(tǒng)的DNA堿基和多核苷酸可被稱為“未修飾的脫氧核糖核苷酸”或”未修飾的脫氧核糖核酸”;相應(yīng)地，如本文所用的術(shù)語”未修飾的核苷酸”或”未修飾的核酸”指“未修飾的核糖核苷酸”或”未修飾的核糖核酸”，除非有明確指示相反。此類修飾可以在多核苷酸的核苷酸糖、核苷酸堿基、核苷酸磷酸基團和/或磷酸骨架。在某些實施方案中，如本文公開的修飾可用于增加分子的RNAi活性和/或增加分子的體內(nèi)核酸外切酶和或核酸內(nèi)切酶穩(wěn)定性，特別是在血清中的穩(wěn)定性，和/或增加分子的生物利用度。修飾的非限制性實例包括但不限于核苷酸間或核苷間連接；核堿基修飾和糖修飾。修飾的核苷酸包括具有Northern構(gòu)象的那些，包括鎖核酸(LNA)核苷酸(如，2’_0、4’-C-亞甲基-(D-呋喃核糖基)核苷酸)；2’_甲氧基乙氧基(MOE)核苷酸；2’-甲基_硫代_乙基、2’ -脫氧-2’ -氟核苷酸、2’ -脫氧-2’ -氯核苷酸、2’ -疊氮基核苷酸、和2，-0-甲基核苷酸。鎖核酸、或LNA描述于，例如，Elman等，2005 ;Kurreck等，2002 ；Crinelli 等，2002 ；Braasch 和 Corey, 2001 ；Bondensgaard 等,2000 ；ffahlestedt 等，2000 ；和國際專利公布第 WO 00/47599、WO 99/14226、和 W098/39352 和 WO 2004/083430 號。在一個實施方案中，LNA被摻入有義鏈的5’末端?；瘜W(xué)修飾還包括非鎖核酸或UNA，其是非核苷酸、非環(huán)狀類似物，其中糖的C2，-C3，鍵不存在(盡管UNA不是真正的核苷酸，但是如本文所預(yù)期的，它們明確包括在“修飾的”核苷酸或核酸或非常規(guī)部分的范圍內(nèi))。在特定的實施方案中，具有突出部分的核酸分子可被修飾為在突出部分位置具有UNA ( S卩，2核苷酸鎖縫)。在其他實施方案中，UNA被包括在3’-或5’-端。UNA可位于沿核酸鏈的任何位置，即在位置7。核酸分子可含有一個或多個 UNA。不例性 UNA 公開于 Nucleic Acids Symposium Series No. 52p. 133-134 (2008)。在一些實施方案中，具有3’ -突出部分的如本文所述的核酸分子在3’突出部分包括一個或兩個UNA。在一些實施方案中，如本文所述的核酸分子(如，siNA分子)在反義鏈中包括UNA (例如一個UNA);例如在反義鏈的位置6或位置7?；瘜W(xué)修飾還包括非配對核苷酸類似物，例如如本文所公開的?；瘜W(xué)修飾還包括如本文所公開的非常規(guī)部分。對糖的化學(xué)修飾包括六元“六元環(huán)核苷酸類似物”。六元環(huán)核苷酸類似物的實例公開于 Allart 等(Nucleosides & Nucleotides, 1998,17 :1523-1526 ;和 Perez-Perez 等，1996, Bioorg. and Medicinal Chem Letters6 :1457-1460)。包括 6-兀環(huán)核苷酸類似物包括己糖醇和阿卓糖醇核苷酸單體的寡核苷酸公開于國際專利申請公布第WO 2006/047842號。 化學(xué)修飾還包括“鏡像”核苷酸，其與正常的天然存在的核苷酸相比具有相反的手性；即鏡像核苷酸可以是天然存在的D-核苷酸的“L-核苷酸”類似物(參見美國專利第6，602, 858號)。鏡像核苷酸還可包括至少一種糖或堿基修飾和/或骨架修飾，例如，如本文所述，諸如硫代磷酸或膦酸部分。美國專利第6，602, 858號公開了核酸催化劑，包括至少一種L-核苷酸取代。鏡像核苷酸包括例如L-DNA(L-脫氧核糖腺苷-3’-磷酸(鏡像dA)；L-脫氧核糖胞苷-3’ -憐酸(鏡像dC) ；L-脫氧核糖鳥苷-3’ -憐酸(鏡像dG) ;L_脫氧核糖胸苷_3’ -磷酸(鏡像dT))和L-RNA(L-核糖腺苷_3’ -磷酸(鏡像rA) ；L-核糖胞苷_3’_磷酸(鏡像rC) ;L-核糖鳥苷-3’-磷酸(鏡像rG) ;L_核糖尿嘧啶-3’-磷酸(鏡像 dU)。在一些實施方案中，修飾的核糖核苷酸包括修飾的脫氧核糖核苷酸，例如5’ OMeDNA (5-甲基-脫氧核糖鳥苷-3’ -磷酸)，其可用作5’末端位置(位置編號I)的核苷酸；PACE(脫氧核糖腺嘌呤3’磷乙酸、脫氧核糖胞苷3’磷乙酸、脫氧核糖鳥苷3’磷乙酸、脫氧核糖胸苷3’磷乙酸。修飾可存在于本文公開的核酸分子的一條或多條鏈中，如在有義鏈、反義鏈、或兩條鏈中。在某些實施方案中，反義鏈可包括修飾而有義鏈可僅包括未修飾的RNA。核堿基本文公開的核酸的核堿基可包括未修飾的核糖核苷酸(嘌呤和嘧啶)，諸如腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿苷。一條或兩條鏈中的核堿基可以用諸如以下的天然的和合成的核堿基修飾胸腺嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、肌苷、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、任何“通用堿基”核苷酸；腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、5-鹵素尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4_硫尿嘧啶、8-鹵素、氨基、硫醇、硫烷基、羥基和其他8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤、去氮嘌呤、嘌呤和嘧啶的雜環(huán)取代的類似物如氨基乙氧基吩噁嗪、嘌呤和嘧啶的衍生物(如I-烷基_、I-烯基_、雜芳族-和I-炔基衍生物)和其互變異構(gòu)體、8-氧-N6-甲基腺嘌呤、7- 二氮雜黃嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-(1-丙炔基)尿嘧啶、5-(1-丙炔基)胞嘧啶和4，4-橋亞乙基胞嘧啶)。合適的堿基的其他實例包括非嘌呤和非嘧啶堿基諸如2-氨基吡啶
和三嗪。糖部分本文公開的核酸中的糖部分可包括無任何修飾的2’-羥基-呋喃核糖糖部分?？蛇x地，糖部分可以是修飾的，諸如2’-脫氧-呋喃核糖糖部分、D-核糖、己糖、在呋喃核糖糖部分的2’位置修飾諸如2’ -0-烷基(包括2’ -0-甲基和2’ -0-乙基)，S卩，2’ -烷氧基、2’ -氨基、2’ -0-烯丙基、2’ -S-燒基、2’ -齒素(包括2’ -氟、氯、和溴)、2’ -甲氧基乙氧基、2’ -0-甲氧基乙基、2’ -0-2-甲氧基乙基、2’ -烯丙基氧(-OCH2CH = CH2)、2’ -炔丙基、2’ -丙基、乙炔基、乙烯基、丙烯基、CF、氰基、咪唑、羧酸酯、硫代酯(thioate)、C1至Cltl低級烷基、取代的低級烷基、烷芳基或芳烷基、(^&、0^0-、3-、或^烷基；0_、S、或N-烯基；SOCH3 ；SO2CH3 ；0N02 ;N02、N3 ;雜環(huán)烷基；雜環(huán)烷芳基；氨基烷基氨基；多烷基氨基或取代的甲娃燒基。 燒基基團包括飽和的脂肪基團，包括直鏈燒基基團(如，甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基等)、支鏈烷基基團(異丙基、叔丁基、異丁基等)、環(huán)烷基(脂環(huán)族的)基團(環(huán)丙基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基、環(huán)辛基)、烷基取代的環(huán)烷基基團和環(huán)烷基取代的烷基基團。在某些實施方案中，直鏈或支鏈烷基在其骨架中具有6個或更少碳原子(如對于直鏈為C1-C6、對于支鏈為C3-C6)、和更優(yōu)選地4個或更少。同樣地，優(yōu)選的環(huán)烷基可在其環(huán)結(jié)構(gòu)中具有3-8個碳原子，且更優(yōu)選地在其環(huán)結(jié)構(gòu)中具有5或6個碳原子。術(shù)語C1-C6包括含有I至6個碳原子的烷基基團。烷基基團可以是取代的烷基基團，諸如具有替代烴骨架的一個或多個碳上的氫的取代基的烷基部分。此類取代基可包括，例如烯基、炔基、鹵素、羥基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、烷氧基羰基氧基、芳基氧羰基氧基、羧酸酯、燒基擬基、芳基擬基、燒氧基擬基、氣基擬基、燒基氣基擬基、~■燒基氣基擬基、燒基硫擬基、燒氧基、憐酸、憐酸基、次憐酸基(phosphinato)、氛基、氣基(包括燒基氣基、_■燒基氣基、芳基氨基、二芳基氨基、和烷基芳基氨基)、酰基氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氣基甲酸基和服基)、脈基、亞氣基、疏基、燒基硫基、芳基硫基、硫代竣酸酷、硫酸酷、燒基亞硫?；?、磺酸根合、氨磺?；?、磺酰胺基、硝基、三氟甲基、氰基、疊氮基、雜環(huán)基、烷基芳基、或芳族或雜芳族部分。烷氧基基團包括共價連接至氧原子的取代的和未取代的烷基、烯基、和炔基基團。燒氧基基團的實例包括甲氧基、乙氧基、異丙氧基、丙氧基、丁氧基、和戍氧基基團。取代的烷氧基基團的實例包括鹵素化的烷氧基基團。烷氧基基團可以用諸如以下的基團取代烯基、炔基、齒素、羥基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、烷氧基羰基氧基、芳基氧羰基氧基、羧酸酷、燒基擬基、芳基擬基、燒氧基擬基、氣基擬基、燒基氣基擬基、~■燒基氣基擬基、燒基硫擬基、燒氧基、憐酸、憐酸基、次憐酸基、氛基、氣基(包括燒基氣基、_■燒基氣基、芳基氣基、二芳基氨基、和烷基芳基氨基)、酰基氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲?；头?、脈基、亞氣基、疏基、燒基硫基、芳基硫基、硫代竣酸酷、硫酸酷、燒基亞硫酸基、橫?；?、氨磺?；⒒酋０坊?、硝基、三氟甲基、氰基、疊氮基、雜環(huán)基、烷基芳基、或芳族或雜芳族部分。鹵素取代的烷氧基基團的實例包括但不限于，氟甲氧基、二氟甲氧基、三氟甲氧基、氯甲氧基、二氯甲氧基、三氯甲氧基等。
在一些實施方案中，呋喃核糖環(huán)可用缺乏呋喃核糖環(huán)的C2’ -C3’鍵的非環(huán)狀衍生物替代。例如，無環(huán)核苷酸可用2-羥基乙氧基甲基基團取代通常存在于dNMP中的2’ -脫氧呋喃核糖基糖。鹵素包括氟、溴、氯、碘。骨架本文公開的核酸的核苷亞基可通過磷酸二酯鍵彼此共價連接。磷酸二酯鍵可任選地用其他連接取代。例如，硫代磷酸、硫磷酸-D-核糖實體、三酯、硫代酯、2’-5’橋接的骨架 (還可稱為5’ -2’)、PACE、3’ -(或_5’)脫氧-3’ -(或-5’)硫-硫代磷酸、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、3’ -或-5’)脫氧次磷酸酯、硼代磷酸酯(borano phosphate)、3’ -(或_5’ )脫氧-3’ _(或5’ -)氨基磷酸酰胺、氫膦酸酯(hydrogen phosphonate)、膦酸酯、硼代磷酸酯(borano phosphate esters)、磷酸酰胺、燒基或芳基膦酸酯和磷酸三酯修飾和不含磷的連接例如碳酸酯、氨基甲酸酯、甲硅烷基、硫、磺酸酯、磺酰胺、甲酰基、硫代甲酰基、肟、亞甲基亞氨基、亞甲基甲基亞氨基、亞甲基肼、亞甲基二甲基肼和亞甲基氧甲基亞氨基連接。本文公開的核酸分子可包括肽核酸(PNA)骨架。PNA骨架包括通過肽鍵連接的重復(fù)的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸單元。不同的堿基諸如嘌呤、嘧啶、天然的和合成的堿基通過亞甲基羰基鍵連接到骨架。末端磷酸可在末端磷酸基團進行修飾?？梢允褂貌煌姆€(wěn)定化學(xué)的非限制性實例，如，核酸序列的3’ -端，包括(I) [3-3’ ]-反向脫氧核糖；⑵脫氧核糖核苷酸；(3) [5’ -3’ ]-3’ -脫氧核糖核苷酸；(4) [5’ _3’ ]-核糖核苷酸；(5) [5’ -3’ ]-3’ -0-甲基核糖核苷酸；(6)3’ -甘油基；(7) [3’ -5’ ] -3’ -脫氧核糖核苷酸；(8) [3’ -3’ ]-脫氧核糖核苷酸；(9) [5’ -2’ ]-脫氧核糖核苷酸；和(10) [5-3’ ]_ 二脫氧核糖核苷酸。本文公開的核酸分子(如，siNA、siRNA分子)可以是在兩側(cè)為平端、在兩側(cè)具有突出部分或平端和突出端的組合。突出部分可發(fā)生于有義或反義鏈的5’ -或3’ -端。雙鏈核酸分子(如，siNA)的5’ -和/或3’ -端可以為平端或具有突出部分。在有義鏈或反義鏈中，5 ’ -端可以為平端和3 ’ -端具有突出部分。在其他實施方案中，在有義鏈或反義鏈中，3’ -端可以為平端和5’ -端具有突出部分。在又其他的實施方案中，5’ -和3’ -端均為平端或5’ -和3’ -端均具有突出部分。核酸的一條鏈或兩條鏈的5’ -和/或3’ -端可包括游離羥基基團和/或磷酸基團。任何核酸分子鏈的5’ -和/或3’ -端可以被修飾為包括化學(xué)修飾。此類修飾可穩(wěn)定核酸分子，如3’ -端可由于核酸分子修飾的存在而具有增加的穩(wěn)定性。本文公開的核酸分子(如，siNA、siRNA分子)可包括作為核酸分子中存在的核苷酸總數(shù)的一定百分比的修飾的核苷酸。如此，核酸分子可包括約5%至約100%修飾的核苷酸(如，約 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%修飾的核苷酸)。給定核酸分子中存在的修飾的核苷酸的實際百分比將取決于核酸中存在的核苷酸的總數(shù)。如果核酸分子是單鏈，則百分比修飾可以基于單鏈核酸分子中存在的核苷酸的總數(shù)。同樣地，如果核酸分子是雙鏈，則百分比修飾可以基于有義鏈、反義鏈、或有義鏈和反義鏈二者中存在的核苷酸的總數(shù)?；瘜W(xué)修飾的短干擾核酸(siNA)分子可包括反義區(qū)，其中反義區(qū)中存在的任何(如，一個或多個或全部)嘧啶核苷酸為2’ -O-甲氧基或2’ -脫氧-2’ -氟嘧啶核苷酸。核酸化合物的修飾模式和交替修飾本文提供的核酸分子(如，SiNA分子)可具有修飾的和未修飾的核酸的模式。一連串核苷酸中的核苷酸的修飾模式可以是單一核苷酸或經(jīng)由標(biāo)準(zhǔn)磷酸二酯鍵或至少部分地通過硫代磷酸鍵彼此共價連接的核苷酸組內(nèi)含有的修飾。相應(yīng)地，本文預(yù)期的“模式”不必需要涉及重復(fù)單元，盡管其可以涉及重復(fù)單元。可與本文提供的核酸分子(如，siNA分子)聯(lián)合使用的修飾模式的實例包括公開于Giese，美國專利第7，452，987號中的那些。例如，本文提供的核酸分子(如，siNA分子)包括具有諸如與美國專利第7，452，987號中圖表地顯示的模式相似或相同的修飾模式的那些。在一些包括2’ -0-甲基(2’ -0甲氧基；2’ -0CH3)修飾的核苷酸和非修飾的核苷 酸，優(yōu)選不是2’ -0-甲基修飾的核苷酸的雙鏈核酸分子中，其以交替的方式并入在兩條鏈上，造成交替的2’ -0-甲基修飾的核苷酸和未修飾的或至少不包括2’ -0-甲基修飾的核糖核苷酸的模式。在某些實施方案中，2’ -0-甲基修飾和非修飾的相同序列存在于第二條鏈上；在其他實施方案中，交替的2’ -0-甲基修飾的核苷酸僅存在于有義鏈而不存在于反義鏈；和在又其他的實施方案中，交替2’ -0-甲基修飾的核苷酸僅存在于有義鏈而不存在于反義鏈。在某些實施方案中，兩條鏈之間存在相位移，使得第一條鏈上的2’-0_甲基修飾的核苷酸與第二條鏈上的非修飾的核苷酸堿基配對，反之亦然。核酸化合物的示例性修飾位置和模式雖然下面更詳細地提供了示例性模式，但是預(yù)期了具有本文公開的核酸分子的所有可能的特征和本領(lǐng)域中已知的那些的模式的所有排列(如，包括但不限于以下的特征有義鏈的長度、反義鏈的長度、雙鏈體區(qū)的長度、突出部分的長度、雙鏈核酸分子的一端或兩端是平的或具有突出部分、修飾的核酸的位置、修飾的核酸的數(shù)目、修飾的類型、雙突出部分的核酸分子在每一側(cè)的突出部分上是具有相同或不同數(shù)目的核苷酸、核酸分子中是否使用一種或多于一種類型的修飾和連續(xù)的修飾的/未修飾的核苷酸的數(shù)目)。關(guān)于下面提供的所有詳細的實例，雖然雙鏈體區(qū)顯示為19個核苷酸，但是本文提供的核酸分子可具有I至49個核苷酸長度的雙鏈體區(qū)，因為雙鏈體區(qū)的每條鏈可獨立地是17-49個核苷酸長度。本文提供了示例性模式。本發(fā)明的siRNA分子可通過直接應(yīng)用以載體或稀釋劑配制的裸露的分子遞送至靶組織。術(shù)語”裸露的siRNA”指不含起輔助、促進或利于進入細胞作用的任何遞送載體的siRNA分子，遞送載體包括病毒序列、病毒粒子、脂質(zhì)體制劑、Iipofectin或沉淀劑和類似載體。例如，PBS中的siRNA是“裸露的siRNA”。然而,在一些實施方案中，本發(fā)明的siRNA分子在脂質(zhì)體制劑和Iipofectin制劑和類似制劑中遞送，并可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法制備。此類方法描述于，例如美國專利第5，593，972,5, 589，466，和5，580，859號，其通過引用并入本文。本文使用的具體siRNA分子包括RH0A_4 該分子的未修飾序列為有義5’ > 3’ GCCACTTAATGTATGTTAC和反義5’ > 3’ GTAACATACATTAAGTGGC?；瘜W(xué)修飾的化合物如下
有義5’ rG ；mC ；rC ；mA ；rC ；mU ；rU ；mA ；rA ；mU ；rG ；mU ；rA ；mU ；rG ；mU ；rU ；mA ；rC反義5，mG ；rU ；mA ；rA ；mC ；rA ；mU ；rA ；mC ；rA ；mU ；rU ；mA ；rA ；mG ；rU ；mG ；rG ；mCTLR4_4 該分子的未修飾序列為有義5’ > 3’ GAGTTCAGGTTAACATATA反義5’ >3’ TATATGTTAACCTGAACTC 化學(xué)修飾的化合物如下有義5，rG；mA ；rG ；mU ；rU ；mC ；rA ；mG ；rG ；mU ；rU ；mA ；rA ；mC ；rA ；mU ；rA ；mU ；rA反義5，mU ；rA ；mU ；rA ；mU ；rG ；mU ；rU ；niA ；rA ；mC ；rC ；mU ；rG ；mA ；rA ；mC ；rU ；mC其中核糖核苷酸A、C、G或U之前的“r”指示未修飾的核糖核苷酸而”m”指示2’ -0CH3修飾的核糖核苷酸。定向至相關(guān)靶基因的另外的SiRNA公開于轉(zhuǎn)讓給本發(fā)明的受讓人的PCT專利申請公布第W02008/050329和W02009/044392號，其通過弓I用整體并入本文。話應(yīng)癥脊髓損傷(SCI)在一個實施方案中，CNS的損傷是脊髓損傷(SCI)或脊髓病。SCI或脊髓病是造成感覺和/或運動性損失的脊髓失調(diào)。脊髓損傷的兩種常見類型是由于外傷和疾病。外傷性損傷可由以下造成汽車事故、跌倒、槍擊、潛水事故及其他外傷，和可影響脊髓的疾病，包括脊髓灰質(zhì)炎、脊柱裂、腫瘤、肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)、多發(fā)性硬化(MS)、脊髓空洞癥、橫貫性脊髓炎和弗里德賴希氏共濟失調(diào)。在不同的實施方案中，本文公開的化合物和方法用于治療或預(yù)防脊髓損傷引起的傷害，特別是由電動車輛、跌倒、運動損傷、工業(yè)事故、槍擊傷引起的脊髓外傷，脊柱弱化(諸如因類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或骨質(zhì)疏松)或如果保護脊髓的脊椎管由于正常的老化過程變得太窄(椎管狹窄)引起的脊髓外傷，當(dāng)脊髓被牽拉時、側(cè)壓、或壓縮造成的直接損害，脊髓內(nèi)部或脊髓外部(但在脊椎管內(nèi))流血、流體積累和腫脹后對脊髓的損害。本發(fā)明的耳用藥物組合物還用于治療或預(yù)防由于疾病諸如脊髓灰質(zhì)炎或脊柱裂引起的脊髓損傷造成的損害。其他適應(yīng)癥包括痛覺過敏和異常性疼痛。異常性疼痛異常性疼痛是“其他疼痛”，定義為正常不疼痛的刺激造成的疼痛。該疼痛可發(fā)生 在刺激區(qū)域以外。異常性疼痛和脊髓損傷(SCI)慢性疼痛是SCI最頻繁和令人頭疼的后遺癥之一，經(jīng)常干擾患者的有效康復(fù)。除了在非SCI群體中見到的慢性疼痛綜合征如偏頭痛和皰疹后神經(jīng)痛之外，患有SCI的患者還可遭受SCI獨有的疼痛綜合征。報告的慢性SCI疼痛的發(fā)病率在25%和94%之間變化，這些患者中有近三分之一經(jīng)歷嚴(yán)重的疼痛(Bonica JJ. Introduction semantic,epidemiologic, and educational issues.于Casey KL 編，Pain and central nervoussystem disease the central pain syndromes. New York Raven Press，1991 :13-29 ；Siddall PJ、Taylor DA、McClelland JM、Rutkowski SB、Cousins MJ. Pain report andthe relationship of pain to physical factors in the first six months followingspinal cord injury. Pain 1999 ；81 :187-97 ；Gerhart KA、Johnson RL、WhiteneckGG. Health and psychosocial issues of individuals with incomplete and resolvingspinal cord injuries. Paraplegia 1992 ;30 :282-7)。數(shù)項研究已報告各種類型的 SCI 疼痛的發(fā)病率。肌肉骨骼疼痛是損傷后6個月(40% ) (Siddall PJ. Taylor DA. McClellandJM、Rutkowski SB、Cousins MJ. Pain report and the relationship of pain to physicalfactors in the first six months following spinal cord injury. Pain 1999 ；81 187-97)和 SCI 后 5 年(59 % ) (Siddall PJ、McClelland JM、Rutkowski SB、CousinsMJ. Alongitudinal study of the prevalence and characteristics of pain in thefirst5 years following spinal cord inju ry. Pain 2003 ;103 :249-57)經(jīng)歷的最常見的類型。SCI后5年以上相似地觀察到損傷水平和損傷水平以下神經(jīng)性疼痛發(fā)病率的增加。影響SCI疼痛發(fā)展的變量還不清楚。已考慮了諸如損傷的水平、損傷的完全度、損傷的原因和心理因素的因素(Siddall PJ、Yezierski RP、Loeser JD Taxonomy and epidemiology ofspinal cord injury pain.于Yezierski RPiBurchiel KJ，編Spinal cord injury pain assessment，mechanisms，management. Progress in Pain Research and Management.Vol. 23 Seattle IASP Press，2002 :9-24)。肌肉骨骼疼痛在具有胸廓水平損傷的患者中更常見，并被報告在SCI后2周具有手術(shù)干預(yù)的那些患者中發(fā)病率更高(Sved P.Siddall PJ、McClelland JM、Cousins MJ. Relationship between surgery and pain following spinalcord injury. Spinal Cord 1997;35:526-30)。觀察到與異常性疼痛有關(guān)的神經(jīng)性疼痛在具有不完全脊髓病損的患者中、在頸而不是胸廓脊髓損傷中、和在中央脊髓綜合征中更常見(Siddall PJ、Taylor DA、McClelland JM、Rutkowski SB、Cousins MJ. Pain report andthe relationship of pain to physical factors in the first six months followingspinal cord injury. Pain 1999;81:187-97)。SCI后疼痛類型除了 Tier 2下SCI疼痛的四種主要類型外，存在其他公認的疼痛病癥，其中大多數(shù)在 International Association for the Study of Pain Taxonomy 中是在 Tier 3 下(Siddall PJ,Yezierski RP，Loeser JD. Pain following spinal cord injury clinicalfeatures，prevalence, and taxonomy. International Association for the Study ofPain Newsletter 2000;3:3-7)。這些需要進行臨床鑒定以便可制定適當(dāng)?shù)闹委?。肌肉骨骼疼痛脊柱的機械不穩(wěn)定性這種類型的疼痛是由韌帶/關(guān)節(jié)的受損或骨折引起的，造成脊柱的不穩(wěn)定性。其發(fā)生在損傷后早期，并位于脊柱靠近SCI位點的區(qū)域。其與位置有關(guān)，隨活動惡化并隨休息降低。通過放射照相、計算機斷層掃描或MRI輔助診斷以鑒定病理學(xué)的性質(zhì)和位點。肌肉痙攣疼痛痙攣狀態(tài)定義為特征在于具有夸張的腱反射的緊張性牽張反射(肌肉緊張)的速度依賴性增加的運動障礙，由牽張反射的興奮性過高引起。對α運動神經(jīng)元和肌肉的眾多興奮性和抑制性調(diào)節(jié)突觸影響中的任何的不平衡造成牽張反射弧的活性過高。這一疼痛類型通常發(fā)生于SCI后晚期，并經(jīng)常鑒于具有不完全SCI的人中。損傷水平神經(jīng)性疼痛節(jié)段性去傳入/Girdle或Border或移行帶疼痛這是發(fā)生在二至四節(jié)段帶內(nèi)的SCI的損傷水平以上或以下的損傷水平神經(jīng)性疼痛的變化形式。其經(jīng)常發(fā)生在正常感覺的和麻醉的皮膚邊界。
脊髓空洞癥由于瘺管(即，脊髓中的異常囊腫)的疼痛經(jīng)常以延遲發(fā)作發(fā)生，平均為6年。具有頸損傷的對脊髓中央部分的損害造成中央脊髓綜合征，特征為臂的疼痛和虛弱，以及相對強壯但僵硬的腿功能。脊髓空洞癥的疼痛有時描述為具有異常性疼痛的不斷的灼燒性疼痛。損傷水平以下神經(jīng)性疼痛中央觸物感痛綜合征/中央疼痛/去傳入疼痛彌散性地位于SCI水平尾側(cè)，即遍及從肩到足的整個身體的疼痛，典型的損傷水平以下神經(jīng)性疼痛。該疼痛可與痛覺過敏有關(guān)并可隨時間逐漸惡化。其自發(fā)和/或誘發(fā)發(fā)作地發(fā)生，并經(jīng)常因感染、突然的噪音、和沖突性運動而惡化。SCI疼痛的病理學(xué)和機制
與SCI有關(guān)的疼痛是特征為機械性外傷造成的病理學(xué)變化的損傷和脊髓實質(zhì)的血管受累兩者的結(jié)果。其受病損的性質(zhì)、所損害的神經(jīng)結(jié)構(gòu)和存活組織的次級病理學(xué)變化的影響。存在至少三種建議的SCI疼痛背后的基礎(chǔ)機制增加的神經(jīng)元興奮性過高、降低的抑制、和神經(jīng)元再組織或可塑性。增加的神經(jīng)元興奮性過高外傷性或缺血性SCI后SCI的初始結(jié)果是興奮性氨基酸的短暫但顯著的增加，這觸發(fā)次級病理學(xué)變化的損傷級聯(lián)。這一脊柱“中央損傷級聯(lián)”的主要組成包括共同地相互作用以增加損傷水平的神經(jīng)元響應(yīng)性的解剖學(xué)、神經(jīng)化學(xué)、興奮性中毒和炎性事件，造成產(chǎn)生異常性疼痛和痛覺過敏的臨床癥狀(Yezierski RP. Pathophysiology and animalmodels of spinal cord injury pain.于Yezierski RP, Burchiel KJ,編 Spinal cordinjury pain assessment, mechanisms, management. Progress in pain research andmanagement. Vol. 23. Seattle IASP Press, 2002 :117-36)。現(xiàn)有治療詵擇藥理學(xué)治療一線藥物治療包括全身性利多卡因、加巴噴丁、和普加巴林。二線藥物治療包括單獨或與抗癲癇藥聯(lián)合的三環(huán)抗抑郁劑。三線藥物治療包括氯胺酮、阿片樣物質(zhì)、選擇性血清素再吸收抑制劑、其他抗癲癇藥、鞘內(nèi)嗎啡與可樂定、和鞘內(nèi)巴氯芬。具有局部疼痛癥狀的患者可響應(yīng)于局部利多卡因治療。在彌散性和復(fù)雜性綜合征中，建議最低劑量的加巴噴丁或去甲替林進行初始初始藥物治療，然后逐漸滴定至期望的止痛效應(yīng)和最少的不利效應(yīng)。充分試驗后對藥物的不完全或部分響應(yīng)可通過添加具有不同作用機制的另一藥物來增強。神經(jīng)增強治療SCI疼痛的神經(jīng)增強選擇包括經(jīng)皮電神經(jīng)刺激、脊髓刺激、和深度腦刺激，所有這些都幾乎沒有效力證據(jù)。手術(shù)治療在眾多類型的SCI疼痛中，僅有一些可用手術(shù)成功緩解。這些包括用于穩(wěn)定脊柱的脊柱融合術(shù)、神經(jīng)根壓迫的手術(shù)減壓、和瘺管的引流與分流，其可能需要隨后的脊髓去栓系。其他手術(shù)治療，包括脊髓前側(cè)柱切斷術(shù)、索帶切除術(shù)(cordectomy)、脊髓切開術(shù)、和背根進入?yún)^(qū)病損(特別是對于損傷水平神經(jīng)性疼痛)具有有限的效力證據(jù)。
脊柱康復(fù)康復(fù)治療是恢復(fù)具有SCI的患者的功能獨立性和改善其生活質(zhì)量的治療的主要組成之一。然而證實各種康復(fù)治療的效力的證據(jù)非常有限。物理治療包括鍛煉和水療法、姿勢再教育、壓力緩解、使用物理輔助諸如拐杖、矯形器和輪椅和其他物理形式。遺憾的是，物理治療沒有幫助降低神經(jīng)性SCI疼痛。治療方法
在一方面，本發(fā)明提供治療有相應(yīng)需要的受治療者中的CNS疾病、疾患或損傷的方法，方法包括以有效治療受治療者的量和時間段經(jīng)由實質(zhì)內(nèi)遞送或腰椎穿刺向受治療者的脊髓直接地施用定向至與CNS疾病、疾患或損傷有關(guān)的靶基因的至少一種寡核苷酸化合物。具體的疾病、疾患和損傷在本文公開，并包括神經(jīng)病變，包括糖尿病相關(guān)的神經(jīng)病變、痛覺過敏和異常性疼痛。靶基因的實例在本文公開。RhoA和TLR4是在實施本發(fā)明中有用的特別靶基因。神經(jīng)病變、包括糖尿病相關(guān)的神經(jīng)病變、痛覺過敏和異常性疼痛中任何一種的治療可能需要長期護理和疼痛管理形式。疼痛管理的目標(biāo)是提供癥狀緩解和改善個體進行日常活動的水平。在另一方面，本發(fā)明提供減弱患有CNS疾病、疾患或損傷的受治療者中的靶基因的表達的方法，方法包括以有效減弱靶基因的表達的量和時間段經(jīng)由實質(zhì)內(nèi)遞送或腰椎穿刺向受治療者的脊髓直接地施用定向至與CNS疾病、疾患或損傷有關(guān)的靶基因的至少一種寡核苷酸化合物。在一些實施方案中，方法還包括以有效減弱祀基因的表達的量和時間段經(jīng)由實質(zhì)內(nèi)遞送或腰椎穿刺的至少一種藥理學(xué)劑、CNS疾患或損傷。在一些實施方案中，藥理學(xué)劑選自非甾體抗炎藥(NSAID)、甾體抗炎藥、抗炎劑、抗生素、抗病毒劑、自由基清除劑、抗癌劑和化療劑。在一些實施方案中，CNS疾病、疾患或損傷與選自以下的基因的表達有關(guān)傷害性感受器、APP、MAPT, SODl、BACEl、CASP3、TGM2、NFE2L3、TARDBP, ADRBl、CAMK2A、CBLNl、CDK5R1、GABRAU MAPK10、NOSU NPTX2、NRGN、NTS、PDCD2、PDE4D、PENK, SYTU TTR、FUS、LRDD, CYBA、ATF3、ATF6、CASP2、CASPl、CASP7、CASP8、CASP9、HRK、ClQBP、BNIP3、MAPK8、MAPK14、Racl、GSK3B、P2RX7、TRPM2、PARG、CD38、STEAP4、BMP2、GJAI、TYROBP、CTGF、ANXA2、RHOA, DUOXl、RTP801、RTP801L、N0X4、NOXl、N0X2 (gp91pho、CYBB)、N0X5、DU0X2、N0X01、N0X02 (p47phox、NCFI)、NOXAl、N0XA2 (p67phox、NCF2)、p53 (TP53)、HTRA2、KEAPl、SHCl、ZNHITl、LGALS3、HI95、S0X9、ASPPl、ASPP2、CTSD, CAPNSl、FAS 和 FASLG、NOGO 和 NOGO-R ；TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、ILlbR、MYD88、TICAM、TIRAP, HSP47。下面的表A提供了與每種靶基因有關(guān)的mRNA的基因標(biāo)識號(GI)和登錄號。
權(quán)利要求
1.一種治療或預(yù)防受治療者中的神經(jīng)性疼痛的方法，包括以有效治療或預(yù)防受治療者中的神經(jīng)性疼痛的量向所述受治療者施用定向至選自RhoA或TLR4的靶基因的雙鏈RNA化合物。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述雙鏈RNA化合物通過腰椎注射施用。
3.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其中所述神經(jīng)性疼痛與脊髓損傷或與周圍神經(jīng)系統(tǒng)損傷有關(guān)。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述神經(jīng)性疼痛與脊髓損傷有夫。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述脊髓損傷包含神經(jīng)外傷或缺血性損傷。
6.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述神經(jīng)性疼痛包含異常性疼痛。
7.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其中所述雙鏈RNA是化學(xué)修飾的siRNA。
8.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其中所述受治療者是人受治療者。
9.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述雙鏈RNA在損傷后0小時至48小時之間施用給所述受治療者。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述雙鏈RNA在損傷后0小時至24小時之間施用給所述受治療者。
11.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述神經(jīng)性疼痛與選自由以下組成的組的病癥有關(guān)外傷性神經(jīng)損傷、缺血后、纖維肌痛、反射性交感神經(jīng)營養(yǎng)不良、復(fù)雜區(qū)域性疼痛綜合征、坐骨神經(jīng)痛、幻肢痛、糖尿病性神經(jīng)病變和癌癥化療誘導(dǎo)的神經(jīng)性疼痛。
12.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述神經(jīng)性疼痛由以下引起惡性腫瘤、中風(fēng)、皰疹后神經(jīng)痛、具有單克隆蛋白的神經(jīng)病變、血管炎性神經(jīng)病變、與格-巴ニ氏綜合征有關(guān)的神經(jīng)病變、與法布里病有關(guān)的神經(jīng)病變、炎性病癥、包括多發(fā)性硬化在內(nèi)的自身免疫性疾患、毒素、藥物、遺傳性異常、乳房切除術(shù)或截肢術(shù)。
13.一種治療患有與靶基因的表達有關(guān)的CNS疾病、疾患或損傷的受治療者的方法，包括以有效治療所述受治療者的量向所述受治療者的脊柱局部地施用定向至所述靶基因的雙鏈RNA化合物，其中所述靶基因選自表A所列的基因。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述靶基因選自由以下組成的組=RhoA和TLR4。
15.如權(quán)利要求13或14所述的方法，其中所述雙鏈RNA化合物實質(zhì)內(nèi)施用和/或通過腰椎注射施用。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述雙鏈RNA化合物實質(zhì)內(nèi)施用。
17.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述雙鏈RNA化合物通過腰椎注射施用。
18.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述雙鏈RNA是siRNA。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中siRNA化合物作為裸露的siRNA施用。
20.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述疾病、疾患或損傷包含神經(jīng)變性。
21.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述疾病、疾患或損傷包含運動功能喪失。
22.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述疾病、疾患或損傷包含白質(zhì)丟失。
23.如權(quán)利要求13或14所述的方法，其中所述受治療者患有疼痛。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述疼痛是神經(jīng)性疼痛。
25.如權(quán)利要求13或14所述的方法，其中所述受治療者是人受治療者。
26.如權(quán)利要求I或13所述的方法，其中所述方法包括向所述受治療者施用選自以下的另外的藥理學(xué)劑非留體抗炎藥(NSAID)、留體抗炎藥、抗炎劑、抗生素、抗病毒劑、自由基清除劑、抗癌劑和化療劑或其任何組合，以同時、合并、分別或相繼用于治療所述受治療者。
27.一種恢復(fù)受治療者中的運動功能的方法，包括以有效恢復(fù)所述受治療者中的運動功能的量向受治療者的脊柱局部地施用定向至與所述受治療者中的運動功能喪失有關(guān)的靶基因的雙鏈RNA化合物。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中運動功能的恢復(fù)是運動功能的部分或完全恢復(fù)。
29.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述受治療者患有CNS損傷。
30.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述雙鏈RNA化合物通過腰椎注射施用。
31.一種減弱患有CNS損傷的受治療者中與CNS中靶基因的表達有關(guān)的疼痛的方法，包括以有效減弱所述受治療者中的疼痛的量向所述受治療者施用定向至靶基因的雙鏈RNA化合物，其中所述雙鏈RNA化合物通過腰椎注射施用。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述靶基因是RhoA或TLR4。
33.ー種保留患有CNS損傷的受治療者的脊髄中的白質(zhì)的方法，包括以有效保留所述受治療者中的白質(zhì)的量向所述受治療者施用定向至CNS中的靶基因的雙鏈RNA化合物，其中所述雙鏈RNA化合物通過腰椎注射施用。
34.一種預(yù)防患有CNS損傷的受治療者中的異常性疼痛的方法，包括以有效預(yù)防所述受治療者中的異常性疼痛的量向所述受治療者施用定向至CNS中的靶基因的雙鏈RNA化合物，其中所述雙鏈RNA化合物通過腰椎注射施用。
35.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述靶基因是RhoA或TLR4。
36.一種促進患有CNS損傷的受治療者中的血清素能纖維生長的方法，包括以有效預(yù)防所述受治療者中的異常性疼痛的量向所述受治療者施用定向至CNS中的靶基因的雙鏈RNA化合物，其中所述雙鏈RNA化合物通過腰椎注射施用。
37.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述靶基因是RhoA或TLR4。
全文摘要
本申請至少部分涉及向人或動物患者的脊髓施用小干擾RNA(siRNA)的方法，并且還涉及治療脊髓損傷和其他CNS疾病和疾患的方法。具體地，本申請公開了以有效劑量局部地、直接地和不需要轉(zhuǎn)導(dǎo)載體地遞送siRNA化合物和制劑到受損傷的脊髓以促進CNS功能恢復(fù)和或異常性疼痛減弱的方法。
文檔編號C12N15/11GK102666856SQ201080052820
公開日2012年9月12日 申請日期2010年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月8日
發(fā)明者埃琳娜·費因斯坦, 馬丁·格呂梅 申請人:夸克醫(yī)藥公司, 新澤西州立拉特格斯大學(xué)