一種多粘類芽孢桿菌新普魯蘭酶基因及克隆表達以及發(fā)酵生產新普魯蘭酶的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種多粘類芽孢桿菌新普魯蘭酶基因及克隆表達以及發(fā)酵生產新普魯蘭酶的方法，選擇多粘芽孢桿菌（ paenibacilluspolymyxa ）CFCC10334作為出發(fā)菌株，基因工程宿主菌是大腸桿菌BL21，根據(jù)大腸桿菌表達載體質粒PGEX4T-1的物理圖譜，將多粘芽孢桿菌中新普魯蘭酶基因 Npu 定向插入到表達質粒中，并轉化大腸桿菌BL21，表達產物ENpu5具有正常生物學活性，獲取新普魯蘭酶基因，通過克隆轉化，在大腸桿菌中進行誘導表達，篩選陽性表達子，并測定酶活后得到一株具有較高酶活的基因工程菌株，最后進行發(fā)酵生產得到新普魯蘭酶產品。提高了酶的穩(wěn)定性、活性，降低了生產成本。
【專利說明】一種多粘類芽孢桿菌新普魯蘭酶基因及克隆表達以及發(fā)酵 生產新普魯蘭酶的方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于酶工程【技術領域】，具體涉及利用基因工程技術重組微生物新普魯蘭酶 基因，構建基因工程菌，通過重組酶在載體中的表達進行新普魯蘭酶的發(fā)酵生產。

【背景技術】
[0002] 新普魯蘭酶（Neopullulanase，/?/?/, EC3. 2 . 1. 135)屬于葡萄糖苷水解酶類 (Glycosyl hydrolase family)的 α -淀粉水解酶族 13 ( a-amylase family 13)中的一 種，它是一個多功能復合型的淀粉水解酶，能催化淀粉的四種反應：水解α-(1 - 4)糖苷 鍵、水解α - (1 - 6)糖苷鍵、α - (1 - 4)鍵的轉糖苷作用、α - (1 - 6)鍵的轉糖苷作用。 因此，新普魯蘭酶既具有普魯蘭酶（pullulanase，PU，EC3. 2. 1.41)的活性，可將普魯蘭的 α - (1 - 6)糖苷鍵斷開，生成麥芽三糖；又具有α -淀粉酶的活性，可將普魯蘭水解生成潘 糖。另外，在高糖濃度下，新普魯蘭酶還具有轉α-(1 - 4)和α-(1 - 6)糖苷作用，可將 葡萄糖苷的分枝連接方式在α -(1 - 4)和α -(1 - 6)中相互轉換。并且新普魯蘭酶是最 早發(fā)現(xiàn)的具有代表性的一類多功能淀粉酶（multifunctional amylase, MFA)。
[0003] 在自然界中，每種植物都能利用光合作用合成淀粉并將之存貯起來，為人類和動 物提供源源不斷的能量。作為最原始的貯存能源，淀粉是很重要的多糖，在食品、飲料工業(yè) 中是必不可少的原材料。在淀粉生產淀粉糖的過程中特別是在糖化過程中輔助性的加入 新普魯蘭酶，能水解普通淀粉酶不能作用的a -(1 - 6)糖苷鍵，可提高淀粉糖的轉化率。在 以淀粉生產酒精的工藝中，添加新普魯蘭酶可將淀粉的利用率提高3%_5% ;在以淀粉為原 料生產低聚異麥芽糖、低聚麥芽糖和低聚果糖、甘露寡糖等的生產過程中用新普魯蘭酶替 代其它轉糖苷酶，可將低聚糖的轉化率由原來的45%提高到60%左右，由于新普魯蘭酶能參 與淀粉水解的四種反應，所以在淀粉加工業(yè)中有著重要的用途。
[0004] 微生物是新普魯蘭酶的最佳來源，但由于天然菌種的產酶量低，直接用其生產出 的新普魯蘭酶成本較高，從而影響了新普魯蘭酶的推廣應用。隨著現(xiàn)代分子生物學的飛速 發(fā)展，采用基因工程技術手段改造產新普魯蘭酶微生物，構建新普魯蘭酶基因工程菌，提高 酶產量，進而進行大規(guī)模的發(fā)酵生產，己成為世界研究的熱點。
[0005] 迄今為止，國內外研究的最詳細的新普魯蘭酶是來源于嗜熱脂肪芽孢桿 菌 TRS40 (ifeciBws TRS40)的 NPL 和來源于普通高溫放線 菌（極6?/--0<3<^//70〃?_7<^?>5 1^/§3/^>5 1?247)的1'\^11。除此之外，分別從海洋超適溫菌 (TPAot/o 紐ri/ws)，嗜喊性芽抱桿菌 ifeciBiAs)，多粘芽抱桿菌 (ZfeciBw1S 環(huán)脂酸芽抱桿菌屬 acii/oca/i/ariiAs)中發(fā) 現(xiàn)了新普魯蘭酶的存在。Takata等于1992年發(fā)現(xiàn)來源于嗜熱脂肪芽胞桿菌（ZfeciBm siearoiAerffio/Ai/iAs TRS40)中的新普魯蘭酶（neopullulanase，NPase) (EC 3·2· 1. 135) 兼有糖苷水解酶和糖基轉移酶催化活性，并且嗜熱脂肪芽胞桿菌分泌的新普魯蘭酶是研究 最完善的一種，其酶的基因名為分類編號1422 [NCBI]，氨基酸序列長度為588個氨 基酸。酶的底物結合位點和催化活性中心均已確定，它的三級結構分析顯示為二聚體。最 適溫度為60?65°C，最適pH6. 0,分子量約為62ku。
[0006] 目前，雖有對嗜熱芽孢桿菌中的新普魯蘭酶研究較為深入，但對來源于多粘芽孢 桿菌的研究相對較少，且尚未實現(xiàn)產業(yè)化。由于多粘芽孢桿菌屬于原核生物，通常都會首先 利用大腸桿菌表達系統(tǒng)這一成熟的表達體系，進行多粘芽孢桿菌新普魯蘭酶的表達研究。 大腸桿菌表達系統(tǒng)是最簡單的一種異源表達系統(tǒng)，它的優(yōu)點是遺傳背景比較清楚，表達水 平較高、易操作，有許多菌株突變體和含強啟動子的載體可供選擇。


【發(fā)明內容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種多粘類芽孢桿菌新普魯蘭酶基因； 本發(fā)明的另一個目的在于提供一種用新普魯蘭酶基因通過克隆轉化，在大腸桿菌中進 行誘導表達，發(fā)酵生產新普魯蘭酶的方法。
[0008] 本發(fā)明的目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)的： 一種多粘類芽孢桿菌新普魯蘭酶基因，其核苷酸序列為SEQ ID NO 1。
[0009] -種重組表達載體，含有權利要求1所述的核苷酸序列。
[0010] 一種宿主細胞，所述的宿主細胞為含有上述的核苷酸序列的原核細胞。
[0011] 上述的宿主細胞為含有上述的表達載體的原核細胞。
[0012] 一種多粘類芽孢桿菌新普魯蘭酶基因克隆表達進行發(fā)酵生產新普魯蘭酶的方法， 包括如下步驟：選擇多粘芽孢桿菌CFCC10334作為出發(fā)菌株， 基因工程宿主菌是大腸桿菌BL21，根據(jù)大腸桿菌表達載體質粒PGEX 4T-1的物理圖譜，將 多粘芽孢桿菌中新普魯蘭酶基因你《定向插入到表達質粒中，并轉化大腸桿菌BL21，表達 產物ENpu5具有正常生物學活性，獲取新普魯蘭酶基因，通過克隆轉化，在大腸桿菌中進行 誘導表達，篩選陽性表達子，并測定酶活后得到一株具有較高酶活的基因工程菌株，最后進 行發(fā)酵生產得到新普魯蘭酶產品。
[0013] 本發(fā)明中出發(fā)菌株的宿主菌是大腸桿菌BL21 (購自TaKaRa大連寶生物公 司），采用的出發(fā)菌菌種購于中國林業(yè)微生物菌種保藏管理中心保藏的多粘芽孢桿菌 保藏編號為CFCC10334。該菌種易得、安全性高、且培養(yǎng)方便， 其基因組DNA也易于提取。由于多粘芽孢桿菌屬于原核生物，所以本發(fā)明選擇利用大腸桿 菌表達系統(tǒng)這一成熟的表達體系，進行多粘芽孢桿菌新普魯蘭酶的表達研究。大腸桿菌表 達系統(tǒng)是最簡單的一種異源表達系統(tǒng)，它的優(yōu)點是遺傳背景比較清楚，表達水平較高、易操 作，有許多菌株突變體和含強啟動子的載體可供選擇。
[0014] 多粘類芽抱桿菌是芽抱桿菌科(Bacillaceae)類芽 孢桿菌屬的革蘭氏陽性細菌，在劃入類芽胞桿菌屬之前又稱 貝7忍。多粘類芽孢桿菌的細胞呈直桿狀，（0· 5?2· 5) μ mX (1. 2?10· 0) μ m，G+C含量為 409Γ50%;利用周生鞭毛運動，在膨大孢子囊中產生橢圓形芽孢；最適生長pH為7,最適溫 度為28~30°C ;兼性厭氧，分解葡萄糖和其他糖類產酸，有時產氣，在營養(yǎng)瓊脂上無可溶性色 素，對人或動植物沒有致病性，可產生多肽抗生素、拮抗蛋白、酶、植物激素、絮凝劑等多種 生物活性物質，兼有生物農藥和生物菌肥的作用，已廣泛應用于農業(yè)、工礦業(yè)及廢水處理等 領域。美國環(huán)境保護署（EPA)已將其列為可在商業(yè)上應用的微生物種類之一，我國農業(yè)部 也將其列為免做安全鑒定的一級菌種。
[0015] 本發(fā)明中新普魯蘭酶基因的來源是多粘芽孢桿菌/?〇心 CFCC10334)，基因工程宿主菌是大腸桿菌BL21，根據(jù)大腸桿菌表達載體質粒PGEX 4Τ-1的 物理圖譜，將多粘芽孢桿菌中新普魯蘭酶基因你《定向插入到表達質粒中，并轉化大腸桿 菌BL21，表達產物ENpu5具有正常生物學活性。此外，根據(jù)表達載體上所帶的標簽蛋 白，融合表達產物可采用標簽柱進行純化，同時還可能增加融合蛋白的穩(wěn)定性。具體方 案是對于多粘芽孢桿菌中獲取的新普魯蘭酶基因，通過克隆轉化，最后在大腸桿菌中進行 誘導表達，篩選陽性表達子，并測定酶活后得到了一株具有較高酶活的基因工程菌株，最后 進行發(fā)酵生產得到新普魯蘭酶產品。
[0016] 本發(fā)明采用基因工程技術，構建新普魯蘭酶基因工程菌，即從產新普魯蘭酶的多 粘芽孢桿菌中獲取新普魯蘭酶基因，構建基因工程菌，通過重組酶在載體中的表達進行新 普魯蘭酶的發(fā)酵生產，提高了酶的穩(wěn)定性、活性，降低了生產成本。
[0017] 本發(fā)明方法是發(fā)酵生產新普魯蘭酶的方法，菌種易得、安全性高、且培養(yǎng)方便，其 基因組DNA也易于提取。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖1為提取的細菌總DNA瓊脂糖凝膠電泳結果圖； 圖2為多粘芽孢桿菌PCR克隆新普魯蘭酶基因片段圖； 圖3為新普魯蘭酶基因克隆轉化大腸桿菌DH5 α陽性克隆圖； 圖4為多粘芽孢桿菌中新普魯蘭酶基因克隆子PCR鑒定圖； 圖5為表達引物PCR目的基因片段圖； 圖6為載體PGEX 4Τ-1與PCR產物圖； 圖7為重組新普魯蘭酶基因陽性轉化子PCR鑒定圖； 圖8為GST-Npu基因在大腸桿菌BL21中的表達圖； 圖9為潘糖含量標準曲線圖； 圖10為基因工程菌遺傳穩(wěn)定性圖； 圖11為目的蛋白的SDS-PAGE圖； 圖12為純化后的酶液于25°C保存6個月的酶活性圖； 圖13為純化后的酶液于4°C保存12個月的酶活性圖。

【具體實施方式】
[0019] 下面的實施例可以進一步說明本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
[0020] 以下實施例所用材料，未指明的均為商購現(xiàn)有材料。
[0021] 實施例1 : (一）多粘芽孢桿菌基因組DNA的提?。?將多粘芽孢桿菌在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中于30°C恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，取0. 5~2mL 培養(yǎng)菌液(最多不超過2 X IO9個細胞)，IOOOOrpm離心30秒，盡可能的吸棄上清，收集菌體。
[0022] 依照細菌DNA提取試劑盒(上海生工生物工程技術服務有限公司SK1201-UNIQ-10 柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒）方法提取該菌株的基因組DNA。
[0023] 按照如下操作步驟進行： (1) 加入200μ1緩沖液RB重懸細胞，IOOOrpm離心30秒，棄上清，將細胞震蕩或吹打 重懸于180 μ 1緩沖液RB (革蘭氏陰性菌）或者480 μ I 50mMNa2EDTA (ρΗ8· 0)(革蘭氏陽 性菌）； (2) 加入 120μ1 溶菌酶（20mg/ml in 10 mM Tris-HCl，pH 8.0)，混勻。37°C溫育30-60 分鐘。12000rpm離心2分鐘，棄上清后將細胞震蕩或吹打重懸于180 μ 1緩沖液RB中； (3) 加入20 μ 1蛋白酶K (20mg/ml)溶液，充分混勻，再加入200 μ 1結合液CB，在渦旋 振蕩器上高速連續(xù)振蕩混勻25秒。在70°C放置10分鐘； (4) 冷卻后加入100 μ 1異丙醇，渦旋振蕩混勻，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀； (5) 將上一步混合物(包括可能有的沉淀）加入一個吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管 中），13000rpm離心30-60秒，倒掉收集管中的廢液； (6) 加入500 μ 1抑制物去除液IR, 12000rpm離心30秒，棄廢液； (7) 加入500 μ 1漂洗液WB (其中加入了無水乙醇)，于12000rpm離心30秒，棄廢液； (8) 加入500 μ 1漂洗液WB，于12000rpm離心30秒，棄廢液； (9) 將吸附柱AC放回空收集管中，于13000rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液，以免漂洗 液中殘留的乙醇抑制下游反應； (10) 取出吸附柱AC放入一個干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加100 μ 1洗脫緩 沖液EB(洗脫緩沖液事先在65-70°C水浴中預熱效果更好)，室溫放置3-5分鐘，于12000rpm 離心1分鐘。將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置2分鐘，于12000rpm離心1 分鐘。洗脫體積越大，洗脫效率越高，如果需要DNA的濃度高，可以適當減少洗脫體積，不少 于50 μ 1，過小降低DNA洗脫效率，減少DNA產量； (11) DNA可以存放在2-8°C環(huán)境下，如果要長時間存放，可以放在零下20°C環(huán)境下。
[0024] 提取的細菌總DNA瓊脂糖凝膠電泳結果如圖1所示，圖中可看到明顯的DNA條帶。
[0025] (二）DNA 純度檢測： 取2〇μ L基因組DNA樣品，加滅菌水稀釋，用紫外分光光度計測定λ =260nm和λ =280 nm的吸光度值，計算0D260/0D280的比值。一般認為0D260/0D280〈1.8表示樣品中有蛋白 質、多糖或多酚污染；0D260/0D280>1.9表示RNA含量過多；0D260/0D280=1.8?1. 9,則DNA 純度比較高。
[0026](三）引物的設計與合成： 利用Primer premier 5.0軟件，根據(jù)已報道的多粘芽孢桿菌中編碼新普魯蘭酶基因 序列（U89716. 1)針對該基因開放閱讀框（ORF)上游、下游保守序列設計特異引物。引物由 Invitrogen公司合成。表達時選取BamH I和Not I作為酶切位點。
[0027] 根據(jù)方法所述，分別設計新普魯蘭酶基因克隆引物，如下所示：

【權利要求】
1. 一種多粘類芽孢桿菌新普魯蘭酶基因，其核苷酸序列為SEQ ID NO 1。
2. -種重組表達載體，其特征在于含有權利要求1所述的核苷酸序列。
3. -種宿主細胞，其特征在于所述的宿主細胞為含有權利要求1所述的核苷酸序列的 原核細胞。
4. 如權利要求3所述的宿主細胞，其特征在于所述的宿主細胞為含有權利要求2所述 的表達載體的原核細胞。
5. -種多粘類芽孢桿菌新普魯蘭酶基因克隆表達進行發(fā)酵生產新普魯蘭酶的方法， 其特征在于它包括如下步驟：選擇多粘芽孢桿菌JrJrO1S CFCC10334作 為出發(fā)菌株，基因工程宿主菌是大腸桿菌BL21，根據(jù)大腸桿菌表達載體質粒PGEX 4T-1的 物理圖譜，將多粘芽孢桿菌中新普魯蘭酶基因層7?定向插入到表達質粒中，并轉化大腸桿 菌BL21，表達產物ENpu5具有正常生物學活性，獲取新普魯蘭酶基因，通過克隆轉化，在大 腸桿菌中進行誘導表達，篩選陽性表達子，并測定酶活后得到一株具有較高酶活的基因工 程菌株，最后進行發(fā)酵生產得到新普魯蘭酶產品。
【文檔編號】C12N9/44GK104313042SQ201410544086
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月15日 優(yōu)先權日:2014年10月15日
【發(fā)明者】胡先望, 杜建泉, 梁寧, 陳朋, 嚴曉娟, 宋勇強, 張鳴明 申請人:甘肅省商業(yè)科技研究所