微小核苷酸has-miR574-3p在高血壓診斷中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及微小核苷酸has-miR574-3p在高血壓診斷中的應(yīng)用。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明收集高血壓前期，高血壓患者和正常人的血漿對(duì)全基因組miR表達(dá)譜進(jìn)行研究。研究結(jié)果揭示了一系列miRs與高血壓前期和高血壓相關(guān)，這些差異表達(dá)的miRs有助于闡釋高血壓發(fā)病的分子機(jī)制；為高血壓前期和高血壓的進(jìn)展評(píng)估提供分子標(biāo)記物；為有效控制血壓，治療高血壓前期和高血壓提供全新的治療靶點(diǎn)，同時(shí)采用單一miR或結(jié)合多個(gè)miRs的拮抗劑、模擬劑，為高血壓前期和高血壓的治療提供全新的手段。
【專利說明】微小核苷酸has-miR574-3p在高血壓診斷中的應(yīng)用
[0001] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)日2013年11月26日，申請(qǐng)?zhí)?01310605650. 4,發(fā)明創(chuàng)造名稱為"微 小核苷酸在高血壓診斷和制備降血壓藥物中的應(yīng)用"的分案申請(qǐng)。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明涉及微小核苷酸新用途，具體地說，是微小核苷酸（microRNA) has-miR574_3p在高血壓診斷中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0003] 高血壓（hypertension)是一種常見的以動(dòng)脈血壓持續(xù)升高為主要表現(xiàn)的慢 性疾病，指在靜息狀態(tài)下動(dòng)脈收縮壓> HOmmHg和/或舒張壓> 90mmHg。而收縮壓在 120-139mmHg和/或舒張壓在80-89mmHg之間稱為高血壓前期或正常高值。
[0004] 高血壓是心腦血管病最主要的危險(xiǎn)因素，其腦卒中、心肌梗死、心力衰竭及慢性腎 臟病等主要并發(fā)癥，不僅致殘、致死率高，而且嚴(yán)重消耗醫(yī)療和社會(huì)資源，給家庭和國家造 成沉重負(fù)擔(dān)。大量長期的臨床觀察表明高血壓前期也是心腦血管疾病和腎病的獨(dú)立危險(xiǎn)因 素。我國人群50年來高血壓患病率的明顯上升趨勢(shì)。根據(jù)2002年調(diào)查數(shù)據(jù)，我國18歲以 上成人高血壓患病率為18. 8%，估計(jì)目前我國約有2億高血壓患者，每10個(gè)成年人中就有2 人患有高血壓，約占全球高血壓總?cè)藬?shù)的1/5。高血壓前期在我國的發(fā)病率約為44%-60%， 以中青年為主；其中45%的高血壓前期在十年內(nèi)發(fā)展為高血壓，是我國高血壓患者的"后備 軍"。國內(nèi)外的實(shí)踐證明，高血壓是可以預(yù)防和控制的疾病，降低高血壓患者的血壓水平，可 明顯減少腦卒中及心臟病事件，顯著改善患者的生存質(zhì)量，有效降低疾病負(fù)擔(dān)。
[0005] 微小核苷酸（microRNA，miR)通常由15-22個(gè)核苷酸組成，是一類短鏈的，保守的 非編碼RNAs。miR對(duì)基因表達(dá)具有重要的調(diào)控功能，主要通過降解目標(biāo)mRNA或抑制其翻譯 而達(dá)到抑制基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)的效應(yīng)。miR介導(dǎo)的基因表達(dá)調(diào)控特點(diǎn)是一個(gè)miR通常有多個(gè) 靶基因，涉及多個(gè)信號(hào)通路；而一個(gè)基因可同時(shí)受到多個(gè)miR的調(diào)控，因此miR相關(guān)的基因 表達(dá)調(diào)控具有網(wǎng)絡(luò)狀及相關(guān)對(duì)話的特點(diǎn)。miR的生物學(xué)效應(yīng)涉及廣泛的生物學(xué)過程，包括 細(xì)胞增殖、分化、生長、凋亡等。miRNAs表達(dá)異常涉及多種病理生理狀態(tài)的發(fā)生機(jī)制，包括 器官發(fā)育、衰老、腫瘤、心臟疾病、神經(jīng)退行性病變等。因此，miRs是理解疾病發(fā)生發(fā)展的重 要分子生物學(xué)環(huán)節(jié)，同時(shí)亦是相關(guān)疾病治療的重要靶點(diǎn)。基于miRs的治療模式主要包括兩 方面的途徑：miR拮抗劑（miRantagonists)或抑制劑（microRNAinhibitors)和miR模 擬劑（microRNAmimics)。miR拮抗劑主要用于抑制在疾病狀態(tài)下內(nèi)源性miRs表達(dá)或功能 的上調(diào)，而miR模擬劑主要是用來恢復(fù)疾病過程中內(nèi)源性miRs表達(dá)或功能的下調(diào)。通過對(duì) miR的調(diào)節(jié)，可對(duì)其調(diào)控的一系列靶基因的表達(dá)進(jìn)行協(xié)同有效的調(diào)節(jié)，從而起到對(duì)疾病的干 預(yù)效應(yīng)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供微小核苷酸hsa-miR574-3p在制備 診斷高血壓的醫(yī)療器械中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是，提供微小核苷酸hsa-miR574-3p在制備評(píng)估高血壓的疾 病進(jìn)展的醫(yī)療器械中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是，提供微小核苷酸hsa-miR574-3p作為靶點(diǎn)在篩選降血壓 及靶器官保護(hù)的藥物中的應(yīng)用。
[0009] 為實(shí)現(xiàn)上述第一個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：微小核苷酸hsa-miR574-3p 在制備診斷高血壓的醫(yī)療器械中的應(yīng)用，所述的診斷高血壓的醫(yī)療器械以微小核苷酸作為 診斷分子標(biāo)記物。
[0010]為實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：微小核苷酸hsa-miR574-3p在制備評(píng)估高血壓的疾病進(jìn)展的醫(yī)療器械中的應(yīng)用，所述的醫(yī)療器械以微小核苷酸作為診 斷分子標(biāo)記物。
[0011]為實(shí)現(xiàn)上述第三個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：微小核苷酸hsa-miR574-3p作為靶點(diǎn)在篩選降血壓及靶器官保護(hù)的藥物中的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于： 本發(fā)明收集高血壓前期，高血壓患者和正常人的血漿對(duì)全基因組HIiR表達(dá)譜進(jìn)行研 究。研究結(jié)果揭示了一系列miRs與高血壓前期和高血壓相關(guān)，這些差異表達(dá)的miRs有助 于闡釋高血壓發(fā)病的分子機(jī)制；為高血壓前期和高血壓的進(jìn)展評(píng)估提供分子標(biāo)記物；為有 效控制血壓，治療高血壓前期和高血壓提供全新的治療靶點(diǎn)，同時(shí)采用單一miR或結(jié)合多 個(gè)miRs的拮抗劑、模擬劑，為高血壓前期和高血壓的治療提供全新的手段。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 圖1.在正常vs高血壓前期，正常vs高血壓和高血壓前期vs高血壓兩兩比較分 析中具有顯著差異(/?〈〇. 05)的miRs進(jìn)行交集。
[0014] 圖2.在正常vs高血壓前期，正常vs高血壓和高血壓前期vs高血壓兩兩比較分 析中表達(dá)差異倍數(shù)大于2的miRs進(jìn)行交集。

【具體實(shí)施方式】
[0015] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明提供的【具體實(shí)施方式】作詳細(xì)說明。
[0016] 實(shí)施例1 在本實(shí)施方案中，本發(fā)明主要通過miR表達(dá)譜芯片的研究手段，探討并明確了高血壓 前期及高血壓形成過程中差異表達(dá)的miRs。這一研究首次揭示高血壓前期及高血壓相關(guān) 的表達(dá)變化的miRs，不僅有助于更加全面地闡明高血壓發(fā)病的分子機(jī)制，同時(shí)為高血壓疾 病進(jìn)展的評(píng)估提供了一系列全新的分子標(biāo)志物，并提供了一系列全新的基于miR的治療靶 點(diǎn)，為基于miR的降低血壓及高血壓病靶器官保護(hù)的治療手段的研發(fā)奠定了良好的基礎(chǔ)。
[0017] -、方法 1.臨床研究樣本收集 用于本發(fā)明的樣本全部來自本院，并且所有研究對(duì)象都認(rèn)真閱讀并簽署知情同意書， 符合倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。研究對(duì)象均為男性，年齡在36-50歲之間。在不使用藥物的情況下，使 用水銀血壓計(jì)對(duì)研究對(duì)象動(dòng)脈血壓進(jìn)行測(cè)量，并重復(fù)三次。收縮壓< 120mmHg和舒張壓 < 90mmHg納入正常對(duì)照組；收縮壓彡HOmmHg和/或舒張壓彡90mmHg的研究對(duì)象納入高 血壓組；而使用24小時(shí)動(dòng)態(tài)血壓計(jì)監(jiān)測(cè)全天平均收縮壓在120-139mmHg和/或舒張壓在 80-89mmHg的研究對(duì)象納入高血壓前期組。所有研究對(duì)象通過進(jìn)行心電圖和其他生化指標(biāo) 檢測(cè)排除患有心臟病，腎病和糖尿病，同時(shí)使用EDTA抗凝采血管收集2ml血液。收集的血 樣離心（3000轉(zhuǎn)/分）10分鐘，取上層血漿用于本研究。
[0018] 2.血漿miR表達(dá)譜芯片 米用mirVana?miRNAIsolationKit(Cat#AM1561,Ambion，Austin,TX，US)并 且根據(jù)生產(chǎn)廠商提供的標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行血漿樣品的totalRNA抽提，抽提所得total RNA經(jīng)AgilentBioanalyzer2100(Agilenttechnologies,SantaClara,CA,US) 電泳質(zhì)檢合格后備用。實(shí)驗(yàn)樣品RNA采用AgilentmiRNA芯片配套的試劑盒，miRNA CompleteLabelingandHybKit(Cat#519〇-〇456,Agilenttechnologies,Santa Clara,CA,US)，按照標(biāo)準(zhǔn)操作流程的標(biāo)記部分對(duì)樣品中的miRNA分子進(jìn)行熒光標(biāo)記， 用于AgilenthumanmiRNAmicroarray進(jìn)行全基因組miR表達(dá)譜分析。芯片試驗(yàn)按照 AgilentmiRNA芯片配套提供的標(biāo)準(zhǔn)操作流程和配套試劑盒，miRNACompleteLabeling andHybKit(Cat#519〇-〇456,Agilenttechnologies,SantaClara,CA,US)的雜交部 分，進(jìn)行樣品的雜交實(shí)驗(yàn)。在滾動(dòng)雜交爐中，Hybridization0ven(Cat#G2545A,Agilent technologies,SantaClara,CA,US), 55°C，20rpm，滾動(dòng)雜交 20 小時(shí)。雜交完成后在洗 缸stainingdishes(Cat#121,ThermoShandon,Waltham,MA,US)中洗片，洗片所用的 試劑為GeneExpressionWashBufferKit(Cat#5188_5327,Agilenttechnologies, SantaClara,CA,US)。芯片結(jié)果米用AgilentMicroarrayScanner(Cat#G2565BA, Agilenttechnologies,SantaClara,CA,US)進(jìn)行掃描，用FeatureExtraction software10.7(Agilenttechnologies,SantaClara,CA,US)讀取數(shù)據(jù)，軟件設(shè)置 Scanresolution=5μm,PMT100%，5% 最后米用GeneSpringSoftware11. 0(Agilent technologies,SantaClara,CA,US)進(jìn)行歸一化處理，所用的算法為Quantile。
[0019] 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 對(duì)兩組樣品的芯片結(jié)果采用?檢驗(yàn)及倍數(shù)差異（FoldChange，F(xiàn)C)計(jì)算篩選進(jìn)行統(tǒng)計(jì) 學(xué)分析。
[0020] 二、結(jié)果 1.各組樣本臨床資料 對(duì)正常對(duì)照，高血壓前期和高血壓三組樣本臨床信息進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1所示， 表明高血壓組收縮壓和舒張壓明顯高于正常對(duì)照組和高血壓前期組，高血壓前期組明顯高 于正常對(duì)照組。高血壓組肌酐水平明顯高于高血壓前期和正常對(duì)照組，且與高血壓前期組 比較具有顯著差異。年齡，BMI指數(shù)，尿素，尿酸，甘油三酯，總膽固醇，HDL和LDL在三組間 都沒有顯著差異。
[0021] 表1.研究所用樣本臨床信息統(tǒng)計(jì)

【權(quán)利要求】
1. 微小核苷酸hsa-miR574-3p在制備診斷高血壓的醫(yī)療器械中的應(yīng)用，所述的診斷高 血壓的醫(yī)療器械以微小核苷酸作為診斷分子標(biāo)記物。
2. 微小核苷酸hsa-miR574-3p在制備評(píng)估高血壓的疾病進(jìn)展的醫(yī)療器械中的應(yīng)用，所 述的醫(yī)療器械以微小核苷酸作為診斷分子標(biāo)記物。
3. 微小核苷酸hsa-miR574-3p作為靶點(diǎn)在篩選降血壓及靶器官保護(hù)的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104357555SQ201410543912
【公開日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2013年11月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月26日
【發(fā)明者】張騰, 陳瑜, 賈成林, 楊琴波, 王培偉, 李黎, 崔金剛, 杜宵燁, 寧冰冰, 劉麗 申請(qǐng)人:上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院