專利名稱：攜帶可誘導性共刺激分子基因的腺病毒載體及其構建方法與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及ー種攜帶可誘導性共刺激分子基因的腺病毒載體及其構建方法，以及該腺病毒載體在制備預防和治療移植物抗宿主疾病中的應用。
背景技術：
基因治療是指運用DNA轉(zhuǎn)移來治療或預防人類疾病，是在20世紀60年代隨著多學科的發(fā)展而逐漸醞釀形成的。基因治療最初是以治療單基因遺傳病為主，而今已廣泛應用于腫瘤等疾病的治療研究?；蛑委熒婕澳康幕?、載體及受體細胞三方面。在基因治療過程中，正?；蛉绾螌氚屑毎悄芊駥崿F(xiàn)治療目的的關鍵?；蛑委煹耐緩接袃深悺）`類是in vivo途徑，即直接體內(nèi)途徑，把帶有目的基因的重組表達載體直接導入患者體內(nèi)有關的器官組織或細胞內(nèi)以達到治療目的。這種途徑簡便，如肌肉注射、靜脈注射、器官內(nèi)灌注、皮下包埋等，但在技術上還不太成熟，轉(zhuǎn)染效率往往較低，還存在療效短、免疫排斥及安全性等問題。另ー類是ex vivo途徑，即先體外后體內(nèi)途徑，先在體外將目的基因?qū)胼d體細胞，然后再把轉(zhuǎn)基因的載體細胞回輸給患者，載體細胞在體內(nèi)表達目的基因達到治療目的。這種途徑在技術上比較成熟、安全、易控制，但步驟少ヽ復雜ο基因轉(zhuǎn)移的方法包括物理方法，如電穿孔法、基因槍法等；化學方法，如脂質(zhì)體法、磷酸鈣共沉淀法等；生物學方法，主要指應用病毒載體介導的基因轉(zhuǎn)移，這是目前基因治療中應用最多的基因轉(zhuǎn)移方法。目前比較常用的病毒載體是經(jīng)過改造的無害病毒，如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒(adenovirus，Ad)、腺相關病毒、單純皰疹病毒等，它們轉(zhuǎn)移DNA非常有效，可以通過其特定機制把目的基因轉(zhuǎn)移到細胞中，但各種病毒載體均有其各自的優(yōu)缺點腺病毒是呈二十面體対稱的雙鏈DNA (dsDNA)病毒。病毒顆粒具有252個殼粒，其中12個位于頂角的殼粒稱五鄰體，其余的稱六鄰體。每個頂角殼粒上有一條長度為10 30nm的纖維蛋白，纖維蛋白的抗原決定簇決定了病毒的種特異性和亞屬特異性。腺病毒進入人體細胞進行復制，是以纖維蛋白的節(jié)區(qū)與細胞表面CAR相接觸開始的。五鄰體基底部含有5個Arg-Gly-Asp (RGD)序列，與細胞表面的α ν β 3禾Π α ν β 5整合素結合，介導腺病毒的內(nèi)移。腺病毒的吸附和內(nèi)化是兩個不同的過程，需要五鄰體的纖毛和基體分別與其相應的受體結合。腺病毒通過內(nèi)吞小泡通路進入細胞的方法可以避免被溶酶體降解，隨著內(nèi)吞小泡中的PH值降低，纖毛從病毒外殼脫落，緊接著五鄰體基部也從外殼解開，整個病毒外殼崩解，腺病毒的DNA從溶解的內(nèi)吞小泡釋放到宿主細胞的核中，這個過程需時約40分鐘。腺病毒載體是目前基因治療研究和臨床試驗中應用最廣泛的病毒載體之一，其使用率僅次于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。腺病毒具有如下優(yōu)勢1、宿主范圍寬廣；2、轉(zhuǎn)染效率高； 3、可插入外源基因片段大，外源基因表達穩(wěn)定；4、制備滴度高(病毒滴度可達到1012 1013pfu/ml)，易于純化；5、既可感染分裂期細胞又可感染分裂后細胞；6、不整合到宿主染色體，無插入突變。但其也有不足之處1、能引起宿主細胞免疫和體液免疫，使腺病毒及外源基因表達產(chǎn)物易被清除；2、不能充分感染某些具有臨床重要性的細胞類型；3、不能專ー 殺傷靶細胞，特異性較低。目前應用的第一代腺病毒載體(Ad 5型)是用目的基因及其增強子/啟動子序列插入其El區(qū)或E3區(qū)得到的復制缺陷型腺病毒載體，由含El基因的人胚腎細胞293包裝成重組腺病毒。人腺病毒已發(fā)現(xiàn)51種血清型，分為A、B、C、D、E、F六個亞群，Ad5屬于C亞群，這類以CAR為受體的腺病毒存在如下問題1、對靶細胞感染效率不高；2、在體內(nèi)會引起嚴重毒副作用；3、人體內(nèi)廣泛存在5型腺病毒的中和抗體，導致病毒在體內(nèi)很快被免疫系統(tǒng)清除；4、病毒對細胞的感染效率依賴于細胞表面CAR受體的表達水平，而造血系統(tǒng)細胞、 骨骼肌細胞、干細胞、樹突狀細胞、原代腫瘤細胞等重要細胞表面CAR表達量很低。這些問題限制了 Ad5的廣泛應用。造血干細胞移植是治愈惡性血液疾病的重要途徑，但是造血干細胞移植過程中的并發(fā)癥仍是導致患者死亡的重要因素，其中最突出的就是移植物抗宿主病 (graft-versus-host disease GVHD)。如何防治GVHD是造血干細胞移植面臨的嚴峻挑戰(zhàn)。急性GVHD的病理過程主要分為三階段移植預處理引起宿主組織的炎癥反應；宿主抗原遞呈細胞激活供體T淋巴細胞，引起相應的細胞因子分泌；這些細胞因子激活末期炎癥介質(zhì)(TNF-α、IL-1)，聯(lián)合細胞毒性T細胞和NK細胞毒性殺傷作用，攻擊肝臟、皮膚、胃腸道等移植GVHD靶器官，出現(xiàn)相應GVHD表現(xiàn)。因此，供體來源的T淋巴細胞是引起GVHD的直要因索(Appelbaum F. R. Haematopoietic cell transplantation as immunotherapy. Nature. 2001 ；411 :385-389)。T細胞發(fā)揮效應，除了特異性抗原信號作用于T細胞受體外，還需要抗原提呈細胞(APC)提呈的共刺激信號激活，其中最主要的是OT^/CTLA4-B7、⑶40L-⑶40，但阻斷這兩個通路并不能避免移植排斥的發(fā)生。ICOS是T細胞上發(fā)現(xiàn)的可誘導性共刺激因子(Inducible Co-stimulator, I COS)，其結構與CD28相似、基因位點相近，其配體為 B7h(Jun li, Kenrick Semple, Woong-Kyung Suh, et al. Roles of CD 18, CTLA4 and Inducible Costimulator in Acute Graft-versus-disease in mice. Biol Blood Marrow Transplant. 2011 ；17 :962-969)。ICOS表達在激活的CD4+和CD8+T細胞表面，主要功能為增強回憶增殖反應，以及使剛激活的T細胞產(chǎn)生細胞因子，如IL-4、IL-5、IFN- y , TNF-α 等，起著介導T細胞效應的功能。因此如果阻斷ICOS-B^1的信號傳導途徑，即可抑制移植物中的T細胞活化以及相關細胞因子的生成，減輕GVHD的發(fā)生(Nanji SA, Hancock WW, Luo B, et al. Costimulation blockade of both inducible costimu丄ator and CD40 ligand induces dominant tolerance to islet allografts and prevents spontaneous autoimmune diabetes in the NOD mouse. Diabetes. 2006 ；55 :27-33. Chen Y, Liu H, Liu L, et al. Blockade of inducible costimulator pathway to prevent acute rejection in rat liver transplantation. Am J Surg. 2009 ；198 :244—249)。目前尚未見有關攜帯可誘導性共刺激分子基因的腺病毒載體的相關報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種攜帶可誘導性共刺激分子基因的腺病毒載體，本發(fā)明
5的另ー目的是提供上述腺病毒載體的構建方法及其應用。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的具體技術方案如下本發(fā)明提供ー種腺病毒載體本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)腺病毒的組織嗜向性主要由其Fiber 決定，因此將Ad5 Fiber的knob和Shaft替換為Adll Fiber的knob和shaft構建而成的嵌合型腺病毒載體Ad5/11仍具有Adl 1的感染特性，能有效感染低表達CAR的細胞，對MSCs 等干細胞有很高的感染效率，基因表達水平很高，且細胞毒性較低。本發(fā)明采用Ad5和Adll 嵌合型病毒載體，以提高對MSCs的感染效率。其攜帯的增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)作為報告基因可用于熒光顯微鏡觀察，直接判斷轉(zhuǎn)染效率。并將mICOS基因插入上述的改造后的腺病毒載體。引物合成方法采用PCGENE軟件中的PCRPLAN程序，設置各參數(shù)最適Tm = 66， Tm允許范圍50 80，引物長度15 25，G_C含量40% 60%，引物內(nèi)互補最大值為3，3， 端G-C添加為1，引物與模板其它位點同源最大值為60%。經(jīng)過運算，獲得較佳的引物序列， 具體如下，并由基康基因公司合成。mICOS基因的上游引物GT144 5' CCG GAA TT CAC CAT GAA GCC GTA CTT C 3' (SEQ ID NO 1)mICOS基因的下游引物GT145 5' GCG TCG ACT TAT CAG GGG CTG TTG GTG 3' (SEQ ID NO :2)mICOS基因的獲得方法合成GT144、GT145引物，pEGFP-Nl-mIC0S質(zhì)粒行PCR擴増，擴增產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳，用膠回收試劑盒OlIAquick Gel Extraction)回收大小為 621bp 的 mICOS 片段(SEQ ID NO 3)。本發(fā)明提供了一種攜帶可誘導性共刺激分子基因的腺病毒載體，其構建方法如下將腺病毒載體Ad5 Fiber的knob和Shaft替換為Adll Fiber的knob和shaft構建而成的嵌合型腺病毒載體Ad5/ll，并攜帶增強型綠色熒光蛋白(EGFP)，在嵌合型腺病毒載體 Ad5右臂的El區(qū)位置插入攜帯可誘導性共刺激分子基因(mICOS)。所述的攜帯可誘導性共刺激分子基因的腺病毒載體，詳細的構建方法如下1、PDC318_mIC0S 載體的構建a.引物合成ml COS基因的上游引物GT144 5' CCG GAA TT CAC CAT GAA GCC GTA CTT C 3'ml COS基因的下游引物GT145 5' GCG TCG ACT TAT CAG GGG CTG TTG GTG 3'b. mICOS基因的獲得pEGFP-m-mIC0S質(zhì)粒行PCR擴增，引物為步驟a所獲得的GT144、GT145，擴增產(chǎn)物用0. 8 %瓊脂糖凝膠電泳，用膠回收試劑盒^jIAquick Gel Extraction)回收大小為621bp的mICOS片段。c. mICOS基因獲得后的酶切將步驟b中所獲得的mICOS片段于37°C水浴2小時后，用QIAquick柱回收，得到大小為621bp的mICOS目的片段。d.PDC318載體的酶切用EcoR I和Sal I酶切，37°C水浴4小時后，用1. 2%瓊脂糖凝膠電泳，用膠回收試劑盒(MN Gel Extraction)回收大小為3895bp的DNA片段。e. PDC318-mIC0S的合成將步驟c中所獲得的mICOS目的基因片段與步驟d中所獲得的PDC318載體進行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5ci大腸桿菌感受態(tài)細胞，鋪瓊脂板(含 AMP)后，37°C生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10 12h。挑取生長的細菌單克隆，在含氨芐青霉素的LB 溶液中，37°C搖床擴增12h。抽提陽性克隆的質(zhì)粒DNA，酶切鑒定正確后命名PDC318_mIC0S。2、Ad5/Fllb-mIC0S-EGFP病毒的重組及鑒定，其特征在于將質(zhì)粒PDC318_mIC0S 與含有5型腺病毒右臂的質(zhì)粒pPE3-Fl IB-EGFP通過Lipofectamine 2000共轉(zhuǎn)染至293細胞，mICOS基因被插入到腺病毒基因組的El區(qū)。共轉(zhuǎn)染后9 14天細胞出現(xiàn)病毒空斑，經(jīng)過3次病毒空斑純化，應用QIAamp DNA Blood Mini Kit提取腺病毒DNA，進行PCR鑒定，經(jīng)鑒定正確的腺病毒命名為Ad5/Fllb-mIC0S-EGFP，即攜帶mICOS基因的非增殖型腺病毒。3、病毒的擴增、滴度測定及純化，其特征在于，該方法的具體步驟為a. 293細胞的培養(yǎng)b.病毒的擴增，其特征在于步驟3a中所培養(yǎng)細胞5 X IO6,取0. 5ul首次擴增的病毒保存液，加入10% NCS/DMEM至1ml，混勻。移去培養(yǎng)液，小心加入病毒混合液，十字形慢慢晃動3次，37°C、5% CO2孵箱中培養(yǎng)120分鐘，加入9ml 10% NCS/DMEM，再培養(yǎng)72小時， 收集細胞，600Xg離心5分鐘沉淀細胞，用病毒保存溶液重懸細胞，-20°C至37°C凍融3次， 臺式離心機上以最大速率離心20分鐘去除細胞碎片，收集上清，反復擴增至需要病毒量。c. 50%組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)法測定病毒滴度。測得重組腺病毒滴度達到 4. 9X109pfu/mlod.氯化銫密度梯度離心法純化病毒。病毒置于_80°C保存。本發(fā)明還提供了上述的攜帯可誘導性共刺激分子基因的腺病毒載體在制備預防和治療移植物抗宿主疾病(GVHD)中的應用。本發(fā)明人選擇了骨髄間充質(zhì)干細胞(MSCs)作為攜帶ICOS基因的載體細胞。MSCs 是ー種來源于骨髓基質(zhì)的中胚層干細胞，也能從其他組織，如脂肪、視網(wǎng)膜、肝臟、內(nèi)耳、胃上皮、羊水、胎盤、臍帶、毛囊、牙齒中分離出來。MSCs具有高度的自我更新能力和多向分化潛能，可以在體外被誘導分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、成纖維細胞、肌細胞、神經(jīng)細胞等，具有干細胞特性。它易于在體外培養(yǎng)擴增，細胞表面表達ka-Ι、⑶44丄擬9、⑶73、 CD90、CD105、CD106，不表達 CD45、CD34、CD14、CD1 Ib、CD19、CD79、CD31、HLA DR，其免疫表型普遍表現(xiàn)為MHC-I+、MHC-II-、CD40-、CD80-、CD86-，因此不具有免疫原性。這些優(yōu)勢使MSCs 在基因治療中具有較好的應用前景，是目前基因治療中應用較廣的載體細胞。選用MSCs作為載體細胞更為重要的原因是，國內(nèi)外多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)MSCs還具有很多特性1、促進造血干細胞植入、加速造血重建；2、具有免疫調(diào)節(jié)作用，減輕GVHD ;3、體內(nèi)向炎癥組織、受損傷的 GVHD靶組織聚集，參與受損組織的修復。MSCs的這些特性不僅利于將攜帯的目的基因ICOS 帶到aGVHD受損的靶組織，增加目的基因在體內(nèi)的靶向性，而且利于移植后小鼠造血恢復、 預防aGVHD，實現(xiàn)了細胞治療和基因治療的完美結合。體外實驗證實MSCs作為靶細胞具有很高的基因轉(zhuǎn)染效率及可以長期獲得表達。 體內(nèi)實驗證實，MSCs具有向受損傷組織歸巢的特性。目前，已有很多研究將MSCs作為基因治療的載體細胞，治療某些缺陷性疾病、腫瘤和急性GVHD等。本發(fā)明構建的攜帯ICOS基因的腺病毒載體，轉(zhuǎn)染至小鼠骨髄來源、人骨髓來源、 人臍帶組織來源的間充質(zhì)干細胞，形成MSC-ICOS細胞，具體技術方案如下1、Ad5/Fl lb-mlCOS-EGFP 轉(zhuǎn)染小鼠骨髓來源 MSC
A、ICOS轉(zhuǎn)染小鼠骨髓來源MSCs 轉(zhuǎn)染將所培養(yǎng)小鼠骨髄來源MSCs細胞以IXlO5/孔的密度接種于對孔板中，待細胞完全貼壁后，移去培養(yǎng)液，每孔加入0. 5ml新鮮的DMEM完全培養(yǎng)基，取lul、2ul、5ul、 IOul、20ul、50ul Ad5/Fl lb-mIC0S-EGFP病毒液分別加入各孔，十字形慢慢晃動混勻，37°C、 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4小時后更換新鮮的mMSCs維持培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后不同時間點于熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達情況。B、轉(zhuǎn)染后細胞生物學特性的鑒定每日在倒置顯微鏡下觀察MSCs-ICOS、MSCs-EGFP和MSCs的形態(tài)及生長狀態(tài)，三種細胞形態(tài)無明顯差異；三種細胞接種后每天計數(shù)細胞數(shù)，繪制三種細胞的生長曲線，生長曲
線基本一致。流式細胞儀檢測MSCs-ICOS、MSCs-EGFP和MSCs表面抗原表達，主要為ぶca_l、 CD29、CD44、CD90. 2、Flk-1、CDl 17、CD34、MHC-I、MHC_II 類抗原。三種細胞經(jīng)成脂肪誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)10 14天后，光鏡下均呈現(xiàn)脂肪細胞形態(tài)，油紅0染色均呈現(xiàn)橙紅色脂滴；經(jīng)成骨細胞培養(yǎng)10 14天后，光鏡下均呈現(xiàn)多角形、不規(guī)則性、體積增大的細胞形態(tài)，AKP染色均見胞漿有深紫色沉淀。2、Ad5/Fllb-mIC0S-EGFP 轉(zhuǎn)染正常人骨髓來源 MSCA、ICOS轉(zhuǎn)染人骨髓來源MSCs 轉(zhuǎn)染將所培養(yǎng)人骨髓來源MSCs細胞以IX IO4/孔的密度接種于M孔板中，待細胞完全貼壁后，移去培養(yǎng)液，每孔加入0. 2ml新鮮的DMEM完全培養(yǎng)基，取0. IuUO. 2ul、 0. 5ul、lul、l. 5ul、2ul Ad5/Fllb-mIC0S_EGFP病毒液分別加入各孔，十字形慢慢晃動混勻， 37°C,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4小時后更換新鮮的MSCs維持培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后不同時間點于熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達情況。B、轉(zhuǎn)染后細胞生物學特性的鑒定毎日在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及生長狀態(tài)，三種細胞形態(tài)無明顯差異；三種細胞接種后每天計數(shù)細胞數(shù)，繪制三種細胞的生長曲線，生長曲線基本一致。流式細胞儀檢測細胞表面抗原表達，主要為Sca_l、⑶29、⑶44、⑶90. 2、Flk-I、 CD117、CD34、MHC-I、MHC-II 類抗原。三種細胞經(jīng)成脂肪誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)10 14天后，光鏡下均呈現(xiàn)脂肪細胞形態(tài)，油紅0染色均呈現(xiàn)橙紅色脂滴；經(jīng)成骨細胞培養(yǎng)10 14天后，光鏡下均呈現(xiàn)多角形、不規(guī)則性、體積增大的細胞形態(tài)，AKP染色均見胞漿有深紫色沉淀。3、Ad5/Fllb-mIC0S-EGFP 轉(zhuǎn)染人臍帶組織來源 MSCA、ICOS轉(zhuǎn)染人臍帶組織來源MSCs 轉(zhuǎn)染將所培養(yǎng)人臍帶組織來源MSCs細胞以IX IO4/孔的密度接種于M孔板中， 待細胞完全貼壁后，移去培養(yǎng)液，每孔加入0. 2ml新鮮的DMEM完全培養(yǎng)基，取0. IuUO. 2ul、 0. 5ul、lul、l. 5ul、2ul Ad5/Fllb-mIC0S_EGFP病毒液分別加入各孔，十字形慢慢晃動混勻， 37°C,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4小時后更換新鮮的MSCs維持培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后不同時間點于熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達情況。B、轉(zhuǎn)染后細胞生物學特性的鑒定毎日在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及生長狀態(tài)，三種細胞形態(tài)無明顯差異；三種細胞接種后每天計數(shù)細胞數(shù)，繪制三種細胞的生長曲線，生長曲線基本一致。流式細胞儀檢測細胞表面抗原表達，主要為Sca_l、CD29、CD44、CD90. 2、Flk-I、 CD117、CD34、MHC-I、MHC-II 類抗原。三種細胞經(jīng)成脂肪誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)10 14天后，光鏡下均呈現(xiàn)脂肪細胞形態(tài)，油紅0染色均呈現(xiàn)橙紅色脂滴；經(jīng)成骨細胞培養(yǎng)10 14天后，光鏡下均呈現(xiàn)多角形、不規(guī)則性、體積增大的細胞形態(tài)，AKP染色均見胞漿有深紫色沉淀。本發(fā)明構建了攜帯ICOS基因的腺病毒載體，并且可以高效穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染至小鼠骨髓來源、人骨髓來源、人臍帶組織來源的間充質(zhì)干細胞，形成MSC-ICOS細胞，再將MSC-ICOS 細胞輸入急性GVHD模型小鼠體內(nèi)，通過mMSCs表達IC0S，競爭性結合抗原遞呈細胞(單核巨噬細胞及B淋巴細胞、DC等)上的B^i配體，阻斷ICOS/B^i通路，減弱或移植T淋巴細胞活性，起到減輕急性GVHD的作用。這種基因治療的方法屬于ex vivo途徑，比較安全。本發(fā)明利用可誘導性共刺激分子在T淋巴細胞活化過程中的作用與間充質(zhì)干細胞在免疫調(diào)節(jié)過程中的作用相結合的方法，達到防治移植物抗宿主病(GVHD)的目的，最終為臨床疾病的治療提供依據(jù)。


圖1是PDC318_mIC0S載體構建流程示意2是PDC318雙酶切回收3是mICOS PCR電泳4是PDC318_mIC0S酶切鑒定 5 是 PCR 鑒定 Ad5/Fl lb-mlCOS-EGFP 病毒 DNA 包含 mICOS 基因圖 6 是 PCR 鑒定 Ad5/Fl lb-mlCOS-EGFP 病毒 DNA 包含 Adl 1 的 fiber圖7是PCR鑒定Ad5/Fllb-mIC0S-EGFP病毒中無野病毒存在圖 8 是流式檢測 mMSC-ICOS (A)、mMSC-EGFP (B)上 mICOS、EGFP 表達率圖 9 是 mMSC-ICOS、mMSC-EGFP 和 mMSCs 的生長曲線圖10是人骨髓MSC(A)、人臍帶組織MSC(B)轉(zhuǎn)染后流式檢測mIC0S、EGFP表達率。圖11是體外混合淋巴細胞反應實驗證實轉(zhuǎn)染后的MSC-ICOS可抑制T淋巴細胞增
殖
具體實施例方式現(xiàn)結合實施例和附圖，對本發(fā)明作詳細描述，但本發(fā)明的實施不僅限于此。腺病毒載體pXCl 加拿大MICR0BIX BI0SYSTEMS公司腺病毒載體PDC318 上海醫(yī)元生物基因科技發(fā)展有限公司構建人血清5型腺病毒(WAd5)上海醫(yī)元生物基因科技發(fā)展有限公司保存腺病毒載體PSUCMV 上海醫(yī)元生物基因科技發(fā)展有限公司構建pEGFPNl-ICOS質(zhì)粒上?；祷蚬竞铣蓪嵤├? 攜帶mICOS基因的非增殖型腺病毒Ad5/Fllb-mIC0S_EGFP的構建。1、PDC318-mIC0S載體的構建采用PCGENE軟件中的PCRPLAN程序，設置各參數(shù) 最適Tm= 66, Tm允許范圍50 80，引物長度15 25，G_C含量40% 60%，引物內(nèi)互補最大值為3，3’端G-C添加為1，引物與模板其它位點同源最大值為60%。經(jīng)過運算，獲得較佳的引物序列GT144和GT145。ml COS基因的上游引物GT144 5' CCG GAA TT CAC CAT GAA GCC GTA CTT C 3' (SEQ ID NO 1)ml COS基因的下游引物GT145 5' GCG TCG ACT TAT CAG GGG CTG TTG GTG 3' (SEQ ID NO :2)2、mIC0S目的基因的獲得pEGFP-m_mIC0S質(zhì)粒行PCR擴增，引物為GT144、 GT145，擴增產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳，用膠回收試劑盒OlIAquick Gel Extraction)回收大小為621bp的mICOS片段。將mICOS片段于37°C水浴2小時后，用QIAquick柱回收， 得到大小為621bp的mICOS目的片段，核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示，上海基康基因公司測序正確。micos gaattc Iacc^atgaagccgtacttctgccatgtctttgtcttctgcttcctaatcagactttta
ACAGGAGAAATCAATGGCTCGGCCGATCATAGGATGTTTTCATTTCACAATGGAGGTGTACAGATTTCTTGTAAATA CCCTGAGACTGTCCAGCAGTTAAAAATGCGATTGTTCAGAGAGAGAGAAGTCCTCTGCGAACTCACCAAGACCAAGG GAAGCGGAAATGCGGTGTCCATCAAGAATCCAATGCTCTGTCTATATCATCTGTCAAACAACAGCGTCTCTTTTTTC CTAAACAACCCAGACAGCTCCCAGGGAAGCTATTACTTCTGCAGCCTGTCCATTTTTGACCCACCTCCTTTTCAAGA AAGGAACCTTAGTGGAGGATATTTGCATATTTATGAATCCCAGCTCTGCTGCCAGCTGAAGCTCTGGCTACCCGTAG GGTGTGCAGCTTTCGTTGTGGTACTCCTTTTTGGATGCATACTTATCATCTGGTTTTCAAAAAAGAAATACGGATCC AGTGTGCATGACCCTAATAGTGAATACATGTTCATGGCGGCAGTCAACACAAACAAAAAGTCTAGACTTGCAGGTGT GACCTCATAAGTCGAC(注下劃線標注的堿基為酶切位點；加框的為保護堿基。)3、PDC318載體的酶切用EcoR I和Sal I酶切，37°C水浴4小時后，用1. 2%瓊脂糖凝膠電泳，用膠回收試劑盒(MN Gel Extraction)回收大小為3895bp的DNA片段，上?；祷蚬緶y序正確。4、PDC318-mIC0S的形成將mICOS目的基因片段與PDC318載體進行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5ci大腸桿菌感受態(tài)細胞，鋪瓊脂板(含AMP)后，37°C生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10 12h。挑取生長的細菌單克隆，在含氨芐青霉素的LB溶液中，37°C搖床擴增12h。抽提陽性克隆的質(zhì)粒DNA，酶切鑒定正確后命名PDC318-mIC0S。圖1、2、3和4表示PDC318_mIC0S的形成過程，通過此方法為下一歩腺病毒的構建
做準備。實施例2 :Ad5/Fllb-mIC0S-EGFP病毒的重組及鑒定。1、將質(zhì)粒PDC318_mIC0S與含有5型腺病毒右臂的質(zhì)粒pPE3-Fl IB-EGFP 通過 Lipofectamine 2000 共轉(zhuǎn)染至 293 細胞，mICOS 基因被插入到腺病毒基因組的El區(qū)。共轉(zhuǎn)染后9 14天細胞出現(xiàn)病毒空斑，經(jīng)過3次病毒空斑純化， 應用QIAamp DNA Blood Mini Kit提取腺病毒DNA，進行PCR鑒定，經(jīng)鑒定正確的腺病毒命名為Ad5/Fllb-mIC0S-EGFP，即攜帶mICOS基因的非增殖型腺病毒。2、病毒的擴增、滴度測定及純化(1)293細胞的復蘇及傳代培養(yǎng)將凍存的293細胞在37°C水浴輕輕晃動融化后，加入10mL10%FBS/DMEM，1000Xg離心5分鐘，棄去上清。將細胞用IOmL 10%FBS/DMEM重懸，輕輕打勻，轉(zhuǎn)入75cm2培養(yǎng)瓶中，在5% CO2孵箱中37°C培養(yǎng)。將復蘇培養(yǎng)的293細胞胰酶消化2分鐘使貼壁細胞脫落，倒置顯微鏡下觀察細胞變圓、脫落，離心，培養(yǎng)液重懸細胞， 以1 3 5分瓶培養(yǎng)。(2)取所培養(yǎng)細胞5 X 106，取0. 5ul首次擴增的病毒保存液，加入10% NCS/DMEM 至1ml，混勻。移去培養(yǎng)液，小心加入病毒混合液，十字形慢慢晃動3次，37°C、5% CO2孵箱中培養(yǎng)120分鐘，加入9ml 10% NCS/DMEM,再培養(yǎng)72小時，收集細胞，600X g離心5分鐘沉淀細胞，用病毒保存溶液重懸細胞，-20°C至37°C凍融3次，臺式離心機上以最大速率離心 20分鐘去除細胞碎片，收集上清，反復擴增至需要病毒量。03)50%組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)法測定病毒滴度收集步驟3_a所得293細胞，計數(shù)，用2% NCS/DMEM準備105/ml細胞共20ml。96孔板中每孔加入IOOul細胞懸液，準備稀釋病毒液。第1管中加入0. 9ml 2% NCS/DMEM，其余7管各加入1. 8ml 2% NCS/DMEM, 第1管中再加入0. Iml病毒保存液，上下吸打5次混勻。從第1管中吸取0. 2ml加入第2管中，反復稀釋至最高稀釋度，最終形成8個不同稀釋度的稀釋液。加入96孔板，每孔0. Iml, 每個稀釋度10孔，2孔為陰性對照，37°C培養(yǎng)10天。10天后，倒置顯微鏡下觀察，計算每一排中出現(xiàn)細胞病變效應(CP^的孔數(shù)，Karbers公式計算病毒滴度。測得重組腺病毒滴度達到 4. QXlOYfu/ml。(4)氯化銫密度梯度離心法純化病毒50ml離心管4°C，12500g，離心30分鐘， 取上清，棄沉淀。每Iml上清加入lml20% PEG8000/2. 5M NaCl，混勻，冰浴1小時，4°C， 12500g，離心30分鐘。棄上清，沉淀充分重懸于5ml CsCl (1. lg/ml)，4°C，8000g，離心5分鐘。取上清，在超速離心管中緩慢加入anlCsCl (1. 4g/ml)，非常小心輕輕順管壁加入另ー層 3ml CsCl (1. 3g/ml)，沿管壁小心加滿病毒顆粒，約5ml上清(1. lg/ml)。平衡離心管，4°C， 60，OOOg離心2小吋，取出離心管，固定于離心管架上，用5ml注射器，18G針頭，在病毒層的最低點刺破管壁，在CsCl(1.3g/ml) -CsCl(IjgAil)交界處吸出病毒顆粒層。病毒層溶液轉(zhuǎn)移到一個無菌的容器，4°C，透析過夜。病毒置于-80°C保存。圖5、6和7表示攜帶ICOS基因的腺病毒載體Ad5/Fllb-mIC0S_EGFP構建成功，能有效感染低表達CAR的細胞，對MSCs等干細胞有很高的感染效率，基因表達水平很高，且細胞毒性較低。本實驗采用Ad5和Adll嵌合型病毒載體，以提高對MSCs的感染效率。其攜帶的增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)作為報告基因可用于熒光顯微鏡觀察，直接判斷轉(zhuǎn)染效率。實施例3 :Ad5/Fllb-mIC0S-EGFP轉(zhuǎn)染小鼠骨髓來源MSC。(I)MSC細胞傳代吸棄培養(yǎng)液，2ml PBS洗滌兩遍，加入適量0. 05 %胰蛋白酶-0. 02% EDTA消化液消化細胞，倒置顯微鏡下見大多數(shù)細胞變圓、脫落后，加入兩倍體積的培養(yǎng)液中和胰酶，低速離心后棄上清，新鮮mMSCs維持培養(yǎng)基重懸后接種于培養(yǎng)皿。(2)將細胞以IX IO5/孔的密度接種于M孔板中，待細胞完全貼壁后，移去培養(yǎng)液，每孔加入0. 5ml新鮮的DMEM完全培養(yǎng)基，取lul、2ul、5ul、10ul、20ul、50ul Ad5/ Fllb-mlCOS-EGFP病毒液分別加入各孔，十字形慢慢晃動混勻，37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 4小時后更換新鮮的mMSCs維持培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后不同時間點于熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達情況。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后6小時即有綠色熒光蛋白表達，8 14小時達高峰，Ad5/Fllb-mIC0S-EGFP 轉(zhuǎn)染 MSCs 的最佳 MOI = 1000。收集細胞，用 anti-mlCOS-PE 孵育后，流式細胞儀檢測MSCs-ICOS上mICOS表達率為90. 16%，同法獲得Ad5/FlIb-EGFP轉(zhuǎn)染MSCs的最佳MOI = 1200，EGFP表達率為57. 18%。圖8表示構建含ICOS的腺病毒載體可穩(wěn)定高效轉(zhuǎn)染MSC，形成MSC-IC0S細胞群。實施例4 轉(zhuǎn)染后細胞生物學特性的鑒定。(1)每日在倒置顯微鏡下觀察MSCs-ICOS、MSCs-EGFP和MSCs的形態(tài)及生長狀態(tài)， 分別取mMSCs、mMSC-ICOS和mMSC_EGFP，以5000/孔的密度接種于M孔板，每孔加Iml維持培養(yǎng)基，置37°C、5% C02、100%飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，依次于培養(yǎng)第1天至第8天分別消化3復孔細胞，取3孔細胞數(shù)均值與標準差繪制三種細胞的生長曲線。結果見表1及圖9。表ImMSC-ICOS、mMSC-EGFP 和 mMSCs 體外擴增計數(shù)(X IO3)根據(jù)表1的結果可以得出三種細胞生長曲線基本一致，提示腺病毒載體轉(zhuǎn)染 mMSCs后不改變mMSCs的生長特性。(2)流式細胞儀檢測MSCs-ICOS、MSCs-EGFP和MSCs表面抗原表達，收集mMSCs， 以0. 05%胰蛋白酶-0. 02% EDTA消化液消化收獲細胞，PBS洗滌后制成1. OX 106/ml的單細胞懸液，每個流式管取0. 1ml，分別加入熒光標記抗體0^9-PE、CD44-PE、CD90. 2-ΡΕ、 CD117-PE、Sca-l-PE、FLK-I-ΡΕ, MHC-II-PE、CD45_PE/Cy5、CD34-PE、MHOI-PE、mIC0S-PE， 室溫避光孵育30分鐘，PBS洗去未標記抗體，加入200ul PBS重懸細胞，設陰性對照組，流式細胞儀檢測表面標記。同法標記mMSC-ICOS和mMSC-EGFP，流式細胞儀檢測表面標記。結果見表2。表2mMSC-IC0S、mMSC-EGFP 和 mMSCs 流式檢測表面抗原
*表達EGFP的細胞上某種檢測分子的陽性率#所有細胞上某種檢測分子的陽性率根據(jù)表2的結果可以得出三種細胞均高表達ka-Ι、⑶29、⑶44，中度表達 ⑶90. 2、Flk-l，不表達或低表達⑶117、⑶34、MHC-I、MHC-II類抗原。三種細胞表面標志的流式檢測結果無顯著差異，提示腺病毒載體轉(zhuǎn)染mMSCs后不改變mMSCs的免疫表型。(3)三種細胞經(jīng)成脂肪誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)取mMSCs、以IXlOVcm2的密度接種于 6孔板中，待細胞生長融合達70 80%后更換脂肪細胞誘導培養(yǎng)基(DMEM-LG、10% FBS, 10ug/mL牛胰島素、0. 25uM地塞米松、0. 5mMIBXM、50uM吲哚美辛、100IU/ml 青霉素 100ug/mL 鏈霉素、4mM L-谷氨酰胺)，每3 4天換液，10 14天后鑒定。油紅O染色鑒定吸出細胞培養(yǎng)上清，PBS洗滌，室溫下10%甲醛固定10分鐘，加入油紅O染液中孵育30分鐘，60% 異丙醇洗去多余染液，蒸餾水清洗，光鏡觀察。實驗結果光鏡下均呈現(xiàn)脂肪細胞形態(tài)，油紅O染色均呈現(xiàn)橙紅色脂滴。(4)三種細胞經(jīng)成骨誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)取mMSCs以lX104/cm2的密度接種于6孔板中，待細胞生長融合達70 80%后分別更換成骨細胞誘導培養(yǎng)基(DMEM-LG、5% FBS,0. 25uM地塞米松、 0. 2mM維生素C、IOmMβ -甘油磷酸鈉、100IU/ml青霉素100ug/mL鏈霉素)，每3 4天換液，10 14天后鑒定。AKP (堿性磷酸酶)檢測原理偶氮耦聯(lián)染色法，磷酸根與偶氮鹽偶合，形成紫色沉淀。步驟吸出細胞培養(yǎng)上清，去離子水沖洗，晾干；配置新鮮工作液，將ニ 甲基甲酰溶解底物倒入緩沖液中，再加入固紫B混勻；加入工作液，置37°C，45分鐘，去離子水清洗3次；蘇木素復染3分鐘，去離子水清洗，干燥，光鏡觀察。實驗結果經(jīng)成骨細胞培養(yǎng)10 14天后，光鏡下均呈現(xiàn)多角形、不規(guī)則性、體積增大的細胞形態(tài)，AKP染色均見胞漿有深紫色沉淀。實施例5 :Ad5/Fl lb-mlCOS-EGFP 轉(zhuǎn)染人骨髓來源 MSC。(I)MSC細胞傳代吸棄培養(yǎng)液，2ml PBS洗滌兩遍，加入適量0. 05 %胰蛋白酶-0. 02% EDTA消化液消化細胞，倒置顯微鏡下見大多數(shù)細胞變圓、脫落后，加入兩倍體積的培養(yǎng)液中和胰酶，低速離心后棄上清，新鮮mMSCs維持培養(yǎng)基重懸后接種于培養(yǎng)皿。(2)以IX IO4/孔的密度接種于M孔板中，待細胞完全貼壁后，移去培養(yǎng)液， 每孔加入 0. 2ml 新鮮的 DMEM 完全培養(yǎng)基，取 0. lul.O. 2ul、0. 5ul、lul、l. 5ul、2ul Ad5/ Fllb-mlCOS-EGFP病毒液分別加入各孔，十字形慢慢晃動混勻，37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 4小時后更換新鮮的MSCs維持培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后不同時間點于熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達情況。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后5小時即有綠色熒光蛋白表達，6 18小時持續(xù)高峰狀態(tài)，Ad5/Fllb-mIC0S-EGFP 轉(zhuǎn)染 MSCs 的最佳 MOI = 750。收集細胞，用 anti-mlCOS-PE 孵育后，流式細胞儀檢測MSCs-ICOS上mICOS表達率為95. 19%。同法獲得Ad5/FlIb-EGFP 轉(zhuǎn)染MSCs的最佳MOI = 900，EGFP表達率為99. 91 %。實施例6 :Ad5/Fl lb-mIC0S-EGFP 轉(zhuǎn)染人臍血來源 MSC。(I)MSC細胞傳代吸棄培養(yǎng)液，2ml PBS洗滌兩遍，加入適量0. 05 %胰蛋白酶-0. 02% EDTA消化液消化細胞，倒置顯微鏡下見大多數(shù)細胞變圓、脫落后，加入兩倍體積的培養(yǎng)液中和胰酶，低速離心后棄上清，新鮮mMSCs維持培養(yǎng)基重懸后接種于培養(yǎng)皿。(2)將細胞以IXlO4/孔的密度接種于對孔板中，待細胞完全貼壁后，移去培養(yǎng)液，每孔加入 0. 2ml 新鮮的 DMEM 完全培養(yǎng)基，取 0. lul.O. 2ul、0. 5ul、lul、l. 5ul、2ul Ad5/Fllb-mlCOS-EGFP病毒液分別加入各孔，十字形慢慢晃動混勻，37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 4小時后更換新鮮的MSCs維持培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后不同時間點于熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達情況。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后5小時即有綠色熒光蛋白表達，6 18小時持續(xù)高峰狀態(tài)，Ad5/Fllb-mIC0S-EGFP 轉(zhuǎn)染 MSCs 的最佳 MOI = 500。收集細胞，用 anti-mlCOS-PE 孵育后，流式細胞儀檢測MSCs-ICOS上mICOS表達率為99. 46 %。同法獲得Ad5/Fl Ib-EGFP 轉(zhuǎn)染MSCs的最佳MOI = 750，EGFP表達率為92. 。圖10示所構建的腺病毒載體亦可高效穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染至人臍帶組織來源MSC，這可以為臨床采用MSC-ICOS作為GVHD的干預措施提供實驗基礎。實施例7 體外混合淋巴細胞反應實驗證實轉(zhuǎn)染后的MSC-ICOS可抑制T淋巴細胞
増殖(1)刺激細胞獲取BALB/C雌性小鼠骨髄來源樹突狀細胞的培養(yǎng)PBS沖洗小鼠股骨、脛骨內(nèi)骨髄細胞，無菌裂紅液處理，PBS洗滌兩遍，洗滌后的細胞用含10% FCS, IOng/ ml GM-CSF, lng/ml mIL-4的RPMI1640培養(yǎng)基懸液，分至六孔板內(nèi)培養(yǎng)，48小時后去除懸浮細胞，僅保留疏松貼壁細胞，加入新鮮的培養(yǎng)基培養(yǎng)5-6天即可。最后4小時加入絲裂霉素 (5ug/ml)孵育。(2)反應細胞獲取C57BL/6雄性小鼠脾臟CD4+T細胞獲取取小鼠脾臟碾磨，細胞懸液使用⑶4+磁珠進行分選，所獲細胞流式檢測⑶4+細胞比例為98%至99%。(3)混合細胞反應將刺激細胞、反應細胞及MSC-ICOS共同放置于培養(yǎng)皿中，細胞比例為1 10 0. 5。共同培養(yǎng)48小時后，CCK-8法檢測⑶4+T淋巴細胞増殖情況。圖11示MSC-ICOS干預下CD4+T細胞增殖顯著受抑制。表明MSC-IC0S干預可減弱或移植⑶4+T淋巴細胞増殖活性，從而改善GVHD表現(xiàn)，為臨床采用MSC-ICOS作為GVHD 的干預措施提供實驗基礎。上述實驗例結果表明構建攜帯可誘導性共刺激分子基因的腺病毒載體，并將其高效穩(wěn)定轉(zhuǎn)染小鼠骨髄來源間充質(zhì)干細胞后并不影響其細胞原有生物學特性，并且該腺病毒載體也可高效穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人骨髓來源、人臍帶組織來源間充質(zhì)干細胞，為進一歩利用 MSC-ICOS作為干預措施防止GVHD提供可靠的實驗依據(jù)。
權利要求
1.一種攜帶可誘導性共刺激分子基因的腺病毒載體，其特征在干，先將腺病毒載體Ad5 Fiber的knob和Shaft替換為Adll Fiber的knob和shaft構建而成的嵌合型腺病毒載體，并攜帶增強型綠色熒光蛋白，再在嵌合型腺病毒載體Ad5右臂的El區(qū)位置插入如SEQ ID NO :3所示的mICOS基因。
2.一種如權利要求1所述的攜帯可誘導性共刺激分子基因的腺病毒載體的構建方法， 包括如下步驟先將腺病毒載體Ad5 Fiber的knob和Siaft替換為Adll Fiber的knob和 shaft構建而成的嵌合型腺病毒載體，并攜帶增強型綠色熒光蛋白，再在嵌合型腺病毒載體 Ad5右臂的El區(qū)位置插入如SEQ ID NO 3所示的mICOS基因。
3.根據(jù)權利要求2所述的攜帯可誘導性共刺激分子基因的腺病毒載體的構建方法，其特征在干，其中的mICOS基因的獲得方法如下合成如SEQ ID NO :1或2所示的引物，pEGFP-Nl-mIC0S質(zhì)粒行PCR擴增，擴增產(chǎn)物用 0.8%瓊脂糖凝膠電泳，用膠回收試劑盒回收如SEQ ID N0:3所示的mICOS基因片段。
4.根據(jù)權利要求3所述的攜帯可誘導性共刺激分子基因的腺病毒載體的構建方法，其特征在于，該腺病毒載體的構建方法如下A、PDC318-mIC0S載體的構建a.合成引物mICOS基因的上游引物GT144 5' CCG GAA TT CAC CAT GAA GCC GTA CTT C 3'mICOS基因的下游引物GT145 5' GCG TCG ACT TAT CAG GGG CTG TTG GTG 3'b.mICOS基因的獲得pEGFP-m-mIC0S質(zhì)粒行PCR擴增，引物為步驟a所獲得的GT144、 GT145，擴增產(chǎn)物用0. 8%瓊脂糖凝膠電泳，用膠回收試劑盒回收大小為621bp的mICOS片段；c.mICOS基因獲得后的酶切將步驟b中所獲得的mICOS片段于37°C水浴2小時后，用 QIAquick柱回收，得到大小為621bp的mICOS目的片段；d.PDC318載體的酶切用EcoRI和Ml I酶切，37°C水浴4小時后，用1. 2%瓊脂糖凝膠電泳，用膠回收試劑盒回收大小為3895bp的DNA片段；e.PDC318-mIC0S的合成將步驟c中所獲得的mICOS目的基因片段與步驟d中所獲得的PDC318載體進行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5ci大腸桿菌感受態(tài)細胞，鋪含AMP瓊脂板后， 37°C生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10 12小時；挑取生長的細菌單克隆，在含氨芐青霉素的LB溶液中，37°C搖床擴增12小時；抽提陽性克隆的質(zhì)粒DNA，酶切鑒定正確后命名PDC318_mIC0S ；B、Ad5/Fllb-mIC0S-EGFP病毒的重組及鑒定將質(zhì)粒PDC318-mIC0S與含有Ad5腺病毒右臂的質(zhì)粒pPE3_Fl IB-EGFP通過 Lipofectamine 2000共轉(zhuǎn)染至293細胞，mICOS基因被插入到腺病毒基因組的El區(qū)；共轉(zhuǎn)染后9 14天細胞出現(xiàn)病毒空斑，經(jīng)過3次病毒空斑純化，應用QIAamp DNA Blood Mini Kit提取腺病毒DNA，進行PCR鑒定，經(jīng)鑒定正確的腺病毒命名為Ad5/Fllb-mIC0S-EGFP。
5.一種如權利要求1所述的攜帯可誘導性共刺激分子基因的腺病毒載體在制備預防和治療移植物抗宿主疾病中的應用。
6.根據(jù)權利要求5所述的攜帯可誘導性共刺激分子基因的腺病毒載體在制備預防和治療移植物抗宿主疾病中的應用，是將攜帯可誘導性共刺激分子基因的腺病毒載體轉(zhuǎn)染至小鼠骨髄來源、人骨髓來源、人臍帶組織來源的間充質(zhì)干細胞，形成MSC-ICOS細胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術領域。造血干細胞移植是治愈惡性血液疾病的唯一途徑，但是造血干細胞移植過程中的并發(fā)癥仍是導致患者死亡的重要因素，其中最突出的就是移植物抗宿主病(GVHD)。如何防治GVHD是造血干細胞移植面臨的嚴峻挑戰(zhàn)。本發(fā)明提供一種攜帶可誘導性共刺激分子(ICOS)基因的腺病毒載體及其構建方法，本發(fā)明的腺病毒載體轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細胞(MSCs)后利用可誘導性共刺激分子在T淋巴細胞活化過程中的作用與間充質(zhì)干細胞在免疫調(diào)節(jié)過程中的作用相結合的方法，達到防治GVHD的目的。
文檔編號C12N15/66GK102533859SQ201210073440
公開日2012年7月4日 申請日期2012年3月19日 優(yōu)先權日2012年1月12日
發(fā)明者包曉辰, 周虹, 楊丹, 王健民, 王利平 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學