專利名稱：一種普魯蘭酶及其產(chǎn)生菌株和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物酶技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種新型普魯蘭酶及其產(chǎn)酶菌株的篩選及鑒定。本發(fā)明還提供了該普魯蘭酶生產(chǎn)方法、酶學(xué)特性及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
淀粉是綠色植物光合作用的產(chǎn)物，由直鏈淀粉和支鏈淀粉構(gòu)成。其中直鏈淀粉主要通過α_1，4葡萄糖糖苷鍵連接而成，而支鏈淀粉還含有分支鏈，連接分支處的是α_1，6 葡萄糖糖苷鍵。淀粉是目前最為廣泛應(yīng)用的工業(yè)原料之一，比如制備葡萄糖漿、高麥芽糖漿等等。然而由于淀粉中含有約4% 5%的α-1，6糖苷鍵，使用α-淀粉酶(水解α_1，4糖苷鍵)無法徹底水解淀粉，影響了淀粉水解度的提高。I型普魯蘭酶(EC 3.2. I. 41)以內(nèi)切方式水解普魯蘭糖或淀粉的α_1，6葡萄糖糖苷鍵(Doman-Pytka M et al. , Critical Reviews in Microbiology, 2004, Vol 30，Issue 2，107-121)，因此I型普魯蘭酶具有很重要的工業(yè)應(yīng)用價值。工業(yè)上利用α -淀粉酶和普魯蘭酶協(xié)同作用能夠徹底水解淀粉，制備高葡萄糖漿、超高麥芽糖漿、提高啤酒發(fā)酵度等； 另外，將普魯蘭酶直接作用于淀粉能夠生產(chǎn)高直鏈淀粉、緩慢消化淀粉，這些產(chǎn)物在食品、 環(huán)保、醫(yī)療行業(yè)中都具有重要的作用。普魯蘭酶極大的提高了淀粉資源的利用率，然而目前國內(nèi)外分離所得的產(chǎn)普魯蘭酶菌株的產(chǎn)酶酶活較低(一般2 5 U/mL)，且價格昂貴，限制了其在工業(yè)上的應(yīng)用。這些產(chǎn)酶菌株主要來源于芽孢桿菌屬{Bacillus')和克雷伯菌屬),未見通過實驗方法從氣單胞菌屬中篩選到產(chǎn)普魯蘭酶菌株。本發(fā)明首次從稻田土壤中篩選到一株具有普魯蘭多糖降解能力的氣單胞菌屬菌株sp. As),其所產(chǎn)的普魯蘭酶能夠水解普魯蘭多糖和淀粉中的α-I，6糖苷鍵，不能水解α-I，4糖苷鍵，鑒定其為I型普魯蘭酶。該酶可應(yīng)用于以淀粉質(zhì)為原料的加工業(yè)中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的在于提供一種產(chǎn)酶酶活高的產(chǎn)普魯蘭酶菌株。本發(fā)明的第二個目的在于提供該普魯蘭酶菌株發(fā)酵方法。本發(fā)明利用唯一碳源法從稻田土壤中獲得了一種產(chǎn)普魯蘭酶的菌株As，該菌種保藏號為CGMCC NO. 5490，保藏日期為2011年11月28號，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，編號為3G2。對該菌株的16S rDNA (SEQ ID NO I)系統(tǒng)發(fā)育樹分析(見圖1)，表明該菌株來源于細(xì)菌中的氣單胞菌屬(命名為Jeroffioaas sp. As)。其 16S rIMk序列與Aeroinonaspunctata菌種相似度為99%。該菌株顯微形態(tài)為短桿菌，在LB 平板上菌落為圓形較大，微白色透明，邊緣光滑，菌落中間凸起，菌體粘稠(見圖2)。本發(fā)明為國內(nèi)外首次通過實驗的方法篩選到氣單胞菌屬來源的產(chǎn)普魯蘭酶菌株。本發(fā)明還提供上述產(chǎn)普魯蘭酶的菌株的發(fā)酵方法(即用普魯蘭酶菌株產(chǎn)普魯蘭酶的方法)，具體步驟如下對As菌株進(jìn)行分離純化后，挑取單菌落接種于15-25 mL種子培養(yǎng)基中(該培養(yǎng)基組分為可溶性淀粉1_2%，蛋白胨O. 5-1. O %，酵母粉O. 1-0. 3 %，MgSO4
7H20 O. 02- O. 05 %，KH2 PO4 O. 05-0. I %，其余為水；pH 6. 5-7. 5),28-32 °C，震蕩培養(yǎng) 16 18 h ;隨后取1-2 mL轉(zhuǎn)接入25-50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中(該培養(yǎng)基組分為可溶性淀粉 1-2 %，蛋白胨 O. 5-1. 5 %，酵母粉 O. 5-1. O %，MgSO4 · 7H20 O. 02-0. 05 %，KH2 PO4 O. 05-0. I %，其余為水；pH 6. 5-7. 5)，28-32 1震蕩培養(yǎng)36-60 h。其搖瓶發(fā)酵產(chǎn)生的I型普魯蘭酶的酶活為24.8 U/mL (見圖3)。本發(fā)明使用分子截留量為50 KDa的Amicon超濾管對50 mL發(fā)酵上清液進(jìn)行濃縮截流，并更換背景緩沖液為20 mM的Tris-HCl (pH8. O)。取濃縮初步純化后的酶液進(jìn)行后續(xù)的酶學(xué)特性分析。通過薄層層析(TLC)和離子色譜(HPAEC)的方法鑒定該菌株所產(chǎn)普魯蘭酶為I型普魯蘭酶(見圖5、圖6)。該I型普魯蘭酶的酶促反應(yīng)溫度可以是40°C -70°C, 最適溫度為60 °C ;酶促反應(yīng)pH可以是pH5-9，最適pH值為6. 0，在pH 6. O 9. O范圍內(nèi)相對酶活力均大于90% ;60 °C處理50 min，酶活力殘留約50%。該普魯蘭酶對馬鈴薯淀粉的降解能力約為其水解普魯蘭多糖的20%。本發(fā)明提供的I型普魯蘭酶可應(yīng)用于淀粉加工、 環(huán)保、食品、醫(yī)療保健等行業(yè)。


圖I :產(chǎn)普魯蘭酶菌株As的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析圖。根據(jù)細(xì)菌16S rDNA分類標(biāo)準(zhǔn)，16S rDNA序列相似度大于等于99%可初步認(rèn)為是同一種細(xì)菌。通過PCR擴(kuò)增Jerofflmas sp. As菌株基因組16S rDNA序列，獲得的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知的微生物16S rDNA序列進(jìn)行同源性比對,結(jié)果表明其與Jerofflmas/w/flciaia菌種相似度為99%。在系統(tǒng)發(fā)育樹中與氣單胞菌屬菌株16S rDNA序列形成同一個簇,共與Aeromonaspunctata菌種具有最聞的相似度。圖2 :產(chǎn)酶菌株Jeroffioaas 5/7. As菌落形態(tài)及顯微形態(tài)圖。該菌株顯微形態(tài)為短桿菌；在LB平板上菌落粘稠容易長成菌苔，菌落圓形，微白色透明，邊緣光滑，菌落中間凸起。該菌落形態(tài)與顯微形態(tài)的特征與氣單胞菌屬細(xì)菌形態(tài)特征相符合。圖3 :發(fā)酵時間對Jerofflmas sp. As產(chǎn)普魯蘭酶的影響。通過對Jerofflmas sp. As菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化(pH為7. 5，培養(yǎng)溫度為30 °C)，選擇不同的培養(yǎng)時間測定發(fā)酵上清液酶活。圖中的結(jié)果表明培養(yǎng)48 h時，其產(chǎn)酶量最高，上清液普魯蘭酶活達(dá)到24. 8 U/mL, 通過蛋白濃度測定計算該發(fā)酵液的粗酶比活力約為40 U/mg。圖4 : SDS-PAGE分析Aeromonas sp. As發(fā)酵上清液普魯蘭酶的純化結(jié)果。 Aeromonas sp. As在不含淀粉的LB培養(yǎng)基發(fā)酵48 h后，其上清液存在大小約60 KDa,50 KDa和38 KDa的蛋白條帶(泳道2)，通過對發(fā)酵上清液的酶活測定，發(fā)現(xiàn)其不具有普魯蘭酶酶活。使用含淀粉的發(fā)酵培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)As菌株24 h后，除了上述3條主要的蛋白外，還在140 KDa處檢測一蛋白表達(dá)條帶(泳道3);發(fā)酵48 h后，140 KDa處的蛋白條帶加深，測得發(fā)酵液中普魯蘭酶的酶活力提高(泳道4)。隨后采取超濾的方法對粗酶液進(jìn)行初步兩步純化，分別使用截留分子量為30 KDa (泳道5)和50 KDa (泳道6)的Amicon超濾管對發(fā)酵上清液進(jìn)行濃縮截流。兩步純化后140 KDa蛋白條帶明顯變濃，蛋白比酶活進(jìn)一步提高。 結(jié)果提示140 KDa的條帶蛋白可能是Jerofflmas sp. As所產(chǎn)普魯蘭酶。戰(zhàn)b -Aeromonas sp· As所產(chǎn)普魯蘭酶水解普魯蘭多糖產(chǎn)物薄層層析分析圖。根據(jù) IUBMB (International Union of Biochemistry and Molecular Biology)建立的兩類分類標(biāo)準(zhǔn)(把普魯蘭降解酶分成多類，其中I型普魯蘭酶(Type I pullulanase, EC 3. 2. I. 41)專一水解普魯蘭糖α -1，6糖苷鍵產(chǎn)生麥芽三糖；新普魯蘭酶(Neopullulanase， EC3. 2. I. 135)專一水解普魯蘭多糖的α _1，4糖苷鍵產(chǎn)生潘糖。不同類型的普魯蘭降解酶能夠水解不同的糖苷鍵，并生成不同的產(chǎn)物，因此在各個行業(yè)中的應(yīng)用也不盡相同；而I型普魯蘭酶在工業(yè)上的應(yīng)用最為廣泛。本發(fā)明通過薄層層析(TLC)和離子色譜法(HPAECjn 圖5)對As菌株所產(chǎn)普魯蘭酶水解普魯蘭多糖的產(chǎn)物進(jìn)行了分析。圖中泳道I為葡萄糖 (Cl)、麥芽糖(C2)、麥芽三糖(C3)層析后位置；泳道2為未水解的普魯蘭多糖；泳道3是使 M Aeromonas sp. As菌株產(chǎn)生的普魯蘭酶水解普魯蘭多糖后得到的產(chǎn)物。該圖表明As菌株普魯蘭酶水解普魯蘭多糖得到的產(chǎn)物為三糖。圖6 deroffioftas sp. As產(chǎn)生的普魯蘭酶水解普魯蘭多糖產(chǎn)物離子色譜分析圖。 為了進(jìn)一步鑒定該普魯蘭降解酶的催化分類，本發(fā)明采取離子色譜的方法對其水解普魯蘭多糖的產(chǎn)物進(jìn)行了鑒定。該普魯蘭降解酶水解普魯蘭多糖產(chǎn)生的三糖產(chǎn)物，其離子色譜保留時間約為16 min (如圖A),與麥芽三糖的標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間一致(如圖B)。通過標(biāo)準(zhǔn)加入法分析，結(jié)果表明該酶水解普魯蘭糖三糖產(chǎn)物的色譜峰與麥芽三糖標(biāo)準(zhǔn)品的峰發(fā)生重疊 (見圖C)，形成單一峰，這一結(jié)果說明該普魯蘭酶水解普魯蘭多糖的產(chǎn)物是麥芽三糖，因此 As菌株所產(chǎn)普魯蘭酶屬于I型普魯蘭酶。戰(zhàn)].Aeromonas sp· As產(chǎn)生的普魯蘭酶最適反應(yīng)溫度測定圖。將5 μ L初步純化后的粗酶液與95 μ L含1%普魯蘭多糖的20 mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液中(pH 6.0) 混勻，分別在30，40，50，60，70和80 °C溫度下反應(yīng)10 min，然后用DNS法測定普魯蘭酶活力，其中酶活力最高的設(shè)為100%。圖7的結(jié)果表明該普魯蘭酶可以在40-70°C進(jìn)行酶促反應(yīng)，酶活力在40%以上，最適反應(yīng)溫度為60 V。戰(zhàn)8 .Aeromonas sp· As產(chǎn)生的普魯蘭酶的最適pH測定圖。分別配制含1%普魯蘭多糖的pH 4. O 10. O的緩沖液，其中pH 4. O 6. O為20 mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液，pH 7. O 為 20 mM 的 NaH2PO4-Na2HPO4 緩沖液，pH 8. O 10. O 為 20mM 的 Tris-HCl 緩沖液。取含有底物的緩沖液95 μ L與5 μ L純化后的酶液一起在水浴中60 °C反應(yīng)10 min。 測定普魯蘭酶活力，其中酶活力最高的設(shè)為100%。圖7表明，在pH 6. O 9. O的范圍內(nèi)酶活均在90%以上，pH 5. O 9. O酶活都在70%以上，該酶的最適pH為6. O。圖9 iAaromonas sp. As產(chǎn)生的普魯蘭酶的熱穩(wěn)定性測定圖。將適量的酶液放置在60 °C、和65 °C下恒溫水浴中，每隔10 min取樣測定剩余酶活力，以保溫O min時的酶活力計為100%。圖8的結(jié)果表明，在60 °C條件下處理50 min，該普魯蘭酶的酶活力殘留約 50%。圖10 iAaromonas sp. As產(chǎn)生的普魯蘭酶的底物特異性測定。用20 mM朽1檬酸-朽1 檬酸三鈉緩沖液(pH 6. 0)配制1%的普魯蘭多糖、馬鈴薯淀粉、直鏈淀粉、α -環(huán)糊精、β -環(huán)糊精溶液，取5 μ L酶液與95 μ L底物混合，于60 V反應(yīng)10 min,用DNS還原糖法測定菌株As所產(chǎn)普魯蘭酶對不同底物的水解酶活。圖10的結(jié)果表明Jeroffioaas sp. As產(chǎn)生的普魯蘭酶水解淀粉的能力約為水解普魯蘭多糖的20%,不能水解直鏈淀粉(由α -1，4糖苷鍵構(gòu)成)、α-環(huán)糊精和環(huán)糊精。
具體實施例方式所用實驗材料和相關(guān)操作方法如下，未詳述處可以參考冷泉實驗室的《分子克隆》 (J. Sambrook, et al.,第二版，1996)
I.菌株，載體大腸桿菌菌株ToplO，質(zhì)粒pPMD18-T均為本實驗室保存，與現(xiàn)有文獻(xiàn)中相應(yīng)物質(zhì)的性質(zhì)相同。2.培養(yǎng)基
LB 培養(yǎng)基1.0% Polypeptone (BBI),O. 5% Yeast Extract (Oxoid),O. 5% NaCl, pH
7.O。平板富集培養(yǎng)基普魯蘭多糖3. O g，(NH4) 2 SO4 5. O g，KH2 PO4 O. 5g，MgSO4
7H20 O. I g，瓊脂糖 20. O g，加水至 1000 mL，pH 值 5.0。菌種分離培養(yǎng)基蛋白胨10. 0 g，牛肉膏3. O g, NaCl 5 g，加水至1000 mL，pH值 6· O。產(chǎn)酶種子培養(yǎng)基可溶性淀粉I. 2 %，蛋白胨O. 8 %，酵母粉O. 2 %，MgSO4 · 7Η20
O.05 %，KH2 PO4 O. I %，pH 7· O。產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基可溶性淀粉I. 5 %，蛋白胨I. O %，酵母粉O. 5 %，MgSO4 · 7Η20
O.05 %，KH2 PO4 O. I %，pH 7· O。3.實驗試劑普魯蘭多糖、馬鈴薯淀粉、直鏈淀粉等多糖購于Sigma公司；分子生物學(xué)需要的試劑購自TaKaRa公司；引物合成和DNA測序由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司完成。DNS (3，5-二硝基水楊酸)試劑(甲液溶解6. 9 g結(jié)晶酚于15. 2 mL 10%Na0H中，用蒸餾水稀釋至69 mL，再加入6. 9 g NaHSO3 ;乙液255克酒石酸鉀鈉加至300 mL 10%Na0H 中，再加入880 mL 1%3，5- 二硝基水楊酸溶液；將甲液與乙液相混合即得到黃色DNS試劑， 儲于棕色瓶中，在室溫下放置7 10天后使用)。4.普魯蘭酶酶活力測定方法本發(fā)明使用DNS還原糖法測定普魯蘭酶的酶活力。 具體方法如下取5 μ L酶液加入95 μ L含1% (質(zhì)量體積比)的普魯蘭多糖的檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液中(pH 6.0,20 mM)，60°C反應(yīng)10 min，加入100 μ L DNS終止反應(yīng)，煮沸10 min顯色；以5 μ L煮沸滅活的酶液為空白對照，570 nm測定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算產(chǎn)生還原糖的量，每組反應(yīng)做3個平行樣品。酶活單位定義每分鐘釋放I ymol還原糖(以葡萄糖計)定義為一個酶活力單位(IU)。實施例I :產(chǎn)普魯蘭酶菌株的篩選、分離及鑒定
取10 g 土樣加入到裝有90 mL無菌水和玻璃珠的三角瓶中，振蕩30 min，使樣品充分打散后，吸取100 μ L培養(yǎng)液稀釋后涂布于以普魯蘭多糖為唯一碳源的平板富集培養(yǎng)基上， 30 °C溫箱中培養(yǎng)48 h。從富集培養(yǎng)基上挑取不同形態(tài)單菌落各2個接于菌株分離培養(yǎng)基上，并對挑取的單菌落進(jìn)行反復(fù)劃線培養(yǎng)。隨后，將平板劃線純化后的菌落接入產(chǎn)酶種子培養(yǎng)基中，30 1振蕩培養(yǎng)24 h后，制得菌懸液。將菌懸液以4%接種量接入產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基， 30 1振蕩培養(yǎng)48 h ;取出上清液加入含1%的普魯蘭多糖的檸檬酸鈉緩沖液(pH 7.0),37 °C反應(yīng)30 min，初步測定發(fā)酵液上清中普魯蘭降解酶的酶活。對具有普魯蘭糖降解活性的菌株進(jìn)行基因組抽提，PCR擴(kuò)增16S rDNA。擴(kuò)增序列為 16S rDNA 通用引物 27F (AGAGTTTGATCMTGGCTCAG)和 1492R (TACGGYTACCTTGTTACGACTT)。 得到的 As 菌株 16S rDNA 序列(SEQ ID NO I)，在 RDP 數(shù)據(jù)庫(http: //rdp. cme. msu. edu/)中進(jìn)行分類。結(jié)果篩選獲得產(chǎn)普魯蘭酶菌株As，經(jīng)16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹分析、菌落形態(tài)、顯微形態(tài)分析(見圖I，圖2)表明該菌株屬于氣單胞菌屬sp.)。本發(fā)明為首次通過實驗的方法從氣單胞菌屬中篩選獲得普魯蘭酶菌株。實施例2 -Aeromonas sp. As發(fā)酵條件優(yōu)化
As菌株的普魯蘭酶屬于誘導(dǎo)型酶，需要在底物誘導(dǎo)條件下表達(dá)，因此在優(yōu)化As菌株產(chǎn)普魯蘭酶條件時，采用可溶性淀粉作為產(chǎn)酶誘導(dǎo)物。對As菌株進(jìn)行分離純化后，挑取單菌落接種于裝有25 mL種子培養(yǎng)基中，30 °C，震蕩培養(yǎng)16 18 h;隨后取2 mL轉(zhuǎn)接入裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 1震蕩培養(yǎng)48 h，取上清測定酶活力。調(diào)整發(fā)酵培養(yǎng)基pH值(pH6. 5 和pH7. 5)和發(fā)酵溫度(30 1和37 °C)，每隔12 h測定發(fā)酵液中普魯蘭酶酶活力，建立菌株As高產(chǎn)普魯蘭酶條件。實施例3 derofflmas 5/7. As發(fā)酵上清液中普魯蘭酶的初步純化
Aeromonas sp. As菌株經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)48 h后，取20 μ L發(fā)酵上清液使用12%的SDS-PAGE 檢測蛋白表達(dá)條帶。取30 mL發(fā)酵上清液，用Amicon超濾管(分子量30 KDa)超濾濃縮至I mL，緩沖液為20 mM Tris-HCKpH 8. 0)，取20 μ L進(jìn)行SDS-PAGE檢測，同時檢測第I次超濾后的普魯蘭酶比酶活(U/mg蛋白)。第2次超濾純化選用截留分子量為50 KDa的Amicon 超濾管，20 mM Tris-HCKpH 8. 0)，超濾后的終體積為800 μ L，取出20 μ L進(jìn)行SDS-PAGE 檢測(如圖4)，同時測定普魯蘭酶的比酶活。實施例4 -.Aeromonas sp. As菌株產(chǎn)普魯蘭酶的酶學(xué)分類分析
由于不同類型的普魯蘭酶的應(yīng)用不相同；其中，I型普魯蘭酶在工業(yè)上的應(yīng)用最廣。為了鑒定Aeromonas sp. As菌株產(chǎn)普魯蘭酶的酶學(xué)分類，本發(fā)明使用TLC和HPAEC方法對As 菌株普魯蘭酶水解普魯蘭多糖的產(chǎn)物進(jìn)行分析，具體操作如下
取5 μ L初步純化后的酶液加入到95 μ L的底物(含1%普魯蘭多糖的20 mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液，pH 6.0)，60°C反應(yīng)3 h，取2 3μ L水解后樣品點樣于Silica gel 60 F254板上，吹干后將硅膠板放置在丁醇/乙醇/水(5:3:2)展層液中展2 3次。展層結(jié)束后，在硅膠板上噴上甲醇/濃硫酸(7:3)顯色液，于110°C烘干顯色5 min。將上述酶解液稀釋2000倍，取I mL上樣色譜柱，使用Dionex 600離子色譜分析系統(tǒng)檢測酶解液的組成，稀釋2000倍的1%的麥芽三糖作為標(biāo)準(zhǔn)品。HPAEC洗脫條件在100 mM NaOH中以O(shè) 250 mM醋酸鈉梯度洗脫30 min,流速為I mL/min。實施例5 -Aeromonas sp. As菌株產(chǎn)普魯蘭酶的酶學(xué)特性分析
(I)最適反應(yīng)溫度測定將5 μ L純化后的酶液與95 μ L含1%普魯蘭多糖的檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液中(20 mM, pH 8.0)混勻，分別在30，40，50，60，70和80 °C溫度下反應(yīng)10 min，然后用DNS法測定普魯蘭酶活力，其中酶活力最高的設(shè)為100% (如圖7)。(2)最適pH值測定分別配制含1%普魯蘭糖的pH 3. O 10. O的緩沖液，其中pH
4.O 6. O為20mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液，pH 7. O為20mM的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液， pH 8. O 10. O為20mM的Tris-HCl緩沖液。取含有底物的緩沖液95 μ L與5 μ L純化后的酶液一起在水浴中60°C反應(yīng)10 min。測定普魯蘭酶活力，其中酶活力最高的設(shè)為100%(如圖8)。(3)熱穩(wěn)定性分析將適量的酶液放置在60°C和65°C下恒溫水浴中，每隔10 min 取樣測定剩余酶活力，以保溫O min時的酶活力計為100% (如圖9)。
(4)底物特異性分析用20 mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液(pH 6. O)配制1%的普魯蘭多糖、馬鈴薯淀粉、直鏈淀粉、α -環(huán)糊精、β -環(huán)糊精溶液，取5 μ L酶液與95 μ L底物 60 °C反應(yīng)10 min，用DNS還原糖法測定菌株As所產(chǎn)普魯蘭酶對不同底物的水解酶活?？梢姡景l(fā)明提供的I型普魯蘭酶可應(yīng)用于淀粉加工、環(huán)保、食品、醫(yī)療保健等行業(yè)。
權(quán)利要求
1.一株氣單胞菌屬菌株，其特征在于能夠產(chǎn)生普魯蘭酶，菌種保藏號為CGMCC NO. 5490,命名為 iAeromonas sp. As。
2.如權(quán)利要求I所述的氣單胞菌屬菌株，其搖瓶發(fā)酵產(chǎn)生的普魯蘭酶為I型普魯蘭酶， 其酶活為24. 8 U/mL。
3.用權(quán)利要求I所述氣單胞菌屬菌株產(chǎn)普魯蘭酶的方法，其特征在于具體步驟如下 對As菌株進(jìn)行分離純化后，挑取單菌落接種于15-25 mL種子培養(yǎng)基中，28-32 °C，震蕩培養(yǎng)16 18 h;隨后取1-2 mL轉(zhuǎn)接入25-50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，28-32 1震蕩培養(yǎng)36-60 h ;其中，所述種子培養(yǎng)基組分為可溶性淀粉1_2%，蛋白胨O. 5-1. O %，酵母粉O. 1-0. 3 %， MgSO4 · 7H20 O. 02- O. 05 %，KH2 PO4 O. 05-0. I %，其余為水，pH 6. 5-7. 5 ;所述發(fā)酵培養(yǎng)基組分為可溶性淀粉 1-2 %，蛋白胨 O. 5-1. 5 %，酵母粉 O. 5-1. O %，MgSO4 · 7H20 O. 02-0. 05 %，KH2 PO4 O. 05-0. I %，其余為水；pH 6. 5-7. 5。
4.如權(quán)利要求2所述的I型普魯蘭酶在淀粉加工、環(huán)保、食品或醫(yī)療保健行業(yè)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物酶技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種普魯蘭酶及其產(chǎn)酶菌株和應(yīng)用。該普魯蘭酶來源于細(xì)菌中的氣單胞菌屬；該菌株所產(chǎn)普魯蘭酶為I型普魯蘭酶，能夠?qū)Ｒ凰馄蒸斕m多糖或淀粉中的α-1，6葡萄糖糖苷鍵。在1.5%可溶性淀粉為底物誘導(dǎo)條件下表達(dá)；培養(yǎng)基pH7.5，培養(yǎng)溫度30℃條件下，搖瓶發(fā)酵48h產(chǎn)普魯蘭酶的水平達(dá)到24.8U/mL。該菌株所產(chǎn)普魯蘭酶的最適反應(yīng)溫度為60℃；最適pH為6.0，在pH6.0～9.0范圍內(nèi)相對酶活大于90%；在60℃處理50min，該普魯蘭酶的殘余活性達(dá)到了50%左右。本發(fā)明提供的I型普魯蘭酶可應(yīng)用于淀粉加工、環(huán)保、食品、醫(yī)療保健等行業(yè)。
文檔編號C12N1/20GK102604861SQ20121003454
公開日2012年7月25日 申請日期2012年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月16日
發(fā)明者馮碧薇, 呂紅, 周峻崗, 王儒愷 申請人:復(fù)旦大學(xué)