專利名稱：煙粉虱抗真菌肽defensin基因及其所編碼的抗菌肽與制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種煙粉虱抗菌肽defensin基因及其所編碼的抗菌肽與應(yīng)用。尤其涉及一種重組煙粉虱抗菌肽defensin的純化制備方法、重組煙粉虱抗菌肽及其抑菌應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近年來(lái),煙粉風(fēng)Bemisia tabaci (Gennadius)已成為一種世界性的入侵性災(zāi)害性昆蟲，在世界各地暴發(fā)成災(zāi)，造成慘重的損失例。該蟲不僅大量取食植物汁液，導(dǎo)致植物枯萎，而且傳播多種植物病毒，尤其是雙生病毒，常導(dǎo)致植物病毒病大流行，使作物嚴(yán)重減產(chǎn)或絕收。由于煙粉虱寄主范圍廣，繁殖力強(qiáng)，危害方式多，對(duì)殺蟲劑產(chǎn)生抗藥性的能力特別強(qiáng)，因此，當(dāng)其入侵到一個(gè)新的地區(qū)，極易暴發(fā)成災(zāi)。由于傳統(tǒng)抗菌素的濫用和耐藥菌株的不斷產(chǎn)生，嚴(yán)重影響了感染性疾病的臨床治療效果。而抗菌肽具有殺菌強(qiáng)，不易引起耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，成為抗菌藥物新的研究熱點(diǎn)。目前抗菌肽產(chǎn)量低，天然抗菌肽的分離難度大，因而傾向于利用基因工程方法獲得抗菌肽。防御素(defensin)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)的一類陽(yáng)離子抗菌多肽，由29 54個(gè)氨基酸殘基組成，含有6 8個(gè)保守的半胱氨酸(通常是6個(gè))，分子量小于5KDa。N端有3個(gè)β轉(zhuǎn)角和I個(gè)Y轉(zhuǎn)角，中間有I個(gè)兩親性的α螺旋，C端有I個(gè)反向平行的β折疊，由3 4個(gè)二硫鍵連接α螺旋和β轉(zhuǎn)角，形成特定的CSa β結(jié)構(gòu)。防御素可在特定的細(xì)胞中合成并貯存于細(xì)胞質(zhì)的顆粒中，或被病原微生物誘導(dǎo)合成，對(duì)多種微生物均具有較強(qiáng)的防御能力，主要作用于病原微生物的細(xì)胞膜，使病原微生物不易對(duì)其產(chǎn)生抗性，防御素是目前頗具吸引力的一類新型候選抗菌藥物。到目前為止，國(guó)內(nèi)外尚沒有煙粉虱defensin抗菌肽的研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是，針對(duì)目前煙粉虱抗菌肽研究狀況及其不足，提供一種重組煙粉虱抗菌肽defensin基因和其所編碼的抗菌多肽，以及所述基因在基因在制備具有抗菌活性的重組蛋白中的應(yīng)用。本發(fā)明的解決方案是，提供了一種煙粉虱defensin抗菌肽基因，該基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。本發(fā)明還提供了所述煙粉虱defensin抗菌肽基因在制備具有抗菌活性的重組蛋白中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了所述煙粉虱defensin抗菌肽基因制備具有抗菌活性的重組蛋白的方法，是通過(guò)基因重組技術(shù)將所述基因在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，獲得具有抗菌活性的重組蛋白。本發(fā)明還提供了所述煙粉虱defensin抗菌肽基因編碼的抗菌肽，該抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
本發(fā)明還提供了所述抗菌肽在制備用于防治煙粉虱的藥物中的應(yīng)用，該藥物適用的煙粉風(fēng)品種為:隱種 Middle East-Asia Minor I(MEAMl)Ji^1I1Mediterranean(Med)Jil 種ZHJl、隱種ZHJ2或隱種ZHJ3。相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于I、本發(fā)明中的煙粉虱defensin抗菌肽基因原核表達(dá)過(guò)程中，表達(dá)載體中引入蛋白酶Xa因子，能夠有效的酶切重組融合蛋白，并根據(jù)蛋白分子大小利用超濾方式快速分離得到defensin多肽。整個(gè)過(guò)程快速簡(jiǎn)單。2、本發(fā)明中的重組煙粉虱defensin抗菌肽具有抗真菌活性，能明顯抑制球孢白僵菌(Beuaveria bassiana)、金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae)和灰霉菌 (Botrytis cinerea)等昆蟲病原真菌生長(zhǎng)。


圖I :不同隱種煙粉虱抗菌肽defensin基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖。在圖I中，M為 DNA maker, 1-5 分別為煙粉虱 MEAMl、Med、ZHJl、ZHJ2 和 ZHJ3 抗菌肽 defensin 基因 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，bp代表堿基對(duì)。圖2 :煙粉虱抗菌肽基因和大腸桿菌表達(dá)載體質(zhì)粒pET_32a及defensin成熟肽基因PCR產(chǎn)物酶切圖。在圖2中，M為DNA maker, I為質(zhì)粒pET_32a經(jīng)BamH I和Xho I雙酶切后產(chǎn)物，2和3為defensin成熟肽基因PCR產(chǎn)物經(jīng)BamH I和Xho I雙酶切后產(chǎn)物。圖3 :煙粉風(fēng)抗菌肽defensin成熟肽片段融合表達(dá)載體pET32a_Def的構(gòu)建示意圖。圖4 =IPTG誘導(dǎo)的pET32a-Def-BL21和純化的重組煙粉虱抗菌肽蛋白的SDS-PAGE 凝膠電泳圖。M為蛋白maker，1-6代表不同IPTG誘導(dǎo)濃度0mM、0. 2mM、0. 4mM、0. 6mM、0. 8mM、 ImM，7代表純化后重組蛋白Trx-Def，kDa代表蛋白分子量。圖5 :重組煙粉風(fēng)抗菌肽defensin Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳圖。M為蛋白 maker, I 為 defensin 蛋白產(chǎn)物。
具體實(shí)施方案本發(fā)明從煙粉虱抗菌肽defensin基因著手，對(duì)其進(jìn)行可性質(zhì)、基因表達(dá)和定位及重組表達(dá)等方面的研究，獲得了專性抗真菌活性的重組防御素defensin。本發(fā)明所述煙粉虱抗菌肽defensin基因，其核苷酸序如SEQ ID NO. I所示。序列特征長(zhǎng)度624堿基對(duì)；類型核酸；鏈型雙鏈；拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性；分子類型cDNA。本發(fā)明所述煙粉虱defensin抗菌肽基因編碼的抗菌肽，其氨基酸如SEQ ID NO. 2 所示。序列特征長(zhǎng)度76氨基酸；類型氨基酸；鏈型單鏈；拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性；分子類型 蛋白質(zhì)。本發(fā)明所述煙粉虱抗菌肽基因cDNA的克隆方法是以煙粉虱總RNA反轉(zhuǎn)錄得到 cDNA為模板，構(gòu)建cDNA文庫(kù)，構(gòu)建抗菌肽數(shù)據(jù)庫(kù)，與煙粉虱轉(zhuǎn)錄組本地Blast篩選得到 defensin部分cDNA序列，然后經(jīng)RACE方法擴(kuò)增得到末端序列，最后經(jīng)序列拼接獲得煙粉虱抗菌肽defensin基因cDNA全長(zhǎng)序列。本發(fā)明用于表達(dá)煙粉虱抗菌肽重組蛋白的抗菌肽成熟肽基因序列是以煙粉虱抗菌肽基因全長(zhǎng)基因雙鏈DNA為模板，經(jīng)PCR方法擴(kuò)增而得到，它來(lái)源于煙粉虱抗菌肽全長(zhǎng)基因區(qū)域所對(duì)應(yīng)的基因片段。本發(fā)明所述的表達(dá)載體構(gòu)建方法是按常規(guī)方法，將通過(guò)PCR方法合成的煙粉虱抗菌肽基因經(jīng)酶切和分離純化后，連接到同樣酶切純化后的具有相應(yīng)酶切位點(diǎn)(即BamH I和 Xho I)之間，即構(gòu)建成所需的含有煙粉虱抗菌肽基因的表達(dá)載體。本發(fā)明上述含有煙粉虱抗菌肽基因的大腸桿菌基因表達(dá)載體優(yōu)先由本發(fā)明合成的煙粉虱抗菌肽基因與大腸桿菌表達(dá)載體pET_32a構(gòu)建的重組表達(dá)載體，命名為 pET32a~Defο本發(fā)明能表達(dá)煙粉虱抗菌肽基因的大腸桿菌重組菌株優(yōu)先由含有煙粉虱抗菌肽的表達(dá)載體pET32a-Def轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)而得到的菌株，命名為pET32a_Def-BL21。上述煙粉虱抗菌肽基因的具體制備方法是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)選取大腸桿菌重組菌株pET32a-Def-BL21接種在IOml含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)過(guò)夜，取50 μ I菌液加入到裝有50ml AMP+LB液體培養(yǎng)基的150ml無(wú)菌三角瓶中，37°C，150rpm 的搖箱中培養(yǎng)6 8h至對(duì)數(shù)期，加入IOOmM IPTG至終濃度為ImM，27°C，250rpm振蕩培養(yǎng)。 當(dāng)重組菌生長(zhǎng)進(jìn)入平臺(tái)期后收集菌體，經(jīng)分離純化得到重組煙粉虱抗菌肽產(chǎn)品。上述酶切后非融合抗菌肽純品,利用添加Factor Xa序列,使用Factor Xa酶切上述純化重組煙粉虱抗菌肽蛋白，并再次純化，得到約5kDa左右煙粉虱抗菌肽defensin肽片段。本發(fā)明利用上述得到抗菌肽進(jìn)行抗菌活性檢測(cè)，結(jié)果表明經(jīng)過(guò)酶切純化后的煙粉風(fēng)defensin抗菌肽具有抗昆蟲病原真菌活性。本發(fā)明所述煙粉虱抗菌肽基因defensin在制備具有抗菌肽活性的重組蛋白中應(yīng)用。其中，所述應(yīng)用的方法是通過(guò)基因重組技術(shù)使所述基因在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)， 獲得具有抗菌活性的重組蛋白。例如將獲得的煙粉虱抗菌肽基因defensin基因克隆到pET_32a (Novagen公司) 表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21細(xì)胞。進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，獲得具有活性的重組蛋白(即煙粉虱抗菌肽基因defensin基因編碼的抗菌肽)。所述抗菌活性的重組蛋白純化后進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明重組的煙粉虱抗菌肽基因defensin基因表達(dá)的多肽具有抗真菌和酵母的活性。進(jìn)一步的，利用本發(fā)明的方法通過(guò)現(xiàn)有基因工程方法生產(chǎn)還可用于煙粉虱生物防治。下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)室具體的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下例實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方案，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York Cold Spring Haebor Laboratory Press, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)。實(shí)施案例I :煙粉虱defensin抗菌肽cDNA克隆I. I、TRIzol 法提取總 RNA
(I)將一定量(200只左右煙粉虱)冰凍lmin，放入I. 5ml離心管中，加入Iml TRIzol試劑，充分研磨勻漿，室溫靜置5min。(2)向離心管中加入O. 2ml氯仿，振蕩15s，混合液轉(zhuǎn)入TIANGEN離心管中，靜置 2min。(3)4°C，12000g離心15min，取上清液，將其轉(zhuǎn)入一新I. 5ml的離心管中。(4)向離心管中加入O. 5ml異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置lOmin。(5) 4°C, 12000g 離心 IOmin,棄掉上清液。(6)向離心管中加入Iml 75 %乙醇，輕輕洗滌沉淀，4°C，7500g離心5min，棄掉上清液。(此時(shí)加入無(wú)水乙醇，可于_80°C超低溫冰箱中長(zhǎng)期保存)(7)晾干離心管，加入適量的DEPC H2O溶解(65°C促溶)，分光光度計(jì)測(cè)量0D260/ 0D280的值，比值在I. 8 2. O之間時(shí)，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。1.2、cDNA 第一鏈合成(I)往O. 5ml無(wú)菌的離心管中分別加入I μ I提取的RNA, I μ I SMART IV/5’ PCR 正向引物，1μ I CDS 111/3’PCR反向引物，加2μ I DEPC H2O使總體積達(dá)到5 μ I。 (DTT) 心。
(2)混勻離心管中的試劑并短暫離心，72°C孵育2min。
(3)迅速將離心管冰浴2min，短暫離心。
(4)往離心管中分別加入2μI 5XFrist-strand Buffer, I μ I 20mM 二硫蘇糖醇 I μ I IOmM dNTP, I μ I Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)錄酶，反復(fù)吹打混勻，短暫離
(5)42°C孵育 Ih。
(6)將離心管置于冰上2 3min，終止反應(yīng)。取一部分用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，其余于-80°C超低溫冰箱冷凍保存。1.3、dsDNA 合成(I)往O. 5離心管中分別加入I μ I第一鏈合成反應(yīng)產(chǎn)物，5 μ I IOXLA Buffer (Mg2+free)，5 μ I Mg2+，8 μ I dNTP, I μ I SMART IV/5，PCR 正向弓I 物，I μ ICDS 111/3’PCR反向引物，O. 5μ I LA Tag DNA聚合酶，29. 5 μ I ddH20，充分混勻，短暫離心。(2)PCR儀中按以下擴(kuò)增程序(95°C, 20s ;25 28X (95。。，5s ；68°C,6min))擴(kuò)增。(3)取5μ1 PCR產(chǎn)物用于凝膠檢測(cè)(檢測(cè)條帶所含分子量范圍及條帶亮暗)，取檢測(cè)結(jié)果良好的I μ I產(chǎn)物稀釋100倍用于做以后PCR的模板，其余于_80°C超低溫冰箱冷凍保存。I. 4、PCR擴(kuò)增煙粉虱抗菌肽defensin基因5’和3’末端操作按Clontech 公司試劑盒 SMARTer RACE cDNA Amplification Kit 說(shuō)明書進(jìn)行。根據(jù)試劑盒的要求，依據(jù)已知的Defensin基因EST序列分別設(shè)計(jì)兩條上、下游引物 (見表1)，以進(jìn)行巢式PCR。第一次PCR反應(yīng)條件為98°C，3min ；30X (98°C，10s ；60°C, 20s ；68°C,lmin) ;68°C，6min。第二次PCR以第一次PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為 95°C，3min ；35X (95。。，25s ；63°C,20s ；72°C, lmin) ;72°C，6min。將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pMD-19 載體上得到重組質(zhì)粒，并用PMD-19的通用引物M13土進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)定結(jié)果與已知序列片段進(jìn)行比較和序列拼接。序列拼接結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BlastX，結(jié)果表明得到序列與大蠟螟Galleria mellonella和煙草天蛾Manduca sexta抗菌妝defensin基因高度相似，相似度分別為75%和74%。表I. PCR擴(kuò)增煙粉虱抗菌肽defensin基因5’和3’末端所需引物
引物名稱引物序列(5’ -3’ )def-for IGTTGGTGCGAAACCCGTAAATAAGATdef-for 2GGAGTGAACTACACCTCTGACTGCTTGAAdef-rev ITGAACTACACCTCTGACTGCTTGAAAGAdef-rev 2TAAAGGCGGACATTGTGGAAGTGC實(shí)施例2 :煙粉虱抗菌肽重組表達(dá)載體構(gòu)建、表達(dá)與抑菌功能測(cè)定2. I表達(dá)載體構(gòu)建(I)根據(jù)煙粉風(fēng)defensin抗菌肽的序列和表達(dá)載體pET_32a (Novagen公司)的克隆位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物，并基因的5’ -端設(shè)計(jì)了 Xa因子的識(shí)別切割位點(diǎn)(IEGR)編碼序列Def-F CGGGATCCATTGAGGGTCGCGACGTCCTCATCGGAAGTT (下劃線為 BamH I 位點(diǎn)，粗體為Xa因子編碼序列);Def-R CCGCTCGAGTTATTTACGGGTTTCGCACCAAC (下劃線為 XhoI 位點(diǎn))。(2)基因擴(kuò)增、克隆與重組質(zhì)粒篩選以煙粉虱dsDNA為模板，用上述引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增條件為94°C，2min預(yù)變性；94°C，15s，63°C，30s，72°C，45s，35 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 6min。取2 μ IPCR產(chǎn)物，I %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，Clean UP試劑盒清潔回收PCR產(chǎn)物。分別以PET-32a質(zhì)粒載體和上述回收的DNA作為DNA模板，配制以下反應(yīng)體系Xho I 限制性內(nèi)切酶I μ 1，BamH I限制性內(nèi)切酶，DNA模板10 μ 1，ddH20 6 μ 1，Buffer 2 μ I。輕輕混勻，短暫離心，37°C孵育Ih。(3)用第二步的雙酶切反應(yīng)產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳，切下大小合適的DNA條帶做 DNA凝膠回收。(4)向PCR管中分別加入2. 5 μ I雙酶切后的PCR產(chǎn)物，O. 5 μ I雙酶切后的pET_32a 質(zhì)粒載體，O. 5 μ I 的 T4Ligase DNA, I μ I 的 T4Ligase DNA Buffer, 5 μ I 的 ddH20，16°C條件下孵育，連接Ih以上。(5)將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)中，涂布于氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板上，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。挑斑培養(yǎng)菌液，以T7ter和S-Tag通用引物進(jìn)行r_Tag反應(yīng)體系PCR檢測(cè)，對(duì)于陽(yáng)性樣品每份取100 μ I留種并送測(cè)。(6)比對(duì)測(cè)序結(jié)果，選取結(jié)果正確的留種菌液做下一步實(shí)驗(yàn)。2. 2重組煙粉風(fēng)defensin抗菌肽表達(dá)與純化選取測(cè)序陽(yáng)性菌液在含50 μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中37°C過(guò)夜振蕩培養(yǎng)，次日，以I %的接種量連接到含150 μ g/mL氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基中，待菌體生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，0D600約I. O時(shí)，加入IOOmM IPTG使其終濃度約為lmM，27°C /250rpm誘導(dǎo)5h后， 測(cè)0D600取樣，5000rpm離心5min，PBS緩沖液(pH7. O)重懸浮菌體并加入適量上樣緩沖液，并用于12% SDS-PAGE電泳分析蛋白表達(dá)情況，融合蛋白Trx-Def以可溶性的形式成功表達(dá)，最后利用Clontech His-tag重力純化試劑盒純化得到煙粉風(fēng)defensin抗菌肽重組蛋白。純化的煙粉風(fēng)defensin重組蛋白經(jīng)15%的SDS-PAGE凝膠電泳分析，Trx-Def融合的重組蛋白顯示約25kDa大小，與預(yù)期大小一致。2. 3重組蛋白Xa因子蛋白酶切A280測(cè)定純化后蛋白濃度，50 μ L體系中融合蛋白濃度(O. 2 μ g/μ L)，按下述體系切割，Xa因子劑量為2U，于23°C反應(yīng)24h。酶切產(chǎn)物首先利用截留分子量為IOkDa的超濾管(Millipore, Amicon Ultra-4)去掉Trx標(biāo)簽及Xa因子等大于IOkDa蛋白分子,然后用截留分子量為3kDa的超濾管對(duì)其進(jìn)行脫鹽及濃縮，采用16% Tricine-SDS-PAGE分析。切割體系如下
Fusion proteinI Opg
IOX Buffer5μL
Factor Xa2 μL
ddH20補(bǔ)加到50μ 2. 5抗菌活性檢測(cè)培養(yǎng)基為YDP培養(yǎng)基，供試菌株有革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、昆蟲病原真菌和酵母。其中革蘭氏陽(yáng)性菌為金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus);革蘭氏陰性菌為腸道沙門氏菌(Salmonella enteritidis)和大腸桿菌(Escherichia coli);昆蟲病原真菌為球抱白僵菌(Beuaveria bassiana)、金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae);植物病原真菌灰霉菌(Botrytis cinerea)酵母為畢赤酵母(pichia pastoris)。按液體生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)進(jìn)行本抗菌試驗(yàn)，具體步驟為供試菌株在培養(yǎng)基(細(xì)菌培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基，真菌和酵母培養(yǎng)基為YDP培養(yǎng)基)中生長(zhǎng)到0D600為O. 8后，用YDP培養(yǎng)基稀釋到0D600為 O. 001左右，80 μ L菌體培養(yǎng)物中加入20 μ L不同濃度的上述酶切蛋白產(chǎn)物。在37°C培養(yǎng) 24小時(shí)，測(cè)定混合培養(yǎng)物0D600值，確定抗菌活性，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。對(duì)照組分別為融合蛋白Trx、Xa因子切割Oh切割液、氨節(jié)青霉素。通過(guò)生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)，結(jié)果顯示defensin 具有顯著地抗真菌和酵母的能力。煙粉風(fēng)defensin抗菌肽的抗菌活性結(jié)果如表2所示表權(quán)利要求
1.一種煙粉虱defensin抗菌肽基因，其特征在于，該基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.權(quán)利要求I所述煙粉虱defensin抗菌肽基因在制備具有抗菌活性的重組蛋白中的應(yīng)用。
3.利用權(quán)利要求I所述煙粉虱defensin抗菌肽基因制備具有抗菌活性的重組蛋白的方法，其特征在于，是通過(guò)基因重組技術(shù)將所述基因在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，獲得具有抗菌活性的重組蛋白。
4.權(quán)利要求I所述煙粉虱defensin抗菌肽基因編碼的抗菌肽，其特征在于，該抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
5.權(quán)利要求4所述抗菌肽在制備用于防治煙粉虱的藥物中的應(yīng)用，該藥物適用的煙粉風(fēng)品種為:隱種 Middle East-Asia Minor I、隱種 Mediterranean、隱種 ZHJl、隱種 ZHJ2 或隱種ZHJ3。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗菌肽及應(yīng)用，旨在提供煙粉虱抗真菌肽defensin基因及其所編碼的抗菌肽與制備。該抗菌肽基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，該抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本發(fā)明在表達(dá)載體中引入蛋白酶Xa因子，能夠有效的酶切重組融合蛋白，并根據(jù)蛋白分子大小利用超濾方式快速分離得到defensin多肽。整個(gè)過(guò)程快速簡(jiǎn)單。所得抗菌肽具有抗真菌活性，能明顯抑制球孢白僵菌、金龜子綠僵菌和灰霉菌等昆蟲病原真菌生長(zhǎng)。
文檔編號(hào)C12N15/12GK102586262SQ20121007327
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月19日
發(fā)明者時(shí)敏, 王知知, 陳學(xué)新 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)