專利名稱：一種產(chǎn)腈水合酶優(yōu)良菌種的選育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)腈水合酶優(yōu)良菌種的選育方法。
背景技術(shù)：
腈水合酶(nitrile hydratase, NHase)是生物催化法生產(chǎn)丙烯酰胺(acrylamide, AM)的催化劑，能催化丙烯腈(acrylonitrile, AN)水合生成丙烯酰胺。該酶的活性大小是微生物法生產(chǎn)丙烯酰胺的關(guān)鍵技術(shù)。在工業(yè)生產(chǎn)中，當(dāng)丙烯酰胺達(dá)到一定濃度后，腈水合酶的催化速率顯著降低，丙烯酰胺濃度很難有進(jìn)一步提高，終濃度通常為300 400 g/L。要得到丙烯酰胺晶體，還要通過蒸氣濃縮及結(jié)晶才能得到98%的含量，生產(chǎn)中得到的結(jié)果表明，提高丙烯酰胺溶液百分比濃度可減少蒸氣用量，所以提高腈水合酶 菌的丙烯酰胺耐受性有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種產(chǎn)腈水合酶優(yōu)良菌種的選
育方法。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案為
(1)接種發(fā)酵液的制備在無菌室內(nèi)，將諾卡氏菌斜面菌種接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形瓶內(nèi)，將錐形瓶放入搖床進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速設(shè)定為150-200r/min，溫度為28±2°C，培養(yǎng)IOOh后得到具有腈水合酶活性的發(fā)酵液；
(2)耐受性培養(yǎng)按照步驟(I)制備菌體發(fā)酵液，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)IOOh時，每隔l-2h向搖瓶發(fā)酵液中加入含量95-99%的丙烯腈2ml繼續(xù)搖瓶培養(yǎng)，同時，每隔l_2h取樣進(jìn)行平板菌落計數(shù)和酶活測定，篩選出一株最耐丙烯酰胺的二次出發(fā)菌種；
(3)低溫馴化培養(yǎng)步驟(2)中得到二次出發(fā)菌種，取其發(fā)酵液5ml稀釋100倍后，平皿涂布，分別置于10-20°C的培養(yǎng)箱里低溫培養(yǎng)100h，觀察菌體生長情況；
(4)擴(kuò)大培養(yǎng)將長出少數(shù)菌落的菌種進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，搖床轉(zhuǎn)速設(shè)定為150-200r/min,溫度為28±2°C，培養(yǎng)IOOh后分別檢測不同低溫處理的腈水合酶酶活，從而得到酶活性最高的菌株。優(yōu)選地，所述的斜面和平板培養(yǎng)基的配方為葡萄糖15-20 g/1, K2HPO4 O. 5-0. 6g/I，酵母浸膏 4.5-5. Og/1 ,MgSO4 · 7H20 0.8 -1.0 g/1，味精 O. 9_1· 0，磷酸氫二鉀 O. 5-0. 6,尿素 7-7. 5g/l，消泡劑 IOOppm,瓊脂 20. O -25. Og/Ι ；
優(yōu)選地，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為葡萄糖20-25g/l，K2HPO4 O. 6-0. 8g/l，酵母浸膏
7.0-9. Og/1, MgSO4 ·7Η20 I. 2-1. 3 g/1，味精 I. 4_1· 5 g/1，脲 7· 0-8.0 g/1，消泡劑 150ppm。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于對諾卡氏菌進(jìn)行丙烯酰胺耐受性培養(yǎng)和低溫馴化培養(yǎng)，優(yōu)選得到腈水合酶酶活性高達(dá)1643萬μ /mg的菌株，比原諾卡氏菌菌株的腈水合酶酶活性854萬u/mg提聞了 92%。同時該菌株對丙稀酸胺的耐受:性也提聞了 20%。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例僅為了進(jìn)一步說明本發(fā)明，并不限制本發(fā)明的內(nèi)容。實(shí)施例I
I、斜面和平板培養(yǎng)基的配制
葡萄糖 15-20 g/1 ,K2HPO4 0.5-0. 6g/l，酵母浸膏 4. 5-5. Og/1 ,MgSO4 ·7Η20 0.8 -1.0 g/1，味精 O. 9-1. 0，磷酸氫二鉀 O. 5-0. 6，尿素 7-7. 5g/l，消泡劑 IOOppmJl^g 20. O -25. Og/L·2、發(fā)酵培養(yǎng)基配制 葡萄糖 20-25g/l，K2HPO4 O. 6-0. 8g/l，酵母浸膏 7. 0-9. Og/1, MgSO4 · 7H20 I. 2-1. 3 g/1，味精 I. 4-1. 5 g/U7.0-8.0 g/1，消泡劑 150ppm。3、耐受性實(shí)驗(yàn)
在無菌室內(nèi)，將諾卡氏菌斜面菌種接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形瓶內(nèi)，將錐形瓶放入搖床進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速設(shè)定為150-200r/min，溫度為28±2°C，培養(yǎng)IOOh后得到具有腈水合酶活性的發(fā)酵液，每隔I. 5h向搖瓶發(fā)酵液中加入含量99%的丙烯腈2ml繼續(xù)搖瓶培養(yǎng)，通過平板菌落計數(shù)觀察菌種生長情況，發(fā)現(xiàn)113. 5h時，菌體的存活率最低，只有
O.0013%，腈水合酶活性為510萬μ /mg。2、低溫馴化實(shí)驗(yàn)
將上述113. 5h時得到的二次出發(fā)菌種，取其發(fā)酵液5ml稀釋100倍后，平皿涂布，分別置于10°C、12°C、14°C、16°C、18°C >20 V的培養(yǎng)箱里低溫培養(yǎng)100h，觀察菌體生長情況，獲得30個殘存菌落，將30個菌落的菌種進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，搖床轉(zhuǎn)速設(shè)定為150-200r/min，溫度為28±2°C，培養(yǎng)IOOh后分別檢測不同低溫處理的腈水合酶酶活，發(fā)現(xiàn)18°C下培養(yǎng)一菌株的酶活性最高，其腈水合酶活性達(dá)到1643萬μ/mg，比原諾卡氏菌菌株的腈水合酶酶活性854萬μ/mg提高了 92%，同時該菌株對丙烯酰胺的耐受性也提高了 20%。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)腈水合酶優(yōu)良菌種的選育方法，其特征在于包括以下步驟 (1)接種發(fā)酵液的制備在無菌室內(nèi)，將諾卡氏菌斜面菌種接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形瓶內(nèi)，將錐形瓶放入搖床進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速設(shè)定為150-200r/min，溫度為28±2°C，培養(yǎng)IOOh后得到具有腈水合酶活性的發(fā)酵液； (2)耐受性培養(yǎng)按照步驟(I)制備菌體發(fā)酵液，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)IOOh時，每隔l-2h向搖瓶發(fā)酵液中加入含量95-99%的丙烯腈2ml繼續(xù)搖瓶培養(yǎng)，同時，每隔l_2h取樣進(jìn)行平板菌落計數(shù)和酶活測定，篩選出一株最耐丙烯酰胺的二次出發(fā)菌種； (3)低溫馴化培養(yǎng)步驟(2)中得到二次出發(fā)菌種，取其發(fā)酵液5ml稀釋100倍后，平皿涂布，分別置于10-20°C的培養(yǎng)箱里低溫培養(yǎng)100h，觀察菌體生長情況； (4)擴(kuò)大培養(yǎng)將長出少數(shù)菌落的菌種進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，搖床轉(zhuǎn)速設(shè)定為150-200r/min,溫度為28±2°C，培養(yǎng)IOOh后分別檢測不同低溫處理的腈水合酶酶活，從而得到酶活性最高的菌株。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種產(chǎn)腈水合酶菌種的選育方法，其特征在于所述的斜面和平板培養(yǎng)基的配方為葡萄糖15-20 g/1，K2HPO4 O. 5-0. 6g/l，酵母浸膏4. 5-5. Og/1,MgSO4 ·7Η20 0.8 -1.0 g/1，味精 O. 9-1.0，磷酸氫二鉀 O. 5-0. 6，尿素 7-7. 5g/l，消泡劑IOOppm,瓊脂 20. O -25. Og/Ι。
3.根據(jù)根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種產(chǎn)腈水合酶菌種的選育方法，其特征在于所述的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為葡萄糖20-25g/l，K2HPO4 O. 6-0. 8g/l，酵母浸膏7. 0-9. Og/1,MgSO4 ·7Η20 I. 2-1. 3 g/1，味精 I. 4_1· 5 g/1，脲 7.0-8.0 g/1，消泡劑 150ppm。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種產(chǎn)腈水合酶優(yōu)良菌種的選育方法，對諾卡氏菌進(jìn)行丙烯酰胺耐受性培養(yǎng)得到單菌落，經(jīng)過搖瓶發(fā)酵得到二次出發(fā)菌種，再通過低溫馴化培養(yǎng)，優(yōu)選性能優(yōu)良的腈水合酶酶菌種，其酶活性高達(dá)1643萬μ/mg，比原諾卡氏菌菌株的腈水合酶酶活性854萬μ/mg提高了92%，同時該菌株對丙烯酰胺的耐受性也提高了20%。為后續(xù)的丙烯酰胺生產(chǎn)提供高效的催化劑。
文檔編號C12N1/20GK102776142SQ20121025164
公開日2012年11月14日 申請日期2012年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月20日
發(fā)明者張小琴, 曹艷, 楊濤, 水瑞芬, 沈瑞華, 熊光輝, 顧稀平 申請人:江蘇南天農(nóng)科化工有限公司