專利名稱：腈水合酶生產(chǎn)菌株紫紅紅球菌m33的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及培養(yǎng)腈水合酶生產(chǎn)菌株紫紅紅球菌M33的生物工藝學(xué)方法，并涉及在該方法中用來增加具有高腈水合酶的生物量產(chǎn)率的培養(yǎng)基。
化學(xué)化合物的工業(yè)生物工藝生產(chǎn)方法的發(fā)展已經(jīng)引起對具有特定酶的微生物產(chǎn)生巨大的興趣，這些酶可用于所選定的生物催化反應(yīng)。它們的實例是用于酰胺合成的生物工藝生產(chǎn)方法，該方法基于一些能夠合成腈水合酶的微生物，該酶催化有機酸的腈基轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的酰胺。在這方面，能夠?qū)⒈╇孓D(zhuǎn)化為丙烯酰胺的細(xì)菌菌株特別具有價值。
各種微生物的培養(yǎng)方法在具有催化活性的生物量或生物催化劑的生產(chǎn)上起重要作用。通常存在兩種選擇來增加每單位體積肉湯培養(yǎng)基的酶活性產(chǎn)率(總活性以U/ml計)1.激活(細(xì)菌)細(xì)胞的酶合成，或換句話說增加特定酶的活性(干生物量的U/mg)2.提高每單位體積肉湯培養(yǎng)基的活性細(xì)胞(活性生物量)的產(chǎn)率。
英國專利2087926A和此處引用的專利文獻(xiàn)中，描述了棒狀桿菌(corynebacterium)菌株N-774(發(fā)酵研究所(Fermentation ResearchInstitute)的保藏號FERM 4446)的培養(yǎng)方法。顯示腈水合酶的該菌株培養(yǎng)于無機培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含有濃度至少0.2mg/L的水溶鐵化合物和以重量計1％的酪蛋白水解產(chǎn)物(酪蛋白氨基酸)。該方法的缺點在于酪蛋白水解產(chǎn)物的成本高和所獲得的腈水合酶的活性低比活性＝53.3U/mg，干生物量＝5.66mg/mL，總活性＝301.7U/mL。
已知有機酸的腈基和酰胺，尤其是丙酸和異丁酸，引起誘導(dǎo)腈水合酶。在這方面，從美國專利第4,555,487號推斷出將這些化合物，其是已知的酶誘導(dǎo)試劑或誘導(dǎo)劑，加于綠針假單胞菌(Pseudomonaschlororaphis)B23株(FERM BP-187)和假單胞菌(Pseudomonas sp.)PS1株(FERM BP-188)，能夠獲得具有62.65U/mg比活性和335.8U/mL總活性的生物量(5.36g/L干生物量)。
該方法的缺點在于使用昂貴的誘導(dǎo)劑和所獲得的細(xì)胞的腈水合酶活性低。
EP0115781所描述的用于誘導(dǎo)綠針假單胞菌(Pseudomonaschlororaphis)B23株(FERM BP-187)和假單胞菌(Pseudomonas sp.)PS1株(FERM BP-188)的培養(yǎng)基不僅包括已描述的誘導(dǎo)劑，例如美國專利第4,555,487號中的，也包括用于增加酶活性的一種或多種α-氨基酸。例如，α-氨基酸如胱氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸等，以0.1至10.1g/L的濃度使用。然而，以該方法獲得的生物量的比活性不超過105.7U/mg，并且總活性不超過428.1U/mL。
利用培養(yǎng)紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)M33株已經(jīng)獲得更高的腈水合酶活性，如德國專利4480132所描述的。該出版物顯示，在含有葡萄糖(濃度5g/L)的合成培養(yǎng)基中培養(yǎng)該菌株期間，可能獲得具有比活性高達(dá)200U/mg和總活性高達(dá)360U/mL的細(xì)胞。所提出方法的基本優(yōu)點是培養(yǎng)基的簡單性，其不包含任何昂貴的成分。然而，提高葡萄糖濃度至20g/L，總活性的增加不超過1368U/ml。
歐洲專利0362829中所描述培養(yǎng)紫紅紅球菌J1株(FERM BP-1487)的方法是工業(yè)上適合的方法。其培養(yǎng)基包含便宜的誘導(dǎo)劑(尿素(濃度15g/L)和二價鈷)，所提議的培養(yǎng)方法使得能夠獲得具有578U/mg比活性的細(xì)胞。為了增加細(xì)胞產(chǎn)率(生物量產(chǎn)率)向培養(yǎng)基加入蛋白胨和酵母提取物。然而，獲得的總活性不超過2480U/mL，因為生物量的產(chǎn)率僅4.3g/L。在工業(yè)條件下上調(diào)培養(yǎng)步驟增加細(xì)胞產(chǎn)率至28g/ml；伴隨著特定腈水合酶活性下降至76U/mg和總活性下降至2100U/mL(YamamaH.，Kobayashi M.，“Nitrile hydratase and Application to IndustrialProduction of Acylamide”，Biosci.Biotech.Biochem.，60(9)，1391-1400，1996)。
文獻(xiàn)中描述了培養(yǎng)紫紅紅球菌M33株的另一種方法(Kim B-Y.，KimJ-C.，Lee H-H，Hyun H-H.，“Fed-batch Fermentation for Production ofNitrile Hydratase Rhodococcus rhodochrous M33”，Biotechnol.BioprocessEng.，611-17，2001)。該方法包括在含純合成培養(yǎng)基的5升發(fā)酵罐中進(jìn)行限制葡萄糖、補料-分批的發(fā)酵，該培養(yǎng)基由KH2PO4、K2HPO4、Fe2SO4×7H2O、EDTA-2Na、MgSO4×7H2O、NaCl、CoCl2×6H2O、尿素和葡萄糖組成。通過不斷的計量加入40％濃度的葡萄糖溶液和向葡萄糖溶液三次周期性加入CoCl2×6H2O(0.01g/L)，可獲得24g/L的細(xì)胞產(chǎn)率和120U/mg的腈水合酶比活性。然而，經(jīng)過約115小時的相對長時間發(fā)酵后，獲得的總活性不超過2882U/mL。
因此，仍然存在對培養(yǎng)腈水合酶生產(chǎn)菌株的生物工藝學(xué)方法的需求，以便能夠增加具有高腈水合酶活性的生物量的工業(yè)產(chǎn)率。
因此，本發(fā)明的一個目標(biāo)是提供這樣的方法。
已經(jīng)令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)腈水合酶生產(chǎn)菌株紫紅紅球菌的方法實現(xiàn)了本發(fā)明的目標(biāo)，所述生產(chǎn)腈水合酶的紫紅紅球菌例如是M33株，其以保藏號DSM 14230保藏于DSMZ，Deutsche Sammlug vonMikroorganismen und Zellkulturen Gmbh(德國微生物保藏中心)，Marschroder Weg 1b，D-38124，不倫瑞克，德國，該方法使用如下培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，該培養(yǎng)基基于12至60mM的磷酸鹽緩沖液，滿足細(xì)胞對磷的需求并在培養(yǎng)期間維持pH在5.5至9.0，并在最初提供的葡萄糖耗盡后計量加入作為新碳源的乙酸。
根據(jù)本發(fā)明，使用的培養(yǎng)基滿足細(xì)胞對磷的需求并在培養(yǎng)期間維持pH在5.5至9.0。優(yōu)選這樣的培養(yǎng)基含有作為額外生長因子的玉米提取物。
在本發(fā)明的方法中，尤其優(yōu)選在培養(yǎng)基中使用作為額外生長因子，加入的玉米提取物例如為玉米漿(corn steep liquor)的形式，以例如1至10g/L的濃度加入。所用的玉米提取物可以是任意的玉米漿，其包括玉米顆粒成分，成分已經(jīng)作為常規(guī)浸漬步驟的結(jié)果以濃縮形式進(jìn)入溶液。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選使用由Cerestar Deutschland GmbH，Krefeld提供的稱作Cerestar 15840的玉米漿。
優(yōu)選能用于本發(fā)明方法的培養(yǎng)基(下文簡稱SI)具有下列成分(g/L)a.)7.9g/L NaH2PO4×12H2Ob.)1.8g/L K2HPO4c.)0.02至0.04g/L CoCl2×6H2Od.)1.0g/L MgSO4×7H2Oe.)0至10g/L玉米提取物f.)20至90g/L葡萄糖g.)4至20g/L尿素。
尤其是使用如下培養(yǎng)基，這些培養(yǎng)基中已經(jīng)加入1至10g/L濃度的玉米提取物，優(yōu)選2至8g/L，更優(yōu)選2至6g/L。最優(yōu)選，所使用的玉米提取物以4g/L濃度在培養(yǎng)基中使用。
培養(yǎng)基的基礎(chǔ)是12至60mM的磷酸鹽緩沖液，其滿足細(xì)胞對磷的需求并在培養(yǎng)期間維持pH在5.5至9.0，使用葡萄糖和乙酸作為碳源，以及使用乙酸作為除葡萄糖外的新的額外碳源。
非常優(yōu)選，在本發(fā)明的方法中使用35.3mM的磷酸鹽緩沖液。
有利的是培養(yǎng)基含有20至90g/L的作為碳源的葡萄糖，優(yōu)選20至60g/L，和更優(yōu)選20至40g/L，特別對于在振蕩培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)。除了葡萄糖，乙酸可用作碳源，優(yōu)選碳源通過兩相法加入，特別對于實驗室或工業(yè)規(guī)模的發(fā)酵罐中培養(yǎng)。
該方法的第一相特征在于以培養(yǎng)基最初含有的第一碳源為基礎(chǔ)的紫紅紅球菌M33株的最初的、強烈細(xì)胞生長，第一碳源優(yōu)選為20g/L葡萄糖。葡萄糖耗盡后，發(fā)酵在已知為補料-分批的過程的第二相中持續(xù)，其中乙酸用作碳源。不昂貴的乙酸能夠替換適合培養(yǎng)的葡萄糖，并且所述的乙酸確保高腈水合酶比活性和高總活性。
有利的是，作為選擇乙酸能夠以其水溶性鹽的形式加入，特別優(yōu)選乙酸鈉作為水溶性乙酸鹽。在本發(fā)明的一個實施方案中，葡萄糖耗盡后計量加入根據(jù)本發(fā)明待用的水溶性乙酸鹽，其中優(yōu)選情形使用的乙酸鈉以1至4g/L的補料濃度加入。尤其優(yōu)選以3g/L的補料濃度加入乙酸鈉。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，水溶性乙酸鹽，優(yōu)選乙酸鈉，存在于最初的批培養(yǎng)中。當(dāng)pH升至7.5至8.5后，然后將乙酸以20至50％、優(yōu)選30％濃度的水溶液計量加入。有利的是，通過在pH7.5至8.5、尤其在7.9的pH-啟動補料計量加入乙酸水溶液。
此外，本發(fā)明的方法可通過在發(fā)酵期間以一定的次數(shù)和合適濃度計量加入待加入的組分來進(jìn)行，優(yōu)選CoCl2×6H2O和尿素，其中鈷作為輔助因子以及尿素作為誘導(dǎo)劑。
具體而言，對誘導(dǎo)腈水合酶，在培養(yǎng)基中計量加入4至20g/L尿素和0.02至0.04g/L的CoCl2×6H2O。優(yōu)選一些尿素在培養(yǎng)基的最初批中以誘導(dǎo)劑存在，優(yōu)選濃度為4g/L，并且在最初提供的葡萄糖耗盡后，優(yōu)選地以6g/L的補料濃度計量加入剩余的尿素。
根據(jù)本發(fā)明，在基于葡萄糖作為碳源的指數(shù)生長期的開始，通過將CoCl2×6H2O(優(yōu)選0.01g/L的投料濃度)與培養(yǎng)基混合加入CoCl2×6H2O輔助因子，然后，在葡萄糖耗盡后，加入更多的CoCl2×6H2O輔助因子，優(yōu)選地以0.03g/L的補料濃度計量加入。
令人驚奇地是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在進(jìn)行本發(fā)明時，如果在指數(shù)生長期的開始時計量加入CoCl2×6H2O，優(yōu)選以0.01g/L的補料濃度加入，發(fā)酵時間可以縮短。
在溫度25至30℃，在擋板式培養(yǎng)瓶(振蕩培養(yǎng)器)中和在實驗室和工業(yè)發(fā)酵罐中進(jìn)行本發(fā)明方法的菌株培養(yǎng)，培養(yǎng)時間從48至170小時。在本發(fā)明方法的優(yōu)選實施方案中，發(fā)酵期間氧的供應(yīng)，特別是對于工業(yè)發(fā)酵罐，被控制在相對氧分壓大于30％，優(yōu)選≥50％。
本發(fā)明的用于培養(yǎng)腈水合酶生產(chǎn)菌株紫紅紅球菌M33的方法的優(yōu)點在于，通過使用本發(fā)明的培養(yǎng)基，尤其是當(dāng)將玉米提取物用作額外的生長因子時，其能夠不僅產(chǎn)生大量的含腈水合酶的生物量(產(chǎn)率至多達(dá)到39.5g/L干生物量)，也產(chǎn)生具有高腈水合酶比活性的生物量(至多達(dá)315U/mg)，而腈水合酶總活性達(dá)到7169U/mg，如從下面實施例推論出。
與已知的培養(yǎng)腈水合酶生產(chǎn)菌株的方法不同的是，根據(jù)本發(fā)明的本方法特征在于使用基于12至60mM磷酸鹽緩沖液的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基在培養(yǎng)期間滿足細(xì)胞對磷的需求并維持pH在5.5至9.0，其特征還在于在最初提供的葡萄糖耗盡后，計量加入作為新碳源的乙酸。而且，可將玉米漿形式的玉米提取物用作額外的生長因子。此外，有利的是培養(yǎng)基中可用于培養(yǎng)的葡萄糖可以被不昂貴的乙酸代替，因此當(dāng)使用本發(fā)明的方法可以確保得到高腈水合酶比活性和高總活性。
測量腈水合酶活性的標(biāo)準(zhǔn)試驗將1ml的于10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.5)中的2％濃度的丙烯腈與1ml的M33細(xì)胞懸浮液混合，該懸浮液通過先前的肉湯培養(yǎng)物離心、洗滌和隨后在10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.5)中再懸浮細(xì)胞獲得。懸浮液包含0.08至0.6mg的細(xì)胞(干重)。反應(yīng)在20℃進(jìn)行5分鐘，之后通過加入20μl濃鹽酸終止反應(yīng)。利用氣相色譜或光度測定法測定所形成的丙烯酰胺的濃度。
腈水合酶活性用下列單位給出·比活性-以mol計的丙烯酰胺/分鐘×干生物量的mg＝[U/mg]·總活性-以mol計的丙烯酰胺/分鐘×培養(yǎng)物肉湯的ml＝[U/ml]利用下列實施例闡述本發(fā)明
實施例1在含有50ml培養(yǎng)基“SI”(以g/L計組成7.9Na2HPO4×12H2O；1.8KH2PO4；0.02CoCl2×6H2O；1.0MgSO4×7H2O；2.0玉米提取物；pH7.2±0.2)和含有葡萄糖(50g/L)和尿素(4至20g/L)的擋板式培養(yǎng)瓶(250ml)中接種1ml紫紅紅球菌M33株接種培養(yǎng)物。接種物已經(jīng)在同樣培養(yǎng)基中培養(yǎng)超過24小時。在30℃，以180rpm(圓周運動)在振蕩培養(yǎng)器中進(jìn)行培養(yǎng)超過96小時。測定生物量的產(chǎn)率和細(xì)胞的腈水合酶活性。結(jié)果列于表1。
表1
實施例2在含有50ml培養(yǎng)基“SI”(以g/L計組成7.9Na2HPO4×12H2O；1.8KH2PO4；0.02CoCl2×6H2O；1.0MgSO4×7H2O；16.0尿素；pH7.2±0.2)和含有葡萄糖(50g/L)和玉米提取物(0至10g/L)的擋板式培養(yǎng)瓶(250ml)中接種1ml紫紅紅球菌M33株接種培養(yǎng)物。接種物已經(jīng)在同樣培養(yǎng)基中培養(yǎng)超過24小時。在30℃，以180rpm(圓周運動)在振蕩培養(yǎng)器中進(jìn)行培養(yǎng)超過96小時。測定生物量的產(chǎn)率和細(xì)胞的腈水合酶活性。結(jié)果列于表2。
表2
*對該起始混合物計量加入0.01g/L FeSO4×7H2O。
從上面的數(shù)據(jù)，證明加入玉米提取物導(dǎo)致腈水合酶比活性和總腈水合酶活性的增加。玉米提取物的最佳濃度是4g/L。
實施例3含有50ml培養(yǎng)基“SI”(以g/L計組成7.9Na2HPO4×12H2O；1.8KH2PO4；0.02CoCl2×6H2O；1.0MgSO4×7H2O；16.0尿素；4.0玉米提取物pH7.2±0.2)的擋板式培養(yǎng)瓶(250ml)中含有濃度為20至90g/L的葡萄糖。接種物和培養(yǎng)瓶接種如實施例1進(jìn)行。表3總結(jié)了測定的生物量產(chǎn)率和細(xì)胞腈水合酶活性。
表3
從表3可以看出，在培養(yǎng)基中細(xì)胞產(chǎn)率和總腈水合酶活性的增加與葡萄糖濃度的增加成比例。這得自于事實上所有的培養(yǎng)基成分以無限制的濃度存在。
實施例4在含有1.5升培養(yǎng)基“SI”(以g/L計組成7.9Na2HPO4×12H2O；1.8KH2PO4；0.01CoCl2×6H2O；1.0MgSO4×7H2O；16.0尿素；4.0玉米提取物；pH7.2±0.2)和含有葡萄糖(5g/L)的3升實驗室發(fā)酵罐中接種100ml紫紅紅球菌M33株接種培養(yǎng)物。接種物已經(jīng)在同樣組分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)超過24小時。
培養(yǎng)條件·溫度 30℃·攪拌速度 560rpm·換氣速率 1.5vvm(體積/體積/分鐘)發(fā)酵18小時后，每2小時計量加入1.5g/L葡萄糖直到終濃度達(dá)到40g/L。結(jié)果顯示生產(chǎn)出了具有215U/mg比活性的16.4g/L的干生物量。總活性是3526U/mL。
實施例5如實施例4所述，在含有1.5升培養(yǎng)基“SI”(以g/l計組成7.9Na2HPO4×12H2O；1.8KH2PO4；0.01g CoCl2×6H2O；1.0g MgSO4×7H2O；16.0尿素；4.0玉米提取物；pH7.2±0.2)和含有20g/L葡萄糖的3升實驗室發(fā)酵罐中進(jìn)行接種。培養(yǎng)條件也同實施例4。發(fā)酵24至36小時和耗盡所有葡萄糖后，計量加入6g/L尿素、3g/L乙酸鈉和0.03g/LCoCl2×6H2O。培養(yǎng)基pH增加后，計量加入30％濃度的乙酸(補料分批)。在這些條件下，發(fā)現(xiàn)在超過72小時里生產(chǎn)出了具有315U/mg比活性的19.6g/L的干生物量?？偦钚允?174U/mL。
實施例6在含有7.0升培養(yǎng)基“SI”(以g/L計組成7.9Na2HPO4×12H2O；1.8KH2PO4；1.0MgSO4×7H2O；4.0尿素；4.0玉米提取物，pH7.2±0.2)和含有20g/L葡萄糖的15升實驗室發(fā)酵罐中接種4％(v/v)紫紅紅球菌M33株接種培養(yǎng)物。接種物作為振蕩培養(yǎng)物已經(jīng)在同樣培養(yǎng)基中培養(yǎng)超過24小時。
培養(yǎng)條件·溫度29-30℃·換氣速率0.5vvm·重疊壓 0.3bar·相對氧分壓 ≥50％(通過攪拌速度控制)·攪拌速率300至600rpm發(fā)酵12小時后(指數(shù)生長期開始)，計量加入0.01g/L CoCl2×6H2O。發(fā)酵21至23小時和耗盡所有葡萄糖后，計量加入6g/L尿素、3g/L乙酸鈉和0.03g/L CoCl2×6H2O。培養(yǎng)基的pH升至7.9后，計量加入乙酸(30％)形式的新碳源，并調(diào)節(jié)pH至7.9(pH-啟動的補料(pH-stat feeding))。在這些條件下，發(fā)現(xiàn)僅在66.5小時里便生產(chǎn)出了具有294U/mg比活性的19.9g/L的干生物量?？偦钚允?851U/mL。
由于事實上指數(shù)生長期前CoCl2×6H2O沒有加入，相比于實施例5可能減少發(fā)酵時間。
實施例7在具有15m3容量和含有10m3培養(yǎng)基“SI”(以g/L計組成3.48H3PO4；0.74KOH；用于調(diào)節(jié)pH至6.9的NaOH；0.01CoCl2×6H2O；1.0MgSO4×7H2O；4.0尿素；4.0玉米提取物，pH7.2±0.2)和含有20g/L葡萄糖的工業(yè)生產(chǎn)發(fā)酵罐中接種5％(v/v)紫紅紅球菌M33株接種培養(yǎng)物。接種物先前已經(jīng)以預(yù)發(fā)酵的方式培養(yǎng)了超過24小時，再次使用“SI”。
·溫度28-30℃·攪拌速度160-165rpm·換氣速率0.5vvm發(fā)酵24至36小時和耗盡所有葡萄糖后，向培養(yǎng)基中計量加入6g/L尿素、3g/L乙酸鈉和0.03g/LCoCl2×6H2O。乙酸的補料以與實施例6所描述類似的方式進(jìn)行。發(fā)酵72小時后，發(fā)現(xiàn)生產(chǎn)出了具有290U/mg比活性的18.8g/L的干生物量。總活性是5452U/mL。
權(quán)利要求
1.腈水合酶生產(chǎn)菌株紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)M33的培養(yǎng)方法，該菌株以保藏號DSM 14230保藏于德國微生物保藏中心，Marschroder Weg 1b，D-38124，不倫瑞克，德國，該方法特征在于使用一種培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基基于12至60mM磷酸鹽緩沖液并滿足細(xì)胞對磷的需求和在培養(yǎng)期間維持pH在5.5-9.0的范圍內(nèi)，并且當(dāng)所有最初提供的葡萄糖已經(jīng)耗盡時，向所述培養(yǎng)基中計量加入乙酸作為新碳源。
2.如權(quán)利要求1定義的方法，特征在于將玉米提取物在所述培養(yǎng)基中用作生長因子。
3.如權(quán)利要求2定義的方法，特征在于將玉米漿和/或玉米浸漬溶液用作玉米提取物。
4.如權(quán)利要求1-3任意一項定義的方法，特征在于所述的玉米提取物在所述的培養(yǎng)基中以1至10g/L的濃度使用。
5.如權(quán)利要求1-4任意一項定義的方法，特征在于將葡萄糖和乙酸用作培養(yǎng)基中的碳源。
6.如權(quán)利要求1-5任意一項定義的方法，特征在于所述的培養(yǎng)基含有濃度為20至90g/L的葡萄糖作為碳源。
7.如權(quán)利要求1-6任意一項定義的方法，特征在于乙酸最初以其水溶性鹽的形式加入。
8.如權(quán)利要求1-7任意一項定義的方法，特征在于所用的水溶性乙酸鹽是乙酸鈉。
9.如權(quán)利要求1-8任意一項定義的方法，特征在于將水溶性乙酸鹽用于最初的批培養(yǎng)，并且當(dāng)pH升至7.5-8.5，計量加入乙酸。
10.如權(quán)利要求1-9任意一項定義的方法，特征在于葡萄糖消耗后，水溶性乙酸鹽以1至4g/L的濃度計量加入，優(yōu)選3g/L。
11.如權(quán)利要求1-10任意一項定義的方法，特征在于隨后以20至50％濃度水溶液的形式、優(yōu)選以30％濃度水溶液的形式加入乙酸。
12.如權(quán)利要求1-11任意一項定義的方法，特征在于在pH7.5-8.5、優(yōu)選pH7.9時通過pH-啟動的補料計量加入乙酸溶液。
13.如權(quán)利要求1-12任意一項定義的方法，特征在于在所述培養(yǎng)基中計量加入尿素和CoCl2×6H2O。
14.如權(quán)利要求1-13任意一項定義的方法，特征在于將一部分尿素作為誘導(dǎo)劑加入用作最初的批培養(yǎng)物的培養(yǎng)基，并且當(dāng)最初提供的葡萄糖已經(jīng)耗盡時，再次計量加入尿素。
15.如權(quán)利要求1-14任意一項定義的方法，特征在于在指數(shù)生長期的開始向基于葡萄糖作為碳源的培養(yǎng)基中加入CoCl2×6H2O，并在葡萄糖耗盡后再次計量加入。
16.如權(quán)利要求1-15任意一項定義的方法，特征在于在發(fā)酵罐培養(yǎng)期間控制氧的供應(yīng)使得相對O2分壓大于30％，并優(yōu)選≥50％。
17.用于權(quán)利要求1至16任意一項定義的方法中的培養(yǎng)基，包含a.)7.9g/L Na2HPO4×12H2Ob.)1.8g/L CH2PO4c.)0.02-0.04g/L CoCl2×6H2Od.)1.0g/L MgSO4×7H2Oe.)從0至10g/L的玉米提取物f.)從20至90g/L的葡萄糖g.)從4至20g/L的尿素。
18.如權(quán)利要求17定義的培養(yǎng)基，特征在于所述培養(yǎng)基含有濃度從1至10g/L的玉米提取物。
19.如權(quán)利要求17或權(quán)利要求18定義的培養(yǎng)基，特征在于其基于12至60mM磷酸鹽緩沖液并滿足細(xì)胞對磷的需求，且在培養(yǎng)期間維持pH在5.5-9.0的范圍內(nèi)。
20.如權(quán)利要求17至19任意一項定義的培養(yǎng)基，特征在于所述的培養(yǎng)基包括乙酸作為進(jìn)一步碳源。
全文摘要
本發(fā)明涉及腈水合酶生產(chǎn)菌株紫紅紅球菌M33的培養(yǎng)方法，其中使用一種培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基基于12至60mM磷酸鹽緩沖液并在培養(yǎng)期間滿足細(xì)胞對磷的需求和維持pH在5.5－9.0的范圍內(nèi)，并且當(dāng)其中已有量的葡萄糖已經(jīng)耗盡時，向培養(yǎng)基中加入乙酸作為新碳源。本發(fā)明也涉及該方法中所用的培養(yǎng)基。
文檔編號C12N1/38GK1961067SQ200480043243
公開日2007年5月9日 申請日期2004年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月3日
發(fā)明者約瑟夫·洛倫茨, S.·P.·沃羅寧, S.·W.·科索林, I.·N.·辛吉爾茲夫, V.·G.·德巴伯夫, A.·S.·亞年科 申請人:亞什蘭許可和知識產(chǎn)權(quán)有限公司