專利名稱：：具有降低的飽和脂肪酸水平的轉(zhuǎn)基因植物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明大致涉及轉(zhuǎn)基因植物領(lǐng)域。更具體而言，本發(fā)明涉及用于改變植物中脂肪酸代謝，用于降低由這種植物制備的種子油的飽和脂肪酸含量的分子技術(shù)。該技術(shù)例如在由產(chǎn)油植物獲得具有提高了營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的種子油的商業(yè)生產(chǎn)中具有實(shí)用性。
背景技術(shù)：
：為了研制出用于特殊目的而設(shè)計(jì)的植物油，改變植物中脂肪酸(FA)代謝已引起極大的興趣。油的性質(zhì)由影響營(yíng)養(yǎng)成份和氧化穩(wěn)定性的其脂肪酸組成決定。在各種類型的脂肪和油中，飽和FA的水平是主要的健康關(guān)注點(diǎn)。因此，在市場(chǎng)上提供具有較低的飽和FA含量的植物油已變得越來(lái)越緊迫。在大部分植物油中飽和脂肪酸的主要組成為16:0(棕櫚酸)和18:0(硬脂酸)。在植物油市場(chǎng)，具有小于7％飽和FA含量的油可以標(biāo)為“低脂”，而具有小于3.5％飽和FA含量的油可以標(biāo)為“無(wú)脂”。蕓苔(Brassicanapus)種子油的飽和脂肪酸一般較低，但是也難以使飽和脂肪酸水平低于界限為7％飽和FA含量的“低脂”。之前，為了解決上述問(wèn)題，已經(jīng)進(jìn)行了嘗試。例如，已經(jīng)制備了包含參與脂肪酸代謝的異種植物基因的轉(zhuǎn)基因植物(參見(jiàn)如ShahS，WeselakeR(2003)FarmingFortheFuture，AARIproject#19990032，F(xiàn)inalReport，pp.1-82；和Yao等人，PlantBiotechJ2003，1221)。然而，這些轉(zhuǎn)基因植物顯示轉(zhuǎn)基因植物中飽和脂肪酸少量下降或沒(méi)有下降。例如，Yao等人(2003)報(bào)道了與擬南芥(Arabidopsis)的ADS1基因在雪里紅(B.juncea)種子中的表達(dá)相關(guān)的1～2％飽和FA水平的下降。在本文中，原核基因提供了一種引人注目的對(duì)植物基因的替代，然而，原核蛋白在植物背景中經(jīng)常表現(xiàn)有限的活性或沒(méi)有活性(參見(jiàn)如，HahnJJ，EschenlauerAC，NarrolMH，SomersDA，SriencF(1997)Growthkinetics，nutrientuptake，andexpressionoftheAlcaligenesentrophuspoly(β-hydroxybutyrate)synthesispathwayintransgenicmaizecellsuspensioncultures.BiotechProg13347-354)。先前已經(jīng)說(shuō)明，可以通過(guò)制備表達(dá)異種Δ-6去飽和酶(得自于藻青菌、琉璃苣或月見(jiàn)草)的轉(zhuǎn)基因植物，以實(shí)現(xiàn)亞油酸(C18Δ9，12)、聚不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化為γ-亞油酸(GLA，C18Δ6，9，12)來(lái)提高植物種子油的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值(參見(jiàn)美國(guó)專利第5552306、5614393、5663068、5789050、6355861、6683232號(hào)，和美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)第20040078845號(hào))。亞油酸(C18Δ9，12)為基本飲食成分，其不能被脊椎動(dòng)物合成且通常由植物來(lái)源獲取；脊椎動(dòng)物細(xì)胞可以在脂肪酸的Δ-9位置引入雙鍵，但是不能在脂肪酸鏈的Δ-9雙鍵和甲基端之間引入另外的雙鍵。哺乳動(dòng)物可以將亞油酸轉(zhuǎn)化為γ-不飽和酸(GLA，C18Δ6，9，12)，其然后可以被轉(zhuǎn)化為多數(shù)前列腺素的基本前體花生四烯酸(20:4)。因此，仍然需要能夠提供具有較低的飽和脂肪酸水平的種子油的轉(zhuǎn)基因植物。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供降低由植物制備的種子油中飽和脂肪酸水平的分子技術(shù)。具體地，本發(fā)明的分子技術(shù)以對(duì)降低由所述的植物制備的種子油中飽和脂肪酸含量有效的水平，在植物中表達(dá)具有Δ-9去飽和酶活性的酶(即，其使脂肪酸在Δ-9位置去飽和)。所以，在本發(fā)明的一個(gè)技術(shù)方案中提供了一種包括與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留和回收信號(hào)(endoplasmicreticulumretentionandretrievalsignal)序列可操作地連接的來(lái)自于原核生物的Δ-9去飽和酶的重組多肽。所述的Δ-9去飽和酶來(lái)自于原核生物，例如藻青菌，如藍(lán)細(xì)菌(Anacystisnidulans)。在實(shí)施方案中，所述的Δ-9去飽和酶包括(a)具有SEQIDNo.列出的氨基酸序列的多肽；(b)與(a)中所限定的多肽具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的同一性，且具有Δ-9去飽和酶活性的(a)所限定的多肽的變異體或同源物；(c)與(a)中限定的多肽具有至少50個(gè)相同的連續(xù)氨基酸，且具有Δ-9去飽和酶活性的(a)中所限定的多肽的片斷。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的Δ-9去飽和酶包括具有SEQIDNo.2中列出的氨基酸序列的多肽，且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜駐留和回收信號(hào)具有氨基酸序列KKSS(SEQIDNo.5)。本發(fā)明還提供編碼如上所限定的重組多肽的核酸分子；包括與啟動(dòng)子可操作地連接的所述核酸分子的載體；用這種載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；和一種轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞包括包含與導(dǎo)致重組多肽在所述的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子可操作地連接的上述核酸分子的轉(zhuǎn)基因元件。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括(a)用上述核酸分子或包括這種核酸的載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中，所述的核酸與實(shí)現(xiàn)重組多肽在所述的植物細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子可操作地連接；和(b)由步驟(a)中制備的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞再生植株。本發(fā)明還提供了一種轉(zhuǎn)基因植物，該轉(zhuǎn)基因元件包括包含與導(dǎo)致重組多肽在所述的轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的啟動(dòng)子可操作地連接的上述核酸分子的轉(zhuǎn)基因元件。與相同種類的野生型植物相比，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物和植物細(xì)胞例如在具有降低的飽和脂肪酸含量的種子油的生產(chǎn)中具有實(shí)用性。具體實(shí)施例方式作為本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明的中請(qǐng)人開(kāi)發(fā)了轉(zhuǎn)基因蕓苔植物，與目前市售的品種相比，證明了飽和脂肪酸百分含量約下降了40％。這是通過(guò)在蕓苔植物中表達(dá)包括與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)回收和駐留信號(hào)KKSS(SEQIDNo.5)融合的SEQIDNo.2的Δ-9去飽和酶的重組多肽實(shí)現(xiàn)的。申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)，融合到KKSS(SEQIDNo.5)的Δ-9去飽和酶的表達(dá)使蕓苔種子油的飽和FA含量顯著下降，而單獨(dú)的去飽和酶基因(即，沒(méi)有融合到KKSS(SEQIDNo.5))在降低蕓苔種子油的飽和脂肪酸水平上不是很有效。與從野生型蕓苔得到的種子油的約7.2％飽和脂肪酸含量相比，這里描述的轉(zhuǎn)基因蕓苔品系含有低至約4.3％的飽和脂肪酸。在這些品系中，蕓苔中主要的飽和脂肪酸(16:0和18:0)均降低。在本文中，脂肪酸中雙鍵的位置由在符號(hào)“Δ(delta)”后從羧基端到具有雙鍵的碳的碳數(shù)表示。雙鍵總數(shù)在總碳數(shù)之后的冒號(hào)后表示。例如，亞油酸表示為18:2Δ9，12，其由下面的結(jié)構(gòu)式表示CH3(CH2)4CH＝CHCH2CH＝CH(CH2)7COOH。但是，本領(lǐng)域中也使用其它命名脂肪酸的習(xí)慣，如，雙鍵的位置可以由在符號(hào)“ω(omega)”后從脂肪酸的甲基端到具有雙鍵的碳的碳數(shù)表示。在本文中，“本發(fā)明的多肽”為具有與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留和回收信號(hào)序列可操作地連接的、來(lái)自于原核生物的Δ-9去飽和酶的重組多肽。在本文中，“本發(fā)明的核酸分子”為編碼本發(fā)明的多肽的重組核酸分子。在本文中，“野生型”植物或植物細(xì)胞為未經(jīng)改造以表達(dá)本發(fā)明的多肽的植物或植物細(xì)胞。在本文中，“Δ-9去飽和酶活性”指在飽和脂肪酸的Δ-9位置引入雙鍵的能力，如16:0、18:0、20:0或22:0飽和脂肪酸或其任意組合。術(shù)語(yǔ)“重組體”指某物已被重組，所以當(dāng)對(duì)于核酸構(gòu)建體時(shí)，該術(shù)語(yǔ)指包括通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)連接或構(gòu)建的核酸序列的分子。當(dāng)對(duì)于蛋白質(zhì)或多肽時(shí)，術(shù)語(yǔ)“重組體”指使用通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建的重組核酸構(gòu)建體表達(dá)的蛋白質(zhì)或多肽分子。當(dāng)對(duì)于遺傳組成時(shí)，術(shù)語(yǔ)“重組體”指具有親代基因組中沒(méi)有出現(xiàn)的新的等位基因組合的配子、后代、細(xì)胞或基因組。重組核酸構(gòu)建體可以包括連接到、或被處理而連接到核酸序列的核苷酸序列，該核苷酸序列在自然界不與核酸序列連接，或該核苷酸序列在自然界于不同的位置與核酸序列連接。所以，對(duì)于構(gòu)建為“重組體”的核酸，是指已經(jīng)使用基因工程，即通過(guò)人介入處理的核酸分子。重組核酸構(gòu)建體可以如通過(guò)轉(zhuǎn)化引入宿主細(xì)胞。這種重組核酸構(gòu)建體可以包括來(lái)源于相同的宿主細(xì)胞物種或不同的宿主細(xì)胞物種的序列，其已被分離并再引入到宿主物種的細(xì)胞中。作為宿主細(xì)胞的初始轉(zhuǎn)化結(jié)果，或者作為隨后的重組和/或修復(fù)事件的結(jié)果，重組核酸構(gòu)建體序列可以整合到宿主細(xì)胞基因組中。Δ-9去飽和酶本發(fā)明的實(shí)施例中使用的Δ-9去飽和酶來(lái)源于藍(lán)細(xì)菌，其為一種藻青菌(Ishizaki-Nishizawa等人，1996)且具有SEQIDNo.2中列出的氨基酸序列。這種蛋白質(zhì)在與脂質(zhì)結(jié)合的飽和脂肪酸的Δ-9位置引入順式雙鍵(或去飽和)。它對(duì)于16:0脂肪酸具有較高的特異性，但也使如18:0的較大的飽和脂肪酸去飽和。在Nishizawa等人的美國(guó)專利第6,043,411號(hào)、在NatureBiotechnology141003-1006中詳細(xì)描述了該蛋白，并以入藏登記號(hào)X77367在EMBLGeneBank中登記，所有這些參考文獻(xiàn)在這里作為參考。編碼該去飽和酶的基因這里指“來(lái)源于藍(lán)細(xì)菌的des9(SEQIDNo.1)”，但在本領(lǐng)域有時(shí)稱為DSG基因。從其它原核來(lái)源得到的Δ-9去飽和酶可以用于本發(fā)明。例如，在本發(fā)明中可能有用的Δ-9去飽和酶的合適的原核來(lái)源包括但不限于細(xì)菌，如屬于水花微囊藻屬、粗集胞屬(Synechocystis)、魚(yú)腥藻屬、隱球藻屬(Aphanocapsa)、鞭枝藻屬(Mastigocladus)、菱形藻屬(Nitzchia)、聚球藻屬(Synechococcus)和螺旋藻屬的藻青菌。高等植物含有16:0FA的量大于18:0FA。所以，具有與16:0FA底物高親和力的Δ-9去飽和酶優(yōu)選用于實(shí)施本發(fā)明。本發(fā)明多肽的Δ-9去飽和酶成分可以是天然Δ-9去飽和酶的變異體，例如缺失，包括平截和片斷；插入和添加，包括標(biāo)記多肽和融合蛋白；和替代，如定位突變體和等位變異體。例如可以通過(guò)替代、去除或添加天然Δ-9去飽和酶或其片斷中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，并篩選生物活性來(lái)制備變異體。用于實(shí)施本發(fā)明的合適的變異體可以具有如至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的與天然去飽和酶的同一性，且具有Δ-9去飽和酶活性。Δ-9去飽和酶還可以是已知Δ-9去飽和酶(如來(lái)自于藍(lán)細(xì)菌的Δ-9去飽和酶SEQIDNo.2))的同源物?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)或通過(guò)尋找存放在遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)中的同源序列而鑒定同源物。用于實(shí)施本發(fā)明的合適的同源物可以具有如至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的與天然去飽和酶(如來(lái)自于藍(lán)細(xì)菌的Δ-9去飽和酶(SEQIDNo.2))的同一性，且具有Δ-9去飽和酶活性。用于實(shí)施本發(fā)明的合適的片斷可以具有至少50個(gè)與天然Δ-9去飽和酶相同的連續(xù)氨基酸，且具有Δ-9去飽和酶活性。例如，合適的片斷可以具有至少約50、100、150、200或250個(gè)與天然Δ-9去飽和酶相同的連續(xù)氨基酸。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留和回收信號(hào)在產(chǎn)油植物中，脂質(zhì)結(jié)合脂肪酸的油合成和去飽和發(fā)生在細(xì)胞的ER中，尤其是種子中細(xì)胞的ER中。因此，通過(guò)將酶定位于ER可以提高在真核細(xì)胞中參與脂肪酸代謝的原核酶(如去飽和酶)的活性。在真核細(xì)胞中，許多跨膜蛋白被加工并轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面。通過(guò)向所述蛋白質(zhì)中加入適當(dāng)?shù)男盘?hào)序列可以在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中回收并駐留這些蛋白質(zhì)中的一些。例如，下面的氨基酸序列可以起到ER駐留和回收信號(hào)序列的作用(a)KDEL(SEQIDNo.4(參見(jiàn)，如VandenBroeck等人，(1985)Nature313，358；和Michaelis等人，(1982)Ann.Rev.Microbiol.36，425)；(b)KKXX(SEQIDNo.3)，其中，X為任一氨基酸，特別是KKSS(SEQIDNO5)(Vincent等人，(1998)J.Biol.Chem.273950-6)；(c)HDEF(SEQIDNo.6)(LehmannK.等人。(2001)PlantPhysiol.Oct；127(2)436-49)；(d)KEEL(SEQIDNo.7)和KDQL(SEQIDNo.8)(ManabuMurakami，TakayoshiOhba，F(xiàn)engXu，SeijiShida，EisakuSatoh，KyoichiOno，IchiroMiyoshi，HiroyukiWatanabe，HiroshiIto，和ToshihikoIijima“GenomicorganizationandfunctionalanalysisofmurinePKD2L1”(2004)JBCPapersinPress.2004年11月17日出版，原稿號(hào)為M411496200)。本發(fā)明的實(shí)施例證明，可以通過(guò)將原核Δ-9去飽和酶(如SEQIDNo.2)與ER駐留和回收信號(hào)序列(如KKSS(SEQIDNo.5))可操作地連接而提高植物(如蕓苔)中該酶的活性，從而使由植物制備的種子油的飽和脂肪酸水平顯著下降。盡管本發(fā)明的實(shí)施例使用KKSS(SEQIDNo.5)作為ER駐留和回收信號(hào)序列，但是其它ER駐留和回收信號(hào)序列(如KKXX，其中X為不是“S”的氨基酸)可以用于在ER中回收并駐留蛋白質(zhì)。本發(fā)明的范圍不限于任何特別的原核Δ-9去飽和酶或任何特別的信號(hào)序列，或其任何特別的組合。這就是說(shuō)，本發(fā)明可以使用其它Δ-9去飽和酶及其它ER駐留和回收信號(hào)序列。所以，用于實(shí)施本發(fā)明的適當(dāng)?shù)腅R駐留和回收信號(hào)序列的例子包括但不限于KDEL(SEQIDNo.4)、KKSS(SEQIDNo.5)、HDEF(SEQIDNo.6)、KEEL(SEQIDNo.7)和KDQL(SEQIDNo.8)。術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”是指將對(duì)于編碼序列的表達(dá)必要的調(diào)節(jié)序列及ER回收和駐留信號(hào)序列以相對(duì)于編碼序列適當(dāng)?shù)奈恢煤驼_的讀碼框置于DNA構(gòu)建體中，以實(shí)現(xiàn)基因的表達(dá)。為了有效的連接，將ER駐留和回收信號(hào)序列加到Δ-9去飽和酶的羧基端。ER駐留和回收信號(hào)序列可以在本發(fā)明多肽的最后的羧基端部分，或者其后可以接另外的氨基酸。可以通過(guò)編碼Δ-9去飽和酶的基因的基因工程加上所述的信號(hào)序列。核酸分子術(shù)語(yǔ)“DNA構(gòu)建體”這里指用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的DNA基因序列。術(shù)語(yǔ)“表達(dá)盒(expressioncassette)”這里指包括已在其5′和3′端連接有啟動(dòng)子和終止子調(diào)節(jié)序列的編碼區(qū)以實(shí)現(xiàn)基因和基因產(chǎn)物在轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞中適當(dāng)表達(dá)的DNA序列。在本發(fā)明的實(shí)施例中，申請(qǐng)人構(gòu)建了一種DNA構(gòu)建體，其包含兩個(gè)表達(dá)盒第一組件包括與編碼信號(hào)KKSS(SEQIDNo.5)的核苷酸序列可操作地連接的藍(lán)細(xì)菌的des9基因(SEQIDNo.1)，來(lái)自于蕓苔的種子特異性napin啟動(dòng)子，和來(lái)自于豌豆的rbcs3′轉(zhuǎn)錄終止子；和第二表達(dá)盒包括表達(dá)有助于鑒定和篩選轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞和植物的基因產(chǎn)物的啟動(dòng)子、編碼區(qū)和終止子。第二表達(dá)盒為可選擇的，因?yàn)槠渌椒梢杂糜阼b定和選擇轉(zhuǎn)化體?？梢圆捎萌魏芜m當(dāng)?shù)暮Y選方法進(jìn)行篩選，例如抗生素篩選(如卡那霉素、慶大霉素、潮霉素)；在植物中不存在的特異性糖的代謝標(biāo)記基因(如Syngenta公司的PositechTM篩選系統(tǒng)；和磷酸甘露糖異構(gòu)酶)；除草標(biāo)記基因(如拜耳公司的pat和bar，和Monsanto公司的EPSPS)；可見(jiàn)篩選標(biāo)記，如綠色熒光蛋白等。在本發(fā)明的情況中，使用卡那霉素抗性進(jìn)行篩選。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，申請(qǐng)人使用強(qiáng)效的種子特異性貯藏蛋白napin啟動(dòng)子。但是其它種子特異性啟動(dòng)子可以用于本發(fā)明中，包括但不限于十字花科蛋白(cruciferin)啟動(dòng)子、羥化酶啟動(dòng)子、豆球蛋白啟動(dòng)子(ShasanyAK等人，(2000)IndianJExpBiol.Apr；38(4)363-72)、菜豆球蛋白啟動(dòng)子和玉米醇溶蛋白啟動(dòng)子?？赡苁褂貌皇欠N子特異性的啟動(dòng)子，但是這種啟動(dòng)子在降低植物種子油產(chǎn)品的飽和FA含量方面不那么有效。在本發(fā)明的實(shí)施例中，編碼區(qū)也在3′端與作為調(diào)節(jié)序列的rbcs3′轉(zhuǎn)錄終止子可操作地連接。其它也可用于本發(fā)明中的有用的3′調(diào)節(jié)序列包括但不限于胭脂堿合成酶聚腺苷酸化區(qū)(NOS)和章魚(yú)堿聚腺苷酸化區(qū)(OCS)。所述的DNA構(gòu)建體可以方便地于適合在細(xì)菌宿主中繁殖的第一載體中構(gòu)建，然后被切斷并連接到用于引入到植物宿主中的第二載體。用于引入到植物宿主中的適當(dāng)載體的例子包括pCAMBIA(國(guó)際農(nóng)業(yè)分子生物學(xué)應(yīng)用中心(CAMBIA))載體系列、pBI載體系列(BD生物科學(xué)公司的Clontech部)和基于pKYLX71的載體(Scharld等人，(1987))。載體的選擇部分取決于預(yù)期的轉(zhuǎn)化機(jī)理，即農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化或直接的基因轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因植物和植物細(xì)胞可以使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的任何DNA導(dǎo)入(參見(jiàn)，例如“Plantgenetictransformationandgeneexpression；alaboratorymanual(植物遺傳轉(zhuǎn)化和基因表達(dá)，實(shí)驗(yàn)手冊(cè))”DraperJ等人，Eds.BlackwellScientificPublications，1988)產(chǎn)生包括本發(fā)明的核酸的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物。這些DNA導(dǎo)入包括但不限于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、基因槍(biolistic)DNA導(dǎo)入、原生質(zhì)體電穿孔、直接DNA攝取、PEG處理原生質(zhì)體、UV激光微光束、雙生病毒(Geminivirus)載體、脂質(zhì)體介導(dǎo)的DNA攝取、磷酸鈣處理原生質(zhì)體、和以包覆有轉(zhuǎn)化DNA的微珠攪動(dòng)細(xì)胞懸浮液。在這些DNA導(dǎo)入當(dāng)中，由于農(nóng)桿菌的使用能保證穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化，所以其優(yōu)選用于如蕓苔的雙子葉植物。使用農(nóng)桿菌的方法包括使用野生型腫瘤質(zhì)粒的中間載體法(nature，287(1980)p.654；Cell，32(1983)p.1033；EMBOJ.，3(1984)P.1525)，使用缺乏T-DNA腫瘤形成基因區(qū)的載體的中間載體法(EMBOJ.，2(1983)p.2143；Bio/Technology，3(1985)p.629)，二元載體法(Bio/Technology，1(1983)p.262；Nature，303(1983)p.179；Nucl.AcidsRes.，12(1984)p.8711)等?？梢允褂眠@些方法中的任一方法。用農(nóng)桿菌感染植物的方法包括對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞直接接種、原生質(zhì)體共培養(yǎng)和葉盤(leaf-disk)法。葉盤法在許多情況中便于用在直接且容易地制備大量轉(zhuǎn)化植物。可以通過(guò)在如Murashige-Skooge培養(yǎng)基的已知培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞而再生植株，所述的培養(yǎng)基可以添加篩選抗生素和/或植物生長(zhǎng)激素。將生根幼苗移植到土壤中并培養(yǎng)，以長(zhǎng)成再生植株。在下述實(shí)施例中，使用農(nóng)桿菌T-DNA介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化將上述DNA構(gòu)建體引入到蕓苔植株的基因組中。簡(jiǎn)要地說(shuō)，使用農(nóng)桿菌二元載體系統(tǒng)，植物細(xì)胞核的轉(zhuǎn)化通過(guò)以下步驟完成a)將來(lái)自于藍(lán)細(xì)菌的des9基因(SEQIDNo.1)及回收和駐留信號(hào)KKSS(SEQIDNo.5)插入到載體中，b)將載體引入到農(nóng)桿菌中，c)共培養(yǎng)從幼苗切下的絨毛葉與重組農(nóng)桿菌的懸浮液，隨后在非選擇性培養(yǎng)基中接種，d)將植物組織轉(zhuǎn)移到選擇性培養(yǎng)基中以鑒定轉(zhuǎn)化組織，e)鑒定轉(zhuǎn)化組織和f)從轉(zhuǎn)化組織再生植株。轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平可以根據(jù)其插入到核基因組的位置和數(shù)目而變化。所以，應(yīng)再生幾個(gè)轉(zhuǎn)化體，并應(yīng)檢驗(yàn)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)和改變的脂肪酸構(gòu)成?？梢杂帽绢I(lǐng)域中任何適當(dāng)?shù)募夹g(shù)分析脂肪酸構(gòu)成，例如(a)氣相色譜(GC)脂肪酸甲基酯(FAME)、丁基/丁醇酯、2-丙醇(propan-2-ol)酯(參見(jiàn)，例如，國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織方法參考號(hào)ISO55081990(E)，“Animalandvegetablefatsandoils-Analysisbygaschromatographyofmethylestersoffattyacids(動(dòng)物和植物脂肪和油-用脂肪酸甲基酯的氣相色譜分析”)；(b)高效液相色譜(HPLC)吸附色譜、手性色譜、銀離子色譜、反相色譜；(c)質(zhì)譜(MS)皮考啉基酯、二甲基唑啉(DMOX)、吡咯烷、二甲基二硫化物衍生物(DMSO)；(d)紅外光譜(IR)；和(e)傅立葉變換紅外光譜(FTIR)。一般而言，只有那些證明其種子油的飽和脂肪酸含量顯著下降的轉(zhuǎn)基因植物(即其中，與同種野生型植株相比，種子油的飽和脂肪酸含量降低了約10％、約15％、約20％、約30％、約40％、約50％或更多)是所希望的，且將被篩選用于進(jìn)一步培養(yǎng)。本發(fā)明的實(shí)施例證明，用與ER回收和駐留信號(hào)可操作地連接的藻青菌Δ-9去飽和酶轉(zhuǎn)化蕓苔(歐洲油菜(Brassicanapus))，導(dǎo)致了種子油的總飽和脂肪酸含量下降。然而，油合成的生物化學(xué)(如脂肪酸的去飽和)和這些代謝反應(yīng)的亞細(xì)胞定位與其它油種子農(nóng)作物相似。所以，本發(fā)明的分子技術(shù)可以應(yīng)用于其它雙子葉和單子葉油種子植物，包括但不限于大豆、玉米、花生、向日葵、橄欖、棕櫚、椰子、紅花、棉籽、芥菜、芝麻、大麻、蓖麻、鱷梨和亞麻。本發(fā)明還提供前述轉(zhuǎn)基因植物的細(xì)胞和組織(特別是種子)。前述轉(zhuǎn)基因植物和其后代可以用于通過(guò)雜交和篩選將感興趣的基因轉(zhuǎn)移到其它基因型、栽培種、變種等。所以，本發(fā)明提出的分子技術(shù)可以用于產(chǎn)生大量攜帶本發(fā)明的重組核酸的雜種植物，以制備具有降低的飽和脂肪酸水平的種子油。與明確且單獨(dú)地指明各個(gè)公開(kāi)或?qū)＠暾?qǐng)作為參考引用一樣，本說(shuō)明書(shū)中在這里引用的公開(kāi)和專利申請(qǐng)用于參考。引用任何公開(kāi)是由于其公開(kāi)日早于申請(qǐng)日，不應(yīng)理解為由于現(xiàn)有的發(fā)明，本發(fā)明沒(méi)有資格早于這種公開(kāi)。通過(guò)以下實(shí)施例現(xiàn)在將更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明，這些實(shí)施例決不是要限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例實(shí)施例1沒(méi)有ER信號(hào)的基因構(gòu)建使用在起始和終止密碼子緊鄰的外側(cè)的兩個(gè)引物中引入XhoI位點(diǎn)的下列引物，從藍(lán)細(xì)菌(聚球藻屬，ATCC#33912)擴(kuò)增des9基因(SEQIDNo.1；837bp)的開(kāi)放讀碼框DSG-XhoI-5′CCCCCCTCGAGATGACCCTTGCTATCCGACCCAAG(SEQIDNo.9)和DSG-XhoI-3′CCCCCCTCGAGTTAGTTGTTTGGAGACGCCACTTTG(SEQIDNo.10)。凝膠純化PCR產(chǎn)物，用XhoI消化并連接到大腸桿菌載體pBluescript(BS/KS)，然后測(cè)序以確定其同一性。然后通過(guò)XhoI從BS/KS切除des9基因(SEQIDNo.1)并連接到植物載體pKYLX-Napin中。該載體是通過(guò)用來(lái)自于蕓苔的種子特異性Napin啟動(dòng)子代替載體pKYLX71(Scharld等人，1987)的雙35S啟動(dòng)子而構(gòu)建的。通過(guò)限制性酶切消化分析幾個(gè)重組載體以鑒定對(duì)于啟動(dòng)子和終止子具有正確的des9基因插入方向的克隆。重組載體(pC7)被測(cè)序以確定適當(dāng)?shù)倪B接，且在植物載體中引入的des9基因插入沒(méi)有重排。實(shí)施例2用ER信號(hào)構(gòu)建基因使用在起始和終止密碼子緊鄰的外側(cè)的兩個(gè)引物中引入XhoI位點(diǎn)的下列引物，從藍(lán)細(xì)菌(聚球藻屬，ATCC#33912)擴(kuò)增des9基因(SEQIDNo.1)的ORF(837bp)DSG-XhoI-5′CCCCCCTCGAGATGACCCTTGCTATCCGACCCAAG(SEQIDNo.9)和des9-3′-ERCCCCCCCTCGAGTTAAGAAGACTTTTTGTTGTTTGGAGACGCCAC(SEQIDNo.11)在des9-3′-ER引物中，des9基因的終止密碼子被轉(zhuǎn)化成氨基酸K，并且其后再加上三個(gè)氨基酸(KSS)，之后是一個(gè)新的終止密碼子和XhoI位點(diǎn)。凝膠純化PCR產(chǎn)物(由于增加4個(gè)氨基酸，現(xiàn)為849bp)，用XhoI消化，連接到BS/KS并測(cè)序以確定其同一性。然后通過(guò)XhoI從BS/KS切除des9基因并連接到植物載體pKYLX-Napin中。分析幾個(gè)重組載體以鑒定對(duì)于啟動(dòng)子和終止子具有正確的des9基因插入方向的克隆。重組載體(pC8)被測(cè)序以確定適當(dāng)?shù)倪B接，且在植物載體中引入的des9基因插入沒(méi)有重排。實(shí)施例3載體引入到農(nóng)桿菌中然后通過(guò)三親交配將兩個(gè)構(gòu)建體(pC7和pC8)均從大腸桿菌DH5α轉(zhuǎn)移到根瘤農(nóng)桿菌GV3101中。使用大腸桿菌HB101中的pRK2013作為輔助質(zhì)粒(Ditta等人，1980)。在50mg/L的利福平、20mg/L的慶大霉素和15mg/L的四環(huán)素平板上幾輪篩選轉(zhuǎn)接合子。為了確定沒(méi)有重排發(fā)生，從轉(zhuǎn)接合子提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切核酸酶消化，并與從大腸桿菌DH5α純化的質(zhì)粒對(duì)比。實(shí)施例4蕓苔轉(zhuǎn)化使用由Moloney等人(1989)開(kāi)發(fā)的實(shí)驗(yàn)方案用pC7和pC8基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化蕓苔品種“Wester”。簡(jiǎn)而言之，盡可能接近頂端分生組織但不包括它，用快刀從五天齡幼苗切下包括葉柄的充分展開(kāi)的絨毛葉。將葉柄的剪切端短暫地浸入到1ml含有des9基因構(gòu)建體的根瘤土壤桿菌的液體培養(yǎng)物(OD約0.5)中。然后將葉柄埋入培養(yǎng)皿中的MMO-BA共培養(yǎng)培養(yǎng)基[具有芐基腺嘌呤(BA)的Murashige最小有機(jī)物(MMO，Invitrogen公司，伯靈頓，加拿大)]中，以使外植體垂直豎立。平板用橡皮膏密封，并在25℃、16h亮/8h暗、70～80mE下置于生長(zhǎng)室中2～3天。通過(guò)將外植體轉(zhuǎn)移到含有300mg/L特美汀(Timentin)(GlaxoSmithKline，密西沙加，加拿大)的MMO-BA培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織。實(shí)施例5完整植株的篩選和再生通過(guò)將外植體轉(zhuǎn)移到含有300mg/L特美汀和20mg/L卡那霉素的MMO-BA培養(yǎng)基的平板中而誘導(dǎo)從愈傷組織形成芽。將芽從外植體上切下并放入含有具有抗生素(但沒(méi)有BA)的MMO培養(yǎng)基的品紅容器中。當(dāng)芽以正常的形態(tài)和頂端優(yōu)勢(shì)長(zhǎng)出時(shí)，將其轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基[含有抗生素和萘乙酸(NAA)的MurashigeandSkoog(MS)培養(yǎng)基]中。一旦形成良好的根系，則將植物從容器中移出，用流水清洗掉大部分瓊脂，并轉(zhuǎn)移到潮濕的盆栽土中，用罐遮蓋以避免干燥。然后將它們放入濕度箱中，并緩慢移開(kāi)遮蓋物以使更多空氣進(jìn)入，使植物強(qiáng)壯。實(shí)施例6轉(zhuǎn)化體的鑒定使用des9基因特異性引物通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)鑒定作為轉(zhuǎn)基因植物的再生植株。將從再生轉(zhuǎn)化植株得到的T1種子胚切成較小的塊并置于含有卡那霉素的篩選平板中。從轉(zhuǎn)基因植物得到的胚或都為綠色，或?yàn)榫G色和灰白色的結(jié)合(比例取決于整合的轉(zhuǎn)基因的數(shù)量)，而從非轉(zhuǎn)基因植物得到的種子都為灰白色。這是由于二元載體被構(gòu)建為攜帶與des9基因串連的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NptII)基因。通過(guò)DNA(Southern)印跡分析確定des9基因整合到蕓苔基因組中。根據(jù)Dellaporta等人(1983)分離從幼葉得到的基因組DNA。用只在二元載體的表達(dá)盒一端剪切的限制性內(nèi)切酶消化10μg基因組DNA。然后被消化的DNA在1％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，按照廠商的指導(dǎo)轉(zhuǎn)移至尼龍膜(Amersham加拿大有限公司，渥克維爾，多倫多)，并用通過(guò)隨機(jī)引物標(biāo)記而標(biāo)記有[α-32P]-dCTP的des9基因(生命技術(shù)公司(LifeTechnologies)，格蘭德艾蘭，紐約)探測(cè)。按照Sambrook等人(1989)，在65℃下進(jìn)行雜交和清洗印記。des9基因在轉(zhuǎn)基因蕓苔植物中的表達(dá)通過(guò)RT-PCR和RNA(Northern)印跡由RNA分析而確定。按照Verwoerd等人(1989)中描述的方法從幼葉提取總RNA。該RNA在含有甲醛的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，在尼龍膜上印跡并與des9基因探針雜交。雜交和清洗條件與DNA雜交的條件相同。實(shí)施例7種子的脂肪酸分析按照國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織方法參考號(hào)ISO55081990(E)，“Animalandvegetablefatsandoils-Analysisbygaschromatographyofmethylestersoffattyacids(動(dòng)物和植物脂肪和油-通過(guò)氣相色譜分析脂肪酸的甲基酯)”確定從成熟種子得到的總?；|(zhì)的脂肪酸組成。在5mL聚丙烯瓶中的1mL石油醚中用鋼棒碾碎50～100mg種子。粗粉沉降后，將0.5mL上清液轉(zhuǎn)移到含有1.2mL甲基化溶液(2％甲氧基鈉的甲醇溶液)的玻璃管中。徹底混合后，溶液在室溫下孵化30分鐘。向上述溶液中加入1mL雙蒸水，充分混合并在室溫下放置10分鐘以使相分離。分離后，從上層取200μL，在GC自動(dòng)取樣瓶中用另外300μL石油醚稀釋，并取1μL注入到GC柱中。以氦為載氣于28.0mL/分鐘的流速下，在裝有30m×0.25mm(i.d.)柱(HP-INNOWAX，交聯(lián)聚乙二醇)的火焰離子化氣相色譜儀(型號(hào)6890，HewlettPackard，密西沙加，多倫多)上進(jìn)行FAME的分離。箱溫度為以5℃/分鐘的速度從180℃升至230℃，并在230℃保持13分鐘。通過(guò)與FAME標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間比較來(lái)確定峰，且FAME的相對(duì)比例測(cè)定為總峰面積的百分比。表1攜帶與編碼KKSS(SEQIDNo.5)ER回收和駐留信號(hào)連接的來(lái)源于藍(lán)細(xì)菌的des9基因(SEQIDNo.1)的轉(zhuǎn)基因蕓苔植物(C8-19.1)、只攜帶des9基因的轉(zhuǎn)基因植物(C7-15)和非轉(zhuǎn)化植物(WT)的種子的脂肪酸含量(mol％)。參考文獻(xiàn)“Plantgenetictransformationandgeneexpression；alaboratorymanual”，DraperJ.etal.Eds.BlackwellScientificPublications，1988.Nature，284(1980)p.654.Cell，32(1983)p.1033.EMBOJ.，3(1984)P.1525.EMBOJ.2(1983)p.2143；Bio/Technology，3(1985)p.629.Bio/Technology，1(1983)p.262.Nature，303(1983)p.179.Nucl.AcidsRes.，12(1984)p.8711.DellaportaSL，WoodJ，HicksJB(1983)AplantDNAmini-preparationversionII.PlantMolBiolRep119-21.DittaM.J.，S.Stanfield，D.CorbinandD.R.Helsinki，1980.BroadhostrangeDNAcloningsystemforGramnegativeconstructionofagenebankofRhizobiummeliloti.ProcNatlAcadSciUSA27，7347-7351.HahnJJ，EschenlauerAC，NarrolMH，SomersDA，SriencF(1997)Growthkinetics，nutrientuptake，andexpressionoftheAlcaligeneseutrophuspoly(β-hydroxybutyrate)synthesispathwayintransgenicmaizecellsuspensioncultures.BiotechProg13347-354.Horsch，R.B.，F(xiàn)ry，N.Hofmann，J.Neidermeyer，S.G.RogersandR.T.Fraley，1988.Leafdisctransformation.PlantMolecularBiologyManual，A5/1-A5/9.KluwerAcademicPublishers，Dordrecht/Boston/London.LehmannK.etal.(2001)PlantPhysiol.Oct；127(2)436-49.ManabuMurakami，TakayoshiOhba，F(xiàn)engXu，SeijiShida，EisakuSatoh，KyoichiOno，IchiroMiyoshi，HiroyukiWatanabe，HiroshiIto，andToshihikoIijima“GenomicOrganizationandfunctionalanalysisofmurinePKD2L1”(2004)JBCPapersinPress.PublishedNovember17，2004asManuscriptnumberM411496200.Michaelisetal.(1982)Ann.Rev.Microbiol.36，425.MoloneyM，WalkerJMandSharmaKK1989HighefficiencytransformationofBrassicanapususingAgrobacteriumvectors，PlantCellRep.8，238-242.NishizawaO，ToguriT(1996)Geneforfattyaciddesaturase，vectorcontainingsaidgene，planttransformedwithsaidgene，andprocessforcreatingsaidplant.U.S.patentnumber6,043,411.NishizawaO，F(xiàn)ujiiT，AzumaM，SekiguchiK，MurataN，OhtaniT，ToguriT(1996)Low-temperatureresistanceofhigherplantsissignificantlyenhancedbyanonspecificcyanobacterialdesaturase.NatureBiotechnology141003-1006.Sambrook，J.，E.F.Fritsch，andT.Maniatis，1989.MolecularCloningALaboratoryManual.ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.SchardlC.L.，A.D.Byrd，G.Benzion，M.A.Altschuler，D.F.HildebrandandA.G.Hunt，1987.Designandconstructionofaversatilesystemfortheexpressionofforeigngenesinplants.Gene61，1-11.ShahS，WeselakeR(2003)FarmingFortheFuture，AARIproject#19990032，F(xiàn)inalReport，pp.1-82.ShasanyAKetal.(2000)IndianJExpBiol.Apr；38(4)363-72VandenBroecketal.(1985)Nature313，358.VerwoerdTC，DekkerBMMandHoekemaA(1989)Asmall-scaleprocedurefortherapidisolationofplantRNAs.NucleicAcidResearch，172362.VincentMJ，MartinAS，CompansRW(1998)FunctionoftheKKXX(SEQIDNO3)motifinendoplasmicreticulumretrievalofatransmembraneproteindependsonthelengthandstructureofthecytoplasmicdomain.JBiolChem.273950-6.U.S.patentNo.5,552,306.U.S.patentNo.5,614,393.U.S.patentNo.5,663,068.U.S.patentNo.5,789,050.U.S.patentNo.6,355,861.U.S.patentNo.6,683,232.USpatentapplicationpublicationNo.20040078845.序列表<110>阿爾伯達(dá)研究理事會(huì)股份公司(AlbertaResearchCouncilInc.)<120>具有降低的飽和脂肪酸水平的轉(zhuǎn)基因植物及其制備方法<130>IP06-0944-XC34<140>PCT/CA2004/002156<141>2004-12-17<150>CA2,450,000<151>2003-12-18<160>11<170>PatentInversion3.3<210>1<211>837<212>DNA<213>藍(lán)細(xì)菌(Anacystisnidulans)<400>1atgacccttgctatccgacccaagcttgccttcaactggccgaccgccctgttcatggtc60gccattcacattggagcactgttagcgttcctgccggccaactttaactggcccgctgtg120ggcgtgatggttgcgctgtattacattaccggttgttttggcatcaccctaggctggcac180cggctaatttcgcaccgtagctttgaagttcccaaatggctggaatacgtgctggtgttc240tgtggcaccttggccatgcagcacggcccgatcgaatggatcggtctgcaccgccaccat300cacctccactctgaccaagatgtcgatcaccacgactccaacaagggtttcctctggagt360cacttcctgtggatgatctacgaaattccggcccgtacggaagtagacaagttcacgcgc420gatatcgctggcgaccctgtctatcgcttctttaacaaatatttcttcggtgtccaagtc480ctactgggggtacttttgtacgcctggggcgaggcttgggttggcaatggctggtctttc540gtcgtttgggggatcttcgcccgcttggtggtggtctaccacgtcacttggctggtgaac600agtgctacccacaagtttggctaccgctcccatgagtctggcgaccagtccaccaactgc660tggtgggttgcccttctggcctttggtgaaggctggcacaacaaccaccacgcctaccag720tactcggcacgtcatggcctgcagtggtgggaatttgacttgacttggttgatcatctgc780ggcctgaagaaggtgggtctggctcgcaagatcaaagtggcgtctccaaacaactaa837<210>2<211>278<212>PRT<213>藍(lán)細(xì)菌(Anacystisnidulans)<400>2MetThrLeuAlaIleArgProLysLeuAlaPheAsnTrpProThrAla151015LeuPheMetValAlaIleHisIleGlyAlaLeuLeuAlaPheLeuPro202530AlaAsnPheAsnTrpProAlaValGlyValMetValAlaLeuTyrTyr354045IleThrGlyCysPheGlyIleThrLeuGlyTrpHisArgLeuIleSer505560HisArgSerPheGluValProLysTrpLeuGluTyrValLeuValPhe65707580CysGlyThrLeuAlaMetGlnHisGlyProIleGluTrpIleGlyLeu859095HisArgHisHisHisLeuHisSerAspGlnAspValAspHisHisAsp100105110SerAsnLysGlyPheLeuTrpSerHisPheLeuTrpMetIleTyrGlu115120125IleProAlaArgThrGluValAspLysPheThrArgAspIleAlaGly130135140AspProValTyrArgPhePheAsnLysTyrPhePheGlyValGlnVal145150155160LeuLeuGlyValLeuLeuTyrAlaTrpGlyGluAlaTrpValGlyAsn165170175GlyTrpSerPheValValTrpGlyIlePheAlaArgLeuValValVal180185190TyrHisValThrTrpLeuValAsnSerAlaThrHisLysPheGlyTyr195200205ArgSerHisGluSerGlyAspGlnSerThrAsnCysTrpTrpValAla210215220LeuLeuAlaPheGlyGluGlyTrpHisAsnAsnHisHisAlaTyrGln225230235240TyrSerAlaArgHisGlyLeuGlnTrpTrpGluPheAspLeuThrTrp245250255LeuIleIleCysGlyLeuLysLysValGlyLeuAlaArgLysIleLys260265270ValAlaSerProAsnAsn275<210>3<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留和回收信號(hào)序列<220><221>SITE<222>(3)..(3)<223>Xaa為任一氨基酸<220><221>SITE<222>(4)..(4)<223>Xaa為任一氨基酸<400>3LysLysXaaXaa1<210>4<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留和回收信號(hào)序列<400>4LysAspGluLeu1<210>5<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留和回收信號(hào)序列<400>5LysLysSerSer1<210>6<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留和回收信號(hào)序列<400>6HisAspGluPhe1<210>7<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留和回收信號(hào)序列<400>7LysGluGluLeu1<210>8<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留和回收信號(hào)序列<400>8LysAspGlnLeu1<210>9<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>9cccccctcgagatgacccttgctatccgacccaag35<210>10<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>primer<400>10cccccctcgagttagttgtttggagacgccactttg36<210>11<211>45<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>11ccccccctcgagttaagaagactttttgttgtttggagacgccac4權(quán)利要求1.一種重組多肽，包括與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留和回收信號(hào)序列可操作地連接的來(lái)源于原核生物的Δ-9去飽和酶。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組多肽，其中所述的原核生物為細(xì)菌。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組多肽，其中所述的原核生物為屬于選自包括水花微囊藻屬、粗集胞屬和魚(yú)腥藻屬的組的屬的藻青菌藍(lán)綠藻。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組多肽，其中所述的藻青菌為藍(lán)細(xì)菌(Anacystisnidulans)。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組多肽，其中所述的Δ-9去飽和酶包括(a)具有SEQIDNo.2中列出的氨基酸序列的多肽；(b)與(a)中所限定的多肽具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的同一性，且具有Δ-9去飽和酶活性的(a)所限定的多肽的變異體或同源物；和(c)與(a)中限定的多肽具有至少約50個(gè)相同的連續(xù)氨基酸，且具有Δ-9去飽和酶活性的(a)所限定的多肽的片斷。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組多肽，其中所述的Δ-9去飽和酶具有SEQIDNo.2中列出的氨基酸序列。7.根據(jù)權(quán)利要求1～6的任一項(xiàng)所述的重組多肽，其中所述的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜駐留和回收信號(hào)具有選自包括以下氨基酸序列的組的氨基酸序列(a)KDEL，SEQIDNo.4；(b)KKXX，SEQIDNo.3，其中X為任一氨基酸；(c)HDEF，SEQIDNo.6；(d)KEEL，SEQIDNo.7；和(e)KDQL，SEQIDNo.8。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組多肽，其中所述的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜駐留和回收信號(hào)具有氨基酸序列KKSS，SEQIDNo.5。9.一種編碼權(quán)利要求1～8的任一項(xiàng)中所限定的重組多肽的核酸分子。10.一種包括與啟動(dòng)子可操作地連接的權(quán)利要求9的核酸分子的載體。11.一種用權(quán)利要求10的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的宿主細(xì)胞，來(lái)源于油種子植物。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的宿主細(xì)胞，其中所述的油種子植物選自包括蕓苔、大豆、玉米、花生、向日葵、橄欖、棕櫚、椰子、紅花、棉籽、芥菜、芝麻、大麻、蓖麻、鱷梨和亞麻的組。14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的宿主細(xì)胞，其中所述的油種子植物為蕓苔。15.一種轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，包括包含與導(dǎo)致重組多肽在所述的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子可操作地連接的權(quán)利要求9的核酸分子的轉(zhuǎn)基因元件。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，來(lái)源于油種子植物。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中所述的油種子植物選自包括蕓苔、大豆、玉米、花生、向日葵、橄欖、棕櫚、椰子、紅花、棉籽、芥菜、芝麻、大麻、蓖麻、鱷梨和亞麻的組。18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中所述的油種子植物為蕓苔。19.一種生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括(a)用權(quán)利要求9的核酸或包括這種核酸的載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中，所述的核酸與導(dǎo)致重組多肽在所述的植物細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子可操作地連接；和(b)由步驟(a)中產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞再生植株。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述的植物細(xì)胞來(lái)源于油種子植物。21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述的油種子植物選自包括蕓苔、大豆、玉米、花生、向日葵、橄欖、棕櫚、椰子、紅花、棉籽、芥菜、芝麻、大麻、蓖麻、鱷梨和亞麻的組。22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述的油種子植物為蕓苔。23.一種轉(zhuǎn)基因植物，包括含有與導(dǎo)致重組多肽在所述的轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的啟動(dòng)子可操作地連接的權(quán)利要求9的核酸分子的轉(zhuǎn)基因元件。24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的轉(zhuǎn)基因植物為油種子植物。25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述的油種子植物選自包括蕓苔、大豆、玉米、花生、向日葵、橄欖、棕櫚、椰子、紅花、棉籽、芥菜、芝麻、大麻、蓖麻、鱷梨和亞麻的組。26.根據(jù)權(quán)利要求24所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述的油種子植物為蕓苔。27.根據(jù)權(quán)利要求23～26的任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因植物，其與相同品種的野生型植株相比，產(chǎn)生了具有降低的飽和脂肪酸含量的油。28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述的種子油的飽和脂肪酸含量與所述的野生型植株相比，降低了約10％、約15％、約20％、約30％、約40％、約50％或更多。29.權(quán)利要求23～28的任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因植物在生產(chǎn)與相同品種的野生型植株相比具有降低的飽和脂肪酸含量的種子油中的應(yīng)用。30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的應(yīng)用，其中所述種子油的飽和脂肪酸含量與所述的野生型植株相比，降低了約10％、約15％、約20％、約30％、約40％、約50％或更多。31.根據(jù)權(quán)利要求29所述的應(yīng)用，其中所述的轉(zhuǎn)基因植物為蕓苔。32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的應(yīng)用，其中所述的種子油具有低于約7mol％的飽和脂肪酸含量。33.根據(jù)權(quán)利要求31所述的應(yīng)用，其中所述的種子油具有約4.0％～約4.5％的飽和脂肪酸含量。全文摘要本發(fā)明提供在種子油中具有降低的飽和脂肪酸水平的轉(zhuǎn)基因植物及其生產(chǎn)方法。通過(guò)這種方法培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因植物由于與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留和回收信號(hào)序列可操作地連接的原核Δ－9去飽和酶(即一種在飽和脂肪酸的Δ－9位置引入順式雙鍵的酶)的表達(dá)，在種子油中含有低水平的飽和脂肪酸。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例為表達(dá)與KKSS(SEQIDNo.5)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留和回收信號(hào)序列可操作地連接的來(lái)源于藻青菌屬藍(lán)細(xì)菌的異種Δ－9去飽和酶的植物，所述的Δ－9去飽和酶將脂質(zhì)結(jié)合16:0和18:0脂肪酸轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的16:1和18:1。文檔編號(hào)C12P7/64GK1930293SQ200480041766公開(kāi)日2007年3月14日申請(qǐng)日期2004年12月17日優(yōu)先權(quán)日2003年12月18日發(fā)明者薩利赫烏扎曼·山,蘭德?tīng)枴ろf塞爾卡申請(qǐng)人:阿爾伯達(dá)研究理事會(huì)股份公司