專利名稱：包含與Ⅱ型糖尿病有關(guān)的單核苷酸多態(tài)性的多核苷酸、包含該多核苷酸的微陣列和診斷 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與II型糖尿病有關(guān)的多核苷酸，包含該多核苷酸的微陣列和診斷試劑盒，和分析與II型糖尿病有關(guān)的多核苷酸的方法。
背景技術(shù)：
所有生物體的基因組在它們持續(xù)進(jìn)化的過(guò)程中經(jīng)受自發(fā)突變，產(chǎn)生先祖核酸序列(progenitor nucleic acid sequences)的變體形式(Gusella，Ann.Rev.Biochem.55，831-854(1986))。所述變體形式可賦予相對(duì)于先祖形式的進(jìn)化優(yōu)點(diǎn)或缺點(diǎn)，或可為中性形式(neutral)。在一些情況中，變體形式賦予致死的缺點(diǎn)，并且不遺傳到該生物體的后代。在另外的情況中，變體形式將進(jìn)化優(yōu)點(diǎn)賦予物種，并最終整合入該物種大多數(shù)成員的DNA中且有效地變?yōu)樽嫦刃问健Ｔ谠S多情況中，祖先及變體形式都幸存并在物種的種群中共存。序列的多種形式的共存引起多態(tài)性。
已知幾種不同類型的多態(tài)性(polymorphisms)，包括限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLPs)、短串聯(lián)重復(fù)(STRs)、可變數(shù)串聯(lián)重復(fù)(VNTRs)和單核苷酸多態(tài)性(SNPs)。其中，SNPs具有相同物種的個(gè)體之間單核苷酸變異的形式。當(dāng)SNPs在蛋白編碼序列中發(fā)生時(shí)，任一種多態(tài)性形式可引起缺陷或變體蛋白的表達(dá)。在另一方面，當(dāng)SNPs在非-編碼序列中發(fā)生時(shí)，這些多態(tài)性中的一些可導(dǎo)致缺陷或變體蛋白的表達(dá)(例如，作為缺陷剪接(defective splicing)的結(jié)果)。其他的SNPs可以完全不具有表型效應(yīng)(phenotypic effect)。
已知人SNPs以大約1,000bp中1個(gè)的頻率發(fā)生。當(dāng)這樣的SNPs誘導(dǎo)表型的表達(dá)，如疾病時(shí)，含有該SNPs的多核苷酸可用作診斷疾病的引物或探針。特異性地與該SNP結(jié)合的單克隆抗體也可用于診斷疾病。目前，SNPs的核苷酸序列和功能的研究正由許多研究所進(jìn)行。鑒定出的人SNPs的核苷酸序列和其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)制成數(shù)據(jù)庫(kù)以使其便于獲得。
雖然迄今可利用的發(fā)現(xiàn)顯示，具體的SNPs存在于人基因組或cDNAs上，但還沒(méi)有揭示出所述SNPs的表型效應(yīng)。除去少量的SNPs之外，大多數(shù)SNPs的功能也還沒(méi)有公開。
已知糖尿病患者總數(shù)的90-95％罹患II型糖尿病。II型糖尿病是這樣的病癥，其在異常產(chǎn)生胰島素或?qū)τ谝葝u素具有低敏感性的患者中發(fā)生，由此導(dǎo)致血糖水平的巨大變化。當(dāng)胰島素分泌的紊亂導(dǎo)致II型糖尿病的條件時(shí)，不能將血糖轉(zhuǎn)移到體細(xì)胞，這使得食物向能量的轉(zhuǎn)化變得困難。已知遺傳原因在II型糖尿病中起作用。II型糖尿病的其它危險(xiǎn)因子是年齡超過(guò)45、糖尿病肥胖癥(obesity)、高血壓(hypertension)和高膽固醇水平(high cholesterol level)的家族史(familial history)。目前，主要通過(guò)使用空腹血糖(fasting blood glucose)(FSB)測(cè)試、口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)等測(cè)定病理的表型改變，即，血糖水平來(lái)進(jìn)行糖尿病的診斷[National Institute of Diabetes和Digestive和KidneyDiseases of the National Institutes of Health，http://www.niddk.nih.gov，2003]。當(dāng)作出II型糖尿病的診斷時(shí)，通過(guò)鍛煉、特殊飲食、體重控制、藥物治療等可預(yù)防II型糖尿病或可延遲其發(fā)病。在這點(diǎn)上，可以說(shuō)II型糖尿病是一種非常需要早期診斷的疾病。Millenium Pharmaceuticals Inc.報(bào)道可根據(jù)HNF1基因上存在的基因型變異(genotypic variations)來(lái)進(jìn)行II型糖尿病的診斷和預(yù)測(cè)[PR newswire，Sept 1，1998]。Sequenom Inc.報(bào)道FOXA2(HNF3β)基因與II型糖尿病高度相關(guān)[PR Newswire，Oct 28，2003]。雖然有關(guān)于與II型糖尿病有關(guān)的一些基因的報(bào)道，但是已將發(fā)生II型糖尿病的研究集中在特定人群中一些染色體的特定基因上。為此，研究結(jié)果可根據(jù)人的種類變化。此外，還沒(méi)有鑒定出造成II型糖尿病原因的所有成因基因(causative gene)。通過(guò)所述的分子生物技術(shù)來(lái)診斷II型糖尿病現(xiàn)在是罕見的。另外，在II型糖尿病發(fā)病前的早期診斷目前是不可行的。因此，越來(lái)越需要找到新的與II型糖尿病高度相關(guān)的SNPs和存在于整個(gè)人基因組中的相關(guān)基因，并需要使用所述的SNPs和相關(guān)基因進(jìn)行II型糖尿病的早期診斷。
發(fā)明詳述本發(fā)明的技術(shù)目標(biāo)本發(fā)明提供了含有與II型糖尿病有關(guān)的單核苷酸多態(tài)性的多核苷酸。
本發(fā)明也提供了微陣列和II型糖尿病診斷試劑盒，其每個(gè)包括含有與II型糖尿病有關(guān)的單核苷酸多態(tài)性的多核苷酸本發(fā)明也提供了分析與II型糖尿病有關(guān)的多核苷酸的方法。
本發(fā)明的公開本發(fā)明提供了用于診斷或治療II型糖尿病的多核苷酸，其包括選自核苷酸序列SEQ ID NOS1-80的核苷酸序列的至少10個(gè)連續(xù)的核苷酸，并包括在所述核苷酸序列的多態(tài)性位點(diǎn)(第101位)的核苷酸，或其互補(bǔ)多核苷酸。
所述多核苷酸包括含有核苷酸序列的多態(tài)性位點(diǎn)的至少10個(gè)核苷酸的連續(xù)跨度(span)，所述核苷酸序列選自SEQ ID NOS1-80的核苷酸序列。所述多核苷酸長(zhǎng)度為10至400個(gè)核苷酸，優(yōu)選10至100個(gè)核苷酸，而且更優(yōu)選10至50個(gè)核苷酸。在此，SEQ ID NOS1-80中每個(gè)核苷酸序列的多態(tài)性位點(diǎn)位于101位。
SEQ ID NOS1-80的每個(gè)核苷酸序列是多態(tài)性序列。該多態(tài)性序列指含有多態(tài)性位點(diǎn)的核苷酸序列，在該多態(tài)性位點(diǎn)處發(fā)生單核苷酸多態(tài)性(SNP)。所述多態(tài)性位點(diǎn)指多態(tài)性序列的位置，在該位置發(fā)生SNP。所述核苷酸序列可為DNAs或RNAs。
在本發(fā)明中，SEQ ID NOS1-80的多態(tài)性序列的多態(tài)性位點(diǎn)(第101位)與II型糖尿病相關(guān)。這通過(guò)源自II型糖尿病患者和正常人的血樣的DNA序列分析得到確認(rèn)。SEQ ID NOS1-80的多態(tài)性序列與II型糖尿病的關(guān)聯(lián)和所述多態(tài)性序列的特點(diǎn)總結(jié)于表1-1、1-2、2-1和2-2。
表1-1

表1-1(續(xù))

表1-2

表1-2(續(xù))

表2-1

表2-1(續(xù))

表2-2

表2-2(續(xù))

在表1-1和1-2中，欄中的內(nèi)容定義如下。
-Assay ID代表標(biāo)記物名稱。
-SNP為SNP多態(tài)性位點(diǎn)的多態(tài)性堿基。此處，A1和A2分別代表低頻等位基因(low mass allele)和高頻等位基因(high mass allele)，作為根據(jù)同源MassEXTEND(hME)技術(shù)(Sequenom)序列分析的結(jié)果，并為了實(shí)驗(yàn)的方便任意地設(shè)計(jì)。
-SNP序列代表含有SNP位點(diǎn)的序列，即，在101位含有等位基因A1或A2的序列。
-在等位基因頻率欄，cas_A2、con_A2和Delta分別代表病例組的等位基因A2頻率、正常組的等位基因A2頻率和cas_A2與con_A2之差的絕對(duì)值。此處，cas_A2為病例組中的(基因型A2A2頻率×2+基因型A1A2頻率)/(樣品數(shù)×2)，而con_A2為正常組中的(基因型A2A2頻率×2+基因型A1A2頻率)/(樣品數(shù)×2)。
-基因型頻率代表每種基因型的頻率。此處，cas_A1A1、cas_A1A2和cas_A2A2分別為病例組中具有基因型A1A1、A1A2和A2A2的個(gè)體的數(shù)目，而con_A1A1、con_A1A2和con_A2A2分別為正常組中具有基因型A1A1、A1A2和A2A2的個(gè)體的數(shù)目。
-df＝2代表具有兩個(gè)自由度的chi-平方值。chi-value代表chi-平方值，p-值基于chi-值確定。Chi_exact_p-Value代表卡方檢驗(yàn)(chi-square test)的Fisher精確檢驗(yàn)的p值。當(dāng)基因型的數(shù)目小于5時(shí)，卡方檢驗(yàn)的結(jié)果可能不準(zhǔn)確。在這點(diǎn)上，需要通過(guò)Fisher精確檢驗(yàn)確定更準(zhǔn)確的統(tǒng)計(jì)顯著性(p-值)。Chi_exact_p-Value是在Fisher精確檢驗(yàn)中使用的變量。在本發(fā)明中，當(dāng)p-值≤0.05時(shí)，認(rèn)為病例組的基因型與正常組的不同，即，病例組和正常組之間有顯著的區(qū)別。
-在危險(xiǎn)等位基因欄，當(dāng)參考等位基因是A2而且病例組的等位基因A2頻率大于正常組的等位基因A2頻率(即，cas_A2＞con_A2)時(shí)，就把等位基因A2看作危險(xiǎn)等位基因。而在相反的情況下，則把等位基因A1看作危險(xiǎn)等位基因。
-優(yōu)勢(shì)率(odd ratio)代表病例組中危險(xiǎn)等位基因的可能性與正常組中危險(xiǎn)等位基因的可能性的比例。在本發(fā)明中，使用Mantel-Haenszel優(yōu)勢(shì)率方法。CI代表優(yōu)勢(shì)率的95％置信區(qū)間，并通過(guò)(置信區(qū)間的下限，置信區(qū)間的上限)表示。當(dāng)1落在置信區(qū)間內(nèi)時(shí)，認(rèn)為危險(xiǎn)等位基因與疾病的關(guān)聯(lián)不顯著。
-HWE代表Hardy-Weinberg平衡。此處，con_HWE和cas_HWE分別代表正常組和病例組中相對(duì)于Hardy-Weinberg平衡的偏差度?；诳ǚ綑z驗(yàn)(df＝1)中chi_值＝6.63(p-值＝0.01，df＝1)，把大于6.63的值看作Hardy-Weinberg不平衡(HWD)，而小于6.63的值看作Hardy-Weinberg平衡(HWE)。
-Call rate代表可以對(duì)其基因型進(jìn)行解釋的樣品的數(shù)目比實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的樣品總數(shù)。此處，cas_call_rate和con_call_rate分別代表病例組和正常組中可解釋基因型的樣品的數(shù)目與應(yīng)用的樣品總數(shù)(300個(gè)體)的比例。
表1和2顯示了基于NCBI build 123的SNP標(biāo)記物的特性。
如表1-1、1-2、2-1和2-2所示，根據(jù)本發(fā)明的SEQ ID NOS1-80的多態(tài)性標(biāo)記物的卡方檢驗(yàn)，chi_exact_p-Value在95％置信區(qū)間內(nèi)的4.54×10-4-0.0104范圍內(nèi)。這顯示，在SEQ ID NOS1-80的多態(tài)性標(biāo)記物中，等位基因發(fā)生頻率的期望值和測(cè)量值之間有顯著的差異。優(yōu)勢(shì)率范圍為1.34-2.43，這顯示SEQID NOS1-80的多態(tài)性標(biāo)記物與II型糖尿病有關(guān)。
本發(fā)明的SEQ ID NOS1-80的SNPs以顯著的頻率在II型糖尿病患者組和正常組中發(fā)生。因此，本發(fā)明的多核苷酸可以有效地應(yīng)用于II型糖尿病的診斷、指紋分析(fingerprinting analysis)和治療。具體地，本發(fā)明的多核苷酸可用作診斷II型糖尿病的引物或探針。此外，本發(fā)明的多核苷酸可用作治療II型糖尿病的反義DNA或組合物。
本發(fā)明也提供了等位基因特異性的用于診斷II型糖尿病的多核苷酸或其互補(bǔ)體，其與包括至少10個(gè)核苷酸的連續(xù)跨度的多核苷酸雜交，其含有選自核苷酸序列SEQ ID NOS1-80的核苷酸序列的多態(tài)性位點(diǎn)的核苷酸。
等位基因-特異性的多核苷酸指特異性地與每個(gè)等位基因雜交的多核苷酸。即，等位基因-特異性的多核苷酸具有在SEQ ID NOS1-80的多態(tài)性序列中區(qū)分多態(tài)性位點(diǎn)的核苷酸，并特異性地與每個(gè)這樣的核苷酸雜交的能力。雜交在嚴(yán)謹(jǐn)條件下進(jìn)行，例如，1M或更小的鹽濃度和25℃或更高的溫度。例如，5×SSPE(750mM NaCl，50mM Na磷酸鹽，5mM EDTA，pH7.4)和25-30℃的條件對(duì)于等位基因-特異性探針雜交是適合的。
在本發(fā)明中，等位基因-特異性的多核苷酸可為引物。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“引物”指單鏈寡核苷酸，其在合適的條件下，例如，在包含四種不同的三磷酸核苷和聚合酶如DNA或RNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶的緩沖液中以及合適的溫度下，作為模板-指導(dǎo)的進(jìn)行DNA合成的起始點(diǎn)。所述引物的合適長(zhǎng)度可根據(jù)使用目的變化，通常為15-30個(gè)核苷酸。通常，較短的引物分子需要較低的溫度以與模板形成穩(wěn)定的雜交體。引物序列不需要與模板完全互補(bǔ)，但必須足夠互補(bǔ)以與模板雜交。優(yōu)選地，引物的3’-末端與SEQ ID NOS1-80的每個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)(第101位)的核苷酸對(duì)比(align)。引物與含有多態(tài)性位點(diǎn)的目標(biāo)DNA雜交并開始等位基因擴(kuò)增(allelic amplification)，其中引物呈現(xiàn)與目標(biāo)DNA的完全同源性。引物是成對(duì)使用，其第二個(gè)引物與相反鏈雜交。擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)使用兩條引物擴(kuò)增得到，其意味著有特異性的等位基因形式。本發(fā)明的引物包括用于連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)的多核苷酸片段。
在本發(fā)明中，等位基因-特異性的多核苷酸可為探針。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“探針”指雜交探針，即，能夠序列-特異性地與核酸的互補(bǔ)鏈結(jié)合的寡核苷酸。這樣的探針可為肽核酸，如由Nielsen等在Science 254，1497-1500(1991)中公開的。根據(jù)本發(fā)明的探針是等位基因-特異性的探針。在這點(diǎn)上，當(dāng)在源自相同物種的兩個(gè)成員的核酸片段中有多態(tài)性位點(diǎn)時(shí)，所述的探針與源自一個(gè)成員的DNA片段雜交，而不與源自另一個(gè)成員的DNA片段雜交。在此情況下，雜交條件應(yīng)足夠嚴(yán)謹(jǐn)以允許通過(guò)等位基因之間雜交強(qiáng)度的顯著差異而只與一個(gè)等位基因雜交。優(yōu)選地，探針的中部，即15個(gè)核苷酸的探針的第7位，或16個(gè)核苷酸的探針的第8或第9位，與SEQ ID NOS1-80的核苷酸序列的每個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)對(duì)應(yīng)。因此，可引起等位基因之間雜交中的顯著差異。本發(fā)明的探針可用于檢測(cè)等位基因的診斷方法中。所述診斷方法包括基于核酸雜交的檢測(cè)方法，例如，southern印跡。在將DNA芯片用于基于核酸雜交的檢測(cè)方法的情況中，可以作為在DNA芯片的基板上固定的形式提供探針。
本發(fā)明也提供了用于診斷II型糖尿病的微陣列，其包括本發(fā)明的多核苷酸或其互補(bǔ)的多核苷酸。微陣列的多核苷酸可以為DNA或RNA。所述的微陣列除了包括本發(fā)明的多核苷酸外，與普通的微陣列相同。
本發(fā)明也提供了包括本發(fā)明的多核苷酸的II型糖尿病診斷試劑盒。該II型糖尿病診斷試劑盒除包括本發(fā)明的多核苷酸之外，可包括聚合所必需的試劑，例如，dNTPs、各種聚合酶和著色劑。
本發(fā)明也提供了在個(gè)體中診斷II型糖尿病的方法，其包括將核酸樣品從所述的個(gè)體分離；和測(cè)定SEQ ID NOS1-80的多核苷酸或其互補(bǔ)多核苷酸中至少一個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)(第101位)的核苷酸。此處，當(dāng)樣品核酸的至少一個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的核苷酸與表1-1、1-2、2-1、2-2、3、4和5中顯示的至少一個(gè)危險(xiǎn)等位基因相同時(shí)，可確定該個(gè)體具有較高的可能性被診斷為有發(fā)生II型糖尿病的危險(xiǎn)。
將核酸樣品從所述的個(gè)體中分離的步驟可通過(guò)常規(guī)的DNA分離方法進(jìn)行。例如，可通過(guò)使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增目標(biāo)核酸然后純化來(lái)獲得核酸樣品。除PCR之外，可以應(yīng)用LCR(Wu和Wallace，Genomics 4，560(1989)，Landegren等，Science 241，1077(1988))、轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增(transcription amplification)(Kwoh等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，1173(1989))、自動(dòng)維持序列擴(kuò)增(self-sustained sequence replication)(Guatelli等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，1874(1990))或基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)。后兩種方法與基于等溫轉(zhuǎn)錄的等溫反應(yīng)相關(guān)，并產(chǎn)生30或100倍的RNA單鏈和DNA雙鏈作為擴(kuò)增產(chǎn)物。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，測(cè)定多態(tài)性位點(diǎn)的核苷酸的步驟包括，將核酸樣品雜交到微陣列上并檢測(cè)雜交結(jié)果，在所述的微陣列上固定了用于診斷或治療II型糖尿病的多核苷酸或其互補(bǔ)多核苷酸，所述多核苷酸包括源自核苷酸序列SEQ ID NOS1-80的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸并包括多態(tài)性位點(diǎn)(第101位)的核苷酸。
微陣列和通過(guò)將探針多核苷酸固定在基板上來(lái)制備微陣列的方法在有關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域中是熟知的。將本發(fā)明的與II型糖尿病相關(guān)的探針多核苷酸固定在基板上可使用常規(guī)方法容易地進(jìn)行。核酸在微陣列上的雜交和雜交結(jié)果的檢測(cè)在有關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域中也是熟知的。例如，可以通過(guò)用產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的標(biāo)記物質(zhì)，如熒光物質(zhì)(例如，Cy3和Cy5)標(biāo)記核酸樣品，將標(biāo)記的核酸樣品雜交到微陣列上，并檢測(cè)由標(biāo)記物質(zhì)產(chǎn)生的信號(hào)來(lái)進(jìn)行雜交結(jié)果的檢測(cè)。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，作為測(cè)定多態(tài)性位點(diǎn)的核苷酸序列的結(jié)果，當(dāng)檢測(cè)到至少一個(gè)選自SEQ ID NOS2.4，5，8，9，11，13，16，18，20，21，23，25，27，30，32，33，36，38，40，42，44，46，47，49，51，53，55，57，59，62，63，65，67，69，71，75，77，和80的含有危險(xiǎn)等位基因的核苷酸序列時(shí)，可確定所述個(gè)體具有較高的可能性被診斷為處于發(fā)生II型糖尿病的危險(xiǎn)中。如果在個(gè)體中檢測(cè)到更多危險(xiǎn)等位基因的核苷酸序列，那么可以確定所述個(gè)體具有更高的可能性被診斷為處于發(fā)生II型糖尿病的危險(xiǎn)中。
在下文中，將通過(guò)實(shí)施例更具體地描述本發(fā)明。然而，僅僅為了說(shuō)明而提供如下的實(shí)施例，因此本發(fā)明并不局限于如下實(shí)施例。
本發(fā)明的效果本發(fā)明的多核苷酸可用于II型糖尿病的診斷、治療或指紋分析。
包括本發(fā)明的多核苷酸的微陣列和診斷試劑盒可用于有效診斷II型糖尿病。
根據(jù)本發(fā)明分析與II型糖尿病有關(guān)的多核苷酸的方法可有效地檢測(cè)II型糖尿病的存在或危險(xiǎn)。
本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式實(shí)施例實(shí)施例1在此實(shí)施例中，DNA樣品提取自患者組和正常組的血流，所述患者組由已被診斷為II型糖尿病患者并正在治療中的300個(gè)韓國(guó)人組成，所述正常組由沒(méi)有II型糖尿病癥狀并且與患者組同年齡的300個(gè)韓國(guó)人組成，并評(píng)價(jià)特異性的SNPs的出現(xiàn)頻率。所述SNPs選自已知的數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBI dbSNPhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/)或(Sequenom:http://www.realsnp.com/)。與選擇的SNPs附近的序列雜交的引物用于測(cè)試DNA樣品中SNPs的核苷酸。
1.DNA樣品的制備DNA樣品從II型糖尿病患者和正常人的血流中提取。DNA提取根據(jù)已知的提取方法(Molecular cloningA Laboratory Manual，p 392，Sambrook，F(xiàn)ritsch和Maniatis，2nd edition，Cold Spring Harbor Press，1989)和由Centrasystem制造的商業(yè)試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行。在提取的DNA樣品中，只使用具有至少1.7的純度(通過(guò)A260/A280nm)的DNA樣品。
2.目標(biāo)DNAs的擴(kuò)增目標(biāo)DNAs為包含待分析的SNP的預(yù)定的DNA區(qū)域，它們通過(guò)PCR擴(kuò)增。PCR通過(guò)如下列條件的常規(guī)方法進(jìn)行。首先，制備目標(biāo)基因組DNAs。然后，制備下述PCR混合物。
水(HPLC級(jí)) 2.24μl10x緩沖液(15mM MgCl2，25mM MgCl2) 0.5μldNTP混合物(GIBCO)(每種25mM) 0.04μlTaq pol(HotStar)(5U/μl) 0.02μl正向/反向引物混合物(每種1μM)0.02μlDNA 1.00μl
總體積5.00μl此處，根據(jù)已知數(shù)據(jù)庫(kù)中SNP的上游和下游序列設(shè)計(jì)正向和反向引物。這些引物在下面的表3中列出。
PCR的熱循環(huán)如下在95℃溫育15分鐘；95℃ 30秒，在56℃ 30秒，和在72℃ 1分鐘進(jìn)行45輪循環(huán)；在72℃溫育3分鐘并貯存于4℃。結(jié)果，得到擴(kuò)增的DNA片段，其長(zhǎng)度為200個(gè)或更少的核苷酸。
3.分析擴(kuò)增的目標(biāo)DNA片段中SNPs使用從Sequenom可得到的同源MassExtension(hME)技術(shù)來(lái)進(jìn)行擴(kuò)增的目標(biāo)DNA片段中SNPs的分析。MassExtension技術(shù)的原理如下。首先，設(shè)計(jì)立即終止于目標(biāo)DNA片段中SNPs之前的引物(亦稱為“延伸引物”)。然后，將引物與目標(biāo)DNA片段雜交并進(jìn)行DNA聚合。此時(shí)，聚合溶液含有一種試劑(例如ddTTP)，該試劑使聚合反應(yīng)在摻入與第一個(gè)等位核苷酸(例如，A等位基因)互補(bǔ)的核苷酸之后立即終止。這樣一來(lái)，當(dāng)?shù)谝粋€(gè)等位基因(例如，A等位基因)存在于目標(biāo)DNA片段中時(shí)，得到的產(chǎn)物中只有與該第一個(gè)等位基因互補(bǔ)的核苷酸(例如，T核苷酸)從引物延伸。另一方面，當(dāng)?shù)诙€(gè)等位基因(例如，G等位基因)存在于目標(biāo)DNA片段中時(shí)，與該第二個(gè)等位基因互補(bǔ)的核苷酸(例如，C核苷酸)被添加到引物的3’-末端，然后引物被延伸直到加入與最接近的第一個(gè)等位核苷酸互補(bǔ)的核苷酸(例如，T核苷酸)為止。從引物延伸的產(chǎn)物的長(zhǎng)度通過(guò)質(zhì)譜法測(cè)定。由此，可以鑒定存在于目標(biāo)DNA片段中的等位基因。實(shí)驗(yàn)條件舉例如下。
首先，將未反應(yīng)的dNTPs從PCR產(chǎn)物中去除。為此，加入1.53μl的去離子水，0.17μl的HME緩沖液，0.30μl的蝦堿性磷酸酶(shrimp alkalinephosphatase，SAP)并在1.5ml試管中混合以制備SAP酶溶液。將試管在5,000rpm離心10秒。此后，將PCR產(chǎn)物加入SAP溶液管，密封、在37℃溫育20分鐘然后85℃ 5分鐘，并貯存于4℃。
接著，使用擴(kuò)增的目標(biāo)DNA片段作為模板進(jìn)行同源延伸。用于此延伸的反應(yīng)溶液的組成如下。
水(納米級(jí)去離子水) 1.728μl
hME延伸混合物(含有2.25mMd/ddNTPs的10x緩沖液) 0.200μl延伸引物(每種100μM) 0.054μlThermosequenase(32U/μl) 0.018μl總體積 2.00μl將反應(yīng)溶液與先前制備的目標(biāo)DNA溶液徹底地混合，并進(jìn)行spin-down離心。將含有產(chǎn)物混合物的試管或平板緊密地封好，在94℃溫育2分鐘，接著是94℃ 5秒、52℃ 5秒及72℃ 5秒40個(gè)循環(huán)的同源延伸，并貯存于4℃。所得到的同源延伸產(chǎn)物以樹脂(SpectroCLEAN)洗滌。用于延伸的延伸引物在下面的表3中列出。
表3用于擴(kuò)增的引物和用于目標(biāo)DNAs同源延伸的延伸引物

使用質(zhì)譜法，MALDI-TOF(基質(zhì)輔助的激光解吸和離子化-飛行時(shí)間法(Matrix Assisted Laser Desorption and Ionization-Time of Flight))來(lái)檢測(cè)延伸產(chǎn)物中的多態(tài)性位點(diǎn)的核苷酸。MALDI-TOF根據(jù)如下原理操作。當(dāng)將分析物暴露于激光束時(shí)，它與離子化的基質(zhì)一起，在真空狀態(tài)下飛向位于相對(duì)側(cè)的檢測(cè)器。此時(shí)，計(jì)算分析物到達(dá)檢測(cè)器所花費(fèi)的時(shí)間。具有越小質(zhì)量的物質(zhì)越快到達(dá)檢測(cè)器。根據(jù)這些DNA片段和SNPs的已知核苷酸序列之間的質(zhì)量差異測(cè)定目標(biāo)DNA片段中SNPs的核苷酸。
使用MALDI-TOF檢測(cè)目標(biāo)DNAs多態(tài)性位點(diǎn)的核苷酸的結(jié)果表1-1、1-2、2-1和2-2中顯示。每個(gè)等位基因可以以個(gè)體中的純合子(homozygote)或雜合子(heterozygote)的形式存在。然而，給定種群中雜合子頻率與純合子頻率之間的分布不超過(guò)統(tǒng)計(jì)上的顯著性水平。根據(jù)孟德爾遺傳定律(Mendel’sLaw of inheritance)和哈迪-溫伯格定律(Hardy-Weinberg Law)，構(gòu)成種群的等位基因的基因組成(genetic makeup)以恒定的頻率保持。當(dāng)基因組成具有統(tǒng)計(jì)顯著性時(shí)，可認(rèn)為它具有生物學(xué)意義。本發(fā)明的SNPs以統(tǒng)計(jì)上的顯著水平在II型糖尿病患者中出現(xiàn)，如表1-1、1-2、2-1和2-2中所示，并因此能夠有效地用于診斷II型糖尿病。
序列表<110>三星電子株式會(huì)社<120>包含與II型糖尿病有關(guān)的單核苷酸多態(tài)性的多核苷酸、包含該多核苷酸的微陣列和診斷試劑盒以及使用它們分析多核苷酸的方法<130>PN058287<160>200<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>201<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>1taaaaacaga tgggtgatcc cagtcctcta aatataatcg gggatgccaa atcttttcaa60agagaattca tatatacaac ttaaaggcca aggagcccaa ctcaatcaaa atttgagcca120ggatatgcta agttcaatca gcttgaatat gggcaaagtg taagacctag ccagcacttc180agatatatac agagaaccac a 201<210>2<211>201<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>2taaaaacaga tgggtgatcc cagtcctcta aatataatcg gggatgccaa atcttttcaa60agagaattca tatatacaac ttaaaggcca aggagcccaa ttcaatcaaa atttgagcca120ggatatgcta agttcaatca gcttgaatat gggcaaagtg taagacctag ccagcacttc180agatatatac agagaaccac a 201<210>3<211>201<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>3gtctgttttt catgggataa tttttattga tctatatcca aattgaattt gaatatactt60tattcctatg taatctcctt tgtcctctca aagacattta attttttttt ccaatactgt120atttttccgt cctaaaattt ccatttgttt cttttatagt ttttatttta ttgctgagat180acttctatca tgtctttcac c 201<210>4
<211>201<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>4gtctgttttt catgggataa tttttattga tctatatcca aattgaattt gaatatactt 60tattcctatg taatctcctt tgtcctctca aagacattta gttttttttt ccaatactgt 120atttttccgt cctaaaattt ccatttgttt cttttatagt ttttatttta ttgctgagat 180acttctatca tgtctttcac c 201<210>5<211>201<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>5gcagcagtac ggacgttaca ggaaagccat tgctagctct gctcctttaa catgtgtaaa 60aacatctgtg ggtgacaggc agcaccccag ctcctggggt agtgacagag gctctcagga 120ctccttccta ttgagatgca cagtggtcta ggtgttcccc aggcaggaac ctgtggaatc180tttggctttt ccttgaccta g 201<210>6<211>201<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>6gcagcagtac ggacgttaca ggaaagccat tgctagctct gctcctttaa catgtgtaaa 60aacatctgtg ggtgacaggc agcaccccag ctcctggggt ggtgacagag gctctcagga 120ctccttccta ttgagatgca cagtggtcta ggtgttcccc aggcaggaac ctgtggaatc 180tttggctttt ccttgaccta g 201<210>7<211>201<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>7aaaacaagac ttccagcgtt ttggtttgag caactgagtg gatgccagca ctgtttcctg 60aaatgaataa gcctgggaga agtacaagtc aaaggggagg ggaggtgtta aaattgatca 120agaactctat tttggacatg ttagtttgac atgttgatta aacgtccaag aggaaaagtc 180acaaagccag tgagctatgg t 201
<210>8<211>201<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>8aaaacaagac ttccagcgtt ttggtttgag caactgagtg gatgccagca ctgtttcctg60aaatgaataa gcctgggaga agtacaagtc aaaggggagg agaggtgtta aaattgatca120agaactctat tttggacatg ttagtttgac atgttgatta aacgtccaag aggaaaagtc180acaaagccag tgagctatgg t 201<210>9<211>201<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>9aaactgttca gtaatcctta atgtctagtt ctttccccaa agtacaattg cctgagtaaa60ttatcatagg taactttgag aaggaactat gataatcatg ttatataatg aggacttttc120tacaaggatt caggtacctc ttcaatgagt tctagatcta gaaactgaca caagtttggg180aactaggcaa gaaattgtga c 201<210>10<211>201<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>10aaactgttca gtaatcctta atgtctagtt ctttccccaa agtacaattg cctgagtaaa60ttatcatagg taactttgag aaggaactat gataatcatg gtatataatg aggacttttc120tacaaggatt caggtacctc ttcaatgagt tctagatcta gaaactgaca caagtttggg180aactaggcaa gaaattgtga c 201<210>11<211>201<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>11tggagggtgg cagggagctg gaggagcagt gaggacttgc ttgagcagtc ttgacaagat60gtggcaggcc cacagccttc actgcctcta ggccccctga atgggtcact gtggttcctt120cagacacaag agagacccct tattgcccca gtcccactga cagactctgc ctcccaggcc180cactggccct gcccagacat g 201
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<223>引物<400>137aatctcaaac caaaagcaaa atta 24<210>138<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>引物
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<223>引物<400>149ctcaaaccag gcagcaatga a21<210>150<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>150acgttggatg gctttttgcc ctcatgcatc 30<210>151
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<223>引物<400>152gcatcattta ttctagccaa aac 23<210>153<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>引物<400>154acgttggatg gcttgagatc ctgaatgaac 30<210>155<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物
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<223>引物
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<223>引物<400>167tcttatccaa catgagaatc ca 22<210>168<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
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<213>人工序列<220>
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<223>引物<400>170gctctgtctt tatatgaat 19<210>171<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>171acgttggatg cttgcaccat tatcattgcc 30<210>172<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>172acgttggatg tcttaatggt catgcgtggg 30<210>173<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>173
ttgccaattt gcagatg 17<210>174<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>174acgttggatg gtctcataaa gcacaaccaa c 31<210>175<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>175acgttggatg gtcacttggt tctaaatgtg g 31<210>176<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>引物<400>189acgttggatg gtctcccgag gagagaaatt 30<210>190<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>190acgttggatg ccctgaagtc taaataagat g 31<210>191<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>引物<400>197tacagtcctg acagagtaaa at 22<210>198<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>198acgttggatg gctcactctt ctcaccaatg 30<210>199<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>199acgttggatg gttgccgagg catttgaaag 30<210>200<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>200ggctgcttcc cctccca 1權(quán)利要求
1.用于診斷或治療II型糖尿病的多核苷酸，其包含選自核苷酸序列SEQID NOS1-80的核苷酸序列的至少10個(gè)連續(xù)的核苷酸，并包含在所述核苷酸序列的201位的核苷酸，或其互補(bǔ)多核苷酸。
2.用于診斷或治療II型糖尿病的多核苷酸，其與權(quán)利要求1的多核苷酸或其互補(bǔ)多核苷酸雜交。
3.權(quán)利要求1或2的多核苷酸，其長(zhǎng)度為10至100個(gè)核苷酸。
4.權(quán)利要求1的多核苷酸，其為引物或探針。
5.用于診斷II型糖尿病的微陣列，其包含權(quán)利要求1的多核苷酸或其互補(bǔ)多核苷酸。
6.用于診斷II型糖尿病的試劑盒，其包含權(quán)利要求1的多核苷酸或其互補(bǔ)多核苷酸。
7.在個(gè)體中診斷II型糖尿病的方法，其包括(a)從個(gè)體中分離核酸樣品；和(b)在SEQ ID NOS1-80的多核苷酸或其互補(bǔ)多核苷酸中測(cè)定至少一個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)(第101位)的核苷酸。
8.權(quán)利要求7的方法，其中測(cè)定至少一個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的核苷酸的步驟包括將所述核酸樣品在微陣列上雜交，在該微陣列上固定了權(quán)利要求1的多核苷酸或其互補(bǔ)多核苷酸；和檢測(cè)雜交結(jié)果。
9.權(quán)利要求7的方法，其中當(dāng)檢測(cè)到至少一個(gè)選自SEQ ID NOS2.4，5，8，9，11，13，16，18，20，21，23，25，27，30，32，33，36，38，40，42，44，46，47，49，51，53，55，57，59，62，63，65，67，69，71，75，77，和80的含有危險(xiǎn)等位基因的核苷酸序列時(shí)，可確定所述個(gè)體具有較高的可能性被診斷為處于發(fā)生II型糖尿病的危險(xiǎn)中。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于診斷或治療Ⅱ型糖尿病的多核苷酸，其包括選自核苷酸序列SEQ ID NOS1－80的核苷酸序列的至少10個(gè)連續(xù)的核苷酸，并包括在所述核苷酸序列的101位的核苷酸，或其互補(bǔ)多核苷酸。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1961074SQ200480042089
公開日2007年5月9日 申請(qǐng)日期2004年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月24日
發(fā)明者李圭祥, 金載洽, 樸卿希, 李娟受, 孫玉慶, 趙志榮, 樸娟雅, 洪性宇, 黃貞周, 全涍廷 申請(qǐng)人:三星電子株式會(huì)社